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Developmental Biology

अलगाव और मानव गर्भनाल के लक्षण वर्णन-व्युत्पंन Mesenchymal और अवधि के शिशुओं से स्टेम सेल

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

मानव गर्भनाल (यूसी) प्रसवकालीन अवधि के दौरान प्राप्त किया जा सकता है, शब्द का एक परिणाम के रूप में, और postterm वितरण । इस प्रोटोकॉल में, हम अलगाव और के लक्षण वर्णन UC-व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल (UC-MSCs) भ्रूणों/शिशुओं से 19-40 सप्ताह के गर्भ में ।

Abstract

Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) काफी चिकित्सीय क्षमता है और जैव चिकित्सा के क्षेत्र में रुचि बढ़ाने को आकर्षित । MSCs मूल रूप से अलग कर रहे है और अस्थि मज्जा (बी एम) से विशेषता है, तो वसा ऊतक, synovium, त्वचा, दंत लुगदी, और नाल, गर्भनाल रक्त (यूसीबी), और गर्भनाल (यूसी) के रूप में भ्रूण उपांग सहित ऊतकों से हासिल की । MSCs के लिए क्षमता के साथ एक विषम कोशिका आबादी है (1) मानक संस्कृति की स्थिति में प्लास्टिक का पालन, (2) CD73 की सतह मार्कर अभिव्यक्ति+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- phenotypes, और (3) adipocytes, osteocytes, और chondrocytes में trilineage भेदभाव, वर्तमान में सेलुलर थेरेपी (ISCT) के लिए इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा परिभाषित के रूप में । हालांकि बीएम MSCs के सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया स्रोत है, बीएम आकांक्षा के इनवेसिव प्रकृति नैतिकता की दृष्टि से अपनी पहुंच सीमा । प्रसार और बीएम से प्राप्त MSCs की भिंनता क्षमता आम तौर पर दाता की उंर के साथ गिरावट आई है । इसके विपरीत, भ्रूण MSCs यूसी से प्राप्त जोरदार प्रसार और विभेदक क्षमता जैसे फायदे हैं. यूसी नमूने के लिए कोई नैतिक चिंता नहीं है, क्योंकि यह आम तौर पर चिकित्सा अपशिष्ट के रूप में माना जाता है । मानव यूसी हमल के 4-8 सप्ताह में एमनियोटिक गुहा के सतत विकास के साथ विकसित करने के लिए शुरू होता है और लंबाई में 50-60 सेमी तक पहुँचने तक बढ़ती रहती है, और यह पूरे नवजात प्रसव की अवधि के दौरान अलग किया जा सकता है । असभ्य रोगों के pathophysiology में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हम विभिंन गर्भावधि उंर में वितरित शिशुओं से uc-व्युत्पंन MSCs (uc-MSCs) का इस्तेमाल किया है । इस प्रोटोकॉल में, हम अलगाव और के लक्षण वर्णन UC-MSCs से भ्रूण के 19-40 सप्ताह के गर्भ में/

Introduction

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Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) मूल रूप से अलग कर रहे है और अस्थि मज्जा (बीएम)1,2 से विशेषता है लेकिन यह भी वसा ऊतक, synovium, त्वचा, दंत लुगदी सहित ऊतकों की एक विस्तृत विविधता से प्राप्त किया जा सकता है, और भ्रूण उपांग 3. MSCs एक विषम कोशिका जनसंख्या के रूप में मांयता प्राप्त है कि पैदा करना और adipocytes, osteocytes, और chondrocytes में अंतर कर सकते हैं । इसके अलावा, MSCs चोट की साइटों के लिए विस्थापित करने की क्षमता के अधिकारी, दमन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को मिलाना, और फिर से तैयार है और चोट की मरंमत । वर्तमान में, विभिंन स्रोतों से MSCs ने कोशिका चिकित्सा के लिए एक स्रोत के रूप में बढ़ती ब्याज को आकर्षित किया है, जिसमें भ्रष्टाचार-बनाम-मेजबान रोग, रोधगलन, और मस्तिष्क रोधगलन4,5 शामिल हैं । .

हालांकि बीएम सबसे अच्छी तरह से MSCs के चरित्र का स्रोत है, बीएम आकांक्षा की आक्रामकता नैतिकता की दृष्टि से अपनी पहुंच सीमा । प्रसार और बीएम से प्राप्त MSCs की भिंनता क्षमता आम तौर पर दाता की उंर के साथ गिरावट आई है । इसके विपरीत, भ्रूण MSCs जैसे नाल, गर्भनाल रक्त (यूसीबी), और गर्भनाल (यूसी) के रूप में भ्रूण उपांग से प्राप्त नमूना और मजबूत प्रसार और भेदभाव क्षमता6 के बारे में कम नैतिक चिंताओं सहित लाभ है , 7. भ्रूण उपांग के बीच जो आमतौर पर मेडिकल कचरे के रूप में छोड़ दिया जाता है, यूसीबी और यूसी को भ्रूण अंग माना जाता है, जबकि अपरा को fetomaternal माना जाता है । इसके अलावा, अपरा और यूसीबी नवजात प्रसव के सही समय पर नमूना और एकत्र किए जाने की जरूरत है, जबकि अपरा और यूसी नवजात प्रसव के बाद एकत्र और संसाधित किया जा सकता है । तदनुसार, यूसी सेल थेरेपी8,9के लिए एक होनहार एमएससी स्रोत है.

मानव यूसी हमल के 4-8 सप्ताह में एमनियोटिक गुहा के प्रगतिशील विस्तार के साथ विकसित करने के लिए शुरू होता है, लंबाई में 50-60 सेमी तक विकसित करने के लिए जारी है, और नवजात प्रसव10की पूरी अवधि के दौरान अलग किया जा सकता है । असभ्य रोगों के pathophysiology में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हम विभिंन गर्भावधि उंर11,12पर दिया शिशुओं से uc-व्युत्पंन MSCs (uc-MSCs) का उपयोग करें । इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन कैसे अलग और UC-MSCs से भ्रूण के 19-40 सप्ताह के गर्भ में/

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Protocol

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इस अध्ययन के लिए मानव नमूनों का उपयोग कोबे विश्वविद्यालय के ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन (अनुमोदन no. १३७० और १६९४) की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित की गई.

1. UC-MSCs का अलगाव और संस्कृति

नोट: UC-MSCs सफलतापूर्वक अलग किया गया है, प्रसंस्कृत, और विस्तारित (से अधिक संख्या 4 गद्यांश) से अधिक २०० यूसीएस इस प्रोटोकॉल के अधीन । अधिक से अधिक २०० यूसीएस में, १००% सफल uc-msc अलगाव दिखाया है, कम से 5% आकस्मिक संदूषण दिखाया है, से कम 15% वृद्धि गिरफ्तारी दिखाया है, और ८०% से अधिक सफल uc-एमएससी विस्तार दिखाया है ।

  1. यूसी लीजिए.
    1. एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब, एक अपूतित कैंची, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्फा संशोधित ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (अल्फा मेम) की एक ५०० मिलीलीटर की बोतल तैयार करें ।
    2. Aseptically लंबाई में लगभग 5-10 सेमी पर एक शल्य कैंची के साथ यूसी बाहर कट और सीजेरियन सेक्शन द्वारा नवजात जन्म के बाद जल्द ही इसे इकट्ठा ।
    3. तुरंत एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में UC प्लेस और अल्फा मेम के 20-30 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें ।
    4. यूसी को कमरे के तापमान (RT) पर स्टोर करें जब तक उसे प्रयोगशाला में नहीं पहुँचाया जाता.
      नोट: अपूतित यूसी 2 दिनों तक के लिए आरटी में सीरम मुक्त माध्यम में संग्रहित किया जा सकता है । इसलिए, यदि यह 2 दिनों के भीतर प्रयोगशाला में वितरित किया जाता है तो पड़ोसी अस्पतालों से प्राप्त यूसी एकत्र की जा सकती है ।
  2. काटना यूसी.
    1. एक प्लास्टिक की ट्रे तैयार, निष्फल कैंची और संदंश, 10 मिलीलीटर पिपेट, 25 मिलीलीटर पिपेट, २ ६० मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन, फास्फेट बफर खारा (पंजाब), शुद्ध एंजाइम मिश्रणों ( सामग्री की तालिकादेखें, एक एकाग्रता में बाँझ पंजाबियों के साथ पुनर्गठन की 13 Wünsch इकाइयों/एमएल और ८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित), और कम सीरम मध्यम की एक ५०० मिलीलीटर की बोतल ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. पंजाबियों, शुद्ध एंजाइम मिश्रणों, कम सीरम मध्यम, और संस्कृति मध्यम गर्म [अल्फा मेम युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% एंटीबायोटिक-antimycotic समाधान (ए. ए.) 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत] आर टी के लिए
    3. ट्यूब से यूसी बाहर ले लो और एक प्लास्टिक ट्रे में जगह है ।
    4. वजन और काटना एक निष्फल कैंची के साथ यूसी के 5 जी.
    5. एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर नसबंदी के लिए यूसी पर ७०% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर डालो.
    6. एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर दो बार पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ यूसी धो लें.
    7. UC को एक निष्फल ६० mm टिशू कल्चर डिश में रखें ( चित्रा 1, चरण 1 देखें) ।
    8. डिश में कम सीरम मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    9. शुद्ध एंजाइम मिश्रणों के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें लगभग ०.६२ Wünsch इकाइयों की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए/
      नोट: पारंपरिक collagenase के बजाय शुद्ध एंजाइम मिश्रणों का उपयोग uc-MSCs से अलग की उपज और व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए दिखाया गया है ।
    10. 2-3 मिमी के टुकड़ों में यूसी को निष्फल कैंची और संदंश के साथ काटें ( चित्रा 1, चरण 2 देखें).
      नोट: इस प्रक्रिया में लगभग 30 मिनट लगते हैं ।
    11. एक 5% सह2 मशीन में 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर यूसी टुकड़े मशीन ।
    12. आंशिक रूप से पच UC टुकड़ों को छोटे टुकड़ों में काटें जो कि आसानी से 25 मिलीलीटर पिपेट के माध्यम से प्रवाहित हो ।
      नोट: इस प्रक्रिया में लगभग 30 मिनट लगते हैं ।
    13. एक 5% सह2 मशीन में 15-45 मिनट के लिए ३७ ° c पर छोटे यूसी टुकड़े गर्मी ।
      नोट: गर्मी homogenates चिपचिपा बन जब तक जारी रखने की जरूरत है । कुल पाचन समय लगभग १२० मिनट है । अपरिपक्व शिशुओं से यूसीएस का उपयोग करने के मामले में, तथापि, पाचन समय छोटा किया जा सकता है क्योंकि उन आसानी से काट रहे है और पचा ।
  3. UC-MSCs को अलग करना ।
    1. ४ ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब और संस्कृति माध्यम की एक ५०० मिलीलीटर की बोतल तैयार करें ।
    2. २ ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में यूसी homogenate विभाजित एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर, प्रत्येक ट्यूब में लगभग ७.५ मिलीलीटर के साथ ।
    3. प्रत्येक ट्यूब में संस्कृति माध्यम के 20 मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    4. एक १०० µm सेल एक नया ५० एमएल संग्रह ट्यूब के शीर्ष पर रखा छलनी के माध्यम से प्रत्येक uc homogenate फ़िल्टर, एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर UC-व्युत्पन्न कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ।
      नोट: इस प्रक्रिया के बारे में 15 मिनट प्रत्येक लेता है, के रूप में पचा UC समाधान चिपचिपा है ।
    5. 5 मिनट के लिए १,००० x g पर दो ट्यूबों केंद्रापसारक ।
    6. ध्यान से महाप्राण को supernatant और त्यागें ।
    7. संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ दो ट्यूबों में सेल छर्रों resuspend ।
    8. एक 5% CO2 मशीन में ३७ ° c पर एक नया ६० mm थाली और संस्कृति में सेल निलंबन स्थानांतरण ( चित्रा 1, चरण 3 देखें) ।
  4. कल्चर UC-MSCs ।
    1. पंजाबियों को गर्म करें, trypsin-EDTA (०.२५ w/v%), और कल्चरल मीडियम (अल्फा मेम युक्त 10% FBS और 1% एए) से आरटी
    2. जब कोशिकाएं ६० mm प्लेट से जुड़ी होती हैं, कल्चरल मीडियम को हटा दें और मलबे और लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए दो बार पंजाब के 5 एमएल से धो लें ।
      नोट: संलग्न कोशिकाओं को आमतौर पर प्रारंभिक चढ़ाना के बाद 3-5 दिनों में दिखाई देते है ( चित्रा 1, चरण 4 देखें) ।
    3. संस्कृति मध्यम दो बार प्रति सप्ताह की जगह और ३७ ° c में एक 5% सह2 मशीन में मशीन 90-100% तक प्रवाह ।
      नोट: यह आमतौर पर प्रारंभिक चढ़ाना के बाद 7-14 दिन लगते हैं ।
    4. दो बार पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो, trypsin-EDTA के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें, और 5-10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    5. जब कोशिकाओं गोल और अलग हो जाते हैं, संस्कृति मध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़ने और trypsin को निष्क्रिय करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण ।
    6. एक 5% सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक नया १०० mm प्लेट और संस्कृति में सेल निलंबन स्थानांतरण ( चित्रा 1, चरण 5 देखें) ।
    7. संस्कृति मध्यम दो बार प्रति सप्ताह की जगह और ३७ ° c में एक 5% सह2 मशीन में मशीन 90-100% तक प्रवाह ।
      नोट: यह आमतौर पर प्रारंभिक चढ़ाना के बाद 4-8 दिन लगते हैं ।
    8. दो बार पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें, trypsin-EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 5-10 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    9. जब कोशिकाओं गोल और अलग हो जाते हैं, संस्कृति मध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़ने और trypsin को निष्क्रिय करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण ।
    10. एक 5% सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर दो नए १०० मिमी प्लेटों और संस्कृति में सेल निलंबन स्थानांतरण ( चित्रा 1, चरण 5 देखें) ।
    11. दोहराएं उपसंस्कृति (1:2 विभाजन) दसवें पारित होने तक ( चित्रा 1, चरण 5 देखें) ।
      नोट: क्योंकि कम धाराप्रवाह शर्तों के तहत प्रसंस्कृत कोशिकाओं को पहले प्रसार गिरफ्तारी तक पहुंचने के लिए करते हैं, यह 1:2 के एक विभाजन के अनुपात के साथ कोशिकाओं को पारित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    12. सेल सतह मार्कर विश्लेषण, सेल विभेद परख, और अंय प्रयोगों के लिए पांचवें से आठवें मार्ग पर कोशिकाओं का प्रयोग करें ।
      नोट: के रूप में संभव के रूप में लंबे समय के लिए जोरदार प्रसार रखने के लिए, कोशिकाओं को आम तौर पर 70-80% से अधिक धाराप्रवाह शर्तों के तहत संस्कृति रहे हैं ।

2. यूसी-MSCs की सतह मार्कर अभिव्यक्ति

  1. एक १०० mm थाली में कोशिकाओं को तैयार है और उंहें 5-10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर trypsin-EDTA के 1 मिलीलीटर के साथ अलग कर देना ।
  2. संस्कृति मध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  3. महाप्राण को supernatant और त्याग दें ।
  4. पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ सेल छर्रों resuspend और 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक । इस वाशिंग स्टेप को दो बार दोहराएं ।
  5. प्रवाह cytometry () के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित () () () () के साथ (पंजाब के 2 मिमी EDTA और 10% अवरुद्ध रिएजेंट) बफर 1 × 106 कोशिकाओं/
  6. स्थानांतरण 50-100 एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन के µ एल; add phycoerythrin (PE)-संयुग्मित एंटीबॉडी अगेंस्ट CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, या एचएलए-डॉ; और ४५ मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  7. दो बार के लिए एक साथ कक्ष धो लें और ०.२% व्यवहार्यता डाई समाधान के 50-100 µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  8. 15 मिनट के लिए आरटी पर गर्मी, दो बार के लिए, और एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से के माध्यम से टी. आर.
  9. के माध्यम से सेल के माध्यम से चलाने के लिए और.. ।

3. यूसी-MSCs का Trilineage विभेद

  1. प्रदर्शन adipogenesis ।
    1. संस्कृति माध्यम में एक सेल निलंबन 5 × 103 कोशिकाओं की एक एकाग्रता पर तैयार/
    2. प्लेट एक 12-अच्छी तरह से थाली में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर और ३७ ° c में एक 5% CO2 मशीन में ~ 24 एच के लिए मशीन ।
    3. adipogenic भेदभाव मध्यम के साथ संस्कृति माध्यम बदलें ( सामग्री की तालिकादेखें) और 2-3 सप्ताह के लिए एक 5% CO2 मशीन में ३७ ° c पर मशीन । adipogenic भिंनता मध्यम सप्ताह में दो बार बदलें ।
    4. तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    5. आरटी में 30 मिनट के लिए 4% formaldehyde समाधान में कोशिकाओं की मशीन ।
    6. पंजाब के साथ तीन बार और ६०% isopropanol तीन बार के साथ कोशिकाओं धो लो ।
    7. ०.५% तेल लाल o समाधान को भंग करके तैयार करें ८४ मिलीग्राम तेल लाल हे के 10 मिलीलीटर में १००% isopropanol और आसुत जल के ६.७ मिलीलीटर जोड़ने । 20 मिनट के लिए आर टी पर ०.५% तेल लाल O समाधान की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं दाग ।
    8. ६०% isopropanol तीन बार के साथ कोशिकाओं को धोने और एक खुर्दबीन के नीचे कल्पना ।
  2. प्रदर्शन आस्टियोजेनेसिस ।
    1. 1 × 104 कोशिकाओं की एकाग्रता पर संस्कृति माध्यम में एक सेल निलंबन तैयार/
    2. प्लेट एक 12-अच्छी तरह से थाली में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर और ३७ ° c में एक 5% CO2 मशीन में ~ 24 एच के लिए मशीन ।
    3. osteogeneic भेदभाव मध्यम के साथ संस्कृति माध्यम बदलें ( सामग्री की तालिकादेखें) और 1-2 सप्ताह के लिए एक 5% CO2 मशीन में ३७ ° c पर मशीन । osteogenic भिंनता मध्यम सप्ताह में दो बार बदलें ।
    4. तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    5. आरटी में 30 मिनट के लिए 4% formaldehyde समाधान में कोशिकाओं की मशीन ।
    6. तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    7. आसुत जल के 10 मिलीलीटर के साथ alizarin लाल एस के २०० मिलीग्राम भंग करके 2% alizarin लाल एस समाधान तैयार करें । 3 मिनट के लिए आर टी पर 2% alizarin रेड एस समाधान की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं दाग ।
    8. तीन बार पंजाबियों के साथ कुओं धोने और एक खुर्दबीन के नीचे कल्पना ।
  3. प्रदर्शन chondrogenesis ।
    1. संस्कृति माध्यम में एक सेल निलंबन १.६ × 107 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर तैयार करें ।
    2. एक 12-अच्छी तरह से प्लेट (micromass संस्कृतियों) और ३७ ° c में एक 5% CO2 मशीन में 2-3 एच के लिए केंद्र पर सेल निलंबन की एक 5 µ एल छोटी बूंद प्लेस ।
    3. धीरे chondrogenic भेदभाव मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) और 4-7 दिनों के लिए एक 5% CO2 मशीन में ३७ ° c पर मशीन । chondrogenic भिंनता मध्यम सप्ताह में दो बार बदलें ।
    4. तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    5. आरटी में 30 मिनट के लिए 4% formaldehyde समाधान में कोशिकाओं की मशीन ।
    6. तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    7. ०.०५% toluidine नीले समाधान को भंग करके तैयार करें २५० मिलीग्राम toluidine ब्लू के ५०० मिलीलीटर के साथ ०.१ एम सोडियम एसीटेट बफर पीएच ४.१ के साथ. 30 मिनट के लिए आर टी पर ०.०५% toluidine ब्लू समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं दाग ।
    8. तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने और एक खुर्दबीन के नीचे कल्पना ।

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Representative Results

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यूसी संग्रह से एमएससी संस्कृति के लिए प्रक्रियाओं चित्रा 1में संक्षेप हैं. यूसी की लंबाई में लगभग 5-10 सेमी की सभी सिजेरियन अनुभाग द्वारा वितरित नवजात शिशुओं से एकत्र किया जा सकता है । यूसी हमल के 4-8 सप्ताह में विकसित करने के लिए शुरू होता है और लंबाई में 50-60 सेमी तक विकसित करने के लिए जारी है, के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है. इसमें दो धमनियों (A), एक नस (V), गर्भनाल अस्तर (सीएल), और व्हार्टन की जेली (WJ) यूसी में, जैसा कि चित्रा 3 और चित्रा 4में दर्शाया गया है । UC-MSCs सभी गर्भनाल क्षेत्रों या पूरे गर्भनाल13से अलग किया जा सकता है । क्योंकि जल्दी गर्भावधि उंर के साथ शिशुओं से यूसी नाजुक है और एक कॉर्ड क्षेत्र में विच्छेदन के लिए मुश्किल है, यूसी-MSCs पूरे गर्भनाल से अलग कर रहे हैं11,12. UC से MSCs को अलग करने के लिए कई विधियाँ हैं, जिसमें explant विधि14 और एंजाइमी पाचन विधि15, प्लस उनके डेरिवेटिव16शामिल हैं । लंबे समय तक संस्कृति चक्र के कारण, कम उपज, और explant विधि17,18, UC-MSCs के साथ जुड़े पहले जखीरे गिरफ्तारी के रूप में चित्र 5 में सचित्र एंजाइमी पाचन पद्धति द्वारा संस्कृति रहे है और चित्रा 6.

MSCs परिभाषित करने के लिए ंयूनतम मानदंड ISCT द्वारा स्थापित कर रहे है और उनकी सतह मार्कर लक्षण वर्णन19शामिल हैं । सतह मार्कर अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए, UC-MSCs से अपरिपक्व और शब्द शिशुओं उचित पीई-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ मशीन और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । वे MSC हस्ताक्षर मार्करों के लिए सकारात्मक रहे है (CD73, CD90, CD105) लेकिन monocyte के लिए नकारात्मक/मैक्रोफेज (CD14), endothelial (CD34), टेम (CD19, CD45), और प्रमुख histocompatibility परिसर (एचएलए-DR) मार्कर, के रूप में चित्रा 7में दिखाया गया है ।

ISCT मानदंड19के अनुसार, एमएससी mesodermal अंतर एक trilineage विभेद परख द्वारा मूल्यांकन क्षमता के अधिकारी होना चाहिए । trilineage विभेदन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, UC-MSCs से अपरिपक्व और अवधि के शिशुओं osteocytes में अंतर करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं, adipocytes, और chondrocytes में मानक के तहत इन विट्रो भेदभाव की स्थिति. चित्रा 8में दिखाया गया है, वे अच्छी तरह से mesodermal कोशिकाओं के सभी तीन प्रकार में अंतर कर रहे हैं.

Figure 1
चित्रा 1 : अलगाव और UC-MSCs की संस्कृति के योजनाबद्ध आरेख । चरण 1 । अपरा ऊतक से एकत्र यूसी aseptically के 5-10 सेमी. चरण 2. शुद्ध एंजाइम मिश्रण-पचा यूसी टुकड़े. चरण 3. UC-MSCs की संस्कृति ३७ ° c में एक 5% कं2 मशीन में । चरण 4. संलग्न यूसी-MSCs प्रारंभिक चढ़ाना के बाद 3 दिनों में दिखाई दिया. स्टेप 5. UC-MSCs की उपसंस्कृति । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2 : विभिन्न गर्भावधि उम्र में दिया भ्रूणों/शिशुओं से यूसी. 19-38 सप्ताह के गर्भ में भ्रूणों/शिशुओं से यूसीएस दिखाया जाता है । गर्भावधि उम्र के साथ यूसी का आकार बढ़ जाता है. स्केल बार्स = 8 cm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्रा 3 : टर्म और टर्म शिशुओं से यूसी का अनुभागीय दृश्य. वहां दो धमनियों (एक), एक नस (V), गर्भनाल अस्तर (सीएल), और व्हार्टन के जेली (WJ) UC में अपरिपक्व और अवधि के शिशुओं से कर रहे हैं । इन ऊतकों के आकार गर्भावधि उंर के साथ बदलती हैं । स्केल पट्टियां = 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 4
चित्र 4 : यूसी के एनाटॉमी. () टर्म शिशु से यूसी के 5 सेमी. () यूसी का क्रास सेक्शन. () आंशिक रूप से विच्छेदित यूसी. इसमें दो धमनियों (A), एक नस (V), गर्भनाल अस्तर (सीएल), और Whalton की जेली (WJ) हैं । पहले गर्भावधि उम्र के शिशुओं से यूसी विशेष रूप से कमजोर और विच्छेदित किया जा करने के लिए मुश्किल है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : यूसी शुद्ध एंजाइम मिश्रणों का उपयोग कर विच्छेदन । (A) 5-10 cm यूसी के. () यूसी के 2-3 मिमी टुकड़े । () शुद्ध एंजाइम मिश्रण पचा UC टुकड़े । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : पद और अवधि शिशुओं से यूसी-MSCs की आकृति विज्ञान. (a और E) (a: X40) संस्कृति माध्यम के प्रतिस्थापन से पहले गद्यांश क्रमांक 1 (P1) पर UC-MSCs; ई: X200) । (b और F) UC-MSCs P1 पर संस्कृति माध्यम के प्रतिस्थापन के बाद (b: X40; च: X200) । (c और G) UC-p पर MSCs (c: X40; छ: X200) । (d और H) P5 पर UC-MSCs (d: X40; ज: X200) । स्केल बार्स = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 7
चित्र 7 : शब्द और अवधि शिशुओं से UC-MSCs की सतह मार्कर अभिव्यक्ति । CD73/CD90/CD105-positive and CD14/CD19/CD34/CD45/एचएलए-डा०-नकारात्मक phenotypes UC-MSCs में दोनों अपरिपक्वता (22 सप्ताह के गर्भ) और अवधि (३७ सप्ताह हमल) शिशुओं से पाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : Trilineage और मियादी शिशुओं से UC-MSCs का mesenchymal विभेद । UC-MSCs से अपरिपक्व (22 सप्ताह के गर्भ) और अवधि (37-40 सप्ताह हमल) शिशुओं adipocyte में भेदभाव कर रहे है (तेल लाल ओ द्वारा कल्पना), osteocyte (alizarin लाल एस द्वारा कल्पना), और chondrocyte (toluidine नीले रंग की कल्पना) । चित्र 200x पर ले जाया गया । स्केल बार्स = ५० µm । इस आंकड़े का एक हिस्सा Iwatani एट अल.11से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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MSCs ऊतकों की एक किस्म से अलग किया जा सकता है और कोशिकाओं की विषम जनसंख्या है कि सभी एक ही phenotypic मार्करों व्यक्त नहीं कर रहे हैं । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि समय और अवधि के शिशुओं से यूसी के संग्रह और विच्छेदन गाइड और अलगाव और यूसी-MSCs की संस्कृति में सक्षम बनाता है रेखांकित किया । इस प्रोटोकॉल के बाद, हम सफलतापूर्वक UC-MSCs कि ISCT मानदंडों को पूरा करने से19 भ्रूण/शिशुओं से 19-40 सप्ताह के गर्भ में दिया और प्रदर्शन किया है कि वे असभ्य रोग के कुछ पहलुओं का प्रतिनिधित्व pathophysiology जंम के पूर्व विकास के दौरान11,12

बी. एम.-व्युत्पंन MSCs में (बीएम-MSCs), युवा दाता-प्राप्त बीएम-MSCs आम तौर पर बड़े समकक्षों से अधिक प्रफलन और विभेदक क्षमता दिखाने के लिए और सेल थेरेपी20,21के लिए और अधिक क्षमता पकड़ । इसी प्रकार, अपरिपक्व यूसी-MSCs के 8-12 सप्ताह के गर्भ में निरस्त भ्रूणों से अलग किया गया था और अधिक जोरदार प्रसार और अंतर के लिए की तुलना में प्रदर्शित करने के लिए रिपोर्ट uc-MSCs नवजात शिशुओं के 37-40 सप्ताह में दिया से अलग-थलग हमल22. गर्भावधि उंर और गर्भनाल क्षेत्र में मतभेद के बावजूद, uc-MSCs इस प्रोटोकॉल के साथ अलग भी अवधि uc-MSCs से शब्द uc-MSCs12के एक और अधिक जोरदार प्रसार का पता चला ।

इस प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम शुद्ध एंजाइम मिश्रणों कि collagenase मैं और द्वितीय और dispase से बना रहे है के साथ UC विच्छेदन है । के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में उल्लिखित, यूसी की कठोरता नाटकीय रूप से गर्भावधि उम्र के साथ विविध (चित्रा 2). यूसी के इष्टतम विच्छेदन प्राप्त करने के लिए, शुद्ध एंजाइम मिश्रणों की मशीन समय के लिए व्यक्तिगत यूसी की कठोरता को समायोजित करने की जरूरत है. आम तौर पर, यह आमतौर पर शब्द यूसी से शब्द यूसी के लिए अब लेता है. यूसी से MSCs को अलग करने के लिए मौजूदा विधियों में से, हम एंजाइमी पाचन विधि15 explant विधि14 कि एक लंबे समय तक संस्कृति चक्र के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, कम उपज, और पहले प्रसार17,18की गिरफ्तारी का चयन करें । एंजाइम पाचन विधि का एक महत्वपूर्ण संशोधन के बजाय पारंपरिक collagenase, जो भ्रूण से यूसी के एक कुशल और सुसंगत विच्छेदन में सक्षम बनाता है शुद्ध एंजाइम मिश्रणों का उपयोग है/चर गर्भावधि उंर के साथ शिशुओं ।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यूसी से MSCs को अलग करने के लिए पूरे कॉर्ड का उपयोग है । क्योंकि uc-MSCs सभी गर्भनाल क्षेत्रों या पूरे गर्भनाल13से अलग किया जा सकता है, uc-MSCs इस प्रोटोकॉल में पूरे कॉर्ड से अलग कर रहे हैं । यह अपरिपक्व शिशुओं से यूसी विच्छेदन की व्यवहार्यता के कारण है. हालांकि, प्रत्येक कॉर्ड क्षेत्र के अनुपात में संभावित भिंनता इस प्रोटोकॉल द्वारा अलग UC-MSCs के बीच सख्त तुलना को सीमित कर सकती है ।

यूसी-MSCs तेजी से नैदानिक और नैदानिक अध्ययन के लिए mesenchymal stromal कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है8,9. इस वृद्धि उपयोग के बावजूद, uc-MSCs अलगाव के तरीकों पर एक आम सहमति अभी भी याद आ रही है, जो अलग सेल आबादी में परिणाम के लिए एक ही UC-MSCs समझा जा सकता है । यह प्रोटोकॉल अंततः बेहतर व्युत्पत्ति और UC-MSCs के कार्यात्मक विशेषताओं को समझने में शोधकर्ताओं की सहायता करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित था वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (ग) (अनुदान संख्या: २५४६१६४४) और युवा वैज्ञानिकों (ख) (अनुदान नंबर: 15K19614, २६८६०८४५, 17K16298) के JSPS KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

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References

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अलगाव और मानव गर्भनाल के लक्षण वर्णन-व्युत्पंन Mesenchymal और अवधि के शिशुओं से स्टेम सेल
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Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

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