Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

בידוד ואפיון של האדם נגזר הטבור בתאי גזע Mesenchymal של לידה מוקדמת ותינוקות המונח

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

חבל הטבור אנושי (UC) ניתן להשיג במהלך תקופת הלידה כתוצאה מונח לידה מוקדמת, ולאחר postterm משלוח. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את בידוד ואפיון של UC-derived בתאי גזע mesenchymal (UC-MSCs) מן העוברים/תינוקות בגיל 19-40 שבועות של הריון.

Abstract

גזע mesenchymal (MSCs) יש הפוטנציאל הטיפולי ניכרת ולמשוך עניין גובר בתחום הביו-רפואי. MSCs הן במקור מבודדים מ מח עצם (מוניטור) ואז שנרכשה מן הרקמות כולל רקמת שומן, synovium, עור, שיניים זולה של תוספות בעובר השיליה, כגון דם טבורי (UCB), ושל חבל הטבור (UC). MSCs הם אוכלוסיה הטרוגנית תא עם יכולת הדבקות (1) פלסטיק בתנאים סטנדרטיים תרבות, סמן (2) משטח הביטוי של CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34/CD14 /CD19 פנוטיפים /HLA-DR , בידול trilineage (3) לתוך adipocytes, osteocytes, chondrocytes, כיום שהוגדרו על-ידי האגודה הבינלאומית עבור טיפול הסלולר (ISCT). אמנם המקור הנפוצה ביותר של MSCs מוניטור, העיקרון החודרני של מוניטור השאיפה מגביל אתית הנגישות שלה. יכולת התפשטות ובידול של MSCs המתקבל מוניטור בדרך כלל ירידה של גיל התורם. לעומת זאת, העובר MSCs המתקבל UC יש יתרונות כגון התפשטות נמרצת וקיבולת בידול. אין שום חשש מוסרי UC דגימה, בדרך כלל נחשב פסולת רפואית. UC האנושי מתחיל לפתח עם המשך צמיחה של חלל מי השפיר 4-8 שבועות של הריון, ממשיך לגדול עד שהגיע 50-60 ס מ אורך, וזה יכול להיות מבודדת במהלך תקופת משלוח כל יילוד. כדי לזכות בתובנה הפתופיזיולוגיה של מחלות עיקשות, השתמשנו UC-derived MSCs (UC-MSCs) מן התינוקות הנולדים בגילאים שונים הריונית. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את בידוד ואפיון של UC-MSCs מן העוברים/תינוקות בגיל 19-40 שבועות של הריון.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

גזע mesenchymal (MSCs) במקור מבודדים, מאופיין של מח העצם (מוניטור)1,2 אבל ניתן להשיג ממגוון רחב של רקמות לרבות רקמת שומן, synovium, עור, שיניים זולה תוספות עוברית 3. MSCs מזוהים אוכלוסיה הטרוגנית התא יכול להתרבות, להבדיל לתוך adipocytes, osteocytes ו- chondrocytes. בנוסף, MSCs להחזיק את היכולת להעביר אל אתרי הפציעה, לדכא, לווסת את תגובות מערכת החיסון, ו לשפץ ולתקן פציעה. כיום, MSCs ממקורות שונים משכו עניין הולך וגובר כמקור לטיפול תא נגד מספר מחלות עיקשות, לרבות שתל – מול – מארח מחלות, אוטם מוחי4,5 .

אמנם המקור הכי מאופיין היטב של MSCs מוניטור, invasiveness של מוניטור השאיפה מגביל אתית הנגישות שלה. יכולת התפשטות ובידול של MSCs המתקבל מוניטור בדרך כלל ירידה של גיל התורם. לעומת זאת, העובר MSCs המתקבל עוברית תוספות כגון שליה, דם טבורי (UCB), ואת חבל הטבור (UC) יש יתרונות כולל פחות אתית חששות לגבי התפשטות מדגם וחזק ובידול קיבולת6 , 7. בין תוספות בעובר זה יימחקו בדרך כלל כאל פסולת רפואית, UCB, UC נחשבים איבר בעובר, בעוד השליה נחשב fetomaternal. בנוסף, השליה ו- UCB צריכים להיות שנדגמו, שנאספו ברגע המדויק של היילוד משלוח, ואילו השליה, UC ניתן לאסוף ולהשתמש מעובד לאחר הלידה היילוד. בהתאם לכך, UC הוא מקור MSC מבטיח תא טיפול8,9.

UC האנושי מתחיל לפתח עם הרחבה הדרגתית של חלל מי השפיר 4-8 שבועות של ההיריון, ממשיך לגדול עד 50-60 ס מ אורך, ניתן לבודד במהלך כל תקופת היילוד משלוח10. כדי לזכות בתובנה הפתופיזיולוגיה של מחלות עיקשות, אנו משתמשים UC-derived MSCs (UC-MSCs) מן התינוקות הנולדים הריונית בגילאים שונים11,12. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד ולאפיין UC-MSCs מן העוברים/תינוקות בגיל 19-40 שבועות של הריון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השימוש האנושי דגימות במחקר זה היה אושרו על ידי הוועדה האתית של קובי לתואר שני בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת (אישור מס ' 1370 ו 1694), לפי ההנחיות שאושרו.

1. בידוד והתרבות של UC-MSCs

הערה: UC-MSCs היו מבודדים בהצלחה, תרבותי, ונחשפו המורחב (יותר מאשר מעבר מספר 4) של יותר מ-200 UCs פרוטוקול זה. בין יותר מ-200 UCs, 100% הראו הבידוד מוצלח UC-MSC, פחות מ-5% הראו זיהום בשוגג, פחות מ- 15% הראו צמיחה מעצר, יותר מ- 80% הראו הרחבה UC-MSC מוצלחת.

  1. לאסוף UC.
    1. הכן צינור פלסטיק 50 מל, מספריים aseptic ולאחר בקבוק 500 מ"ל של אלפא שונה המינימום חיוני בינוני רשנה (אלפא MEM) ב 4 º C.
    2. גילוח ורחיצה כירורגית לגזור UC עם מספריים כירורגיים כ 5-10 ס"מ אורך ולאסוף אותה לאחר הלידה היילוד בניתוח קיסרי.
    3. מיד למקם את ה-UC צינור פלסטיק 50 מל ולהוסיף 20-30 מ של אלפא MEM לתוך הצינור.
    4. אחסן את ה-UC בטמפרטורת החדר (RT) עד שהוא מועבר למעבדה.
      הערה: ניתן לאחסן aseptic UC במדיום נטול סרום-RT עד 2 ימים. לכן, ניתן לאסוף UC המתקבל חולים השכן אם היא מועברת למעבדה תוך יומיים.
  2. לנתח UC.
    1. הכנת מגש פלסטיק, מעוקר פיפטות מספריים ומלקחיים, פיפטות 10 מ"ל, 25 מ ל 60 מ מ שתי תרביות רקמה מנות, באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), האנזים מטוהרים תערובות (ראה טבלה של חומרים, מחדש עם סטרילי PBS בריכוז של יחידות Wünsch 13/mL ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס), בקבוק 500 מ"ל מופחת סרום בינוני (ראה טבלה של חומרים).
    2. לחמם PBS, אנזים מטוהרים תערובות, מופחת סרום בינוני, בינוני תרבות [אלפא MEM המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS) ו 1% אנטיביוטיקה-antimycotic פתרון (AA) המאוחסנים ב 4 ° C] כדי RT.
    3. להוציא את ה-UC מהצינור ולמקם אותו מגש פלסטיק.
    4. שוקל ומנתחים 5 גר' UC עם מספריים מעוקר.
    5. שופכים 10 מ"ל אתנול 70% UC עבור עיקור באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
    6. לשטוף את ה-UC עם 10 מ"ל של PBS פעמיים באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
    7. הכנס את ה-UC תבשיל תרביות רקמה סטיריליים 60 מ מ (ראה איור 1, שלב 1).
    8. להוסיף 10 מ של מדיום מופחת סרום לתוך קערה.
    9. להוסיף 0.5 מ ל אנזים מטוהרים תערובות להגיע ריכוז סופי של 0.62 Wünsch יחידות/mL.
      הערה: השימוש של תערובות אנזימים מטוהרים במקום המסורתי collagenase הוכח לשפר את התשואה, הכדאיות של UC-MSCs מבודד UC.
    10. לחתוך את UC לחתיכות של 2-3 מ מ עם מספריים סטיריליים וחדים (ראה איור 1, שלב 2).
      הערה: תהליך זה לוקח בערך 30 דקות.
    11. דגירה החלקים UC ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחממה2 CO 5%.
    12. לחתוך את החלקים UC מעוכל חלקית לחתיכות קטנות יותר הזורמות בקלות באמצעות פיפטה 25 מ.
      הערה: תהליך זה לוקח בערך 30 דקות.
    13. דגירה חתיכות קטנות של UC ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15-45 דקות בחממה2 CO 5%.
      הערה: המודל הפסיכוסקסואלי # שלב צריך להמשיך עד homogenates הופכים צמיגה. הזמן העיכול הכולל הוא כ- 120 דקות. שימוש UCs מתינוקות לידה מוקדמת, אולם הפעם העיכול יכול יתקצר כי אלה הם בקלות חתוך, מתעכל.
  3. לבודד UC-MSCs.
    1. להכין ארבעה צינורות פלסטיק 50 מל בקבוק 500 מ"ל של תרבות בינוני.
    2. לחלק את homogenate UC שני 50 מ ל צינורות פלסטיק באמצעות פיפטה 25 מ ל, עם-7.5 מ ל כל שפופרת.
    3. להוסיף 20 מ של תרבות בינוני כל שפופרת ומערבבים היטב.
    4. לסנן כל homogenate UC דרך מסננת תא 100 מיקרומטר, הממוקמת מעל 50 מ ל אוסף צינור, באמצעות פיפטה 25 מ ל כדי לאסוף תאים נגזר UC.
      הערה: תהליך זה לוקח בערך 15 דקות כל אחד, כמו פתרון ה-UC מתעכל הוא דביק.
    5. צנטריפוגה שני צינורות ב 1,000 x g למשך 5 דקות.
    6. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע וזורקים אותו.
    7. Resuspend כדורי תא שני צינורות עם 5 מ של תרבות בינוני.
    8. העברת התליה תא לתוך צלחת 60 מ מ חדש תרבות ב 37 ° C בחממה2 CO 5% (ראה איור 1, שלב 3).
  4. תרבות ה-UC-MSCs.
    1. לחמם את PBS, טריפסין-EDTA (0.25 w/v%), ואת תרבות בינוני (אלפא MEM המכיל 10% FBS ו 1% AA) ל RT.
    2. כאשר התאים מחוברים צלחת 60 מ מ, להסיר את המדיום תרבות, לשטוף עם 5 מ של PBS פעמיים כדי להסיר את הלכלוך כדוריות דם אדומות.
      הערה: תאים מצורפים מופיעים בדרך כלל ב- 3-5 ימים לאחר ציפוי הראשונית (ראה איור 1, שלב 4).
    3. להחליף את המדיום תרבות פעמיים בשבוע, דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% עד 90-100% confluency.
      הערה: זה בדרך כלל לוקח 7-14 ימים לאחר ציפוי הראשונית.
    4. לשטוף תאים עם 5 מ של PBS פעמיים, להוסיף 0.5 מ של טריפסין-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
    5. כאשר התאים הופכים למעוגלים, מנותק, מוסיפים 9 מ של תרבות בינונית ומערבבים היטב כדי להשבית טריפסין.
    6. העברת התליה תא לתוך צלחת 100 מ מ חדש תרבות ב 37 ° C בחממה2 CO 5% (ראה איור 1, שלב 5).
    7. להחליף את המדיום תרבות פעמיים בשבוע, דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% עד 90-100% confluency.
      הערה: זה בדרך כלל לוקח 4-8 ימים לאחר ציפוי הראשונית.
    8. לשטוף פעמיים תאים עם 10 מ"ל ל- PBS, להוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
    9. כאשר התאים הופכים למעוגלים, מנותק, מוסיפים 9 מ של תרבות בינונית ומערבבים היטב כדי להשבית טריפסין.
    10. להעביר את המתלים תא לתוך שתי צלחות 100 מ מ חדש ותרבות -37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% (ראה איור 1, שלב 5).
    11. חזור על תת-תרבות (1:2 פיצולים) עד המעבר העשירי (ראה איור 1, שלב 5).
      הערה: כי תאים תרבותי בתנאים confluent פחות נוטים להגיע מעצר התפשטות קודמות, חשוב על מעבר תאים עם פיצול יחס של 1:2.
    12. להשתמש תאים החמישי עד השמיני מעבר ניתוח סמן פני שטח התא, התא בידול וזמינותו של ניסויים אחרים.
      הערה: כדי למנוע התפשטות נמרצת במשך זמן רב ככל האפשר, תאים בדרך כלל מתורבתים תחת יותר תנאים confluent 70-80%.

2. משטח סמן ביטוי של UC-MSCs

  1. להכין תאים בצלחת 100 מ מ, לנתק אותם עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
  2. להוסיף 9 מ של תרבות בינונית, צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות.
  3. וארוקן את תגובת שיקוע וזורקים אותו.
  4. Resuspend כדורי תא עם 10 מ"ל ל- PBS, צנטריפוגה ב 1,000 x g עבור 5 דק. חזור על שלב זה כביסה פעמיים.
  5. Resuspend תאים עם לזרום cytometry (FCM) מאגר (PBS המכילה EDTA 2 מ מ, 10% חסימה ריאגנט) ב ~ 1 × 106 תאים/mL....
  6. העברת 50-100 µL תא השעיה לתוך צינור 1.5 מ; להוסיף phycoerythrin (PE)-מצומדת נוגדנים נגד CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 או הלע ד ר; דגירה על קרח למשך 45 דקות.
  7. שטיפת תאים עם כרטיס FCM מאגר פעמיים ולהוסיף 50-100 µL של 0.2% הכדאיות לצבוע פתרון (ראה טבלה של חומרים).
  8. תקופת דגירה ב RT של 15 דקות, לשטוף תאים עם מאגר FCM פעמיים ותאים לסנן דרך מסננת תא מיקרומטר 70.
  9. תאים להריץ כרטיס FCM ולנתח את התוצאות שהושג באמצעות כרטיס FCM תוכנה על פי הוראות היצרן.

3. Trilineage הבידול של UC-MSCs

  1. לבצע adipogenesis.
    1. להכין השעיה תא תרבות בינוני-ריכוז של 5 × 103 תאים למ"ל.
    2. לוח 1 מ"ל של השעיה תא בצלחת 12-ובכן, דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% עבור ~ 24 h.
    3. להחליף את המדיום תרבות adipogenic בידול בינונית (ראה טבלה של חומרים) דגירה -37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% עבור 2-3 שבועות. שינוי adipogenic בידול בינוני פעמיים בשבוע.
    4. רחץ תאים עם PBS שלוש פעמים.
    5. דגירה תאים בפתרון פורמלדהיד 4% למשך 30 דקות ב- RT.
    6. רחץ תאים PBS שלוש פעמים, עם 60% אלכוהול איזופרופיל שלוש פעמים.
    7. להכין 0.5% שמן אדום O הפתרון על ידי המסת 84 מ ג שמן אדום O ב- 10 מ"ל של 100% אלכוהול איזופרופיל והוספת 6.7 מ ל מים מזוקקים. כתם תאים עם 1 מ"ל של 0.5% שמן אדום פתרון O ב- RT כעשרים דקות.
    8. לשטוף תאים עם 60% אלכוהול איזופרופיל שלוש פעמים והמחש תחת מיקרוסקופ.
  2. לבצע פרכת.
    1. להכין השעיה תא תרבות בינוני-ריכוז של 1 × 104 תאים למ"ל.
    2. לוח 1 מ"ל של השעיה תא בצלחת 12-ובכן, דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% עבור ~ 24 h.
    3. להחליף את המדיום תרבות osteogeneic בידול בינונית (ראה טבלה של חומרים) דגירה -37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% 1-2 שבועות. שנה את הבידול osteogenic בינוני פעמיים בשבוע.
    4. רחץ תאים עם PBS שלוש פעמים.
    5. דגירה תאים בפתרון פורמלדהיד 4% למשך 30 דקות ב- RT.
    6. רחץ תאים עם PBS שלוש פעמים.
    7. להכין 2% alizarin אדום S פתרון על ידי המסת 200 מ ג של alizarin S אדום עם 10 מ ל מים מזוקקים. כתם תאים עם 1 מ"ל של 2% alizarin אדום פתרון S ב- RT למשך 3 דקות.
    8. לשטוף וולס עם PBS שלוש פעמים והמחש תחת מיקרוסקופ.
  3. לבצע chondrogenesis.
    1. להכין השעיה תא תרבות בינוני-ריכוז של 1.6 × 107 תאים למ"ל.
    2. מקום droplet 5 µL תא השעיה במרכז טוב בצלחת 12-טוב (micromass תרבויות), דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% עבור 2-3 h.
    3. בעדינות מוסיפים 1 מ"ל של מדיום בידול chondrogenic (ראה טבלה של חומרים) דגירה -37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% 4-7 ימים. שינוי chondrogenic בידול בינוני פעמיים בשבוע.
    4. רחץ תאים עם PBS שלוש פעמים.
    5. דגירה תאים בפתרון פורמלדהיד 4% למשך 30 דקות ב- RT.
    6. רחץ תאים עם PBS שלוש פעמים.
    7. להכין 0.05% טולדין כחול פתרון על ידי המסת 250 מ"ג של טולדין כחול עם 500 מ"ל של 0.1 M סודיום אצטט מאגר עם pH 4.1. כתם תאים עם 1 מ"ל של 0.05% פתרון טולדין הכחול-RT למשך 30 דקות.
    8. לשטוף תאים עם PBS שלוש פעמים והמחש תחת מיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ההליכים מאוסף UC לתרבות MSC מסוכמות באיור1. UC של 5-10 ס"מ אורך ניתן לאסוף מ לכל תינוק שנולד מועברים על ידי קיסרי. UC מתחיל להתפתח בגיל 4-8 שבועות של ההיריון, ממשיך לגדול עד 50-60 ס מ אורך, כמוצג באיור2. ישנם שני העורקים (א), אחד וריד (V), כבל רירית (CL) וג'לי (WJ וורטון) ב- UC, כפי שהיא מתוארת באיור 3 ו- 4 איור. UC-MSCs ניתן לבודד מכל כבל אזורים או חוט כל13. מכיוון UC מתינוקות עם הגילאים הריון מוקדם הוא שביר וקשה לנתיחה לתוך אזור כבל יחיד, UC-MSCs מבודדים כל חוט11,12. ישנן מספר שיטות כדי לבודד MSCs של UC, הכוללים את שיטת explant14 , עיכול אנזימטי שיטת15, וכן שלהם נגזרים16. זמן מחזור התרבות, תשואה נמוכה יותר וכתוצאה קודמות מעצר התפשטות המשויך את שיטת explant17,18, UC-MSCs מתורבתים בשיטה עיכול אנזימטי כמופיע באיור 5 ו איור 6.

הקריטריונים מינימלי הגדרת MSCs הנקבעים על-ידי ISCT וכוללים האפיון שלהם סמן משטח19. כדי לקבוע את הביטוי סמן משטח, UC-MSCs מתינוקות לידה מוקדמת והמונח מודגרות עם נוגדנים המתאימים מצומדת-PE, נותחו על ידי cytometry זרימה. הם חיוביים עבור סמני החתימה MSC (CD73, CD90, CD105) אבל שלילי עבור מונוציט/מקרופאג (CD14), אנדותל (CD34), hematopoietic (CD19, CD45) וסמנים histocompatibility הגדולות מורכבות (הלע ד ר), כפי שמוצג באיור 7.

על-פי קריטריונים ' ISCT '19, MSC צריך להחזיק בידול mesodermal קיבולת לאומדן assay בידול trilineage. כדי להעריך את יכולת התמיינות trilineage, UC-MSCs מתינוקות לידה מוקדמת והמונח הם המושרה להבדיל לתוך osteocytes, adipocytes ו- chondrocytes בתנאים בידול ' תקן במבחנה . כמוצג באיור8, הם היטב הבדיל כל לשלושה סוגים של תאים mesodermal.

Figure 1
איור 1 : תרשים סכמטי של בידוד והתרבות של UC-MSCs. שלב 1. 5-10 ס מ של ה-UC אסף גילוח ורחיצה כירורגית מרקמות היפרדות. שלב 2. אנזים מטוהרים מתעכל תערובת UC חתיכות. שלב 3. תרבות של UC-MSCs ב 37 ° C בחממה2 CO 5%. שלב 4. UC המצורפת-MSCs הופיעה 3 ימים לאחר ציפוי הראשונית. שלב 5. תת-תרבות של ה-UC-MSCs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : UC מתינוקות/שהעוברים מועברים בגילאים שונים הריונית. UCs מן העוברים/תינוקות בגיל 19-38 שבועות של הריון מוצגים. הגודל של UC עולה עם גיל ההיריון. גודל ברים = 8 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : תצוגה המודולרית של UC מתינוקות לידה מוקדמת והמונח. ישנם שני העורקים (א), אחד וריד (V), כבל רירית (CL) וג'לי (WJ וורטון) ב- UC מתינוקות לידה מוקדמת של המונח. הגדלים של רקמות אלה משתנה עם גיל הריון. גודל ברים = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : אנטומיה של UC. (א) 5 ס מ של ה-UC מהסמסטר התינוק. (B) חתך של UC. (ג) גזור חלקית UC. ישנם שני העורקים (א), אחד וריד (V), כבל רירית (CL), ג'לי של Whalton (WJ). UC מתינוקות קודם לכן הריון הגילאים הוא שביר וקשה במיוחד ניסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : ניתוח UC באמצעות תערובות אנזימים מטוהרים. (א) 5-10 ס מ של ה-UC. (B) מ מ 2-3 חתיכות של UC. (ג) מטוהרים חתיכות UC מתעכל תערובת אנזימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : מורפולוגיה של UC-MSCs מתינוקות לידה מוקדמת והמונח. (A ו- E) UC-MSCs המעבר מספר 1 (P1) לפני ההחלפה של תרבות בינוני (ת X40; E: X200). (B ו F) UC-MSCs ב P1 לאחר ההחלפה של תרבות בינוני (ב': X40; F: X200). (C ו- G) UC-MSCs-P3 (c: X40; ז' X200). (D ו- H) UC-MSCs-P5 (X40; d: ח': X200). גודל ברים = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : לפני השטח סמן ביטוי של UC-MSCs מתינוקות לידה מוקדמת והמונח. CD73/CD90/CD105-חיוביות CD14/CD19/CD34/CD45/הלע-ד ר-שלילי פנוטיפים נמצאים ב- UC-MSCs לידה מוקדמת (22 שבועות הריון) והן אצל תינוקות טווח (37 שבועות הריון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8 : Trilineage mesenchymal הבידול של UC-MSCs מתינוקות לידה מוקדמת והמונח. UC-MSCs של לידה מוקדמת (22 שבועות הריון) ותינוקות המונח (37-40 שבועות הריון) מובחנים לתוך adipocyte (על ידי שמן אדום O), osteocyte (דמיינו ידי alizarin S אדום), ו- chondrocyte (דמיינו ידי טולדין כחול). התמונות צולמו ב- 200 x. גודל ברים = 50 מיקרומטר. חלק איור זה הותאם מ Iwatani et al.11אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MSCs ניתן לבודד מתוך מגוון של רקמות, הטרוגניות אוכלוסיית תאים שעושים אקספרס לא כל הסמנים פנוטיפי אותו. כאן, אנחנו המתוארים פרוטוקול מנחה דיסקציה של ה-UC ואוסף מתינוקות לידה מוקדמת והמונח ומאפשרת בידוד והתרבות של UC-MSCs. בעקבות פרוטוקול זה, יש בהצלחה בודדנו UC-MSCs העומדים של קריטריונים ISCT19 מן העוברים/תינוקות וכשאשר 19-40 שבועות של הריון והפגינו שהן מייצגות חלק מההיבטים של מחלה סורר פתופסיולוגיה במהלך ההתפתחות לפני הלידה11,12.

ב BM-derived MSCs (מוניטור-MSCs), צעיר נגזר התורם BM-MSCs בדרך כלל אראה פוטנציאל המקדימות, differentiative גדולה יותר מאשר עמיתיהם בוגרים והחזק יותר פוטנציאל התא טיפול20,21. באופן דומה, דווח על לידה מוקדמת UC-MSCs מבודד מעוברים מופלים בגיל 8-12 שבועות של הריון להפגין יותר נמרצים התפשטות ובידול לעומת המונח UC-MSCs מבודד ילודים וכשאשר 37-40 שבועות של הריון22. למרות הבדלי גיל ההיריון ואזור כבל, UC-MSCs מבודדת עם פרוטוקול זה התגלה גם שגשוג נמרצת יותר של UC לידה מוקדמת-MSCs מאשר המונח UC-MSCs12.

שלב קריטי בתוך פרוטוקול זה הוא הקרע UC עם תערובות אנזימים מטוהרים כי הם המורכב collagenase אני ואת השני dispase. כפי שמתואר בספר התוצאות נציג, הנוקשות של UC מגוונים באופן דרמטי עם גיל ההיריון (איור 2). כדי להשיג לנתיחה אופטימלית של ה-UC, זמן הדגירה של האנזים מטוהרים תערובות צריך ניתן לכוונן את הנוקשות של UC בודדים. באופן כללי, זה בדרך כלל לוקח יותר זמן עבור מונח UC מאשר UC לידה מוקדמת. בין שיטות קיימות כדי לבודד MSCs של UC, אנו בוחרים את שיטת עיכול אנזימטי15 על שיטת explant14 שעלולות להוביל עוד מחזור התרבות, תשואה נמוכה יותר, מוקדם יותר התפשטות מעצר17,18. שינוי חשוב של השיטה אנזים עיכול הוא השימוש של תערובות אנזימים מטוהרים במקום collagenase המסורתי, אשר מאפשרת של דיסקציה יעילה ועקבית של ה-UC מן העוברים/תינוקות עם הגילאים הריונית משתנה.

מגבלה של פרוטוקול זה הוא השימוש של כל חוט כדי לבודד MSCs מן ה-UC. כי ה-UC-MSCs ניתן לבודד מכל כבל אזורים או חוט כל13, UC-MSCs מבודדים מן חוט שלם של פרוטוקול זה. זאת בשל הכדאיות של UC לנתיחה מתינוקות לידה מוקדמת. עם זאת, הווריאציה פוטנציאליות ביחס של אזור כבל עלולה להגביל השוואה קפדנית בין ה-UC-MSCs מבודדת על ידי פרוטוקול זה.

UC-MSCs יותר ויותר משמשות כמקור של תאי סטרומה mesenchymal קליניים וקליניים8,9. למרות זה שימוש מוגבר, קונצנזוס על שיטות של UC-MSCs בידוד עדיין חסר, מה שעלול להוביל אוכלוסיות תאים שונים כדי להיחשב את UC-MSCs אותו פרוטוקול זה יסייע בסופו של דבר החוקרים להבין טוב יותר את גזירת ואת המאפיינים הפונקציונליים של UC-MSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי Grants-in-Aid עבור Scientific Research (C) (להעניק מספר: 25461644), מדענים צעירים (B) (להעניק מספרים: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) של JSPS KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6, (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9, (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2, (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25, (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43, (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6, (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16, (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13, (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91, (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35, (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65, (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17, (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97, (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12, (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22, (17), 2425-2439 (2013).
בידוד ואפיון של האדם נגזר הטבור בתאי גזע Mesenchymal של לידה מוקדמת ותינוקות המונח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter