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Developmental Biology

Isolement et caractérisation des humains provenant du cordon ombilical cellules souches mésenchymateuses de prématurés et les nouveau-nés à terme

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

Cordon ombilical humain (UC) peuvent être obtenu au cours de la période périnatale à la suite de terme prématuré et postterm de livraison. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC dérivées de cellules souches mésenchymateuses (UC-MSCs) du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.

Abstract

Cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont un potentiel thérapeutique considérable et susciter un intérêt croissant dans le domaine biomédical. MSCs sont initialement isolés et caractérisés de la moelle osseuse (BM), puis acquis de tissus, y compris le tissu adipeux, membrane synoviale, peau, pulpe dentaire et appendices fœtales comme le placenta, cordon ombilical (UCB) et du cordon ombilical (UC). MSCs sont une population hétérogène de cellules ayant la capacité (1) l’adhérence sur plastique dans des conditions de culture standard, expression du marqueur (2) surface de CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34/CD14 /CD19 Phénotypes /HLA-DR et (3) trilineage différenciation en adipocytes et ostéocytes chondrocytes, tel qu’il est définis par la société internationale pour la thérapie cellulaire (ISCT). Bien que BM est la source plus largement utilisée de MSCs, le caractère invasif d’aspiration BM limite éthiquement son accessibilité. Capacité de prolifération et la différenciation de MSCs provenant de la BM en général diminuent avec l’âge du donateur. En revanche, MSCs fœtales obtenues UC possèdent des avantages tels que la prolifération vigoureuse et capacité de différenciation. Il n’y a aucun souci éthique pour l’échantillonnage de l’UC, car elle est généralement considérée comme les déchets médicaux. UC humaine commence à se développer avec la croissance de la cavité amniotique à 4-8 semaines d’âge gestationnel continue et continue de croître jusqu'à atteindre 50 à 60 cm de longueur, et il peut être isolé pendant le délai de livraison tout nouveau-né. Pour mieux comprendre la physiopathologie des maladies incurables, nous avons utilisé des dérivés UC MSCs (UC-MSCs) de nourrissons livrés à divers âges gestationnels. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC-MSCs du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.

Introduction

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Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont initialement isolés et caractérisé de la moelle osseuse (BM)1,2 mais peut également être obtenues d’une grande variété de tissus, y compris le tissu adipeux, membrane synoviale, peau, pulpe dentaire et appendices foetales 3. MSCs sont reconnus comme une population de cellules hétérogènes qui peut proliférer et se différencier en adipocytes et ostéocytes chondrocytes. En outre, MSCs possèdent la capacité de migrer vers des sites de blessures, de réprimer et de moduler les réponses immunitaires et remodeler et de réparer la blessure. Actuellement, MSCs provenant de différentes sources ont suscité un intérêt croissant comme source pour la thérapie cellulaire contre un certain nombre de maladies incurables, dont graft - versus - host disease, infarctus du myocarde et infarctus cérébral4,5 .

Bien que BM est la source plus bien caractérisée de MSCs, l’empiétement que constitue l’aspiration BM limite éthiquement son accessibilité. Capacité de prolifération et la différenciation de MSCs provenant de la BM en général diminuent avec l’âge du donateur. En revanche, MSCs foetales provenant de foetus appendices comme le placenta, le sang de cordon ombilical (UCB), et du cordon ombilical (UC) ont des avantages, y compris des préoccupations moins éthiques concernant l’échantillonnage et robuste de la prolifération et la différenciation capacité6 , 7. parmi foetales appendices qui sont habituellement mis au rebut comme déchets médicaux, UCB et UC sont considérés comme un organe fœtal, tandis que le placenta est considéré comme des pathologies. En outre, placenta et UCB doivent être échantillonnés et collectées au moment de la livraison de nouveaux-nés, alors que le placenta et l’UC peuvent être collectées et traitées après la livraison de nouveaux-nés. En conséquence, l’UC est une source prometteuse de MSC pour cell therapy8,9.

UC humaine commence à se développer avec l’expansion progressive de la cavité amniotique à 4-8 semaines de gestation, ne cesse de croître jusqu'à 50-60 cm de longueur et peut être isolé pendant toute la durée de livraison nouveau-né10. Pour mieux comprendre la physiopathologie des maladies incurables, nous utilisons des dérivés UC MSCs (UC-MSCs) de nourrissons livrés à divers âges gestationnels11,12. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler et caractériser des UC-MSCs du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.

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Protocol

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L’utilisation d’échantillons humains pour cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de Kobe University Graduate School of Medicine (agrément n° 1370 et 1694) et conformes aux principes directeurs adoptés.

1. isolement et Culture des UC-MSCs

Remarque : UC-MSCs ont été correctement isolées, cultivées, et élargie (plus de numéro de passage 4) de plus de 200 UCs soumis au présent protocole. Parmi plus de 200 UCs, 100 % ont montré des réussite de l’isolement UC-MSC, moins de 5 % ont montré une contamination accidentelle, de moins de 15 % ont montré l’arrestation de croissance, et plus de 80 % ont montré l’expansion réussie de UC-MSC.

  1. Recueillir des UC.
    1. Préparez un tube en plastique de 50 mL, un ciseaux aseptique et une bouteille de 500 mL d’alpha aigle modifié minimales essentielles (alpha MEM) à 4 ° C.
    2. Découper les UC avec un ciseaux chirurgicaux avec environ 5-10 cm de longueur de façon aseptique et ramasser peu après la naissance de nouveaux-nés par césarienne.
    3. Ensuite, placez l’UC dans un tube en plastique de 50 mL et ajouter 20 à 30 mL d’alpha MEM dans le tube.
    4. Stocker l’UC à température ambiante (RT) jusqu'à ce qu’il est transporté au laboratoire.
      Remarque : Aseptique UC peut être stocké dans un milieu sans sérum à ta pendant 2 jours. Par conséquent, UC obtenu à partir des hôpitaux voisins peut être collecté, s’il est remis au laboratoire dans les 2 jours.
  2. Disséquer les UC.
    1. Préparer un plateau en plastique, stérilisés ciseaux et pinces, pipettes de 10 mL, pipettes de 25 mL, deux boîtes de culture de tissus de 60 mm, une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), enzyme purifiée se mélange (voir Table des matières, reconstitué avec du PBS stérile dans une concentration Wünsch 13 unités/ml et conservés à-80 ° C) et une bouteille de 500 mL de milieu de sérum réduit (voir Table des matières).
    2. Réchauffer le PBS, mélanges de l’enzyme purifiée, moyen de sérum réduit et de culture moyen [alpha MEM contenant 10 % bovin sérum fœtal (SVF) et 1 % solution antibiotique-antimycosiques (AA) conservés à 4 ° C] RT.
    3. Sortez de l’UC du tube et le placer dans un plateau en plastique.
    4. Peser et disséquer les 5 g de l’UC avec un ciseaux stérilisé.
    5. Verser 10 mL d’éthanol à 70 % sur le UC pour la stérilisation à l’aide d’une pipette 10 mL.
    6. Laver le UC avec 10 mL de PBS deux fois à l’aide d’une pipette 10 mL.
    7. Placer l’UC dans un plat de vitroplants stérilisé 60 mm (voir Figure 1, étape 1).
    8. Ajouter 10 mL de milieu de sérum réduit dans le plat.
    9. Ajouter 0,5 mL d’enzyme purifiée mélanges pour atteindre une concentration finale d’environ 0,62 Wünsch unités/mL.
      Remarque : L’utilisation des mélanges enzyme purifiée au lieu de collagénase traditionnelle a été établie afin d’améliorer le rendement et la viabilité des UC-MSCs isolé de l’UC.
    10. Couper l’UC en morceaux de 2-3 mm avec des ciseaux stérilisés et pinces (voir la Figure 1, étape 2).
      Remarque : Ce processus prend environ 30 min.
    11. Incuber les morceaux d’UC à 37 ° C pendant 30 min dans un incubateur à2 CO 5 %.
    12. Couper les morceaux UC partiellement digérés en petits morceaux qui circulent facilement dans une pipette 25 mL.
      Remarque : Ce processus prend environ 30 min.
    13. Incuber les petits morceaux d’UC à 37 ° C pendant 15 à 45 min dans un incubateur à2 CO 5 %.
      Remarque : L’incubation doit continuer jusqu'à ce que les homogénats deviennent visqueux. Le temps de digestion totale est environ 120 min. Dans le cas à l’aide de UCs de prématurés, cependant, le temps de digestion peut être raccourci parce que ceux qui sont facilement couper et digérées.
  3. Isoler le UC-MSCs.
    1. Préparer quatre tubes en plastique de 50 mL et une bouteille de 500 mL de milieu de culture.
    2. Diviser l’homogénat UC en deux tubes en plastique de 50 mL à l’aide d’une pipette 25 mL, avec environ 7,5 mL dans chaque tube.
    3. Ajouter 20 mL de milieu de culture dans chaque tube et bien mélanger.
    4. Filtrer chaque UC l’homogénat à travers un tamis de cellule de 100µm placé au dessus d’un nouveau tube de prélèvement de 50 mL, à l’aide d’une pipette 25 mL à prélever des cellules dérivées de UC.
      Remarque : Ce processus prend environ 15 min chacun, comme la solution UC digérée est collante.
    5. Centrifuger les deux tubes à 1 000 x g pendant 5 min.
    6. Soigneusement, aspirer le surnageant et jetez-le.
    7. Remettre en suspension les granules cellulaires dans deux tubes avec 5 mL de milieu de culture.
    8. Transférer la suspension cellulaire dans une nouvelle plaque de 60 mm et de la culture à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % (voir la Figure 1, échelon 3).
  4. La culture UC-MSCs.
    1. Réchauffer le PBS, la trypsine-EDTA (0,25 w/v%) et de culture moyen (alpha MEM contenant 10 % de SVF et 1 % de AA) RT.
    2. Quand les cellules sont fixés sur une plaque de 60 mm, enlever le milieu de culture et laver avec 5 mL de PBS deux fois pour enlever les débris et les globules rouges.
      Remarque : Les cellules attachées apparaissent habituellement 3-5 jours après l’ensemencement initial (voir la Figure 1, étape 4).
    3. Remplacer le milieu de culture deux fois par semaine et incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % jusqu'à la confluence de 90 à 100 %.
      Remarque : Cela prend généralement 7 à 14 jours après l’ensemencement initial.
    4. Laver les cellules avec 5 mL de PBS, ajouter 0,5 mL de trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C pendant 5-10 min.
    5. Quand les cellules deviennent arrondis et détaché, ajouter 9 mL de milieu de culture et bien mélanger pour inactiver la trypsine.
    6. Transférer la suspension cellulaire dans une nouvelle plaque de 100 mm et de la culture à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % (voir la Figure 1, échelon 5).
    7. Remplacer le milieu de culture deux fois par semaine et incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % jusqu'à la confluence de 90 à 100 %.
      Remarque : Cela prend habituellement 4 à 8 jours après l’ensemencement initial.
    8. Laver les cellules avec 10 mL de PBS deux fois, ajouter 1 mL de trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C pendant 5-10 min.
    9. Quand les cellules deviennent arrondis et détaché, ajouter 9 mL de milieu de culture et bien mélanger pour inactiver la trypsine.
    10. Transférer la suspension cellulaire dans deux nouvelles plaques de 100 mm et de la culture à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % (voir la Figure 1, échelon 5).
    11. Répétez la sous-culture (1:2 splits) jusqu’au dixième passage (voir Figure 1, échelon 5).
      Remarque : Puisque les cellules mises en culture dans des conditions moins confluentes tendent à atteindre arrestation antérieure de prolifération, il est important de cellules de passage avec un rapport de 1:2 split.
    12. Utiliser des cellules au passage de la cinquième à la huitième pour l’analyse de marqueurs de surface de cellules, dosage de la différenciation des cellules et d’autres expériences.
      Remarque : Pour garder la prolifération vigoureuse pour aussi longtemps que possible, les cellules sont généralement cultivées dans plus de 70-80 % conditions confluentes.

2. surface Marker Expression de UC-MSCs

  1. Préparer les cellules dans une plaque de 100 mm et se dissocient les avec 1 mL de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 5-10 min.
  2. Ajouter 9 mL de milieu de culture et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min.
  3. Aspirer le surnageant et jetez-le.
  4. Remettre en suspension les granules cellulaires avec 10 mL de PBS et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min. Répétez cette étape de laver deux fois.
  5. Remettre en suspension les cellules avec un tampon écoulement cytometry (FCM) (PBS contenant 2 mM EDTA et réactif de blocage de 10 %) à ~ 1 × 106 cellules/mL.
  6. Transférer 50-100 µL de suspension de cellules dans un tube de 1,5 mL ; ajouter la phycoérythrine (PE)-conjugués anticorps contre CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 ou HLA-DR ; et incuber sur glace pendant 45 min.
  7. Laver les cellules avec FCM tampon deux fois et ajouter 50-100 µL de solution de colorant de viabilité 0,2 % (voir la Table des matières).
  8. Incuber à RT pendant 15 minutes, laver les cellules avec tampon FCM deux fois et les cellules de filtre à travers un tamis de cellule de 70 µm.
  9. Exécuter des cellules par l’intermédiaire de la FCM et d’analyser les résultats obtenus à l’aide de logiciels FCM selon les instructions du fabricant.

3. Trilineage différenciation des UC-MSCs

  1. Effectuer l’adipogenèse.
    1. Préparer une suspension de cellules dans un milieu de culture à une concentration de 5 × 103 cellules/mL.
    2. Plaque 1 mL de suspension cellulaire dans une plaque de 12 puits et incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % ~ 24 h.
    3. Remplacer le milieu de culture avec un moyen de différenciation adipocytaire (voir Table des matières) et incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 2 à 3 semaines. Changer de moyen de différenciation adipocytaire deux fois par semaine.
    4. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
    5. Incuber les cellules dans une solution de formaldéhyde de 4 % pendant 30 min à température ambiante.
    6. Laver les cellules avec du PBS trois fois et avec de l’isopropanol 60 % trois fois.
    7. Préparer la solution à 0,5 % huile rouge O en dissolvant 84 mg d’huile rouge O dans 10 mL d’isopropanol 100 % et en ajoutant les 6,7 mL d’eau distillée. Colorer les cellules avec 1 mL de solution de O de l’huile rouge de 0,5 % à RT pendant 20 min.
    8. Laver les cellules avec de l’isopropanol 60 % trois fois et visualiser au microscope.
  2. Effectuer l’ostéogenèse.
    1. Préparer une suspension de cellules dans un milieu de culture à une concentration de 1 × 104 cellules/mL.
    2. Plaque 1 mL de suspension cellulaire dans une plaque de 12 puits et incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % ~ 24 h.
    3. Remplacer le milieu de culture avec osteogeneic moyen de différenciation (voir Table des matières) et incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 1 à 2 semaines. Changer de moyen de différenciation ostéogénique deux fois par semaine.
    4. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
    5. Incuber les cellules dans une solution de formaldéhyde de 4 % pendant 30 min à température ambiante.
    6. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
    7. Préparer une solution d’alizarine S 2 % en dissolvant 200 mg de l’alizarine rouge S 10 ml d’eau distillée. Colorer les cellules avec 1 mL de solution d’alizarine S une solution 2 % à RT pendant 3 min.
    8. Laver trois fois les loges avec du PBS et visualiser au microscope.
  3. Effectuer chondrogenèse.
    1. Préparer une suspension de cellules dans un milieu de culture à une concentration de 1,6 × 107 cellules/mL.
    2. Placez une goutte de 5 µL de suspension cellulaire vers le centre du puits dans une plaque de 12 puits (micromass cultures) et incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 2-3 h.
    3. Doucement ajouter 1 mL de milieu de différenciation chondrogéniques (voir Table des matières) et incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 4 à 7 jours. Changer de moyen de différenciation chondrogéniques deux fois par semaine.
    4. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
    5. Incuber les cellules dans une solution de formaldéhyde de 4 % pendant 30 min à température ambiante.
    6. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
    7. Préparer 0,05 % solution de bleu de toluidine en dissolvant 250 mg de bleu de toluidine avec 500 mL de tampon d’acétate de sodium 0,1 M pH 4,1. Colorer les cellules avec 1 mL de solution de bleu de toluidine de 0,05 % à RT pendant 30 min.
    8. Laver les cellules avec du PBS trois fois et visualiser au microscope.

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Representative Results

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Les procédures de collecte de l’UC à la culture MSC sont résumées dans la Figure 1. UC d’environ 5-10 cm de longueur peut être prélevé sur tous les nouveaux-nés par césarienne. UC commence à se développer à 4-8 semaines de gestation et ne cesse de croître jusqu'à 50-60 cm de longueur, comme illustré à la Figure 2. Il existe deux artères (A), une veine (V), doublure de cordon (CL) et gelée de Wharton (WJ) en UC, comme illustré à la Figure 3 et Figure 4. UC-MSCs peuvent être isolées de toutes les régions de corde ou cordon entier13. UC de bébés qui ont des âges gestationnels précoces étant fragile et difficile pour la dissection dans une région unique cordon, UC-MSCs sont isolés du cordon entier11,12. Il existe plusieurs méthodes pour isoler les MSCs de UC, qui comprennent la méthode de l’explant14 et digestion enzymatique méthode15, ainsi que leurs dérivés16. En raison du plus long cycle de culture, rendement plus faible et arrestation de prolifération antérieure associée à l’explant méthode17,18, UC-MSCs sont cultivées par méthode de digestion enzymatique comme illustré dans la Figure 5 et Figure 6.

Les critères minimes pour définir MSCs sont établis par l’ISCT et comprennent leur caractérisation de marqueurs de surface19. Pour déterminer l’expression du marqueur de surface, UC-MSCs de nouveau-nés prématurés et à terme sont incubées avec des anticorps conjugués PE et analysés par cytométrie en flux. Ils sont positifs pour les marqueurs de signature MSC (CD73, CD90, CD105) mais négatif pour les monocytes/macrophages (CD14), endothéliales (CD34), hématopoïétiques (CD19, CD45) et marqueurs de (HLA-DR) complexes majeur d’histocompatibilité, comme illustré à la Figure 7.

Selon les critères ISCT19, MSC doit posséder la capacité de différenciation mésodermiques évaluée par un test de différenciation trilineage. Pour évaluer la capacité de différenciation trilineage, UC-MSCs de nouveau-nés prématurés et à terme sont amenées à se différencier en ostéocytes, les adipocytes et les chondrocytes dans standard in vitro les conditions de la différenciation. Comme illustré à la Figure 8, ils sont bien différenciés dans les trois types de cellules mésodermiques.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de principe d’isolement et culture des UC-MSCs. Étape 1. 5-10 cm de UC prélevé aseptiquement tissu placentaire. Étape 2. Enzyme purifiée digérés mélange UC morceaux. Étape 3. Culture de UC-MSCs à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %. Étape 4. UC-MSCs ci-joint est apparu 3 jours après l’ensemencement initial. Étape 5. Repiquage des UC-MSCs. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : UC du foetus/les enfants livrés à divers âges gestationnels. UCs de foetus/nourrissons à 19-38 semaines de gestation sont indiqués. La taille de l’UC augmente avec l’âge gestationnel. Barreaux de l’échelle = 8 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Vue en coupe de nouveau-nés prématurés et à terme de UC. Il y a deux artères (A), une veine (V), doublure de cordon (CL) et gelée de Wharton (WJ) en UC des nouveau-nés prématurés et à terme. Les tailles de ces tissus varient avec l’âge gestationnel. Barreaux de l’échelle = 2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Anatomie de UC. (A) 5 cm de l’UC du terme infantile. (B) coupe transversale de l’UC. (C) partiellement disséqués UC. Il existe deux artères (A), une veine (V), doublure de cordon (CL) et gelée (WJ de Whalton). UC de nourrissons de plus tôt l’âge gestationnel est particulièrement fragile et difficile à être disséqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Dissection de UC à l’aide de mélanges de l’enzyme purifiée. (A) 5-10 cm de l’UC. (B) les morceaux de 2-3 mm de UC. (C) purifié des morceaux UC mélange digestion enzymatique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Morphologie des UC-MSCs de nouveau-nés prématurés et à terme. (A et E) UC-MSCs au passage 1 (P1) avant le remplacement du milieu de culture (A: X40 ; E: X200). (B et F) UC-MSCs P1 après le remplacement du milieu de culture (r : X40 ; F: X200). (C et G) UC-MSCs à P3 (C: X40 ; G: X200). (D et H) UC-MSCs à P5 (D: X40 ; H: X200). Barreaux de l’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Expression du marqueur de UC-MSCs de surface de nouveau-nés prématurés et à terme. CD73/CD90/CD105-positif et phénotypes CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-négatives sont trouvent dans UC-MSCs de naissances prématurées (22 semaines de gestation) et les nouveau-nés à terme (37 semaines de gestation). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Trilineage mésenchymateuse différenciation des UC-MSCs de nouveau-nés prématurés et à terme. UC-MSCs de naissances prématurées (22 semaines de gestation) et les nouveau-nés à terme (37 à 40 semaines de gestation) sont différenciées en adipocytes (visualisées par huile O rouge), ostéocytaires (visualisée par alizarine S rouge) et des chondrocytes (visualisée par le bleu de toluidine). Des images ont été prises à 200 x. Barreaux de l’échelle = 50 µm. Une partie de ce chiffre a été adaptée de Iwatani et al.11S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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MSCs peuvent être isolés dans une variété de tissus et sont une population hétérogène de cellules qui font express pas tous les mêmes marqueurs phénotypiques. Ici, nous avons décrit un protocole qui les guides de la collection et la dissection des UC de nouveau-nés prématurés et à terme et permet l’isolement et la culture de UC-MSCs. Suite à ce protocole, nous avons isolé avec succès UC-MSCs qui remplissent les critères ISCT19 de foetus/les enfants livrés à 19 à 40 semaines de gestation et démontré qu’ils représentent certains aspects de la physiopathologie de la maladie réfractaire au cours du développement prénatal11,12.

Dérivé de BM MSCs (BM-MSCs), dérivé de donateurs plus jeunes BM-MSCs généralement montrent un plus grand potentiel de prolifération et de différenciation que homologues plus âgés et tenir plus de potentiel pour cell therapy20,21. De même, prématurés UC-MSCs isolés provenant de foetus avortés à 8-12 semaines de gestation ont été signalés à exposer plus vigoureux de prolifération et de différenciation par rapport à terme UC-MSCs isolés des nouveaux-nés à 37 à 40 semaines de gestation,22. Malgré les différences de l’âge gestationnel et de la région de cordon, UC-MSCs isolés avec ce protocole a également révèlent une prolifération plus vigoureuse des nouveau-nés prématurés UC-MSCs à terme UC-MSCs12.

Une étape cruciale dans ce protocole est la dissection UC avec des mélanges d’enzymes purifiées qui sont composés de collagénase I et II et a. Comme indiqué dans les résultats représentatifs, la rigidité des UC a varié considérablement avec l’âge gestationnel (Figure 2). Pour réaliser la dissection optimale des UC, le temps d’incubation de l’enzyme purifiée mélanges doit être ajustée à la rigidité de l’UC individuel. Généralement, il faut habituellement plus longue pour terme UC que UC prématuré. Parmi les méthodes existantes afin d’isoler les MSCs de UC, nous avons choisi la méthode de digestion enzymatique15 au fil de l’explant méthode14 pouvant conduire à un plus long cycle de culture, rendement inférieur et antérieur prolifération arrestation17,18. Une importante modification de la méthode de digestion enzymatique est l’utilisation des mélanges enzyme purifiée au lieu de collagénase traditionnel, ce qui permet une dissection efficace et cohérente de l’UC du foetus/bébés qui ont des âges gestationnels variables.

Une limitation de ce protocole est l’utilisation du cordon entier d’isoler MSCs de UC. Parce que UC-MSCs peuvent être isolées de toutes les régions de corde ou cordon entier13, UC-MSCs sont isolées de cordon entier dans le présent protocole. Cela est dû à la faisabilité de dissection de l’UC de chez les nouveau-nés prématurés. Cependant, la variation potentielle dans la proportion de chaque région de cordon peut limiter la comparaison stricte entre UC-MSCs isolé par le présent protocole.

UC-MSCs sont plus en plus utilisés comme source de cellules stromales mésenchymateuses études précliniques et cliniques8,9. Malgré cette utilisation accrue, un consensus sur les méthodes d’isolement de l’UC-MSCs est toujours porté disparu, ce qui peut entraîner différentes populations cellulaires pour être considérés comme les mêmes UC-MSCs. Ce protocole sera finalement aider les chercheurs à mieux comprendre la dérivation et les caractéristiques fonctionnelles des UC-MSCs.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions pour Scientific Research (C) (numéro de licence : 25461644) et de jeunes scientifiques (B) (accorder des numéros : 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) de JSPS KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

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References

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Isolement et caractérisation des humains provenant du cordon ombilical cellules souches mésenchymateuses de prématurés et les nouveau-nés à terme
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Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

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