Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

عزل ووصف البشرية المستمدة من الحبل السري الخلايا الجذعية الوسيطة من الخدج والرضع الناضجين

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

الحبل السري البشري (UC) يمكن الحصول عليها خلال فترة ما حول الولادة نتيجة للأجل قبل الأوان، ومن بوستتيرم التسليم. في هذا البروتوكول، يصف لنا بعزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.

Abstract

إمكانيات علاجية كبيرة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) وجذب اهتمام متزايد في مجال الطب الحيوي. MSCs هي أصلاً معزولة تتسم من نخاع العظم (بي أم)، ثم اكتسبت من الأنسجة بما في ذلك الأنسجة الدهنية والزليلي، والجلد، ولب الأسنان والملاحق الجنينية مثل المشيمة، دم الحبل السري (UCB)، والحبل السري (UC). MSCs عدد سكان خلية غير متجانسة مع القدرة على (1) التمسك بالبلاستيك في ظروف الثقافة القياسية، علامة (2) سطح التعبير عن CD73+/CD90+/CD105+/CD45/CD34/CD14/CD19 تعمل/HLA-DR ، والتمايز تريلينيجي (3) في adipocytes، أوستيوسيتيس، وتشوندروسيتيس، التي حددها "المجتمع الدولي" حاليا للعلاج الخلوي (إيست). على الرغم من أن بي أم هو المصدر الأكثر استخداماً من MSCs، طبيعة الغازية تطلع BM أخلاقيا يحد إمكانية الوصول إليها. قدرة الانتشار والتفرقة من MSCs التي تم الحصول عليها من BM الانخفاض عموما مع سن الجهة المانحة. وفي المقابل، الجنين MSCs التي تم الحصول عليها من جامعة كاليفورنيا بمزايا مثل انتشار قوي وقدرة التمايز. هناك لا قلق أخلاقية لأخذ العينات من جامعة كاليفورنيا، كما أنها تعتبر عادة النفايات الطبية. تفرد الإنسان يبدأ مع استمرار نمو تجويف السلي في 4-8 أسابيع الحمل ويبقى المتزايد حتى وصلت إلى 50-60 سم في الطول، وأنها يمكن أن تكون معزولة أثناء فترة أسرة الوليد تسليم. إلى التبصر في الفسيولوجيا المرضية للأمراض المستعصية، وقد استخدمنا MSCs المستمدة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الرضع وألقى في الإعمار الحملية المختلفة. في هذا البروتوكول، يصف لنا بعزل وتوصيف UC-MSCs من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي أصلاً معزولة وتتميز من نخاع العظم (بي أم)1،2 ولكن يمكن أيضا الحصول على مجموعة متنوعة من الأنسجة بما في ذلك الأنسجة الدهنية والزليلي، والجلد، ولب الأسنان وملحقات الجنين 3-MSCs هي المعترف بها كمحتوى خلية غير متجانسة التي يمكن أن تنتشر وتفرق في adipocytes وأوستيوسيتيس وتشوندروسيتيس. وباﻹضافة إلى ذلك، MSCs تمتلك القدرة على الهجرة إلى مواقع الإصابة وقمعها وتعدل الاستجابات المناعية، وإعادة تشكيلها، وإصلاح الضرر. حاليا، MSCs من مصادر مختلفة وقد اجتذبت اهتمام متزايد كمصدر للخلايا العلاج ضد عدد من الأمراض المستعصية، بما في ذلك الاختلاس – مقابل – المضيف المرض واحتشاء عضلة القلب، واحتشاء دماغي4،5 .

على الرغم من أن بي أم هو المصدر الأكثر تميز جيدا من MSCs، اختزاع تطلع BM أخلاقيا يحد من إمكانية الوصول إليها. قدرة الانتشار والتفرقة من MSCs التي تم الحصول عليها من BM الانخفاض عموما مع سن الجهة المانحة. وفي المقابل، MSCs الأجنة التي تم الحصول عليها من الملاحق الجنينية مثل المشيمة، دم الحبل السري (UCB)، ويكون الحبل السري (UC) المزايا بما في ذلك الشواغل الأخلاقية أقل فيما يتعلق بانتشار أخذ العينات وقوية وتمايز القدرات6 , 7-بين الجنين الملاحق التي عادة ما يتم إهمالها كالنفايات الطبية، UCB وتفرد تعتبر جهازا للجنين، في حين تعتبر المشيمة فيتوماتيرنال. وبالإضافة إلى ذلك، تحتاج المشيمة و UCB أخذ عينات منها وجمعها في هذه اللحظة الدقيقة من تسليم الأطفال حديثي الولادة، بينما المشيمة وتفرد يمكن جمعها ومعالجتها بعد الولادة حديثي الولادة. تبعاً لذلك، تفرد مصدرا واعداً من لجنة السلامة البحرية لخلية العلاج8،9.

تفرد الإنسان يبدأ تطوير مع التوسع التدريجي في تجويف السلي في 4-8 أسابيع الحمل وما زال ينمو حتى 50-60 سم في الطول، ويمكن أن تكون معزولة خلال كامل فترة الوليد تسليم10. إلى التبصر في الفسيولوجيا المرضية للأمراض المستعصية، ونحن استخدام MSCs المستمدة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الرضع في مختلف الإعمار الحملية11،12. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية عزل وتوصيف UC-MSCs من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

استخدام العينات البشرية لهذه الدراسة كانت أقرتها اللجنة الأخلاقية من "كوبي خريج كلية الطب بجامعة" (الموافقة رقم 1370 و 1694) وتجري وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.

1-العزلة وثقافة UC-MSCs

ملاحظة: جامعة كاليفورنيا-MSCs قد تم عزل بنجاح، مثقف، والموسعة (أكثر من الممر رقم 4) من أكثر من 200 UCs تعرضوا لهذا البروتوكول. من بين أكثر من 200 UCs، أظهرت 100 ٪ ناجحة UC-ماجستير العزلة، أقل من 5% قد أظهرت تلوث عرضي، أقل من 15% وقد أظهرت القبض على النمو، وأكثر من 80% وقد أظهرت نجاح UC-ماجستير التوسع.

  1. جمع UC.
    1. إعداد أنبوب بلاستيكي 50 مل، وتعديل مقص العقيم، وزجاجة 500 مل من ألفا المتوسطة النسر الأساسية الدنيا (ألفا MEM) في 4 درجات مئوية.
    2. أسيبتيكالي قطع الاتصالات الموحدة مع مقص جراحي في حوالي 5-10 سم في الطول وجمع قريبا بعد الولادة حديثي الولادة بالعملية القيصرية.
    3. فورا مكان في جامعة كاليفورنيا في أنبوب بلاستيكي 50 مل وإضافة 20-30 مل ألفا MEM في الأنبوب.
    4. تخزين في جامعة كاليفورنيا في درجة حرارة الغرفة (RT) إلى حين نقلها إلى المختبر.
      ملاحظة: يمكن تخزين UC العقيم في المتوسط خالية من المصل في RT لمدة تصل إلى 2 يوما. ولذلك، يمكن جمعها جامعة كاليفورنيا التي تم الحصول عليها من المستشفيات المجاورة إذا كان يتم إرسالها إلى المختبر خلال يومين.
  2. تشريح جامعة كاليفورنيا.
    1. إعداد علبة بلاستيكية، معقمة المقص والملقط، ماصات 10 مل, 25 مل الممصات، اثنين الأطباق 60 ملم زراعة الأنسجة، الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ويمزج إنزيم المنقي (انظر الجدول للموادوتشكيلها مع PBS العقيمة في تركيز 13 Wünsch وحدة/مل وتخزينها في-80 درجة مئوية)، وزجاجة 500 مل من المصل انخفاض المتوسط (انظر الجدول للمواد).
    2. الاحماء في برنامج تلفزيوني، إنزيم المنقي يمزج، وخفضت مصل المتوسطة، والمتوسطة الثقافة [ألفا MEM تحتوي على 10% الجنيني البقري المصل (FBS) وحل مضاد حيوي فطري 1% (أإ) المخزنة في 4 درجات مئوية] إلى الرايت
    3. إخراج UC من الأنبوب ثم ضعه في علبة بلاستيكية.
    4. تزن وتشريح 5 غ من جامعة كاليفورنيا مع مقص معقم.
    5. صب 10 مل إيثانول 70% على تفرد للتعقيم باستخدام ماصة 10 مل.
    6. أغسل UC مع 10 مل من برنامج تلفزيوني مرتين باستخدام ماصة 10 مل.
    7. ضع تفرد في طبق زراعة أنسجة معقمة 60 مم (انظر الشكل 1، الخطوة 1).
    8. أضف 10 مل من المصل انخفاض المتوسط إلى الطبق.
    9. إضافة 0.5 مل مزيج إنزيم المنقي للوصول إلى تركيز نهائي لنحو 0.62 Wünsch وحدة/مل.
      ملاحظة: استخدام إنزيم المنقي يمزج بدلاً من كولاجيناز التقليدية قد ثبت أن تحسين الغلة واستمرارية UC-MSCs المعزولة من جامعة كاليفورنيا.
    10. قطع جامعة كاليفورنيا إلى قطع 2-3 مم مع تعقيم المقص والملقط (انظر الشكل 1من الخطوة 2).
      ملاحظة: وتستغرق هذه العملية حوالي 30 دقيقة.
    11. احتضان قطع الاتصالات الموحدة على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حاضنة2 CO 5%.
    12. قص القطع UC هضمها جزئيا إلى أجزاء أصغر التي تتدفق بسهولة عن طريق ماصة 25 مل.
      ملاحظة: وتستغرق هذه العملية حوالي 30 دقيقة.
    13. احتضان القطع UC أصغر في 37 درجة مئوية لمدة 15-45 دقيقة في حاضنة2 CO 5%.
      ملاحظة: الحضانة يحتاج إلى أن يستمر هوموجيناتيس تصبح لزج. لقد حان وقت الهضم مجموع ما يقرب من 120 دقيقة. في حالة استخدام UCs من الخدج، ومع ذلك، وقت الهضم يمكن اختصارها نظراً لأن تلك هي سهولة قص وهضمها.
  3. عزل UC-MSCs.
    1. إعداد أربعة أنابيب بلاستيكية 50 مل و 500 مل زجاجة متوسطة الثقافة.
    2. تقسيم هوموجيناتي جامعة كاليفورنيا إلى اثنين من أنابيب بلاستيكية 50 مل باستخدام ماصة 25 مل، مع ما يقرب من 7.5 مل في كل أنبوبة.
    3. إضافة 20 مل متوسطة الثقافة في كل أنبوب ومزيج جيد.
    4. تصفية كل هوموجيناتي من جامعة كاليفورنيا من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وضعت على رأس أنبوب جمع 50 مل جديدة، باستخدام ماصة 25 مل لجمع الخلايا المستمدة من جامعة كاليفورنيا.
      ملاحظة: وتستغرق هذه العملية حوالي 15 دقيقة بكل منهما، كما مثبت حل UC هضمها.
    5. الطرد المركزي أنبوبين في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق.
    6. نضح المادة طافية وتخلص منه بعناية.
    7. ريسوسبيند الكريات الخلية في أنبوبين مع 5 مل من الثقافة المتوسطة.
    8. نقل تعليق خلية إلى لوحات 60 ملم الجديدة والثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% (انظر الشكل 1من الخطوة 3).
  4. الثقافة UC-MSCs.
    1. الاحماء في برنامج تلفزيوني، التربسين-يدتا (0.25 w/v%)، والثقافة المتوسطة (ألفا MEM التي تحتوي على 10% FBS و 1% AA) إلى الرايت
    2. عندما خلايا متصلة لوح 60 ملم, إزالة المتوسطة الثقافة وتغسل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني مرتين لإزالة الحطام وخلايا الدم الحمراء.
      ملاحظة: عادة ما تظهر الخلايا المرفقة في 3-5 أيام بعد الطلاء الأولى (انظر الشكل 1من الخطوة 4).
    3. استبدال ثقافة المتوسط مرتين في الأسبوع واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة حتى كونفلوينسي 90-100%.
      ملاحظة: وهذا عادة ما يستغرق 7-14 يوما بعد الطلاء الأولى.
    4. تغسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني مرتين وإضافة 0.5 مل يدتا التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
    5. عندما الخلايا تصبح تقريب ومنفصلة، إضافة 9 مل من الثقافة المتوسطة ومزيج جيد لإلغاء تنشيط التربسين.
    6. نقل تعليق خلية إلى لوحات 100 ملم الجديدة والثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% (انظر الشكل 1، الخطوة 5).
    7. استبدال ثقافة المتوسط مرتين في الأسبوع واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة حتى كونفلوينسي 90-100%.
      ملاحظة: وهذا عادة ما يستغرق 4-8 أيام بعد الطلاء الأولى.
    8. تغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني مرتين وإضافة 1 مل من التربسين-يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
    9. عندما الخلايا تصبح تقريب ومنفصلة، إضافة 9 مل من الثقافة المتوسطة ومزيج جيد لإلغاء تنشيط التربسين.
    10. نقل تعليق خلية في اثنين اللوحات الجديدة 100 مم والثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% (انظر الشكل 1، الخطوة 5).
    11. كرر ثقافة فرعية (تقسيمات 1:2) حتى سن العاشرة (انظر الشكل 1، الخطوة 5).
      ملاحظة: لأن الخلايا المزروعة تحت شروط أقل المتلاقية تميل إلى التوصل إلى توقيف انتشار سابق، من المهم أن خلايا المرور بنسبة 1:2 تقسيم.
    12. استخدام الخلايا في سن الخامسة إلى الثامنة للخلية علامة سطحية التحليل وخلية تحليل التمايز وتجارب أخرى.
      ملاحظة: للحفاظ على انتشار قوي لأطول فترة ممكنة، تستزرع خلايا عموما تحت أكثر من ظروف المتلاقية 70-80%.

2-العلامة سطح التعبير عن UC-MSCs

  1. إعداد الخلايا في صفيحة 100 مم وننأى بها مع 1 مل من التربسين-يدتا في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
  2. إضافة مل 9 الثقافة المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق.
  3. نضح المادة طافية وتجاهل ذلك.
  4. ريسوسبيند الكريات الخلية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز للحد الأدنى 5 كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.
  5. ريسوسبيند الخلايا مع التدفق الخلوي (FCM) المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني يتضمن يدتا 2 مم وكاشف حظر 10%) في ~ 1 × 106 خلايا/مل.
  6. نقل 50-100 ميليلتر من تعليق خلية في أنبوب 1.5 مل؛ إضافة فيكوريثرين (PE)-مترافق الأجسام المضادة ضد CD14، CD19، CD34، CD45، CD73، CD90، CD105، أو هلا-الدكتور؛ واحتضان على الجليد لمدة 45 دقيقة.
  7. أغسل الخلايا مع FCM المخزن المؤقت مرتين وإضافة 50-100 ميليلتر من 0.2% صلاحية صبغ الحل (انظر الجدول للمواد).
  8. احتضان على RT لمدة 15 دقيقة ويغسل خلايا مع المخزن المؤقت FCM مرتين وتصفية الخلايا عن طريق مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
  9. تشغيل الخلايا عن طريق FCM وتحليل النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام البرمجيات FCM وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.

3-تريلينيجي التفريق بين UC-MSCs

  1. أداء أديبوجينيسيس.
    1. إعداد تعليق خلية في المتوسط الثقافة بتركيز3 5 × 10 خلايا/مل.
    2. بلايت 1 مل تعليق خلية في صفيحة 12-جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة ح ~ 24.
    3. استبدال الثقافة المتوسطة بمتوسطة التمايز أديبوجينيك (انظر الجدول للمواد)، واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لمدة 2-3 أسابيع. تغيير متوسطة التمايز أديبوجينيك مرتين في أسبوع.
    4. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    5. احتضان خلايا في 4% فورمالدهايد الحل لمدة 30 دقيقة في الرايت
    6. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات والايزوبروبانول 60% ثلاث مرات.
    7. إعداد 0.5% زيت أحمر س الحل بتذويب ملغ 84 من النفط س أحمر في 10 مل من الكحول 100% وأضاف مل 6.7 من الماء المقطر. وصمة عار الخلايا مع 1 مل من الزيت الأحمر 0.5% O الحل في RT لمدة 20 دقيقة.
    8. غسل الخلايا بالكحول 60% ثلاث مرات وتصور تحت مجهر.
  2. أداء تكون العظم.
    1. إعداد تعليق خلية في المتوسط الثقافة بتركيز 1 × 104 خلايا/مل.
    2. بلايت 1 مل تعليق خلية في صفيحة 12-جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة ح ~ 24.
    3. استبدال الثقافة المتوسطة بمتوسطة التمايز أوستيوجينيك (انظر الجدول للمواد)، واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لأسابيع 1-2. تغيير متوسطة التمايز osteogenic مرتين في أسبوع.
    4. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    5. احتضان خلايا في 4% فورمالدهايد الحل لمدة 30 دقيقة في الرايت
    6. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    7. إعداد الأليزارين الأحمر 2% S الحل عن طريق تذويب 200 مغ اليزارين الأحمر S مع 10 مل ماء المقطر. وصمة عار الخلايا مع 1 مل من الأليزارين الأحمر 2% S الحل في RT لمدة 3 دقائق.
    8. غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وتصور تحت مجهر.
  3. أداء تشوندروجينيسيس.
    1. إعداد تعليق خلية في المتوسط الثقافة بتركيز 1.6 × 107 خلايا/مل.
    2. وضع معالجة تجميعية 5 ميليلتر من تعليق خلية في وسط بئر في لوحة 12-جيدا (الثقافات ميكروماس) واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة ح 2-3.
    3. أضف 1 مل متوسطة التمايز تشوندروجينيك برفق (انظر الجدول للمواد)، واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لمدة 4-7 أيام. تغيير متوسطة التمايز تشوندروجينيك مرتين في أسبوع.
    4. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    5. احتضان خلايا في 4% فورمالدهايد الحل لمدة 30 دقيقة في الرايت
    6. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    7. تحضير 0.05% أزرق تولويدين الحل بتذويب 250 ملغ تولويدين الأزرق مع 500 مل مخزن خلات الصوديوم 0.1 M مع الأس الهيدروجيني 4.1. وصمة عار الخلايا مع 1 مل من محلول أزرق تولويدين 0.05% على RT لمدة 30 دقيقة.
    8. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وتصور تحت مجهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الإجراءات التي من جمع UC ماجستير الثقافة يرد في الشكل 1. ويمكن جمع UC لحوالي 5-10 سم في الطول من جميع الأطفال حديثي الولادة بالعملية القيصرية. UC يبدأ وضع في 4-8 أسابيع الحمل، وما زال ينمو حتى 50-60 سم في الطول، كما هو مبين في الشكل 2. هناك اثنين من الشرايين (A) والسياق واحد (V) وبطانة الحبل (CL) وجيلي (WJ في وارتون) في جامعة كاليفورنيا، كما هو مبين في الشكل 3 و 4 الشكل. جامعة كاليفورنيا-MSCs يمكن عزل من جميع مناطق النخاع أو الحبل كله13. لأن تفرد من الرضع مع أوائل حملية هشة وصعبة للتشريح إلى منطقة سلك واحد، UC-MSCs معزولة من الحبل كله11،12. هناك عدة طرق لعزل MSCs من جامعة كاليفورنيا، التي تشمل أسلوب explant14 و أسلوب الهضم الأنزيمي15، بالإضافة إلى تلك المشتقات16. سبب أطول دورة الثقافة، وانخفاض الغلة، وسابق اعتقال الانتشار المرتبطة بأسلوب اكسبلانت17،18، تستزرع UC-MSCs بطريقة الهضم الأنزيمي كما هو موضح في الشكل 5 و 6 الرقم .

معايير الحد الأدنى لتحديد MSCs تنشئها في إيست، وتشتمل على وصف علامة السطحية19. لتحديد علامة سطح التعبير، المحتضنة مع الأجسام المضادة المناسبة مترافق PE UC-MSCs من الرضع الخدج والمدة وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. فهي إيجابية لماجستير التوقيع علامات (CD73، CD90، CD105) ولكن السلبية الوحيدات/بلعم (CD14)، البطانية (CD34)، المكونة للدم (CD19, CD45)، وهيستوكومباتيبيليتي الرئيسية المعقدة (HLA-DR) علامات، كما هو مبين في الشكل 7.

وفقا لمعايير إيست19، لجنة السلامة البحرية يجب أن تمتلك قدرة التمايز ميسوديرمال يقيمها مقايسة تمايز تريلينيجي. لتقييم قدرة التمايز تريلينيجي، هي التي يسببها UC-MSCs من الرضع الخدج ومصطلح التفريق في osteocytes و adipocytes و chondrocytes تحت الظروف القياسية في المختبر التمايز. كما هو مبين في الشكل 8، ومتمايزة جيدا في كافة الأنواع الثلاثة من الخلايا ميسوديرمال.

Figure 1
الشكل 1 : رسم تخطيطي للعزلة وثقافة UC-MSCs. الخطوة 1. 5-10 سم من جامعة كاليفورنيا أسيبتيكالي التي جمعت من الأنسجة المشيمية. الخطوة 2. تنقية إنزيم يهضم مزيج تفرد القطع. الخطوة 3. ثقافة UC-MSCs في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5%. الخطوة 4. ظهرت المرفقة UC-MSCs في 3 أيام بعد الطلاء الأولى. الخطوة 5. ثقافة فرعية من جامعة كاليفورنيا-MSCs. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تسليم UC من الأجنة/الرضع في مختلف الإعمار الحملية. يتم إظهار UCs من الأجنة/الرضع في 19-38 أسبوعا من الحمل. زيادة حجم الاتصالات الموحدة مع العمر الحملي. تغيير حجم أشرطة = 8 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : عرض الأقسام من جامعة كاليفورنيا من الرضع الخدج والأجل. هناك اثنين من الشرايين (A) والسياق واحد (V) وبطانة الحبل (CL) وجيلي (WJ في وارتون) في جامعة كاليفورنيا من الرضع الخدج والأجل. وتختلف أحجام هذه الأنسجة حملية. تغيير حجم أشرطة = 2 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : علم التشريح من جامعة كاليفورنيا- (أ) 5 سم من جامعة كاليفورنيا من مصطلح الرضع. (ب) قطاع عريض من جامعة كاليفورنيا. (ج) جزئيا تشريح UC. هناك اثنين من الشرايين (A) والمنطلق واحد (V) وبطانة الحبل (CL) وجيلي (WJ في والتون). UC من الرضع في وقت سابق حملية خاصة هشة وصعبة لأن تشريح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : تشريح UC استخدام مزيج إنزيم المنقي. (أ) 5-10 سم من جامعة كاليفورنيا. (ب) قطع 2-3 مم من جامعة كاليفورنيا. (ج) تنقية إنزيم يهضم مزيج تفرد القطع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : مورفولوجية UC-MSCs من الرضع الخدج والأجل. (ألف و هاء) UC-MSCs في الممر رقم 1 (P1) قبل استبدال الثقافة المتوسطة (ج: X40؛ هاء: X200). (ب وو) UC-MSCs في P1 بعد استبدال الثقافة المتوسطة (ب: X40؛ واو: X200). (ج وز) UC-MSCs في P3 (c: X40؛ زاي: X200). (دال و حاء) UC-MSCs في P5 (d: X40؛ H: X200). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : سطح التعبير علامة من جامعة كاليفورنيا-MSCs من الرضع الخدج والأجل. CD73/CD90/CD105--الإيجابية وتعمل CD14/CD19/CD34/CD45/هلا-الدكتور-السلبية موجودة في UC MSCs من الولادة قبل الأوان (22 أسبوعا من الحمل) والرضع الناضجين (37 أسبوعا من الحمل). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8 : التمايز تريلينيجي mesenchymal من جامعة كاليفورنيا-MSCs من الرضع الخدج والأجل. ميزت UC-MSCs من الولادة قبل الأوان (22 أسبوعا من الحمل) والرضع الناضجين (37-40 أسبوعا من الحمل) إلى adipocyte (تصور بالنفط يا أحمر)، أوستيوسيتي (تصور طريق اليزارين S أحمر)، وتشوندروسيتي (تصور طريق تولويدين الأزرق). صور أخذت في 200 x. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. وقد تم تكييف جزء من هذا الرقم ايواتاني et al.11الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويمكن أن تكون معزولة من مجموعة متنوعة من الأنسجة MSCs السكان غير متجانسة من الخلايا التي تفعل إكسبرس ليس كل العلامات المظهرية نفس. هنا، نحن المبينة بروتوكول أن أدلة جمع والتشريح من جامعة كاليفورنيا من الرضع الخدج والمدة ويمكن عزلة وثقافة UC-MSCs. وفي أعقاب هذا البروتوكول، نحن بنجاح معزولة UC-MSCs التي تفي بمعايير ISCT19 من الأجنة/الرضع ألقاه في 19-40 أسبوعا من الحمل، وأثبتت أنها تمثل بعض الجوانب من الأمراض المستعصية الفيزيولوجيا المرضية وخلال تطور الجنين11،12.

في MSCs المستمدة من BM (بي أم-MSCs)، المستمدة من المانحين BM الأصغر سنا-MSCs عموما إظهار إمكانيات التكاثري وديفيرينتياتيفي أكبر من نظرائهم الأكبر سنا وإمكانات أكثر لخلية العلاج20،21. وبالمثل، أبلغ الخدج UC-MSCs عزل من الأجنة التي أجهضت في 8-12 أسبوعا من الحمل يحمل أقوى من انتشار والتمايز مقارنة بالمدة UC-MSCs المعزولة من الأطفال حديثي الولادة في 37-40 أسبوعا من الحمل22. على الرغم من الاختلافات في منطقة الحبل والعمر الحملي، كشفت UC-MSCs معزولة مع هذا البروتوكول أيضا انتشار الخدج UC-MSCs أقوى من مصطلح UC-MSCs12.

خطوة حاسمة في إطار هذا البروتوكول هو تشريح UC مع إنزيم المنقي الأخلاط التي تتألف من كولاجيناز الأولى والثانية ديسباسي. كما ورد في نتائج تمثيلية، صلابة من جامعة كاليفورنيا تختلف جذريا مع العمر الحملي (الشكل 2). ولتحقيق تشريح الأمثل من جامعة كاليفورنيا، يمزج وقت الحضانة إنزيم المنقي حاجة إلى تعديل لصلابة من جامعة كاليفورنيا الفردية. وبصفة عامة، عادة ما يستغرق وقتاً أطول لمصطلح UC من جامعة كاليفورنيا قبل الأوان. من بين الأساليب القائمة على عزل MSCs من جامعة كاليفورنيا، نختار طريقة الهضم الأنزيمي15 عبر أسلوب explant14 التي قد تؤدي إلى أطول دورة الثقافة وانخفاض الغلة، وسابق انتشار القبض على17،18. تعديل طريقة الهضم إنزيم هام هو استخدام مزيج إنزيم المنقي بدلاً من كولاجيناز التقليدية، التي تمكن تشريح فعالة ومتسقة من جامعة كاليفورنيا من الأجنة/الرضع ذوي الإعمار الحملية متغير.

حد من هذا البروتوكول هو استخدام الحبل كله لعزل MSCs من جامعة كاليفورنيا. لأنه يمكن عزل UC-MSCs من جميع مناطق النخاع أو الحبل كله13، معزولون UC-MSCs من الحبل كله في هذا البروتوكول. هذا سبب جدوى التشريح UC من الرضع الخدج. ومع ذلك، قد تحد من الاختلاف المحتملة في نسبة كل منطقة الحبل مقارنة صارمة بين UC-MSCs عزل بموجب هذا البروتوكول.

جامعة كاليفورنيا-MSCs متزايد تستخدم كمصدر للخلايا اللحمية الوسيطة للدراسات السريرية والسريرية8،9. وعلى الرغم من هذا الاستخدام المتزايد، توافق في آراء حول أساليب العزلة UC-MSCs مازال مفقوداً، الذي قد يسفر عن السكان خلية مختلفة باعتبار نفس UC-MSCs. وسيساعد هذا البروتوكول في نهاية المطاف الباحثين في فهم أفضل لاشتقاق والخصائص الوظيفية لجامعة كاليفورنيا-MSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل بمعونة عن Scientific Research (C) (منح رقم: 25461644) والعلماء الشباب (ب) (منح أرقام: 15 ك 19614، 26860845، 17 ك 16298) من كاكينهي JSPS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6, (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9, (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2, (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25, (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43, (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6, (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16, (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13, (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91, (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35, (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65, (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17, (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97, (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12, (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22, (17), 2425-2439 (2013).
عزل ووصف البشرية المستمدة من الحبل السري الخلايا الجذعية الوسيطة من الخدج والرضع الناضجين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter