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Developmental Biology

Isolamento e caracterização de células humanas de Cordão Umbilical-derivados mesenquimais haste de prematuros e recém-nascidos de termo

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

Cordão umbilical humano (UC) podem ser obtido durante o período perinatal como resultado de pré-termo, termo e postterm entrega. Neste protocolo, descrevemos o isolamento e caracterização de UC-derivado células-tronco mesenquimais (UC-MSCs) de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

Abstract

Células-tronco mesenquimais (MSCs) têm considerável potencial terapêutico e atrair o interesse crescente no campo biomédico. MSCs são originalmente isolados caracteriza-se da medula óssea (BM), e adquiridos a partir de tecidos, incluindo o tecido adiposo, membrana sinovial, pele, polpa dental e apêndices fetais, tais como a placenta, sangue do cordão umbilical (UCB) e do cordão umbilical (UC). MSCs são uma população heterogênea de células com capacidade para (1) a adesão ao plástico em condições de cultura padrão, expressão do marcador (2) superfície de CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34/CD14 /CD19 Fenótipos de /HLA-DR e (3) trilineage diferenciação em adipócitos, condrócitos, como atualmente definidos pela sociedade internacional para terapia celular (ISCT) e osteócitos. Embora BM é a fonte mais amplamente utilizada de MSCs, a natureza invasiva da aspiração BM eticamente limita sua acessibilidade. Capacidade de proliferação e diferenciação de MSCs obtidos de BM geralmente diminuem com a idade do doador. Em contraste, MSCs fetais obtidos a partir da UC tem vantagens tais como a capacidade de diferenciação e proliferação vigorosa. Não há nenhuma preocupação ética para amostragem de UC, como é normalmente considerado como lixo hospitalar. UC humana começa a desenvolver-se com o contínuo crescimento da cavidade amniótica com 4-8 semanas de gestação e continua a crescer até atingir 50 a 60 cm de comprimento, e pode ser isolado durante o período de entrega todo recém-nascido. Para obter informações sobre a fisiopatologia das doenças intratáveis, usamos UC-derivado MSCs (UC-MSCs) de crianças entregadas às várias idades gestacional. Neste protocolo, descrevemos o isolamento e caracterização da UC-MSCs de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

Introduction

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Células-tronco mesenquimais (MSCs) são originalmente isoladas e caracterizado da medula óssea (BM)1,2 , mas também pode ser obtidas de uma grande variedade de tecidos, incluindo o tecido adiposo, membrana sinovial, pele, polpa dental e apêndices fetais 3. MSCs são reconhecidos como uma população heterogênea de células que pode se proliferar e se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos. Além disso, o MSCs possuem a capacidade de migrar para locais de ferimento, suprimir e modulam respostas imunes e remodelar e reparar a lesão. Atualmente, MSCs de diferentes fontes têm atraído interesse crescente como fonte de terapia celular contra uma série de doenças intratáveis, incluindo doença do enxerto - versus - hospedeiro, infarto do miocárdio e infarto cerebral4,5 .

Embora BM é a fonte mais bem caracterizada do MSCs, a invasão de aspiração BM eticamente limita sua acessibilidade. Capacidade de proliferação e diferenciação de MSCs obtidos de BM geralmente diminuem com a idade do doador. Em contraste, MSCs fetais obtido a partir de apêndices fetais, tais como a placenta, o sangue do cordão umbilical (UCB), e do cordão umbilical (UC) têm vantagens, incluindo preocupações menos éticas de amostragem e robusta de proliferação e diferenciação de capacidade6 , 7. entre fetais apêndices que geralmente são descartadas como resíduos hospitalares, UCB e UC são considerados um órgão fetal, enquanto a placenta é considerado síndrome. Além disso, placenta e UCB precisam ser amostrados e recolhidos no momento da entrega do recém-nascido, Considerando que a placenta e UC podem ser coletadas e processadas após a entrega do recém-nascido. Nesse sentido, UC é uma fonte promissora de MSC para celular terapia8,9.

UC humana começa a desenvolver com a progressiva expansão da cavidade amniótica com 4-8 semanas de gestação, continua a crescer até 50-60 cm de comprimento e pode ser isolado durante todo o prazo de entrega recém-nascido10. Para obter informações sobre a fisiopatologia das doenças intratáveis, usamos UC-derivado MSCs (UC-MSCs) de crianças entregadas às várias idades gestacional11,12. Neste protocolo, descrevemos como isolar e caracterizar UC-MSCs de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

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Protocol

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O uso de amostras humanas para este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética da Kobe University Graduate School of Medicine (SVGW 1370 e 1694) e conduzido de acordo com as diretrizes aprovadas.

1. isolamento e cultura de UC-MSCs

Nota: UC-MSCs foram isolados com sucesso, culta, e expandido (mais do que o número de passagem 4) de mais de 200 UCs sujeitos ao presente protocolo. Entre mais de 200 UCs, 100% mostraram bem sucedido isolamento UC-MSC, menos de 5% mostraram contaminação acidental, menos do que 15% mostraram a prisão de crescimento, e mais de 80% têm mostrado bem sucedida expansão UC-MSC.

  1. Recolha a UC.
    1. Preparar um tubo de plástico de 50 mL, uma tesoura asséptica e uma garrafa de 500 mL de alfa modificado mínimo essencial médio do águia (alfa MEM) a 4 ° C.
    2. Assepticamente cortado UC com uma tesoura cirúrgica aproximadamente 5-10 cm de comprimento e coletá-lo logo após o nascimento de recém-nascidos por cesárea.
    3. Imediatamente coloque a UC em um tubo de plástico de 50 mL e adicionar 20-30 mL de alfa MEM no tubo.
    4. Armazene a UC em temperatura ambiente (RT) até que ele é transportado para o laboratório.
      Nota: Asséptico UC pode ser armazenado em meio livre de soro no RT por até 2 dias. Portanto, a UC obtido de hospitais vizinhos pode ser coletado se é entregue ao laboratório dentro de 2 dias.
  2. Disse UC.
    1. Prepare uma bandeja plástica, esterilizado tesoura e pinça, pipetas de 10 mL, pipetas de 25 mL, dois pratos de cultura de tecidos de 60mm, tampão fosfato salino (PBS), enzima purificada combina (ver Tabela de materiais, reconstituído com PBS estéril em uma concentração de 13 Wünsch unidades/mL e armazenado a-80 ° C) e um frasco de 500 mL de meio de soro reduzida (ver Tabela de materiais).
    2. Aquecer a PBS, enzima purificada combina, reduzida média de soro e meio de cultura [alfa MEM contendo 10% fetal de soro bovino (FBS) e 1% solução antibiótico antimicótico (AA) armazenadas a 4 ° C] para RT
    3. Retire a UC do tubo e colocá-lo em uma bandeja plástica.
    4. Pesar e dissecar 5g de UC com uma tesoura esterilizada.
    5. Verta o UC para esterilização utilizando uma pipeta de 10 mL, 10 mL de etanol a 70%.
    6. Lave o UC com 10 mL de PBS duas vezes usando uma pipeta de 10 mL.
    7. Coloque o UC em um prato de cultura de tecidos esterilizados 60 mm (ver Figura 1, etapa 1).
    8. Adicione 10 mL de meio de soro reduzida no prato.
    9. Adicione 0,5 mL de misturas de enzima purificada para atingir uma concentração final de aproximadamente 0,62 Wünsch unidades/mL.
      Nota: A utilização de misturas de enzima purificada em vez de colagenase tradicional foi mostrada para melhorar o rendimento e a viabilidade da UC-MSCs isoladas de UC.
    10. Corte a UC em pedaços de 2-3 mm com tesoura esterilizada e pinça (consulte a Figura 1, passo 2).
      Nota: Este processo leva cerca de 30 min.
    11. Incube as peças UC a 37 ° C por 30 min em uma 5% CO2 incubadora.
    12. Corte os pedaços UC parcialmente digerido em pedaços menores que fluem facilmente através de uma pipeta de 25 mL.
      Nota: Este processo leva cerca de 30 min.
    13. Incube os pedaços menores de UC a 37 ° C por 15 a 45 min numa incubadora 5% CO2 .
      Nota: Incubação deve continuar até que o homogenates tornar-se viscoso. O tempo de digestão total é aproximadamente 120 min. No caso de usar o UCs de infantes prematuros, no entanto, o tempo de digestão pode ser encurtado porque aqueles são facilmente cortados e digeridos.
  3. Isole o UC-MSCs.
    1. Prepare-se quatro tubos de plástico de 50 mL e uma garrafa de 500 mL de meio de cultura.
    2. Divida o homogenate UC em dois tubos de plástico de 50 mL com uma pipeta de 25 mL, com cerca de 7,5 mL em cada tubo.
    3. Adicionar 20 mL de meio de cultura em cada tubo e misture bem.
    4. Filtre cada UC homogenate através de um filtro de célula de 100 µm colocado em cima de um novo tubo de coleção de 50 mL, usando uma pipeta de 25 mL para recolher pilhas UC-derivado.
      Nota: Este processo leva cerca de 15 min cada, como a solução UC digerida é pegajosa.
    5. Centrifuga os dois tubos a 1.000 x g por 5 min.
    6. Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante e descartá-lo.
    7. Resuspenda as pelotas de célula em dois tubos com 5 mL de meio de cultura.
    8. Transferir a suspensão de células em uma nova placa de 60 mm e cultura a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 (consulte a Figura 1, etapa 3).
  4. Cultura UC-MSCs.
    1. Aquecer a PBS, do trypsin-EDTA (0,25 w/v%) e meio de cultura (alfa MEM contendo 10% FBS e 1% AA) para RT
    2. Quando as células estão conectadas a uma placa de 60 mm, retire o meio de cultura e lavar com 5 mL de PBS duas vezes para remover detritos e células vermelhas do sangue.
      Nota: Células anexadas geralmente aparecem no 3-5 dias após o chapeamento inicial (consulte a Figura 1, etapa 4).
    3. Substituir o meio de cultura, duas vezes por semana e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 até confluência de 90-100%.
      Nota: Isso geralmente leva 7-14 dias após a inicial do chapeamento.
    4. Lavam-se duas células com 5 mL de PBS, adicionar 0,5 mL de EDTA-tripsina e incubar a 37 ° C, durante 5-10 min.
    5. Quando as células se tornam arredondadas e separada, adicione 9 mL do meio de cultura e misture bem para inactivar a tripsina.
    6. Transferir a suspensão de células em uma nova placa de 100mm e cultura a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 (consulte a Figura 1, passo 5).
    7. Substituir o meio de cultura, duas vezes por semana e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 até confluência de 90-100%.
      Nota: Isto normalmente leva 4-8 dias após a inicial do chapeamento.
    8. Lavam-se duas células com 10 mL de PBS, adicionar 1 mL de EDTA-tripsina e incubar a 37 ° C, durante 5-10 min.
    9. Quando as células se tornam arredondadas e separada, adicione 9 mL do meio de cultura e misture bem para inactivar a tripsina.
    10. Transferir a suspensão de células em duas novas placas de 100 mm e cultura a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 (consulte a Figura 1, passo 5).
    11. Repetem a subcultura (divisões de 1:2) até a décima passagem (ver Figura 1, passo 5).
      Nota: Porque as células cultivadas sob condições menos confluentes tendem a chegar a prisão de proliferação anterior, é importante para as células de passagem com uma razão de split de 1:2.
    12. Use células na passagem de quinta a oitava para análise de marcador de superfície celular, ensaio de diferenciação de células e outras experiências.
      Nota: Para manter a proliferação vigorosa por tanto tempo quanto possível, as células são geralmente cultivadas sob mais de 70-80% condições confluente.

2. superfície marcador expressão da UC-MSCs

  1. Preparar as células em uma placa de 100mm e dissociá-los com 1 mL de EDTA-tripsina a 37 ° C por 5-10 min.
  2. Adicione 9 mL do meio de cultura e centrifugar a 1.000 x g por 5 min.
  3. Aspirar o sobrenadante e descartá-lo.
  4. Resuspenda as pelotas de celular com 10 mL de PBS e centrifugar a 1.000 x g por 5 min. Repita este passo lavar duas vezes.
  5. Ressuspender as células com buffer de fluxo cytometry (FCM) (PBS contendo EDTA 2 mM e 10% bloqueio reagente) ~ 1 × 106 células/ml.
  6. Transferir 50-100 µ l de suspensão de células em um tubo de 1,5 mL; Adicionar ficoeritrina (PE)-conjugados com anticorpos contra CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 ou HLA-DR; e incubar no gelo por 45 min.
  7. Lavagem de células com FCM buffer duas vezes e adicionar 50-100 µ l da solução de tintura de viabilidade de 0,2% (ver Tabela de materiais).
  8. Incube a RT por 15 min, lavagem de células com buffer do FCM duas vezes e filtro células através de um filtro de célula de 70 µm.
  9. Executar as células através da FCM e analisar os resultados obtidos utilizando software FCM de acordo com as instruções do fabricante.

3. Trilineage diferenciação de UC-MSCs

  1. Execute adipogenesis.
    1. Prepare uma suspensão de células em meio de cultura em concentrações de 5 × 103 células/mL.
    2. 1 mL de suspensão de células em uma placa de 12 da placa e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para ~ 24 h.
    3. Substituir o meio de cultura com o meio de diferenciação de adipogenic (ver Tabela de materiais) e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 por 2-3 semanas. Alterar o meio de diferenciação de adipogenic duas vezes por semana.
    4. Lave as células com PBS três vezes.
    5. Incubar as células em solução de formol 4% durante 30 min à RT
    6. Lave as células com PBS três vezes e com isopropanol 60% três vezes.
    7. Preparar 0,5% óleo vermelho O solução dissolvendo-se 84 mg de óleo O vermelho em 10 mL de isopropanol 100% e adição de 6,7 mL de água destilada. Mancha de células com 1 mL de solução de O óleo vermelho 0,5% em RT por 20 min.
    8. Lavar as células com isopropanol 60% três vezes e Visualizar em um microscópio.
  2. Execute a osteogênese.
    1. Prepare uma suspensão de células em meio de cultura em uma concentração de 1 × 104 células/mL.
    2. 1 mL de suspensão de células em uma placa de 12 da placa e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para ~ 24 h.
    3. Substituir o meio de cultura com o meio de diferenciação de osteogeneic (ver Tabela de materiais) e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 por 1-2 semanas. Alterar o meio de diferenciação osteogênica duas vezes por semana.
    4. Lave as células com PBS três vezes.
    5. Incubar as células em solução de formol 4% durante 30 min à RT
    6. Lave as células com PBS três vezes.
    7. Prepare 2% vermelho de alizarina S solução dissolvendo-se 200 mg de alizarina S vermelho com 10 mL de água destilada. Mancha de células com 1 mL de solução de S de vermelho de alizarina 2% em RT por 3 min.
    8. Lavar poços com PBS três vezes e Visualizar em um microscópio.
  3. Execute a condrogênese.
    1. Prepare uma suspensão de células em meio de cultura em uma concentração de 1,6 × 107 células/mL.
    2. Coloque uma gota de 5 µ l de suspensão de células do centro do poço em uma placa de 12 (micromass culturas) e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para 2-3 h.
    3. Delicadamente, adicione 1 mL de meio de diferenciação de chondrogenic (ver Tabela de materiais) e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 4-7 dias. Alterar o meio de diferenciação de chondrogenic duas vezes por semana.
    4. Lave as células com PBS três vezes.
    5. Incubar as células em solução de formol 4% durante 30 min à RT
    6. Lave as células com PBS três vezes.
    7. Prepare a solução de azul de toluidina 0,05% dissolvendo-se 250 mg de azul de toluidina com 500 mL de tampão de acetato de sódio 0,1 M com pH 4.1. Mancha de células com 1 mL de solução de azul de toluidina 0,05% em RT por 30 min.
    8. Lavar as células com PBS três vezes e Visualizar em um microscópio.

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Representative Results

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Os procedimentos de coleta de UC à cultura MSC são resumidos na Figura 1. UC de aproximadamente 5 a 10 cm de comprimento pode ser coletada de todos os recém-nascidos entregados por cesárea. UC começa a desenvolver-se em 4-8 semanas de gestação e continua a crescer até 50-60 cm de comprimento, como mostrado na Figura 2. Existem duas artérias (A), (V) de uma veia, forro de cabo (CL) e geleia de Wharton (WJ) em UC, conforme representado na Figura 3 e Figura 4. UC-MSCs podem ser isolados de todas as regiões de cabo ou cabo inteiro13. Porque UC de lactentes com idade gestacional é frágil e difícil para dissecção para região um único cabo, UC-MSCs são isolados de toda cabo11,12. Existem vários métodos para isolar o MSCs da UC, que incluem o explante método14 e digestão enzimática método15, além de seus derivados16. Devido o ciclo mais longo de cultura, menor rendimento e detenção de proliferação anterior associado com o método de explant17,18, UC-MSCs são cultivadas pelo método de digestão enzimática, conforme ilustrado na Figura 5 e Figura 6.

Os critérios mínimos para definir MSCs são estabelecidos pelo ISCT e possuem sua superfície marcador caracterização19. Para determinar a expressão de superfície de marcador, UC-MSCs de infantes prematuros e de termo são incubadas com anticorpos conjugados a PE apropriados e analisadas por citometria de fluxo. Eles são positivas para os marcadores de assinatura MSC (CD73, CD90, CD105) mas negativo para monócitos/macrófagos (CD14), endotelial (CD34), hematopoiéticas (CD19, CD45) e marcadores de (HLA-DR) complexos principal de histocompatibilidade, conforme mostrado na Figura 7.

De acordo com os critérios ISCT19, MSC deve possuir capacidade de diferenciação do mesoderma, avaliada por um ensaio de diferenciação de trilineage. Para avaliar a capacidade de diferenciação de trilineage, UC-MSCs de infantes prematuros e de termo são induzidas de se diferenciar em condrócitos condições padrão em vitro diferenciação, adipócitos e osteócitos. Como mostrado na Figura 8, eles são bem diferenciados em todos os três tipos de células mesodérmicas.

Figure 1
Figura 1 : Diagrama esquemático de isolamento e cultura de UC-MSCs. Passo 1. 5 a 10 cm da UC coletados assepticamente de tecido placentário. Passo 2. Enzima purificada digerida a mistura peças UC. Passo 3. Cultura da UC-MSCs a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 . Passo 4. UC-MSCs anexados apareceram em 3 dias após o chapeamento inicial. Passo 5. Subcultura de UC-MSCs. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : UC de fetos/recém-nascidos entregues em várias idades gestacional. UCs de fetos/bebês em 19-38 semanas de gestação são mostrados. O tamanho da UC aumenta com a idade gestacional. Escala de barras = 8 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Vista secional da UC de infantes prematuros e de termo. Existem duas artérias (A), (V) de uma veia, forro de cabo (CL) e geleia de Wharton (WJ) em UC de infantes prematuros e de termo. Os tamanhos desses tecidos variam com a idade gestacional. Escala de barras = 2 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Anatomia do UC. (A), 5 cm de UC do termo infantil. (B) seção transversal de UC. (C) parcialmente dissecados UC. Existem duas artérias (A), (V) de uma veia, forro de cabo (CL) e geleia (WJ do Whalton). UC de infantes de anteriormente as idades gestacional é particularmente frágil e difícil de ser dissecado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Dissecação de UC utilizar misturas de enzima purificada. () 5 a 10 cm da UC. (B) peças de 2-3mm de UC. (C) purificado pedaços UC enzima mistura-digerido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Morfologia da UC-MSCs de infantes prematuros e de termo. (A e E) UC-MSCs no número de passagem 1 (P1) antes da substituição do meio de cultura (r: X40; E: X200). (B e F) UC-MSCs no P1 após a substituição do meio de cultura (b: X40; F: X200). (C e G) UC-MSCs no P3 (c: X40; G: X200). (D e H) UC-MSCs no P5 (d X40; H: X200). Barras de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : Expressão do marcador de UC-MSCs de superfície de infantes prematuros e de termo. CD73/CD90/CD105-positivo e CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-negativo fenótipos são encontrados em UC-MSCs de pré-termo (22 semanas de gestação) e recém-nascidos de termo (37 semanas de gestação). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8 : Trilineage de diferenciação mesenquimal de UC-MSCs de infantes prematuros e de termo. UC-MSCs de prematuros (22 semanas de gestação) e recém-nascidos de termo (37-40 semanas de gestação) são diferenciadas em adipócitos (visualizado por óleo O vermelho), osteócito (visualizado por alizarina S vermelho) e condrócitos (visualizado por azul de toluidina). Imagens foram tiradas no x 200. Barras de escala = 50 µm. Uma parte desta figura foi adaptada de Iwatani et al.11Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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MSCs podem ser isoladas em uma variedade de tecidos e são uma população heterogênea de células que fazer express não todos os marcadores fenotípicos mesmos. Aqui, nós esboçamos um protocolo que orienta a coleta e a dissecação da UC de infantes prematuros e de termo e permite o isolamento e cultura de UC-MSCs. Na sequência deste protocolo, isolamos com êxito o UC-MSCs que cumprir os critérios ISCT19 de fetos/recém-nascidos entregues às 19-40 semanas de gestação e demonstrou que elas representam alguns aspectos da fisiopatologia da doença intratável durante o desenvolvimento pré-natal11,12.

Em BM-derivado MSCs (BM-MSCs), BM-MSCs mais novos doador-derivado geralmente mostram potencial maior de proliferativa e differentiative do que os colegas mais velhas em têm mais potencial para celular terapia20,21. Da mesma forma, prematuridade UC-MSCs isoladas de feto abortado às 8-12 semanas de gestação foram relatados para expor mais vigorosa de proliferação e diferenciação em relação ao termo UC-MSCs isoladas de recém-nascidos entregados em 37-40 semanas de gestação de22. Apesar das diferenças de idade gestacional e a região do cabo, UC-MSCs isoladas com este protocolo também revelaram uma proliferação mais vigorosa da UC-MSCs pré-termo que termo UC-MSCs12.

Um passo crítico no âmbito do presente protocolo é a dissecação de UC com misturas de enzima purificada que são compostas de colagenase I e II e dispase. Conforme descrito nos resultados representativos, a rigidez da UC variadas dramaticamente com a idade gestacional (Figura 2). Para atingir o ideal dissecação da UC, o tempo de incubação da enzima purificada mistura precisa ser ajustada para a rigidez da UC individual. Geralmente, geralmente demora mais para termo UC que UC pré-termo. Entre os métodos existentes para isolar MSCs da UC, escolhemos o método de digestão enzimática15 sobre o método de explant14 que pode levar a um ciclo mais longo de cultura, menor rendimento e proliferação anterior prisão17,18. Uma modificação importante do método de digestão enzimática é a utilização de misturas de enzima purificada em vez de colagenase tradicional, o que permite uma dissecação eficiente e consistente da UC de fetos/recém-nascidos com idade gestacional variável.

Uma limitação do presente protocolo é o uso de fio inteiro para isolar MSCs da UC. Porque UC-MSCs podem ser isolados de todas as regiões de cabo ou cabo inteiro13, UC-MSCs são isolados do cordão todo neste protocolo. Isto é devido a viabilidade de dissecação da UC de prematuros. No entanto, a potencial variação na proporção de cada região do cabo pode limitar a comparação estrita entre UC-MSCs isoladas pelo presente protocolo.

UC-MSCs estão sendo cada vez mais usados como fonte de células estromais mesenquimais para estudos pré-clínicos e clínicos,8,9. Apesar desse uso aumentado, um consenso sobre os métodos de isolamento de UC-MSCs ainda está desaparecido, que pode resultar em populações de células diferentes para ser considerada as mesmas UC-MSCs. Este protocolo, finalmente, ajudará os pesquisadores na melhor compreensão da derivação e características funcionais do UC-MSCs.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Grants-in-Aid para Scientific Research (C) (número de concessão: 25461644) e jovens cientistas (B) (conceder números: 15 19614 K, 26860845, 17 K 16298) de JSPS KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

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References

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Isolamento e caracterização de células humanas de Cordão Umbilical-derivados mesenquimais haste de prematuros e recém-nascidos de termo
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Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

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