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Developmental Biology

Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

Menschlichen Nabelschnur (UC) erhalten Sie während der Perinatalperiode durch Frühgeburt, Begriff und postterm Lieferung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-mesenchymale Stammzellen (UC-MSCs) von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

Abstract

Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) haben erhebliches therapeutische Potenzial und zunehmendes Interesse im Bereich Biomedizin zu gewinnen. MSCs sind ursprünglich isoliert und charakterisiert, die aus dem Knochenmark (BM), dann gewonnenen Gewebe, wie Fettgewebe, Synovialis, Haut, Zahnpulpa und fetalen Anhängseln wie Plazenta, Nabelschnurblut (UCB) und Nabelschnur (UC). MSCs sind eine heterogene Zellpopulation mit einer Kapazität für (1) die Einhaltung Kunststoff in standard Kulturbedingungen, (2) Oberfläche Marker Ausdruck CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34/CD14/CD19 /HLA-DR Phänotypen, und (3) Trilineage Differenzierung in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten, wie Sie derzeit von der internationalen Gesellschaft für zelluläre Therapie (ISCT) definiert. Obwohl BM die am weitesten verbreitete Quelle der MSCs ist, schränkt die invasive Art des Strebens BM ethisch seiner Zugänglichkeit. Proliferation und Differenzierung Kapazität von MSCs von BM erhalten in der Regel nimmt mit dem Alter des Spenders. Im Gegensatz dazu haben fetalen MSCs UC gewonnenen Vorteile wie kräftige Proliferation und Differenzierung Kapazität. Da es in der Regel als medizinische Abfälle gilt, gibt es keine ethischen Bedenken für UC Probenahme. Menschlichen UC mit anhaltenden Wachstum des Fruchtwassers Hohlraums bei 4 bis 8 Wochen der Schwangerschaft zu entwickeln beginnt und hält bis zu 50-60 cm in der Länge wachsen, und es kann während der gesamten Neugeborenen Lieferzeit isoliert werden. Um einen Einblick in die Pathophysiologie der hartnäckigen Krankheiten, haben wir UC abgeleitet MSCs (UC-MSCs) vom Säugling geliefert in verschiedenen gestational Alter verwendet. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-MSCs aus Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

Introduction

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Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind ursprünglich isoliert und charakterisiert aus dem Knochenmark (BM)1,2 aber erhalten Sie auch bei einer Vielzahl von Geweben einschließlich Fettgewebe, Synovialis, Haut, Zahnpulpa und fetalen Anhängsel 3. MSCs sind anerkannt als eine heterogene Zellpopulation, die sich vermehren und in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten differenzieren kann. Darüber hinaus MSCs besitzen die Fähigkeit, migrieren auf Seiten der Verletzung, zu unterdrücken und zu modulieren, Immunantworten, umgestalten und Verletzungen zu reparieren. MSCs aus verschiedenen Quellen haben derzeit wachsendes Interesse als Quelle für die Zelltherapie gegen eine Reihe von hartnäckigen Krankheiten, einschließlich Graft - Versus - Host-Seuche, Myokardinfarkt und Hirninfarkt4,5 angezogen .

Obwohl BM die meisten gut-gekennzeichneten Quelle der MSCs ist, schränkt die Invasivität der BM Aspiration ethisch seiner Zugänglichkeit. Proliferation und Differenzierung Kapazität von MSCs von BM erhalten in der Regel nimmt mit dem Alter des Spenders. Im Gegensatz dazu fetalen MSCs aus fetalen Anhängseln wie Plazenta und Nabelschnurblut (UCB), und Nabelschnur (UC) haben Vorteile, einschließlich weniger ethische Bedenken hinsichtlich Probenahme und robuste Proliferation und Differenzierung Kapazität6 , 7. unter fetalen Anhängsel, die in der Regel als medizinischer Abfall entsorgt werden, UCB und UC sind als eine fetale Orgel, während Plazenta Fetomaternal gilt. Darüber hinaus müssen Plazenta und UCB abgetastet und auf den genauen Zeitpunkt der Neugeborenen Lieferung erhoben, während Plazenta und UC gesammelt und nach der Neugeborenen Lieferung verarbeitet werden kann. UC ist eine vielversprechende MSC-Quelle für Zelle Therapie8,9.

Menschlichen UC mit fortschreitenden Ausbau der Fruchtblase Hohlraum 4-8 Wochen der Schwangerschaft zu entwickeln beginnt, wächst weiter bis 50-60 cm in der Länge und kann während der gesamten Laufzeit des Neugeborenen Lieferung10isoliert werden. Um einen Einblick in die Pathophysiologie der hartnäckigen Krankheiten, verwenden wir UC abgeleitet MSCs (UC-MSCs) vom Säugling bei verschiedenen gestational Alter11,12geliefert. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zu isolieren und zu charakterisieren UC-MSCs aus Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

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Protocol

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Die Verwendung von humanen Proben für diese Studie wurde von der Ethikkommission der Kobe University Graduate School of Medicine (Zulassungs-Nr. 1370 und 1694) genehmigt und im Einklang mit den genehmigten Richtlinien.

1. Isolierung und Kultur der UC-MSCs

Hinweis: UC-MSCs wurden erfolgreich isoliert, kultiviert, und erweitert (mehr als Durchgangsnummer 4) von mehr als 200 BKS ausgesetzt zu diesem Protokoll. Unter mehr als 200 BKS, 100 % haben gezeigt erfolgreiche UC-MSC-Isolierung, weniger als 5 % haben zufällige Kontaminierung gezeigt, weniger als 15 % Wachstum Verhaftung gezeigt haben, und mehr als 80 % haben erfolgreichen UC-MSC Expansion gezeigt.

  1. UC zu sammeln.
    1. Bereiten Sie eine 50 mL-Kunststoff-Rohr, eine aseptische Scheren und einen 500-mL-Flasche von Alpha modifiziert Adlers minimale wesentliche Medium (Alpha MEM) bei 4 ° C.
    2. Aseptisch UC mit einer chirurgischen Schere bei ca. 5-10 cm in der Länge schneiden Sie aus und sammeln Sie es bald nach der Neugeborenen Geburt durch Kaiserschnitt.
    3. Sofort setzen Sie die UC in 50 mL Kunststoffhülse und 20-30 mL Alpha MEM in die Röhre.
    4. Speichern Sie die UC bei Raumtemperatur (RT), bis es ins Labor transportiert wird.
      Hinweis: Aseptische UC kann bis zu 2 Tage in serumfreien Medium bei RT aufbewahrt werden. Daher kann UC erhalten von den benachbarten Krankenhäusern gesammelt werden, wenn es ins Labor innerhalb von 2 Tagen geliefert wird.
  2. UC zu sezieren.
    1. Bereiten Sie eine Plastikschale, sterilisierte Scheren und Pinzetten, Pipetten 10 mL, 25 mL Pipetten, zwei 60 mm Gewebekultur Schalen, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), gereinigtes Enzym verbindet (siehe Tabelle der Materialien, rekonstituiert mit sterilen PBS in einer Konzentration von 13 Wünsch Einheiten/mL und bei-80 ° C gelagert), und eine 500 mL Flasche reduzierte Serum-Medium (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Aufwärmen der PBS, gereinigtes Enzym mischt, Serum, und Kultur Medium [alpha MEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Antibiotikum antimykotische Lösung (AA) bei 4 ° C gelagert] auf RT reduziert
    3. Nehmen Sie die UC aus der Tube und legen Sie sie in eine Plastikschale.
    4. Wiegen und 5 g UC mit einer sterilisierten Schere zu sezieren.
    5. Die UC für die Sterilisation mit einer 10 mL-Pipette übergießen Sie 10 mL 70 % igem Ethanol.
    6. Waschen Sie die UC mit 10 mL PBS zweimal mit einer 10 mL-Pipette.
    7. Die UC in der Kulturschale sterilisierte 60 mm Gewebe zu platzieren (siehe Abbildung 1, Schritt 1).
    8. Fügen Sie 10 mL Medium reduzierte Serum in die Schüssel.
    9. Fügen Sie 0,5 mL gereinigtes Enzym-Mischungen, eine Endkonzentration von etwa 0,62 Wünsch Einheiten/mL zu erreichen.
      Hinweis: Die Verwendung von gereinigten Enzyms Mischungen anstelle von traditionellen Kollagenase wurde gezeigt, um den Ertrag zu verbessern und Lebensfähigkeit der UC-MSCs von UC isoliert.
    10. Schneiden Sie die UC in 2-3 mm Stücke, mit sterilisierten Schere und Zange (siehe Abbildung 1, Schritt 2).
      Hinweis: Dieser Vorgang dauert etwa 30 Minuten.
    11. Inkubieren Sie die UC-Stücke bei 37 ° C für 30 min in einem 5 % CO2 Inkubator.
    12. Schneiden Sie die teilweise verdaut UC-Stücke in kleinere Stücke, die leicht durch einen 25-mL-Pipette fließen.
      Hinweis: Dieser Vorgang dauert etwa 30 Minuten.
    13. Inkubieren Sie die kleineren Stücke der UC bei 37 ° C für 15-45 min in einem 5 % CO2 Inkubator.
      Hinweis: Inkubation muss weiterhin, bis die Homogenates zähflüssig geworden. Die gesamte Dauer der Verdauung ist ca. 120 Minuten. Im Falle der Verwendung von UCs von Frühgeborenen, kann jedoch die Aufschlusszeit gekürzt werden, weil die leicht geschnitten und verdaut werden.
  3. UC-MSCs zu isolieren.
    1. Bereiten Sie vier 50 mL-Kunststoff-Rohre und eine Flasche 500 mL Kulturmedium.
    2. Teilen Sie die UC-Homogenat in zwei 50 mL Kunststoffrohre mit einen 25-mL-Pipette mit ca. 7,5 mL in jedem Röhrchen auf.
    3. 20 mL Kulturmedium in jedes Rohr hinzufügen und gut verrühren.
    4. Filtern Sie jeder UC-Homogenat durch ein 100 µm Zelle Sieb platziert ein neues 50 mL Sammelröhrchen, mit einer 25 mL-Pipette, um UC-abgeleitete Zellen zu sammeln.
      Hinweis: Dieser Vorgang dauert ca. 15 min., da die verdaute UC-Lösung klebrig ist.
    5. Zentrifugieren Sie zwei Röhren bei 1.000 x g für 5 min.
    6. Vorsichtig aspirieren Sie überstand und entsorgen.
    7. Die Zelle-Pellets in zwei Röhren mit 5 mL Kulturmedium aufzuwirbeln.
    8. Die Zellsuspension in eine neue 60 mm Platte und Kultur bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator zu übertragen (siehe Abbildung 1, Schritt 3).
  4. UC-MSCs Kultur.
    1. PBS, Trypsin-EDTA (0,25 w/v%), Aufwärmen und Kultur Medium (Alpha MEM mit 10 % FBS und 1 % AA), RT
    2. Wenn Zellen mit einer 60 mm Platte angeschlossen sind, entfernen das Kulturmedium und waschen mit 5 mL PBS zweimal, um Schmutz und roten Blutkörperchen zu entfernen.
      Hinweis: Angeschlossene Zellen erscheinen in der Regel 3-5 Tage nach anfänglichen Beschichtung (siehe Abbildung 1, Schritt 4).
    3. Ersetzen Sie das Kulturmedium zweimal pro Woche und Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator bis 90-100 % Konfluenz.
      Hinweis: Dies dauert in der Regel 7-14 Tage nach der ersten Beschichtung.
    4. Zellen mit 5 mL PBS zweimal waschen, 0,5 mL Trypsin-EDTA hinzufügen und bei 37 ° C für ca. 5-10 min inkubieren.
    5. Wenn Zellen werden gerundet und losgelöst, 9 mL Kulturmedium hinzufügen und gut verrühren, Trypsin zu inaktivieren.
    6. Die Zellsuspension in eine neue 100 mm Platte und Kultur bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator zu übertragen (siehe Abbildung 1, Schritt 5).
    7. Ersetzen Sie das Kulturmedium zweimal pro Woche und Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator bis 90-100 % Konfluenz.
      Hinweis: Dies dauert in der Regel 4-8 Tage nach der ersten Beschichtung.
    8. Waschen Sie Zellen mit 10 mL PBS zweimal, fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA und bei 37 ° C für ca. 5-10 min inkubieren.
    9. Wenn Zellen werden gerundet und losgelöst, 9 mL Kulturmedium hinzufügen und gut verrühren, Trypsin zu inaktivieren.
    10. Die Zellsuspension in zwei neuen 100 mm Platten und Kultur bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator zu übertragen (siehe Abbildung 1, Schritt 5).
    11. Subkultur (1:2 Splits) bis zehnten Durchgang zu wiederholen (siehe Abbildung 1, Schritt 5).
      Hinweis: Da Zellen kultiviert unter weniger konfluierende Bedingungen neigen dazu, frühere Verbreitung Verhaftung zu erreichen, ist es wichtig, Durchgang Zellen mit einem Split-Verhältnis von 1:2.
    12. Verwenden Sie Zellen in der fünften bis achten Passage für Zelle Oberfläche Markeranalyse, Zelle Differenzierung Assay und andere Experimente.
      Hinweis: Um die starke Verbreitung so lange wie möglich zu halten, sind Zellen in der Regel unter mehr als 70-80 % konfluierende Bedingungen kultiviert.

2. Oberfläche Marker Ausdruck der UC-MSCs

  1. Bereiten Sie Zellen in einem 100 mm-Platte und mit 1 mL Trypsin-EDTA bei 37 ° C für ca. 5-10 min distanzieren.
  2. 9 mL Kulturmedium und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min zugeben.
  3. Den Überstand abgesaugt und entsorgen.
  4. Die Zelle-Pellets mit 10 mL PBS Aufschwemmen und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min. wiederholen waschen zweimal.
  5. Aufzuwirbeln Sie Zellen mit Flow Cytometry (FCM) Puffer (PBS mit 2 mM EDTA und 10 % blockierende Reagenzien) ~ 1 × 106 Zellen/ml.
  6. 50-100 µL Zellsuspension in ein 1,5 mL Röhrchen zu übertragen; Hinzufügen von Phycoerythrin (PE)-konjugierten Antikörpern gegen CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 oder HLA-DR; und inkubieren Sie für 45 min auf Eis.
  7. Wash-Zellen mit FCM doppelt gepuffert und fügen Sie 50-100 µL 0,2 % Lebensfähigkeit Farbstofflösung (siehe Tabelle der Materialien).
  8. Bei inkubieren Sie RT 15 min waschen Zellen mit FCM Puffer zweimal und Filterzellen durch ein Sieb 70 µm Zelle.
  9. Der FCM Zellen durchlaufen und die erzielten Ergebnisse mit FCM-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers zu analysieren.

3. Trilineage Differenzierung der UC-MSCs

  1. Durchführen Sie angereizte.
    1. Bereiten Sie eine Zellsuspension in Kulturmedium in einer Konzentration von 5 × 103 Zellen/mL.
    2. Platte 1 mL Zellsuspension in einem 12-Well-Platte und Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator für ~ 24 h.
    3. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit adipogenen Differenzierung Medium (siehe Tabelle der Materialien) und 2-3 Wochen bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator inkubieren. Adipogenen Differenzierung Medium zweimal wöchentlich gewechselt.
    4. Waschen Sie Zellen mit PBS dreimal.
    5. Inkubieren Sie Zellen in 4 % Formaldehyd-Lösung für 30 min bei RT
    6. Waschen Sie Zellen mit PBS dreimal und mit 60 % Isopropanol dreimal.
    7. Bereiten Sie 0,5 % Öl rot O Lösung durch Auflösen von 84 mg Öl rot O in 10 mL 100 % Isopropanol und Hinzufügen von 6,7 mL destilliertem Wasser. Zellen mit 1 mL 0,5 % rot O Öllösung bei RT für 20 min. Fleck.
    8. Zellen mit 60 % Isopropanol dreimal waschen und unter dem Mikroskop zu visualisieren.
  2. Durchführen Sie Osteogenesis.
    1. Bereiten Sie eine Zellsuspension in Kulturmedium in einer Konzentration von 1 × 104 Zellen/mL.
    2. Platte 1 mL Zellsuspension in einem 12-Well-Platte und Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator für ~ 24 h.
    3. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit Osteogeneic Differenzierung Medium (siehe Tabelle der Materialien) und 1-2 Wochen bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator inkubieren. Osteogene Differenzierung Medium zweimal wöchentlich gewechselt.
    4. Waschen Sie Zellen mit PBS dreimal.
    5. Inkubieren Sie Zellen in 4 % Formaldehyd-Lösung für 30 min bei RT
    6. Waschen Sie Zellen mit PBS dreimal.
    7. Bereiten Sie 2 % rote Alizarin S-Lösung durch Auflösen von 200 mg von Alizarin Rot S mit 10 mL destilliertem Wasser. Führen Sie Zellen mit 1 mL 2 % rote Alizarin S Lösung bei RT 3 min zu Flecken.
    8. Dreimal mit PBS waschen und unter dem Mikroskop zu visualisieren.
  3. Durchführen Sie werden.
    1. Bereiten Sie eine Zellsuspension in Kulturmedium in einer Konzentration von 1,6 × 107 Zellen/mL.
    2. Einen Tropfen 5 µL Zellsuspension auf der Mitte der Brunnen in einem 12-Well-Platte (Micromass Kulturen) und Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator für 2-3 h.
    3. Sanft fügen Sie 1 mL Chondrogenic Differenzierung Medium (siehe Tabelle der Materialien) und 4-7 Tage bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator inkubieren. Chondrogenic Differenzierung Medium zweimal wöchentlich gewechselt.
    4. Waschen Sie Zellen mit PBS dreimal.
    5. Inkubieren Sie Zellen in 4 % Formaldehyd-Lösung für 30 min bei RT
    6. Waschen Sie Zellen mit PBS dreimal.
    7. Bereiten Sie 0,05 % Toluidin blau Lösung durch Auflösen von 250 mg Toluidin blau mit 500 mL 0,1 M Natrium-Acetat-Puffer mit pH 4,1. Zellen mit 1 mL 0,05 % Toluidin blau Lösung bei RT für 30 min. Fleck.
    8. Zellen mit PBS dreimal waschen und unter dem Mikroskop zu visualisieren.

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Representative Results

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Die Verfahren von UC Sammlung MSC Kultur sind in Abbildung 1zusammengefasst. UC von ca. 5-10 cm Länge kann alle Neugeborenen geliefert per Kaiserschnitt abgeholt werden. UC beginnt bei 4 bis 8 Wochen der Schwangerschaft entwickeln und wächst weiter bis 50-60 cm in der Länge, wie in Abbildung 2dargestellt. Es gibt zwei Arterien (A), eine Vene (V), Kabel-Futter (CL) und Wharton Gelee (WJ) in UC, wie in Abbildung 3 und Abbildung 4dargestellt. UC-MSCs können von allen Kabel-Regionen oder ganze Kabel13isoliert werden. Da UC von Säuglingen mit frühen gestational Alter anfällig und schwierig für Dissektion zu einer einzigen Schnur-Region ist, sind UC-MSCs isoliert vom ganzen Kabel11,12. Es gibt mehrere Methoden, MSCs von UC, die modellabhängigen Methode14 und enzymatische Verdauung Methode15sowie deren Derivate16gehören zu isolieren. Aufgrund der längeren Kultur-Zyklus, geringere Ausbeute und früheren Verbreitung Verhaftung verbunden mit dem modellabhängigen Methode17,18sind UC-MSCs durch enzymatische Verdauung Methode wie in Abbildung 5 und kultiviert. Abbildung 6.

Die minimale Kriterien für die Definition von MSCs werden durch die ISCT festgelegt und umfassen ihre Oberfläche Marker Charakterisierung19. UC-MSCs von Frühgeborenen und Begriff Säuglinge sind Surface Marker Ausdruck feststellen, mit entsprechenden PE-konjugierten Antikörpern inkubiert und durch Durchflusszytometrie analysiert. Sie sind positiv für MSC-Signatur-Marker (CD73, CD90, CD105) aber negativ für Monocyte/Makrophagen (CD14), Endothelzellen (CD34), hämatopoetischen (CD19, CD45) und großen Histocompatibility complex (HLA-DR) Marker, wie in Abbildung 7dargestellt.

Nach der ISCT Kriterien19muss MSC mesodermalen Differenzierung Kapazität anhand einer Trilineage Differenzierung Assay besitzen. Um Trilineage Differenzierung Kapazität zu bewerten, UC-MSCs von Frühgeborenen und Begriff Säuglingen induziert, in Osteozyten, Adipozyten und Chondrozyten Bedingungen standard in-vitro- Differenzierung zu unterscheiden. Wie in Abbildung 8gezeigt, sind sie in alle drei Arten von mesodermalen Zellen gut differenziert.

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Isolation und der Kultur der UC-MSCs. Schritt 1. 5-10 cm von UC abgeholt aseptisch plazentaren Gewebes. Schritt 2. Gereinigtes Enzym Mischung verdaut UC Stücke. Schritt 3. Kultur der UC-MSCs bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator. Schritt 4. Beigefügten UC-MSCs erschienen 3 Tage nach der ersten Beschichtung. Schritt 5. Subkultur der UC-MSCs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : UC von Föten/Säuglingen geliefert in verschiedenen gestational Alter. BKS aus Föten/Kleinkinder in der Woche 19-38 werden angezeigt. Die Größe des UC steigt mit fortschreitender. Skalieren von Balken = 8 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : UC-Schnittansicht von Frühgeborenen und Begriff Säuglingen. Es gibt zwei Arterien (A), eine Vene (V), Kabel-Futter (CL) und Wharton Gelee (WJ) in UC von Frühgeborenen und Begriff Säuglingen. Die Größen dieser Gewebe variieren mit gestational Alter. Skalieren von Balken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Anatomie des UC. (A) 5 cm von UC vom Begriff Kleinkind. (B) Querschnitt von UC. (C) seziert teilweise UC. Es gibt zwei Arterien (A), eine Vene (V), Kabel-Futter (CL) und Whalton Gelee (WJ). UC von Säuglingen früher gestational Alters ist besonders empfindlich und schwer zu seziert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : UC Dissektion mit gereinigten Enzyms Mischungen. (A) ca. 5-10 cm von UC. (B) 2-3 mm Stücke von UC. (C) gereinigtes Enzym Mischung verdaut UC Stücke. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Morphologie der UC-MSCs von Frühgeborenen und Begriff Säuglingen. (A und E) UC-MSCs Durchgang Nummer 1 (P1) vor dem Austausch des Kulturmediums (A: X40; E: X200). (B und F) UC-MSCs auf P1 nach dem Austausch des Kulturmediums (B: X40; F: X200). (C und G) UC-MSCs auf P3 (C: X40; G: X200). (D und H) UC-MSCs auf P5 (D: X40; H: X200). Skalieren von Balken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Surface Marker Ausdruck der UC-MSCs von Frühgeborenen und Begriff Säuglingen. CD73/CD90/CD105-Positive CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-Negative Phänotypen in UC-MSCs von Frühgeborenen (22 Schwangerschaftswoche) und langfristig (37 Wochen Schwangerschaft) Kleinkinder befinden und. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8 : Trilineage mesenchymalen Differenzierung der UC-MSCs von Frühgeborenen und Begriff Säuglingen. UC-MSCs von Frühgeborenen (22 Schwangerschaftswoche) und langfristig (Schwangerschaftswoche 37-40) Kleinkinder unterscheiden sich in Adipocyte (visualisiert durch Öl rot O), Osteocyte (von Alizarin visualisiert Rot S), und Knorpelzelltransplantation (visualisiert durch Toluidin blau). Bilder wurden bei 200 X. Skalieren von Balken = 50 µm. Ein Teil dieser Figur wurde von Iwatani Et Al.11angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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MSCs können aus einer Vielzahl von Geweben isoliert und sind heterogene Bevölkerung der Zellen, die nicht alle Express derselben phänotypischer Marker tun. Wir beschrieben hier, eine Protokoll, die leitet die Sammlung und sezieren von UC von Frühgeborenen und Begriff Säuglingen und Isolation und Kultur der UC-MSCs ermöglicht. Nach diesem Protokoll haben wir erfolgreich UC-MSCs isoliert, die erfüllen die ISCT Kriterien19 von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft geliefert und gezeigt, dass sie einige Aspekte der Pathophysiologie der hartnäckigen Krankheit darstellen während der pränatalen Entwicklung11,12.

In BM abgeleitet MSCs (BM-MSCs) jüngere Spender abgeleitet BM-MSCs im Allgemeinen zeigen größere proliferative und differentiative Potenzial als älteren Kollegen und halten mehr Potenzial für die Zelle Therapie20,21. Ebenso wurden Frühgeborenen UC-MSCs isoliert von Föten zu 8-12 Wochen der Schwangerschaft abgebrochen gemeldet, energischer Proliferation und Differenzierung im Vergleich zum Begriff UC-MSCs isoliert von Neugeborenen bei 37-40 Wochen der Schwangerschaft22geliefert auszustellen. Trotz der Unterschiede in Gestationsalter und Schnur Region UC-MSCs isoliert mit diesem Protokoll auch eine stärkere Verbreitung von Frühgeborenen UC-MSCs als Begriff UC-MSCs12gezeigt.

Ein wichtiger Schritt innerhalb dieses Protokolls ist die UC-Dissektion gereinigtes Enzym-Mischungen, die Kollagenase, bestehend aus I und II und Dispase. Wie in die repräsentativen Ergebnisse dargelegt, variiert die Steifigkeit des UC dramatisch mit fortschreitender (Abbildung 2). Um optimale Dissektion der UC zu erreichen, verbindet die Inkubationszeit des gereinigten Enzyms muss auf die Steifigkeit des einzelnen UC angepasst werden. Es dauert in der Regel längere Amtszeit als Frühgeburt UC UC. Unter den vorhandenen Methoden, MSCs von UC zu isolieren wählen wir die enzymatische Verdauung Methode15 über die modellabhängigen Methode14 , die eine längere Kultur-Zyklus, geringere Ausbeute und früheren Verbreitung Verhaftung17,18führen kann. Eine wichtige Änderung der Enzym-Verdauung-Methode ist die Verwendung von gereinigten Enzyms Mischungen anstelle von traditionellen Kollagenase, ermöglicht eine effiziente und einheitliche Dissektion der UC von Föten/Säuglinge mit variabler gestational Alter.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Verwendung von ganzen Schnur, MSCs von UC zu isolieren. Da alle Kabel Regionen oder ganze Kabel13UC-MSCs isoliert werden können, sind UC-MSCs ganze Kabel in diesem Protokoll isoliert. Dies ist auf die Machbarkeit der UC Dissektion von Frühgeborenen. Die mögliche Variation des Anteils jeder Schnur Region schränken jedoch die strengen Vergleich zwischen UC-MSCs isoliert durch dieses Protokoll.

UC-MSCs sind zunehmend als eine Quelle von mesenchymalen Zellen Stromazellen für präklinische und klinische Studien8,9eingesetzt. Trotz dieser erhöhten Nutzung fehlt ein Konsens über die Methoden der UC-MSCs Isolation, unterschiedliche Zellpopulationen gelten die gleichen UC-MSCs führen kann. Dieses Protokoll wird letztlich Forscher bei der Ableitung und funktionellen Eigenschaften der UC-MSCs besser zu verstehen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid für Scientific Research (C) (Gewährungsnummer: 25461644) und junge Wissenschaftler (B) (Nummern zu gewähren: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) von JSPS KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

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References

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Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff
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Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

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