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Developmental Biology

Isolamento e caratterizzazione di umani cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale-derivato da prematuri e neonati a termine

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

Cordone ombelicale umano (UC) possono essere ottenuti durante il periodo perinatale a seguito di termine prematuro e postterm consegna. In questo protocollo, descriviamo l'isolamento e la caratterizzazione di UC-derivati di cellule staminali mesenchimali (MSCs-UC) da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.

Abstract

Cellule staminali mesenchimali (MSCs) hanno un notevole potenziale terapeutico e attrarre l'interesse crescente in campo biomedico. MSCs sono originariamente isolato e caratterizzato dal midollo osseo (BM), poi acquisita da tessuti compreso il tessuto adiposo, synovium, pelle, polpa dentale e degli annessi fetali come la placenta, sangue del cordone ombelicale (UCB) e del cordone ombelicale (UC). MSCs sono una popolazione eterogenea delle cellule con la capacità per (1) l'adesione alla plastica in condizioni di coltura standard, espressione di marcatori (2) superficie di CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34/CD14 /CD19 Fenotipi /HLA-DR e (3) trilineage differenziazione in adipociti, osteociti e condrociti, come attualmente definiti dalla società internazionale per la terapia cellulare (ISCT). Sebbene BM è la fonte più ampiamente usata di MSCs, la natura invasiva di aspirazione BM eticamente limita la sua accessibilità. Capacità di proliferazione e differenziazione di cellule staminali mesenchimali ottenute da BM generalmente diminuiscono con l'età del donatore. Al contrario, MSCs fetale ottenuto da UC hanno vantaggi come la capacità di differenziazione e proliferazione vigorosa. Non c'è nessuna preoccupazione etica per il campionamento di UC, come è in genere considerato come rifiuti sanitari. UC umano inizia a sviluppare con la continua crescita della cavità amniotic a 4-8 settimane di gestazione e continua a crescere fino a raggiungere 50-60 cm di lunghezza, e può essere isolato durante il periodo di consegna tutto neonato. Per guadagnare la comprensione nella patofisiologia delle malattie intrattabili, abbiamo usato UC-derivato MSCs (UC-MSCs) da infanti consegnati alle varie età gestazionale. In questo protocollo, descriviamo l'isolamento e la caratterizzazione di UC-MSCs da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.

Introduction

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Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono originariamente isolate e caratterizzata dal midollo osseo (BM)1,2 , ma può essere ottenute anche da una vasta gamma di tessuti compreso il tessuto adiposo, synovium, pelle, polpa dentale e degli annessi fetali 3. MSCs sono riconosciuti come una popolazione cellulare eterogenea che può proliferare e differenziarsi in condrociti, osteociti e adipociti. Inoltre, MSCs possiedono la capacità di migrare verso luoghi della ferita, sopprimere e modulare le risposte immunitarie e ritoccare e riparare le lesioni. Attualmente, MSCs da diverse fonti hanno attirato l'interesse crescente come una fonte per la terapia cellulare contro un certo numero di malattie intrattabili, compreso la malattia dell'innesto - contro - ospite, infarto miocardico e infarto cerebrale4,5 .

Sebbene BM è la fonte più ben caratterizzata di MSCs, l'invasività di aspirazione BM eticamente limita la sua accessibilità. Capacità di proliferazione e differenziazione di cellule staminali mesenchimali ottenute da BM generalmente diminuiscono con l'età del donatore. Al contrario, MSCs fetale ottenuto da annessi fetali come la placenta, sangue del cordone ombelicale (UCB), e del cordone ombelicale (UC) hanno vantaggi tra cui meno etiche preoccupazioni per quanto riguarda il campionamento e robusta la proliferazione e differenziazione capacità6 , 7. tra annessi fetali che solitamente vengono scartati come rifiuti sanitari, UCB e UC sono considerati un organo fetale, mentre la placenta è considerata di fetomaternal. Inoltre, placenta e UCB devono essere provati e raccolti nel momento esatto di consegna neonato, considerando che la placenta e UC possono essere raccolti ed elaborati dopo la consegna del neonato. Di conseguenza, UC è una promettente fonte MSC per terapia cellulare8,9.

UC umano inizia a sviluppare con la progressiva espansione della cavità amniotic a 4-8 settimane di gestazione, continua a crescere fino a 50-60 cm di lunghezza e possono essere isolati durante tutto il periodo di consegna neonato10. Per guadagnare la comprensione nella patofisiologia delle malattie intrattabili, usiamo UC-derivato MSCs (UC-MSCs) da infanti consegnati alle varie età gestazionale11,12. In questo protocollo, descriviamo come isolare e caratterizzare UC-MSCs da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.

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Protocol

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L'uso di campioni umani per questo studio è stato approvato dal comitato etico della Kobe University Graduate School of Medicine (approvazione n ° 1370 e 1694) e condotto in conformità con gli orientamenti approvati.

1. isolamento e coltura di UC-MSCs

Nota: UC-MSCs sono state correttamente isolate, coltivate, ed espansa (più di numero di passaggio 4) da più di 200 UCs sottoposto al presente protocollo. Tra più di 200 UCs, 100% hanno dimostrato il successo isolamento UC-MSC, meno del 5% hanno mostrato una contaminazione accidentale, a meno di 15% hanno indicato l'arresto di crescita, e più di 80% hanno mostrato riuscita espansione UC-MSC.

  1. Raccogliere UC.
    1. Preparare una provetta di plastica da 50 mL, una forbice asettico e una bottiglia di 500 mL di alfa modificato medium essenziale dell'Aquila minimo (alfa MEM) a 4 ° C.
    2. Asetticamente UC tagliare con una forbice chirurgica a circa 5-10 cm di lunghezza e ritirarlo subito dopo la nascita neonato dalla sezione cesarean.
    3. Immediatamente posto la UC in un tubo di plastica da 50 mL e aggiungere 20-30 mL di alfa MEM nel tubo.
    4. Memorizzare la UC a temperatura ambiente (TA) fino a quando è trasportato al laboratorio.
      Nota: Asettica UC sono memorizzabili in medium senza siero a RT fino a 2 giorni. Di conseguenza, UC ottenuti dagli ospedali vicini possono essere raccolti se è trasportato al laboratorio entro 2 giorni.
  2. Sezionare la UC.
    1. Preparare un vassoio di plastica, pipette di 25 mL di forbici e pinze, pipette da 10 mL, sterilizzati, due piastre di coltura del tessuto da 60 mm, tampone fosfato salino (PBS), enzima purificato si fonde (Vedi Tabella materiali, ricostituito con PBS sterile in una concentrazione 13 Wünsch unità/ml e conservati a-80 ° C) e una bottiglia di 500 mL di mezzo di riduttore del siero (Vedi Tabella materiali).
    2. Scaldare il PBS, enzima purificato fonde, ridotto del siero medio e terreno di coltura [alfa MEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% soluzione antibiotico antimicotico (AA) conservato a 4 ° C] a RT.
    3. Estrarre il UC dal tubo e inserirlo in un vassoio di plastica.
    4. Pesare e sezionare 5 g di UC con una forbice sterilizzata.
    5. Versare 10 mL di etanolo al 70% sopra la UC per sterilizzazione utilizzando una pipetta da 10 mL.
    6. Lavare la UC con 10 mL di PBS due volte utilizzando una pipetta da 10 mL.
    7. Posizionare il UC in un piatto di coltura del tessuto sterilizzato 60 mm (Vedi Figura 1, passaggio 1).
    8. Aggiungere 10 mL di mezzo di riduttore del siero nel piatto.
    9. Aggiungere 0,5 mL di miscele di enzima purificato per raggiungere una concentrazione finale di circa 0,62 Wünsch unità/mL.
      Nota: L'uso di miscele di enzima purificato invece di collagenasi tradizionale è stato indicato per migliorare il rendimento e redditività di UC-cellule staminali mesenchimali isolate da UC.
    10. Tagliare il UC in pezzi di 2-3 mm con forbici sterilizzate e forcipe (Vedi Figura 1, passaggio 2).
      Nota: Questo processo richiede circa 30 min.
    11. Incubare i pezzi UC a 37 ° C per 30 min in un'incubatrice di 5% CO2 .
    12. Tagliare i pezzi UC parzialmente digerito in pezzi più piccoli che scorrono facilmente attraverso una pipetta da 25 mL.
      Nota: Questo processo richiede circa 30 min.
    13. Incubare i pezzi più piccoli UC a 37 ° C per 15-45 min in un'incubatrice di 5% CO2 .
      Nota: Incubazione deve continuare fino a quando gli omogeneati diventano viscosi. Il tempo di digestione totale è di circa 120 min. Nel caso di utilizzo UCs da infanti prematuri, tuttavia, il tempo di digestione può essere accorciato perché quelli sono facilmente tagliare e digeriti.
  3. Isolare il UC-MSCs.
    1. Preparare quattro provette di plastica da 50 mL e una bottiglia di 500 mL di terreno di coltura.
    2. Dividere l'omogenato UC in due provette di plastica da 50 mL utilizzando una pipetta 25 mL, con circa 7,5 mL in ogni provetta.
    3. Aggiungere 20 mL di terreno di coltura in ogni provetta e mescolare bene.
    4. Filtrare ogni omogeneato UC attraverso un colino di cella di 100 µm posizionato sopra un nuovo tubo di raccolta di 50 mL, utilizzando una pipetta 25 mL per raccogliere le cellule derivate da UC.
      Nota: Questo processo dura circa 15 minuti ciascuno, come la soluzione UC digerita è appiccicosa.
    5. Centrifugare due tubi a 1.000 x g per 5 min.
    6. Attentamente, aspirare il supernatante e scartarlo.
    7. Risospendere il pellet cellulare in due tubi con 5 mL di terreno di coltura.
    8. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra di 60 mm e la coltura a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% (Vedi Figura 1, passaggio 3).
  4. Cultura UC-MSCs.
    1. Scaldare il PBS, tripsina-EDTA (0.25 w/v%) e cultura medio (alfa MEM contenente 10% FBS e 1% AA) a RT.
    2. Quando le cellule sono fissate ad una piastra di 60 mm, rimuovere il terreno di coltura e lavare con 5 mL di PBS due volte per rimuovere i detriti e globuli rossi.
      Nota: Cellule di solito appaiono in 3-5 giorni dopo il placcaggio iniziale (Vedi Figura 1, passaggio 4).
    3. Sostituire il terreno di coltura due volte a settimana e incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% fino al confluency di 90-100%.
      Nota: Ciò richiede solitamente 7-14 giorni dopo il placcaggio iniziale.
    4. Lavare le cellule con 5 mL di PBS due volte, aggiungere 0,5 mL di tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 5-10 min.
    5. Quando le cellule diventano arrotondate e distaccato, aggiungere 9 mL di terreno di coltura e mescolare bene per inattivare la tripsina.
    6. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra di 100 mm e la coltura a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% (Vedi Figura 1, punto 5).
    7. Sostituire il terreno di coltura due volte a settimana e incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% fino al confluency di 90-100%.
      Nota: Questo di solito prende 4-8 giorni dopo il placcaggio iniziale.
    8. Lavare le cellule con 10 mL di PBS due volte, aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 5-10 min.
    9. Quando le cellule diventano arrotondate e distaccato, aggiungere 9 mL di terreno di coltura e mescolare bene per inattivare la tripsina.
    10. Trasferire la sospensione cellulare in due nuove piastre di 100 mm e coltura a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% (Vedi Figura 1, punto 5).
    11. Ripetere la sottocultura (1:2 divisioni) fino al decimo passaggio (vedere Figura 1, punto 5).
      Nota: Perché le cellule coltivate in condizioni meno confluenti tendono a raggiungere precedente arresto della proliferazione, è importante per le cellule di passaggio con un rapporto di divisione di 1:2.
    12. Utilizzare celle al quinto a ottavo passaggio per analisi di superficie dell'indicatore delle cellule, analisi di differenziazione delle cellule ed altri esperimenti.
      Nota: Per mantenere la proliferazione vigorosa per quanto possibile, le cellule sono coltivate generalmente sotto più di 70-80% confluenti condizioni.

2. superficie dell'indicatore espressione di UC-MSCs

  1. Preparare le cellule in un piatto di 100 mm e dissociare li con 1 mL di tripsina-EDTA a 37 ° C per 5-10 min.
  2. Aggiungere 9 mL di terreno di coltura e centrifugare a 1.000 x g per 5 min.
  3. Aspirare il supernatante e scartarlo.
  4. Risospendere il pellet di cellule con 10 mL di PBS e centrifugare a 1.000 x g per 5 min, ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
  5. Risospendere le cellule con buffer di flusso cytometry (FCM) (PBS contenente 2 mM EDTA e 10% reagente bloccante) a ~ 1 × 106 cellule/mL.
  6. Trasferire 50-100 µ l di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 mL; aggiungere ficoeritrina (PE)-anticorpi contro CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 o HLA-DR; e incubare in ghiaccio per 45 min.
  7. Lavare le cellule con FCM buffer due volte e aggiungere 50-100 µ l di soluzione colorante attuabilità di 0,2% (Vedi Tabella materiali).
  8. Incubare a RT per 15 min, lavare le cellule con buffer di FCM due volte e celle filtranti attraverso un colino di cella di 70 µm.
  9. Eseguire le cellule attraverso il FCM e analizzare i risultati ottenuti utilizzando il software FCM secondo le istruzioni del produttore.

3. Trilineage differenziazione delle UC-MSC

  1. Eseguire il adipogenesis.
    1. Preparare una sospensione di cellule in terreno di coltura ad una concentrazione di 5 × 103 cellule/mL.
    2. Piastra 1 mL di sospensione cellulare in un piatto di 12-pozzetti e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per ~ 24 h.
    3. Sostituire il terreno di coltura con mezzo di differenziazione adipogenico (Vedi Tabella materiali) e incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% per 2-3 settimane. Cambiare mezzo di differenziazione adipogenico due volte a settimana.
    4. Lavare le cellule con PBS tre volte.
    5. Incubare le cellule in soluzione di formaldeide 4% per 30 minuti a TA.
    6. Lavare le cellule con PBS tre volte e con 60% isopropanolo tre volte.
    7. Preparare soluzione 0,5% olio rosso O sciogliendo 84 mg di olio rosso O in 10 mL di isopropanolo 100% e l'aggiunta di 6,7 mL di acqua distillata. Macchia le cellule con 1 mL di soluzione 0,5% olio rosso O a temperatura ambiente per 20 min.
    8. Lavare le cellule con 60% isopropanolo tre volte e visualizzare sotto un microscopio.
  2. Eseguire l'osteogenesi.
    1. Preparare una sospensione di cellule in terreno di coltura ad una concentrazione di 1 × 104 cellule/mL.
    2. Piastra 1 mL di sospensione cellulare in un piatto di 12-pozzetti e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per ~ 24 h.
    3. Sostituire il terreno di coltura con osteogeneic mezzo di differenziazione (Vedi Tabella materiali) e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 1-2 settimane. Sostituire il differenziamento osteogenico terreno due volte a settimana.
    4. Lavare le cellule con PBS tre volte.
    5. Incubare le cellule in soluzione di formaldeide 4% per 30 minuti a TA.
    6. Lavare le cellule con PBS tre volte.
    7. Preparare 2% colore rosso di alizarina S soluzione sciogliendo 200 mg di alizarina S rossa con 10 mL di acqua distillata. Macchia le cellule con 1 mL di soluzione al 2% colore rosso di alizarina S a RT per 3 min.
    8. Lavare i pozzetti con PBS tre volte e visualizzare sotto un microscopio.
  3. Eseguire chondrogenesis.
    1. Preparare una sospensione di cellule in terreno di coltura ad una concentrazione di 1,6 × 107 cellule/mL.
    2. Posizionare una goccia di 5 µ l di sospensione cellulare al centro del pozzo in un piatto di 12-pozzetti (micromass culture) e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 2-3 h.
    3. Delicatamente aggiungere 1 mL di mezzo di differenziazione condrogenica (Vedi Tabella materiali) e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 4-7 giorni. Cambiare mezzo di differenziazione condrogenica due volte a settimana.
    4. Lavare le cellule con PBS tre volte.
    5. Incubare le cellule in soluzione di formaldeide 4% per 30 minuti a TA.
    6. Lavare le cellule con PBS tre volte.
    7. Preparare soluzione allo 0,05% blu di toluidina sciogliendo 250 mg di blu di toluidina con 500 mL di tampone di acetato di sodio 0.1 M a pH 4.1. Macchia le cellule con 1 mL di soluzione di blu di toluidina allo 0,05% a temperatura ambiente per 30 min.
    8. Lavare le cellule con PBS tre volte e visualizzare sotto un microscopio.

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Representative Results

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Le procedure da collezione UC alla cultura MSC sono riassunti nella Figura 1. UC di circa 5-10 cm di lunghezza possono essere raccolti da tutti i neonati trasportati dalla sezione cesarean. UC inizia a svilupparsi a 4-8 settimane di gestazione e continua a crescere fino a 50-60 cm di lunghezza, come mostrato nella Figura 2. Ci sono due arterie (A), una vena (V), cavo fodera (CL) e gelatina di Wharton (WJ) nel UC, come raffigurato in Figura 3 e Figura 4. UC-MSCs può essere isolato da tutte le regioni del cavo o del cordone intero13. Perché UC da neonati con età gestazionale precoce è fragile e difficile per la dissezione in una regione di fune singola, UC-MSCs sono isolate dal cordonale11,12. Ci sono diversi metodi per isolare MSCs da UC, che comprendono l'espianto metodo14 e digestione enzimatica metodo15, più loro derivati16. A causa del più lungo ciclo di cultura, resa inferiore e precedente arresto di proliferazione associato l'espianto metodo17,18, UC-MSCs sono coltivate con metodo di digestione enzimatica come illustrato in Figura 5 e Figura 6.

I criteri minimi per la definizione di MSCs sono stabiliti con la ISCT e comprendono la loro caratterizzazione di superficie dell'indicatore19. Per determinare l'espressione di superficie dell'indicatore, UC-MSCs dai neonati pretermine e a termine sono incubate con anticorpi coniugati PE appropriati e analizzati tramite flusso cytometry. Sono positivo per gli indicatori di firma MSC (CD73, CD90, CD105) ma la negazione per monociti/macrofagi (CD14), endoteliali (CD34), ematopoietiche (CD19, CD45) e marcatori (HLA-DR) complessi di istocompatibilità, come illustrato nella Figura 7.

Secondo i criteri ISCT19, MSC deve possedere capacità di differenziazione mesodermal valutati da un'analisi di differenziazione di trilineage. Per valutare la capacità di differenziazione di trilineage, UC-MSCs dai neonati pretermine e a termine sono indotte a differenziarsi in condrociti sotto condizioni standard in vitro differenziazione, adipociti e osteociti. Come illustrato nella Figura 8, che sono bene-differenziati in tutti i tre tipi di cellule mesodermiche.

Figure 1
Figura 1 : Diagramma schematico di isolamento e coltura di UC-MSCs. Passaggio 1. 5-10 cm di UC raccolto asetticamente da tessuto placentare. Passaggio 2. Enzima purificato miscela-digerito UC pezzi. Passaggio 3. Cultura di UC-MSCs a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 . Passaggio 4. Allegato UC-MSCs è comparso ai 3 giorni dopo il placcaggio iniziale. Passaggio 5. Sottocultura di UC-MSCs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : UC da OSSC consegnato alle varie età gestazionale. Sono mostrati UCs da OSSC a 19-38 settimane della gestazione. La dimensione del UC aumenta con l'età gestazionale. Scala bar = 8 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Vista in sezione di UC dai neonati pretermine e a termine. Ci sono due arterie (A), una vena (V), cavo fodera (CL) e gelatina di Wharton (WJ) in UC dai neonati pretermine e a termine. Le dimensioni di questi tessuti variano con l'età gestazionale. Scala bar = 2 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Anatomia del UC. (A), 5 cm di UC dal termine infante. (B) sezione trasversale del UC. (C) parzialmente sezionato UC. Ci sono due arterie (A), una vena (V), cavo fodera (CL) e Jelly (WJ di Whalton). UC da infanti di prima età gestazionale è particolarmente fragile e difficile da essere dissecato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Dissezione UC utilizzare miscele di enzima purificato. (A) 5-10 cm di UC. (B) mm 2-3 pezzi di UC. (C) purificato pezzi di enzima miscela-digerito UC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Morfologia del UC-MSCs dai neonati pretermine e a termine. (A ed E) UC-MSCs al numero di passaggio 1 (P1) prima della sostituzione del terreno di coltura (r: X40; E: X200). (B e F) UC-MSCs P1 dopo la sostituzione del terreno di coltura (b: X40; F: X200). (C e G) UC-MSCs a P3 (c: X40; G: X200). (D e H) UC-MSCs al P5 (d: X40; H: X200). Scala bar = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Dai neonati pretermine e a termine in superficie dell'espressione dei marker di UC-MSCs. CD73/CD90/CD105-positivo e fenotipi CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-negativo si trovano in UC-MSCs da sia pretermine (22 settimane di gestazione) e neonati a termine (37 settimane di gestazione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8 : Trilineage differenziazione mesenchymal di UC-cellule staminali mesenchimali da neonati pretermine e a termine. UC-MSCs da pretermine (22 settimane di gestazione) e neonati a termine (37-40 settimane di gestazione) sono differenziati in adipociti (visualizzati da olio O rosso), Osteocita (visualizzate da alizarina S rossa) e condrociti (visualizzate con blu di toluidina). Immagini sono state scattate a 200x. Scala bar = 50 µm. Una parte di questa figura è stata adattata da Iwatani et al.11Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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MSCs può essere isolato da una varietà di tessuti e sono una popolazione eterogenea di cellule che fare express non tutti gli stessi marcatori fenotipici. Qui, abbiamo delineato un protocollo che guida la raccolta e la dissezione di UC dai neonati pretermine e a termine e consente l'isolamento e la coltura di UC-MSCs. A seguito di questo protocollo, abbiamo isolato correttamente UC-MSCs che soddisfano i criteri ISCT19 da OSSC trasportato a 19-40 settimane di gestazione e ha dimostrato che rappresentano alcuni aspetti della fisiopatologia della malattia intrattabile durante lo sviluppo prenatale11,12.

In BM-derivato MSCs (BM-MSCs), giovane donatore-derivati BM-MSCs generalmente mostrano maggiore potenziale proliferativo e differenziativo rispetto colleghi più anziani e tenere più potenziale per la terapia cellulare20,21. Allo stesso modo, pretermine UC-MSCs isolato da feti interrotto a 8-12 settimane di gestazione sono stati segnalati per esporre più vigorosa proliferazione e differenziazione rispetto al termine UC-MSCs isolato dai neonati trasportati a 37-40 settimane di gestazione22. Nonostante le differenze di età gestazionale e cavo regione, UC-MSCs isolato con questo protocollo inoltre ha rivelato una proliferazione più vigorosa del pretermine UC-MSCs di termine UC-MSCs12.

Un passo fondamentale nell'ambito di questo protocollo è la dissezione UC con miscele di enzima purificato che sono composti da collagenosi I e II e dispase. Come indicato nei risultati rappresentativi, la rigidità del UC varia drammaticamente con l'età gestazionale (Figura 2). Per raggiungere ottima dissezione di UC, il tempo di incubazione di enzima purificato miscele deve essere adattata per la rigidità del UC individuali. In genere, di solito richiede più tempo per termine UC di UC pretermine. Tra i metodi esistenti per isolare MSCs da UC, abbiamo scelto il metodo di digestione enzimatica15 oltre il metodo explant14 che può condurre ad un più lungo ciclo di cultura, resa inferiore e precedenti proliferazione arresto17,18. Un'importante modifica del metodo di digestione degli enzimi è l'uso di miscele di enzima purificato invece di collagenasi tradizionale, che consente una dissezione efficiente e coerenza di UC da feti/neonati con età gestazionale variabile.

Una limitazione di questo protocollo è l'uso di cavo intero per isolare MSCs da UC. Perché UC-MSCs può essere isolato da tutte le regioni del cavo o del cordone intero13, UC-MSCs sono isolate da cordonale in questo protocollo. Ciò è dovuto la fattibilità della dissezione UC da infanti prematuri. Tuttavia, la potenziale variazione della percentuale di ogni regione di cavo può limitare il rigoroso confronto tra UC-MSCs isolato dal presente protocollo.

UC-MSCs vengono sempre più utilizzati come fonte di cellule stromali mesenchimali per studi preclinici e clinici8,9. Nonostante questo maggiore utilizzo, un consenso su metodi di isolamento UC-MSCs è ancora mancano, che potrebbe sfociare in popolazioni differenti delle cellule possa essere ritenuto lo stesso UC-MSCs. Questo protocollo in definitiva aiuterà i ricercatori a comprendere meglio la derivazione e caratteristiche funzionali delle UC-MSC.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da localizzativi per Scientific Research (C) (concessione numero: 25461644) e giovani scienziati (B) (concedere numeri: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) di JSPS KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

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References

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Isolamento e caratterizzazione di umani cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale-derivato da prematuri e neonati a termine
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Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

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