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Developmental Biology

절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

인간의 탯 (UC) preterm, 용어, 결과로 perinatal 기간 동안 얻을 수 있습니다 하 고 postterm 배달. 이 프로토콜에서 우리 기술 분리와 UC 유래 중간 엽 줄기 세포 (UC-MSCs)의 태아/유아에서 임신 19-40 주.

Abstract

중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 상당한 치료 잠재력 있고 생물 의학 분야에서 증가 관심을 유치. MSCs는 원래 고립 된 골 수 (BM)에서 특징 그리고 지방 조직, 막, 피부, 치과 펄프와 같은 태 반, 태아 부속을 포함 하 여 조직에서 획득 한 탯 줄 혈액 (UCB), 그리고 탯 (UC). MSCs는 이종 세포 인구 (1) 표준 문화 조건, (2) 표면 마커 표현의 CD73 플라스틱 준수 한 용량+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- 고기, 그리고 (3) trilineage 차별화 adipocytes, osteocytes, 및 chondrocytes, 현재 국제 사회에 의해 세포 치료 (ISCT)에 대 한 정의를 실현. BM은 MSCs의 가장 널리 사용 되는 소스, BM 포부의 침략 적인 본질은 윤리적 접근을 제한 합니다. MSCs의 확산 및 감 별 법 용량 BM에서 얻은 일반적으로 기증자의 나 이와 함께 감소. 대조적으로, UC에서 얻은 태아 MSCs 활발 한 증식 및 분화 능력 등 장점이 있다. 그것은 일반적으로 의료 폐기물로 간주 UC 샘플링에 대 한 윤리적인 우려가입니다. 인간의 UC 4-8 주 임신에서 양수 내 구멍의 성장을 지속적으로 개발을 시작 하 고 성장 하는 길이, 50-60 cm를 도달할 때까지 계속 전체 신생아 배달 기간 동안 격리 될 수 있습니다. 다루기 힘든 질병의 이상에 대 한 통찰력을 얻으려면, UC 파생 MSCs (UC-MSCs) 다양 한 임신 나가에 전달 하는 유아에서 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 분리와 19-40 주 임신의 태아/유아에서 UC MSCs의 특성을 설명합니다.

Introduction

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중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 원래 고 골에서 (BM)1,2 특징 하지만 또한 다양 한 지방 조직, 막, 피부, 치과 펄프 및 태아 부속을 포함 하 여 조직에서에서 얻을 수 있습니다. 3. MSCs 격 증 하 고 adipocytes, osteocytes, 및 chondrocytes 차별화 수 있는 다른 유형의 세포 인구로 서 인식 됩니다. MSCs 상해의 사이트로 마이그레이션할 억제 하 고 면역 반응을 조절 하는 능력을 소유 하는 또한, 개장 하 고 상해를 복구. 현재, 서로 다른 소스에서 MSCs 이식-비교-호스트 질병, 심근 경색 및 뇌4,5 포함 하 여 다루기 힘든 질병의 숫자에 대 한 세포 치료에 대 한 원본으로 성장 관심을 받고 있다 .

BM은 MSCs의 가장 좋은 특징이 소스, BM 포부의 침입은 윤리적 접근을 제한 합니다. MSCs의 확산 및 감 별 법 용량 BM에서 얻은 일반적으로 기증자의 나 이와 함께 감소. 반면, 태 반, 탯 줄 혈액 (UCB) 등 태아 부속에서 얻은 태아 MSCs 및 탯 (UC) 샘플링 하 고 강력한 확산 및 감 별 법 용량6 덜 윤리적 문제를 포함 하는 장점이 있다 , 7. 중 의료 폐기물로 폐기 보통 태아 부속, UCB와 UC는 간주 태아 기관 태 fetomaternal 간주 됩니다. 또한, 태 반 및 UCB 샘플링 하 여 태 반 및 UC 수집 하 고 신생아 배달 후 처리 될 수 있습니다 신생아 배달의 정확한 순간에 수집 해야 합니다. 따라서, UC 세포 치료8,9대 유망 MSC 소스 이다.

인간의 UC 4-8 주 임신에서 양수 내 구멍의 진보적인 확장 개발을 시작 하 고 길이, 50-60 cm까지 성장 하 고 신생아 배달10의 전체 기간 동안 고립 될 수 있다. 다루기 힘든 질병의 이상에 대 한 통찰력을 얻으려면, 우리는 다양 한 임신 성 연령11,12에서 제공 하는 유아에서 UC 파생 MSCs (UC-MSCs) 사용 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 격리 하 고 19-40 주 임신의 태아/유아에서 UC-MSCs를 특성화 하는 방법을 설명 합니다.

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Protocol

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이 연구에 대 한 인간의 샘플의 사용 고베 대학 대학원의 학부 (승인 제 1370, 1694)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 승인된 지침에 따라 실시.

1. 격리와 UC MSCs의 문화

참고: UC-MSCs 성공적으로 격리 된, 교양, 그리고 확장된 (이상 통로 번호 4) 200 이상에서 UCs이이 프로토콜을 복종. 이상의 200 간에 UCs, 100% 나타났습니다 성공적인 UC MSC 격리, 5% 미만 15%로 나타났습니다 성장 검거 하 고 80% 이상 성공적인 UC MSC 확장 우발적인 오염 나타났습니다.

  1. UC를 수집 합니다.
    1. 50 mL 플라스틱 튜브를 준비, 무 균가 위, 그리고 알파의 500 mL 병 4 ° c.에이 글의 최소 필수 매체 (알파 MEM) 수정
    2. Aseptically 길이에서 대략 5-10 cm에서 수술 시저와 UC 잘라 고 제왕 절 개 하 여 신생아 출생 후 곧 그것을 수집 합니다.
    3. 즉시는 UC 50ml 플라스틱 튜브에 놓고 MEM 튜브에 알파의 20-30 mL를 추가 합니다.
    4. 그것은 실험실에 수송 될 때까지 실 온 (RT)에서 UC를 저장 합니다.
      참고: 무 균 UC 최대 2 일 동안 RT에서 혈 청 자유로운 매체에 저장할 수 있습니다. 따라서, 2 일 이내 실험실으로 전달 되는 경우 인근 병원에서 얻은 UC는 수집할 수 있습니다.
  2. UC를 해 부.
    1. 플라스틱 트레이, 소독된가 위, 집게, 10 mL 펫 25 mL 펫, 2 개의 60 m m 조직 문화 요리, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 준비, 정제 효소 혼합 (참조 테이블의 자료, 농도에서 살 균 PBS와 재구성 13 Wünsch 단위/mL의-80 ° C에 저장), 그리고 감소 된 혈 청 매체의 500 mL 병 ( 재료의 표참조).
    2. PBS, 정제 효소를 따뜻한 혼합, 실시간으로 혈 청 매체와 문화 매체 [알파 MEM 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 항생제 antimycotic 솔루션 (AA) 4 ° C에 저장]을 감소
    3. 튜브에서 UC를 꺼내와 플라스틱 쟁반에.
    4. 무게 하 고 소독된가 위 UC의 5 g를 해 부.
    5. 10 mL 피 펫을 사용 하 여 살 균을 위한 UC의 70% 에탄올 10 mL 붓는 다.
    6. PBS는 10 mL 피 펫을 사용 하 여 두 번의 10 mL와 UC를 씻어.
    7. 멸 균된 60 m m 조직 문화 접시에는 UC를 놓습니다 ( 그림 1, 1 단계 참조).
    8. 접시에 감소 된 혈 청 매체의 10 mL를 추가 합니다.
    9. 정제 효소 혼합 약 0.62 Wünsch 단위/mL의 최종 농도 도달의 0.5 mL를 추가 합니다.
      참고: 전통적인 콜라 대신 정제 효소 혼합의 사용 수율을 향상을 보여줘 왔다 그리고 UC MSCs의 UC에서 격리.
    10. 집게 (참조 그림 1, 2 단계)와 소독된가 위는 UC 2-3 m m 조각으로 잘라.
      참고: 이 프로세스는 약 30 분 걸립니다.
    11. UC 조각 5% CO2 배양 기에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    12. 부분적으로 소화 된 UC 조각 25 mL 피 펫을 쉽게 통과 하는 작은 조각으로 잘라.
      참고: 이 프로세스는 약 30 분 걸립니다.
    13. 작은 UC 조각 5% CO2 배양 기에서 15-45 분 동안 37 ° C에서 품 어.
      참고: 부 화는 homogenates 점성 될 때까지 계속 해야 합니다. 총 소화 시간은 약 120 분입니다. 그러나 Preterm 유아에서 UCs를 사용 하는 경우, 소화 시간 단축 수 있다 수 있기 때문에 그는 쉽게 잘라 소화.
  3. UC-MSCs를 격리 합니다.
    1. 4 50 mL 플라스틱 튜브와 문화 매체의 500 mL 병을 준비 합니다.
    2. UC homogenate를 2 50ml 플라스틱 튜브 각 튜브에 약 7.5 mL와 함께 25 mL 피 펫을 사용 하 여 나눕니다.
    3. 각 관으로 문화 매체의 20 mL를 추가 하 고 잘 혼합.
    4. 25 mL 피 펫을 사용 하 여 UC 파생 된 세포를 수집 하는 새로운 50 mL 컬렉션 튜브 위에 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 각 UC homogenate를 필터링 합니다.
      참고: 소화 UC 솔루션은 끈 적이 과정 각각 15 분 정도 걸립니다.
    5. 5 분 동안 1000 x g에서 두 튜브 원심
    6. 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기.
    7. 문화 매체의 5 mL와 함께 두 개의 튜브에서 셀 펠 릿을 resuspend.
    8. 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 문화와 새로운 60 m m 플레이트에 세포 현 탁 액을 전송 ( 그림 1, 3 단계 참조).
  4. -MSCs 문화 Uc입니다.
    1. PBS, 트립 신-EDTA (0.25 w/v%), 워밍업 및 매체 문화 (알파 MEM 10 %FBS 1 %AA 포함) 실시간을
    2. 셀 60 m m 플레이트에 장착 하는 경우 문화 매체를 제거 하 고 두 번 파편과 적혈구를 제거 하는 PBS의 5 mL로 씻어.
      참고: 연결 된 셀은 일반적으로 초기 도금 후 3-5 일에 나타납니다 ( 그림 1, 4 단계 참조).
    3. 두 번 주당 문화 매체를 대체 하 고 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 90-100 %confluency 품 어.
      참고: 이 일반적으로 초기 도금 후 7-14 일 걸립니다.
    4. 5 mL의 PBS로 세척 세포는 두 번, 트립 신-EDTA의 0.5 mL을 추가 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    5. 때 셀 반올림 되 고 문화 매체의 9 mL을 추가 하 고 잘 섞어 분리, 트립 신을 비활성화 하려면.
    6. 셀 서 스 펜 션 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 문화와 새로운 100 mm 접시에 전송 ( 그림 1, 5 단계 참조).
    7. 두 번 주당 문화 매체를 대체 하 고 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 90-100 %confluency 품 어.
      참고: 이 일반적으로 초기 도금 후 4-8 일 걸립니다.
    8. 10 mL PBS의 셀을 두 번 씻어 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    9. 때 셀 반올림 되 고 문화 매체의 9 mL을 추가 하 고 잘 섞어 분리, 트립 신을 비활성화 하려면.
    10. 셀 서 스 펜 션 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 두 문화와 새로운 100 mm 접시에 전송 ( 그림 1, 5 단계 참조).
    11. 10 번째 통로까지 subculture (1:2 분할)을 반복 ( 그림 1, 5 단계 참조).
      참고: 적은 confluent 조건 하에서 경작 하는 세포는 이전 확산 체포를 도달 하는 경향이, 때문에 분할 비율 1: 2의 통로 세포에 중요 하다.
    12. 5 8 통로에 세포를 사용 하 여 세포 표면 마커 분석, 세포 감 별 법 분석 실험, 및 다른 실험에 대 한.
      참고: 유지 하기 위해 가능한 한 길게를 위한 활발 한 증식, 세포 일반적으로 70-80 %confluent 조건 보다 더 아래 교양.

2. 표면 마커 UC MSCs의 표현

  1. 셀 100 mm 접시에 준비 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 트립 신-EDTA의 1 mL와 함께 그들을 떼어 놓다.
  2. 5 분 동안 1000 x g에서 문화 매체와 원심 분리기의 9 mL를 추가 합니다.
  3. 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기.
  4. PBS의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 고 1000 x g에서 원심 분리기는 5 분에 대 한 두 번이 세척 단계를 반복 합니다.
  5. ~ 1 × 106 셀/mL에서 교류 cytometry (FCM) 버퍼 (PBS 2 mM EDTA 및 10% 차단 시 약 포함)에 포함 된 셀을 resuspend.
  6. 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액의 50-100 µ L를 전송 phycoerythrin (PE) 추가-CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, 또는 HLA-DR;에 대 한 항 체를 활용 그리고 45 분 동안 얼음에 품 어.
  7. FCM과 워시 셀 두 번 버퍼링 하 고 0.2% 생존 염료 솔루션의 50-100 µ L를 추가 ( 재료의 표참조).
  8. 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 15 분, FCM 버퍼 두 번 세척 세포 및 필터 셀에 대 한 RT에서 품 어.
  9. FCM을 통해 셀을 실행 하 고 제조업체의 지침에 따라 FCM 소프트웨어를 사용 하 여 얻은 결과 분석.

3. Trilineage UC MSCs의 차별화

  1. 지질을 수행 합니다.
    1. 5 × 103 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
    2. 12-잘 접시에 셀 서 스 펜 션의 1 mL 접시 하 고 37 ° c ~ 24 h에 대 한 5% CO2 배양 기에서 품 어.
    3. Adipogenic 차별 매체와 문화 매체를 대체 ( 재료의 표참조)와 2-3 주 동안 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어. 일주일에 두 번 adipogenic 차별화 매체를 변경 합니다.
    4. PBS와 셀 세 번 씻어.
    5. 실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어
    6. 셀 60% 소 프로 파 놀과 PBS 세 번 세 번 씻어.
    7. 0.5% 기름 빨간 O 솔루션 준비 석유의 84 mg를 용 해 하 여 빨간 O 100% 소 프로 파 놀과 추가의 6.7 mL 10 mL에서 증류수. 20 분에 대 한 실시간에 0.5% 기름 빨간 O 솔루션의 1 mL로 세포 얼룩.
    8. 60% 소 프로 파 놀과 셀 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.
  2. 골을 수행 합니다.
    1. 1 × 104 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
    2. 12-잘 접시에 셀 서 스 펜 션의 1 mL 접시 하 고 37 ° c ~ 24 h에 대 한 5% CO2 배양 기에서 품 어.
    3. Osteogeneic 차별 매체와 문화 매체를 대체 ( 재료의 표참조) 고 1-2 주 동안 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어. 일주일에 두 번 osteogenic 차별화 매체를 변경 합니다.
    4. PBS와 셀 세 번 씻어.
    5. 실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어
    6. PBS와 셀 세 번 씻어.
    7. 알리자린의 200 mg를 용 해 하 여 2% 붉은 알리자린 S 용액 준비 빨간색 S 증류수 10 mL로. 2% 붉은 알리자린 S 솔루션 RT에서 3 분의 1 mL로 세포 얼룩.
    8. PBS와 웰 스 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.
  3. Chondrogenesis을 수행 합니다.
    1. 1.6 × 107 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
    2. 12-잘 접시 (micromass 문화)의 중심에 세포 현 탁 액의 5 µ L 방울을 배치 하 고 2-3 h 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어.
    3. 부드럽게 chondrogenic 차별화 매체의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 및 4-7 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 품 어. 일주일에 두 번 chondrogenic 차별화 매체를 변경 합니다.
    4. PBS와 셀 세 번 씻어.
    5. 실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어
    6. PBS와 셀 세 번 씻어.
    7. Ph 4.1 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼의 500 mL와 함께 블루 톨루이의 250 mg를 용 해 하 여 0.05% 톨루이 블루 솔루션을 준비 합니다. 30 분에 대 한 실시간에 0.05% 톨루이 블루 솔루션의 1 mL로 세포 얼룩.
    8. PBS와 셀 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.

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Representative Results

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MSC 문화 UC 컬렉션에서 절차는 그림 1에서 요약 된다. 길이 약 5-10 cm의 UC 제왕 절 개에 의해 전달 하는 모든 신생아에서 수집할 수 있습니다. UC는 임신의 4-8 주에 개발을 시작 하 고 그림 2와 같이 길이, 50-60 cm까지 성장 하 고. 그림 3그림 4에서 같이 두 동맥 (A), 한 맥 (V), 코드 (CL), 안 감과 튼의 젤리 (WJ) UC에 있습니다. UC-MSCs 모든 코드 영역 또는 전체 코드13에서 격리 될 수 있습니다. 초기 임신 연령대와 유아에서 UC는 취약 하며 단일 코드 영역으로 해 부에 대 한 어려운, 때문에 UC MSCs 전체 코드11,12으로부터 격리 됩니다. Explant 방법14 및 효소 소화 방법15, 플러스 그들의 파생 상품16를 포함 하는 UC에서 MSCs를 격리 하기 위해 여러 가지 방법이 있다. 더 이상 문화 주기, 낮은 수율 및 이전 확산 체포 explant 방법17,18와 관련 된, UC MSCs 효소 소화 방법 그림 5에서 볼 수 있듯이 교양 그림 6.

MSCs를 정의 하기 위한 최소한의 기준을 ISCT에 의해 설립 되 고 그들의 표면 마커 특성19를 포함 합니다. 표면 마커 식을 결정 하려면 UC-MSCs preterm와 기간 유아에서 적절 한 PE 활용 된 항 체와 알을 품는 고 cytometry에 의해 분석. 그들은 MSC 서명 마커 (CD73, CD90, CD105)에 대 한 긍정적인 하지만 대 한 부정적인 monocyte/대 식 세포 (CD14), 내 피 (CD34), 조 혈 (CD19, CD45) 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (HLA-DR) 마커, 그림 7에서 같이.

19ISCT 기준 따라 MSC mesodermal 차별화 용량 trilineage 차별화 분석 결과 의해 평가 보유 해야 합니다. Trilineage 차별화 능력 평가, UC-MSCs preterm와 기간 유아에서 osteocytes, adipocytes, 및 조건 표준 체 외에서 분화 chondrocytes로 차별화 하는 유도. 그림 8에서 같이, 그들은 잘 mesodermal 셀의 모든 세 가지 유형으로 차별화입니다.

Figure 1
그림 1 : UC MSCs의 문화와 격리의 회로도. 1 단계입니다. UC의 5-10 cm aseptically 태 반 조직에서 수집. 2 단계입니다. 정제 효소 혼합 소화 UC 조각입니다. 3 단계입니다. 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 UC MSCs의 문화. 4 단계입니다. 연결 된 UC-MSCs 초기 도금 후 3 일에서 나타났다. 5 단계입니다. UC의 subculture-MSCs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 다양 한 임신 나가에 태아/유아에서 UC 전달. 임신의 19-38 주에 태아/유아에서 UCs 표시 됩니다. UC의 크기와 임신 중인 나이 증가 한다. 스케일 바 = 8 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 용어 및 preterm 유아에서 UC의 단면 보기. Preterm와 기간 유아에서 두 동맥 (A), 한 맥 (V), 코드 (CL), 안 감과 튼의 젤리 (WJ) UC에 있습니다. 이러한 조직의 크기 임신 연령대와 다릅니다. 스케일 바 = 2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : UC의. (A)에서 UC의 5 cm의 유아 (B) UC의 횡단면. (C)는 부분적으로 UC를 해 부. 두 동맥 (A), 한 맥 (V), 코드 라이닝 (CL), 그리고 Whalton의 젤리 (WJ) 있다. 이전 임신 연령의 유아에서 UC는 특히 취약 하며 해 부 수 어렵다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : UC 해 부 정화 효소 혼합을 사용 하 여. (A) UC의 5-10 cm. UC의 (B) 2-3 m m 조각. (C) 정화 효소 혼합 소화 UC 조각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : UC-MSCs preterm와 기간 유아에서의 형태. (AE) UC-MSCs 문화 매체 (한: X40;의 교체 전에 통로 번호 1 (P1) E: X200)입니다. (BF) P1 문화 매체 (b: X40;의 교체 후에 UC-MSCs F: X200)입니다. (CG) UC-MSCs에서 P3 (c: X40; G: X200)입니다. (DH) P5에 UC-MSCs (d: X40; H: X200)입니다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 : 용어 및 preterm 유아에서 UC MSCs의 마커 식 표면. CD73/CD90/CD105-긍정과 CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-네거티브 고기는 preterm (임신 22 주)와 (37 주 임신) 기간 유아에서 UC MSCs에서 발견 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8 : 용어 및 preterm 유아에서 UC MSCs의 Trilineage 엽 차별화. UC-MSCs preterm (임신 22 주) 및 용어 (37-40 주 임신) 유아 체형으로 분화 된다 (에 의해 시각 기름 빨간 O), osteocyte (알리자린에 의해 시각 빨간색 S), 그리고 chondrocyte (톨루이 블루에 의해 시각). 이미지는 200 x에서 촬영 했다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 일부가 이와타 외.11에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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MSCs는 다양 한 조직에서에서 고립 될 수 있다 고 할 모든 익스프레스 같은 phenotypic 표식 셀의 이종 인구. 여기, 우리는 preterm와 기간 유아에서 수집 및 UC의 해 부 가이드 및 절연 UC MSCs의 문화를 가능 하 게 하는 프로토콜을 설명 했다. 이 프로토콜에 따라 우리는 성공적으로 고립 된 UC-MSCs ISCT 기준19 태아/유아 임신 19-40 주에 전달 하 고 다루기 힘든 질병 이상의 일부 측면을 나타내는 시연에서 충족 동안 태아 개발11,12.

BM 파생 MSCs (BM-MSCs), 젊은 기증자 파생 BM MSCs 일반적으로 이전 보다 더 큰 증식 및 differentiative 잠재력을 표시 하 고 셀 치료20,21에 대 한 더 많은 잠재력이. 마찬가지로, 태아 임신의 8 ~ 12 주에 중단에서 격리 하는 preterm UC-MSCs 더 활발 한 확산 및 용어 UC-MSCs 임신22의 37-40 주에 전달 하는 신생아에서 격리에 비해 차별화를 보도 했다. 임신 나이 및 코드 지역 차이도 불구 하 고 UC-MSCs 절연이 프로토콜을 또한 용어 UC MSCs12보다 preterm UC-MSCs의 더 활발 한 증식을 밝혔다.

이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 정화 효소의 혼합을 가진 UC 해 부 I, II 및 dispase 콜라의 구성. 대표 결과에 명시 된 대로 UC의 강성 극적으로 임신 나이 (그림 2) 다양 한. UC의 최적의 해 부를 위해 순화 된 효소의 외피 시간 개별 UC의 강성을 조정할 수 필요가 혼합 합니다. 일반적으로, 일반적으로 걸리는 긴 기간 preterm UC 보다 UC에 대 한. UC에서 MSCs를 분리 하는 기존의 방법, 가운데 우리 더 이상 문화 주기, 낮은 수확량 및 이전 확산 체포17,18이어질 수 있습니다 explant 방법14 효소 소화 방법15 선택. 효소 소화 방법의 중요 한 수정은 효율적이 고 일관 된 해 부 UC의 가변 임신 연령대와 태아/유아에서 가능 하 게 전통적인 콜라 대신 정제 효소 혼합의 사용 이다.

이 프로토콜의 제한 UC에서 MSCs를 분리 하는 전체 코드의 사용 이다. UC-MSCs 모든 코드 영역 또는 전체 코드13에서 격리 될 수 있습니다, 때문에 UC MSCs이이 프로토콜에 전체 코드에서 격리 됩니다. 이것은 preterm 유아에서 UC 해 부의 타당성입니다. 그러나, 각 코드 영역의 비율에서 잠재적인 변이 UC-MSCs이이 프로토콜에 의해 고립 된 엄격한 비교를 제한할 수 있습니다.

UC-MSCs 점점 사용 되고있다 mesenchymal stromal 세포의 소스로 전 임상 및 임상 연구8,9. 이 증가 사용에도 불구 하 고 UC MSCs 격리의 방법에 대 한 합의 아직 실종이 같은 UC MSCs 간주를 다른 세포 인구에서 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜 궁극적으로 더 나은 이해 파생 및 UC MSCs의 기능적 특성에 연구원을 지원 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 Scientific Research (C)에 대 한 보조금에 의해 지원 되었다 (번호 부여: 25461644)와 젊은 과학자 (B) (번호 부여: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) JSP KAKENHI의.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

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References

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절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화
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Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

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