Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

Menselijke navelstreng (UC) kan worden verkregen in de perinatale periode als gevolg van premature, termijn en postterm levering. In dit protocol beschrijven we de isolatie en de karakterisering van UC-afgeleide mesenchymale stamcellen (UC-MSCs) uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht.

Abstract

Mesenchymale stamcellen (MSCs) hebben aanzienlijke therapeutische mogelijkheden en toenemende belangstelling in de biomedische veld. MSCs zijn oorspronkelijk geïsoleerd en gekenmerkt uit beenmerg (BM), dan verworven weefsel met inbegrip van vetweefsel, synovia, huid, tandmerg en foetale aanhangsels zoals de placenta, navelstrengbloed (UCB), en de navelstreng (UC). MSCs zijn een heterogene celpopulatie met de capaciteit voor (1) naleving van kunststof in standaard kweekomstandigheden, (2) oppervlakte marker uitdrukking van CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- fenotypen, en (3) trilineage differentiatie in adipocytes, osteocytes en chondrocyten, zoals dat momenteel gedefinieerd door de International Society voor cellulaire therapie (ISCT). Hoewel BM de wijdst gebruikte bron van MSCs is, beperkt het invasieve karakter van BM aspiratie ethisch zijn toegankelijkheid. Capaciteit van de proliferatie en differentiatie van MSCs BM verkregen in het algemeen dalen met de leeftijd van de donor. Daarentegen hebben de foetale MSCs UC verkregen voordelen zoals krachtige proliferatie en differentiatie capaciteit. Er is geen ethische bezorgdheid voor UC bemonstering, zoals het meestal wordt beschouwd als medisch afval. Menselijke UC begint te ontwikkelen met de aanhoudende groei van het vruchtwater spouw op 4-8 weken van de dracht en houdt tot het bereiken van de 50-60 cm in de lengte groeien, en gedurende de hele pasgeboren leveringsperiode geïsoleerd kan worden. Om inzicht te krijgen in de pathofysiologie van hardnekkige ziekten, hebben we de UC-afgeleide MSCs (UC-MSCs) van zuigelingen geleverd op verschillende zwangerschapsduur leeftijd gebruikt. In dit protocol beschrijven we de isolatie en de karakterisering van UC-MSCs uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn oorspronkelijk geïsoleerd en gekenmerkt uit beenmerg (BM)1,2 , maar kan ook worden verkregen bij een breed scala aan weefsels, met inbegrip van vetweefsel, synovia, huid, tandmerg en foetale aanhangsels 3. MSCs worden erkend als een heterogene celpopulatie die kan vermenigvuldigen en differentiëren in adipocytes, osteocytes en chondrocyten. Daarnaast MSCs beschikken over het vermogen om te migreren naar plaatsen van verwonding, onderdrukken en moduleren immuunresponsen, verbouwen en herstellen van schade. Op dit moment hebben MSCs uit verschillende bronnen groeiende belangstelling aangetrokken als een bron voor celtherapie tegen een aantal hardnekkige ziekten, inclusief graft - versus-klauwzeer host, myocardinfarct en cerebrale infarct4,5 .

Hoewel BM de meest goed gekarakteriseerd bron van MSCs is, beperkt de invasiviteit van BM aspiratie ethisch zijn toegankelijkheid. Capaciteit van de proliferatie en differentiatie van MSCs BM verkregen in het algemeen dalen met de leeftijd van de donor. In tegenstelling, foetale MSCs verkregen foetale aanhangsels zoals de placenta, navelstrengbloed (UCB), en navelstreng (UC) hebben voordelen, waaronder minder ethische bezwaren met betrekking tot bemonstering en robuuste proliferatie en differentiatie capaciteit6 , 7. onder foetale aanhangsels die zijn meestal weggegooid als medisch afval, UCB en UC worden beschouwd als een foetale orgel, terwijl de placenta wordt beschouwd als fetomaternal. Bovendien, moeten placenta en UCB worden bemonsterd en verzameld op het exacte moment van pasgeboren levering, overwegende dat de placenta en UC kan worden verzameld en na de pasgeboren levering verwerkt. Dienovereenkomstig, UC is een veelbelovende MSC-bron voor cel therapie8,9.

Menselijke UC begint te ontwikkelen met geleidelijke uitbreiding van het vruchtwater holte op 4-8 weken van de dracht, blijft tot 50-60 cm in de lengte groeien, en kan worden geïsoleerd gedurende de gehele looptijd van pasgeboren levering10. We gebruiken om inzicht te krijgen in de pathofysiologie van hardnekkige ziekten, UC-afgeleide MSCs (UC-MSCs) van zuigelingen op verschillende zwangerschapsduur leeftijd11,12afgeleverd. In dit protocol beschrijven we hoe u kunt isoleren en karakteriseren van UC-MSCs uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het gebruik van menselijke specimens voor deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van Kobe University Graduate School of Medicine (goedkeuring nr. 1370 en 1694) en uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtsnoeren.

1. isolatie en de cultuur van UC-MSCs

Opmerking: UC-MSCs werden met succes geïsoleerd, gekweekt, en uitgebreide (meer dan passage nummer 4) van meer dan 200 UCs onderworpen aan dit protocol. Onder meer dan 200 UCs, 100% gebleken succesvolle UC-MSC isolatie, minder dan 5% is gebleken dat accidentele verontreiniging, minder dan 15% groei arrestatie hebben aangetoond, en meer dan 80% succesvolle UC-MSC expansie gebleken.

  1. Verzamelen van UC.
    1. Bereiden van een plastic buis van 50 mL, een aseptische scissor, en een fles van 500 mL voor alpha gemodificeerde Eagle's minimale essentiële medium (alpha MEM) bij 4 ° C.
    2. Aseptisch UC uitgesneden met een chirurgische scissor op ongeveer 5-10 cm in lengte en verzamel het kort na de geboorte van de pasgeboren door keizersnede.
    3. Onmiddellijk plaats van de UC in een plastic buis van 50 mL en Voeg 20-30 mL voor alpha MEM in de buis.
    4. Bewaar de UC bij kamertemperatuur (RT) totdat het wordt vervoerd naar het laboratorium.
      Opmerking: Aseptische UC kan worden opgeslagen in serumvrij medium bij RT voor tot 2 dagen. UC verkregen uit naburige ziekenhuizen kan daarom worden verzameld indien het binnen 2 dagen naar het lab is uitgebracht.
  2. Ontleden van UC.
    1. Bereiden van een kunststof dienblad, gesteriliseerde schaar en pincet, 10 mL pipetten, 25 mL pipetten, twee 60 mm weefselkweek gerechten, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gezuiverde enzym past (Zie Tabel van materialen, gereconstitueerd met steriel PBS in een concentratie van 13 Wünsch eenheden/mL en opgeslagen bij-80 ° C), en een verminderde serum medium fles 500 mL (Zie Tabel van materialen).
    2. Warming-up de PBS, gezuiverde enzym combineert, serum medium, en kweekmedium [alpha MEM met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% antibioticum-antimycotic-oplossing (AA) opgeslagen bij 4 ° C] teruggebracht tot RT.
    3. Neem de UC uit de buis en plaatst u deze in een plastic lade.
    4. Wegen en ontleden van 5 g van UC met een gesteriliseerde schaar.
    5. Giet de UC voor sterilisatie met behulp van een precisiepipet 10 mL 10 mL 70% ethanol.
    6. Wassen van de UC met 10 mL PBS tweemaal met behulp van een pipet 10 mL.
    7. De UC in een gesteriliseerde 60 mm weefselkweek schotel plaatsen (Zie Figuur 1, stap 1).
    8. Voeg 10 mL van verminderde serum medium in de schotel.
    9. Voeg 0,5 mL van gezuiverde enzym mengsels te bereiken een eindconcentratie van ongeveer 0.62 Wünsch eenheden/mL.
      Opmerking: Het gebruik van gezuiverde enzym mengsels in plaats van traditionele collagenase is aangetoond dat het verbeteren van het rendement en levensvatbaarheid van UC-MSCs geïsoleerd van UC.
    10. Snijd de UC in stukken van 2-3 mm met een gesteriliseerde schaar en pincet (Zie Figuur 1, stap 2).
      Opmerking: Dit proces duurt ongeveer 30 min.
    11. Incubeer de UC-stukken bij 37 ° C gedurende 30 minuten in een 5% CO2 incubator.
    12. Snij de stukken UC gedeeltelijk verteerd in kleinere stukken die gemakkelijk doorstromen naar een precisiepipet 25 mL.
      Opmerking: Dit proces duurt ongeveer 30 min.
    13. Incubeer de kleinere UC stukken bij 37 ° C gedurende 15-45 min. in een 5% CO2 incubator.
      Opmerking: Incubatie moet blijven totdat de homogenates viskeuze geworden. De totale spijsvertering tijd is ongeveer 120 min. In het geval van het gebruik van UCs van te vroeg geboren baby, echter kan de spijsvertering-tijd worden verkort omdat die gemakkelijk kunnen worden gesneden en verteerd.
  3. UC-MSCs isoleren.
    1. Vier 50 mL plastic buizen en een fles 500 mL gestolde voedingsbodem voorbereiden.
    2. Verdeel de UC homogenaat in twee 50 mL plastic buizen met behulp van een precisiepipet 25 mL met ongeveer 7,5 mL in elke buis.
    3. Voeg 20 mL gestolde voedingsbodem in elke buis en meng goed.
    4. Elke UC homogenaat wordt gefiltreerd door een zeef van 100 µm cel geplaatst bovenop een nieuwe 50 mL collectie buis, met behulp van een precisiepipet 25 mL voor het verzamelen van UC-afgeleide cellen.
      Opmerking: Dit proces duurt ongeveer 15 minuten elk, zoals de verteerd UC-oplossing kleverig is.
    5. Centrifugeer twee buizen bij 1.000 x g gedurende 5 min.
    6. Zorgvuldig de bovendrijvende substantie gecombineerd en verwerpen.
    7. Resuspendeer de cel pellets in twee buizen met 5 mL gestolde voedingsbodem.
    8. Spoel de celsuspensie in een nieuwe 60 mm plaat en cultuur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator (Zie Figuur 1, stap 3).
  4. Cultuur UC-MSCs.
    1. Opwarmen van de PBS, trypsine-EDTA (0,25 w/v%), en cultuur medium (alpha MEM met 10% FBS en 1% AA) aan RT.
    2. Wanneer cellen zijn gekoppeld aan de plaat van een 60 mm, verwijdert u het kweekmedium en wassen met 5 mL PBS tweemaal te verwijderen van puin en rode bloedcellen.
      Opmerking: Gekoppelde cellen verschijnen meestal 3-5 dagen na de eerste platen (Zie Figuur 1, stap 4).
    3. Vervang het kweekmedium tweemaal per week en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator tot 90-100% confluentie.
      Opmerking: Dit duurt meestal 7-14 dagen na de eerste beplating.
    4. Cellen met 5 mL PBS tweemaal wassen, Voeg 0,5 mL trypsine-EDTA en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
    5. Wanneer cellen worden afgerond en vrijstaand, voeg 9 mL gestolde voedingsbodem en meng goed tot de inactivering van trypsine.
    6. Spoel de celsuspensie in een nieuwe 100 mm plaat en cultuur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator (Zie Figuur 1, stap 5).
    7. Vervang het kweekmedium tweemaal per week en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator tot 90-100% confluentie.
      Opmerking: Dit duurt meestal 4-8 dagen na de eerste beplating.
    8. Cellen met 10 mL PBS tweemaal wassen, voeg 1 mL trypsine-EDTA en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
    9. Wanneer cellen worden afgerond en vrijstaand, voeg 9 mL gestolde voedingsbodem en meng goed tot de inactivering van trypsine.
    10. Spoel de celsuspensie in twee nieuwe 100 mm platen en cultuur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator (Zie Figuur 1, stap 5).
    11. Herhaal subcultuur (1:2 splits) tot tiende passage (Zie Figuur 1, stap 5).
      Opmerking: Omdat cellen gekweekt onder minder confluente voorwaarden de neiging om eerdere arrestatie van proliferatie te bereiken, is het belangrijk op passage cellen met een splitsingsverhouding van 1:2.
    12. Cellen bij vijfde tot achtste passage gebruiken voor de analyse van de oppervlakte marker van de cel, cel differentiatie assay en andere experimenten.
      Opmerking: Om te houden van de krachtige proliferatie voor zo lang mogelijk, worden de cellen in het algemeen gekweekt onder meer dan 70-80% confluente voorwaarden.

2. oppervlakte Marker uitdrukking van UC-MSCs

  1. Bereiden van cellen in een 100 mm plaat en distantiëren ze met 1 mL trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5-10 min.
  2. 9 mL gestolde voedingsbodem en centrifuge toevoegen bij 1.000 x g gedurende 5 min.
  3. De bovendrijvende substantie gecombineerd en verwerpen.
  4. Resuspendeer de cel pellets met 10 mL PBS en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min. Herhaal deze wassen stap tweemaal.
  5. Resuspendeer de cellen met stroom cytometry (FCM) buffer (PBS met 2 mM EDTA en 10% blokkerende reagens) ~ 1 × 106 cellen/ml.
  6. Pipetteer van 50-100 µL celsuspensie in een tube van 1,5 mL; toevoegen van phycoerythrin (PE)-geconjugeerde antilichamen tegen CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 of HLA-DR; en uit te broeden op ijs voor 45 min.
  7. Wash cellen met FCM buffer tweemaal en voeg 50-100 µL van 0,2% levensvatbaarheid kleurstof-oplossing (Zie Tabel van materialen).
  8. Incubeer bij RT gedurende 15 min, wassen cellen met FCM buffer tweemaal en filter cellen door een zeef van de cel 70 µm.
  9. Cellen doorlopen met de FCM en analyseren van de verkregen resultaten met behulp van FCM software volgens de instructies van de fabrikant.

3. Trilineage differentiatie van UC-MSCs

  1. Uitvoeren van adipogenesis.
    1. Bereid een celsuspensie in een kweekvloeistof bij een concentratie van 5 × 10-3 cellen/mL.
    2. 1 mL celsuspensie in een 12-well plaat plaat en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor ~ 24 h.
    3. Vervang het kweekmedium met adipogenic differentiatie medium (Zie Tabel van materialen) en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 2-3 weken. Wijzigen adipogenic differentiatie gemiddeld twee keer per week.
    4. Spoel de cellen met PBS driemaal.
    5. Incubeer de cellen in 4% formaldehyde oplossing voor 30 min op RT.
    6. Spoel de cellen met PBS driemaal en met 60% isopropanol driemaal.
    7. 0,5% olie rood O oplossing voor te bereiden door het oplossen van 84 mg olie rood O in 10 mL 100% isopropanol en toevoeging van 6,7 mL gedestilleerd water. Vlek cellen met 1 mL van 0,5% olie rood O oplossing bij RT voor 20 min.
    8. Spoel de cellen met 60% isopropanol driemaal en visualiseer onder een microscoop.
  2. Osteogenesis uitvoeren
    1. Bereid een celsuspensie in een kweekvloeistof bij een concentratie van 1 × 104 cellen/mL.
    2. 1 mL celsuspensie in een 12-well plaat plaat en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor ~ 24 h.
    3. Vervang het kweekmedium met osteogeneic differentiatie medium (Zie Tabel van materialen) en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 1-2 weken. Wijzigen osteogenic differentiatie gemiddeld twee keer per week.
    4. Spoel de cellen met PBS driemaal.
    5. Incubeer de cellen in 4% formaldehyde oplossing voor 30 min op RT.
    6. Spoel de cellen met PBS driemaal.
    7. Bereiden van 2% Alizarine rode S-oplossing door ontbinding van 200 mg Alizarine rood S met 10 mL gedestilleerd water. Vlek cellen met 1 mL 2% Alizarine rode S-oplossing op RT gedurende 3 minuten.
    8. Was de putjes met PBS driemaal en visualiseer onder een microscoop.
  3. Uitvoeren van chondrogenesis.
    1. Bereid een celsuspensie in een kweekvloeistof bij een concentratie van 1,6 × 107 cellen/mL.
    2. Een droplet 5 µL van celsuspensie plaats in het midden van het goed in een 12-well plaat (micromass culturen) en Incubeer bij 37 ° C in een broedstoof 5% CO2 gedurende 2-3 uur.
    3. Voeg voorzichtig 1 mL van chondrogenic differentiatie medium (Zie Tabel van materialen) en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 4-7 dagen. Wijzigen chondrogenic differentiatie gemiddeld twee keer per week.
    4. Spoel de cellen met PBS driemaal.
    5. Incubeer de cellen in 4% formaldehyde oplossing voor 30 min op RT.
    6. Spoel de cellen met PBS driemaal.
    7. Bereid 0.05% toluïdine blauwe oplossing door ontbinding van 250 mg toluïdine blauw met 500 mL 0,1 M natrium acetaat buffer met pH 4.1. Vlek cellen met 1 mL van 0,05% toluïdine blauwe oplossing bij RT voor 30 min.
    8. Spoel de cellen met PBS driemaal en visualiseer onder een microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De procedures uit UC collectie aan MSC cultuur worden samengevat in Figuur 1. UC van ongeveer 5-10 cm in lengte kan worden verzameld van alle pasgeborenen geleverd door keizersnede. UC begint te ontwikkelen op 4-8 weken van de dracht en blijft groeien tot 50-60 cm in lengte, zoals weergegeven in Figuur 2. Er zijn twee slagaders (A), één ader (V), snoer voering (CL) en Wharton van Jelly (WJ) in UC, zoals afgebeeld in Figuur 3 en 4 van de figuur. UC-MSCs kunnen worden geïsoleerd uit alle snoer regio's of hele snoer13. Omdat UC van zuigelingen met jonge zwangerschapsduur leeftijd breekbaar en moeilijk voor dissectie in een regio één snoer is, zijn UC-MSCs geïsoleerd uit hele snoer11,12. Er zijn verschillende methoden om te isoleren MSCs van UC, waaronder de explant methode14 en enzymatische spijsvertering methode15, plus hun derivaten-16. Dankzij de langere cultuur cyclus, lagere opbrengst en eerdere proliferatie arrestatie gekoppeld aan de explant methode17,18, worden UC-MSCs gekweekt door enzymatische spijsvertering methode zoals geïllustreerd in Figuur 5 en Figuur 6.

De minimale criteria voor de vaststelling van de MSCs worden vastgesteld door de ISCT en hun oppervlakte marker karakterisering19omvatten. Om te bepalen oppervlakte marker expressie, zijn UC-MSCs van vroeggeboorte en termijn zuigelingen geïncubeerd met passende PE-geconjugeerde antilichamen en geanalyseerd door stroom cytometry. Ze zijn positief voor MSC handtekening markeringen (CD73, CD90, CD105) maar negatief voor monocyt/macrofaag (CD14), endotheel (CD34), hematopoietische (CD19, CD45), en grote histocompatibility complex (HLA-DR) markers, zoals weergegeven in Figuur 7.

Volgens de ISCT criteria19, moet MSC mesodermal differentiatie capaciteit beoordeeld door een trilineage differentiatie assay bezitten. Om te beoordelen trilineage differentiatie capaciteit, worden UC-MSCs van vroeggeboorte en termijn zuigelingen veroorzaakt om te differentiëren in osteocytes, adipocytes en chondrocyten voorwaarden standaard in vitro differentiatie. Zoals aangetoond in Figuur 8, zijn ze goed gedifferentieerde in alle drie soorten mesodermal cellen.

Figure 1
Figuur 1 : Schematisch diagram van de isolatie en de cultuur van UC-MSCs. Stap 1. 5-10 cm van UC verzameld aseptisch uit weefsel van de placenta. Stap 2. Gezuiverde enzym mix-verteerd UC stukken. Stap 3. Cultuur van UC-MSCs bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Stap 4. Bijgevoegde UC-MSCs verscheen op 3 dagen na de eerste beplating. Stap 5. Subcultuur van UC-MSCs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : UC uit foetussen/zuigelingen geleverd op verschillende zwangerschapsduur leeftijd. UCs uit foetussen/zuigelingen op 19-38 weken van de dracht worden weergegeven. De grootte van UC neemt toe met de zwangerschapsduur. Schaal bars = 8 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Aanzicht van UC van vroeggeboorte en termijn zuigelingen. Er zijn twee slagaders (A), één ader (V), snoer voering (CL) en Wharton van Jelly (WJ) in UC van vroeggeboorte en termijn zuigelingen. De grootte van deze weefsels zijn afhankelijk van de zwangerschapsduur leeftijd. Schaal bars = 2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Anatomie van UC. (A) 5 cm van UC vanaf de term zuigeling. (B) doorsnede van UC. (C) ontleed gedeeltelijk UC. Er zijn twee slagaders (A), één ader (V), snoer voering (CL) en Whalton van Jelly (WJ). UC uit zuigelingen eerder zwangerschapsduur leeftijd is bijzonder kwetsbare en moeilijk te worden ontleed. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : UC dissectie met behulp van gezuiverde enzym overvloeiingen. (A) 5-10 cm van UC. (B) 2-3 mm stukken van UC. (C) enzym mix-verteerd UC stukken gezuiverd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Morfologie van UC-MSCs van vroeggeboorte en termijn zuigelingen. (A en E) UC-MSCs op passage nummer 1 (P1) voor de vervanging van kweekmedium (A: X40; E: X200). (B en F) UC-MSCs bij P1 na de vervanging van kweekmedium (B: X40; F: X200). (C en G) UC-MSCs op P3 (C: X40; G: X200). (D en H) UC-MSCs op P5 (D: X40; H: X200). Schaal bars = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Oppervlakte marker uitdrukking van UC-MSCs van vroeggeboorte en termijn zuigelingen. CD73/CD90/CD105-positieve en CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-negatieve fenotypen gevonden in UC-MSCs van zowel de vroeggeboorte (22 weken zwangerschap) en de termijn (37 weken zwangerschap) zuigelingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8 : De mesenchymale differentiatie van de Trilineage van UC-MSCs van vroeggeboorte en termijn zuigelingen. UC-MSCs van vroeggeboorte (22 weken zwangerschap) en term (37-40 weken zwangerschap) zuigelingen zijn onderscheid gemaakt tussen adipocyte (gevisualiseerde door rode O olie), Osteocyt (gevisualiseerd door Alizarine rood S), en chondrocyten (gevisualiseerd door toluïdine blauw). Beelden werden genomen op 200 x. Schaal bars = 50 µm. Een deel van dit bedrag is aangepast van Iwatani et al.11Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MSCs kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan weefsels en heterogene populatie vormen van cellen die niet alle express de dezelfde fenotypische markers doen. We beschreven hier, een protocol dat het verzamelen en de dissectie van UC van vroeggeboorte en termijn zuigelingen begeleidt en maakt isolatie en cultuur van UC-MSCs. Naar aanleiding van dit protocol, hebben we met succes geïsoleerd UC-MSCs die voldoen aan de ISCT criteria19 uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht en heeft duidelijk gemaakt dat zij bepaalde aspecten van hardnekkige ziekte pathofysiologie vertegenwoordigen tijdens de prenatale ontwikkeling11,12.

In BM afkomstige MSCs (BM-MSCs), jongere donor afkomstige BM-MSCs over het algemeen groter proliferatieve en differentiative potentieel dan oudere collega's Toon en houd meer mogelijkheden voor cel therapie20,21. Evenzo werden premature UC-MSCs geïsoleerd uit foetussen afgebroken op 8-12 weken van de dracht gemeld om krachtiger proliferatie en differentiatie ten opzichte van term UC-MSCs geïsoleerd van pasgeborenen geleverd op 37-40 weken van de dracht22tentoon te stellen. Ondanks de verschillen in zwangerschapsduur en snoer regio bleek UC-MSCs geïsoleerd met dit protocol ook een krachtiger wildgroei van premature UC-MSCs dan term UC-MSCs12.

Een kritieke stap binnen dit protocol is de UC-dissectie met gezuiverde enzym mengsels die zijn samengesteld uit collagenase I en II en dispase. Zoals uiteengezet in de representatieve resultaten, wordt de stijfheid van UC dramatisch afgewisseld met de zwangerschapsduur (Figuur 2). Om te bereiken optimale dissectie van UC, combineert de incubatietijd van gezuiverde enzym behoeften aan te passen aan de stijfheid van de individuele UC. In het algemeen, het duurt meestal langer voor termijn UC dan premature UC. Onder de bestaande methoden te isoleren MSCs van UC, kiezen we de enzymatische spijsvertering methode15 over de explant methode14 die tot een langere cyclus van de cultuur, lagere opbrengst en eerdere proliferatie arrestatie-17,18 leiden kunnen. Een belangrijke aanpassing van het enzym spijsvertering methode is het gebruik van gezuiverde enzym mengsels in plaats van traditionele collagenase, waardoor een efficiënte en consistente dissectie van UC uit foetussen/zuigelingen met variabele zwangerschapsduur leeftijd.

Een beperking van dit protocol is het gebruik van hele koord te isoleren MSCs van UC. Omdat UC-MSCs geïsoleerd uit alle snoer regio's of hele snoer13 worden kunnen, zijn UC-MSCs geïsoleerd uit hele snoer in dit protocol. Dit is te wijten aan de haalbaarheid van UC dissectie van te vroeg geboren baby. Echter, de potentiële variatie in het percentage van elke regio snoer kan beperken de strikte vergelijking tussen UC-MSCs geïsoleerd door dit protocol.

UC-MSCs worden steeds vaker wordt gebruikt als een bron van mesenchymale stromale cellen voor preklinische en klinische studies8,9. Ondanks deze verhoogd gebruik ontbreekt een consensus over de methoden van UC-MSCs isolatie nog, die kan resulteren in andere cel populaties worden geacht de dezelfde UC-MSCs. Dit protocol zal uiteindelijk onderzoekers helpen bij het beter begrijpen de afleiding en functionele kenmerken van UC-MSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Grants-in-Aid voor Scientific Research (C) (verlenen van nummer: 25461644) en jonge wetenschappers (B) (verlenen van nummers: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) van JSPS KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6, (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9, (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2, (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25, (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43, (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6, (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16, (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13, (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91, (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35, (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65, (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17, (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97, (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12, (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22, (17), 2425-2439 (2013).
Isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter