Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Isolering och karakterisering av navelsträngen-derived mesenkymala stamceller från prematura och benämner spädbarn

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

Mänskliga navelsträngen (UC) kan erhållas under den perinatala perioden till följd av prematura, sikt och postterm leverans. I detta protokoll beskriver vi isolering och karakterisering av UC-derived mesenkymala stamceller (UC-msc) från foster/spädbarn på 19-40: e graviditetsveckan.

Abstract

Mesenkymala stamceller (MSC) har stor terapeutisk potential och locka ökande intresse för det biomedicinska fältet. MSCs är ursprungligen isolerade kännetecknas från benmärg (BM) och förvärvade från vävnader inklusive fettvävnad, synovialvätskan, hud, tandpulpan och fostrets bihang till exempel moderkakan, navelsträngsblod (UCB) och navelsträngen (UC). MSCs är en heterogen cell befolkningen med kapacitet för (1) efterlevnad av plast i standard odlingsbetingelser, (2) ytan markör uttryck för CD73+/CD90+/CD105+/CD45/CD34/CD14/CD19 /HLA-DR fenotyper och (3) trilineage differentiering in adipocyter, osteocyter och kondrocyter, som för närvarande definieras av den internationella föreningen för cellulära terapi (ISCT). Även om BM är den vanligaste källan till MSCs, begränsar invasiva arten av BM aspiration etiskt dess tillgänglighet. Proliferation och differentiering kapacitet av MSCs erhållits från BM generellt avtar med åldern av givaren. Däremot har fostrets MSCs erhållits från UC fördelar såsom kraftig proliferation och differentiering kapacitet. Det finns inga etiska oro för UC provtagning, eftersom det betraktas vanligtvis som medicinskt avfall. Mänskliga UC börjar utveckla med fortsatt tillväxt av fostervatten kaviteten på 4-8: e graviditetsveckan och håller växer tills de når 50-60 cm i längd, och det kan vara isolerade under leveransperioden helt nyfödda. För att få inblick i patofysiologin av svårbehandlade sjukdomar, har vi använt UC-derived MSCs (UC-MSCs) från spädbarn levereras vid olika graviditetsdiabetes ålder. I detta protokoll beskriver vi isolering och karakterisering av UC-MSCs från foster/spädbarn på 19-40: e graviditetsveckan.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mesenkymala stamceller (MSC) är ursprungligen isolerade och kännetecknas från benmärg (BM)1,2 men kan även erhållas från en mängd olika vävnader inklusive fettvävnad, synovialvätskan, hud, tandpulpan och fostrets bihang 3. MSCs redovisas som en heterogen cell population som kan föröka sig och differentiera i adipocyter, osteocyter och kondrocyter. Dessutom MSCs besitter förmågan att migrera till platser av skada, undertrycka och modulera immunsvaret, och renovera och reparera skadan. För närvarande har MSCs från olika källor lockade växande intresse som en källa för cellterapi mot ett antal svårlösta sjukdomar, inklusive graft - versus - host sjukdom, hjärtinfarkt och cerebral infarkt4,5 .

Även om BM är mest välkarakteriserad källan av MSCs, begränsar invasivitet av BM aspiration etiskt dess tillgänglighet. Proliferation och differentiering kapacitet av MSCs erhållits från BM generellt avtar med åldern av givaren. Däremot fostrets MSCs erhållits från fostrets bihang till exempel moderkakan, navelsträngsblod (UCB), och navelsträngen (UC) har fördelar inklusive mindre etiska betänkligheter angående provtagning och robust proliferation och differentiering kapacitet6 , 7. bland fostrets bihang som vanligen kasseras som medicinskt avfall, UCB och UC betraktas ett fostrets organ, medan moderkakan anses Fetomaternell. Dessutom behöver moderkakan och UCB provtas och samlas in på det exakta ögonblicket nyfödda leverans, medan placenta och UC kan samlas in och bearbetas efter nyfödda leverans. UC är således en lovande MSC källa för cell terapi8,9.

Mänskliga UC börjar utveckla med progressiv utvidgning av fostervatten kaviteten på 4-8: e graviditetsveckan, fortsätter att växa fram till 50-60 cm i längd och kan isoleras under hela perioden av nyfödda leverans10. För att få inblick i patofysiologin av svårbehandlade sjukdomar, använder vi UC-derived MSCs (UC-MSCs) från spädbarn levereras vid olika graviditetslängd åldrarna11,12. I detta protokoll beskriver vi hur man isolera och karakterisera UC-MSCs från foster/spädbarn på 19-40: e graviditetsveckan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Användningen av mänskliga prover för denna studie godkändes av den etiska kommittén av Kobe University Graduate School of Medicine (godkännande nr 1370 och 1694) och utförs i enlighet med de godkända riktlinjerna.

1. isolering och kultur av UC-MSCs

Obs: UC-MSCs har framgångsrikt isolerad, odlade, och utökade (mer än passage nummer 4) från mer än 200 UCs utsätts för detta protokoll. Bland mer än 200 UCs, 100% har visat framgångsrika UC-MSC isolering, mindre än 5% har visat oavsiktlig kontaminering, mindre än 15% har visat tillväxt gripandet, och mer än 80% har visat framgångsrika UC-MSC expansion.

  1. Samla UC.
    1. Förbereda ett 50 mL plaströr, en aseptisk sax och en 500 mL flaska alpha modifierade örnens minsta viktigt medium (alpha MEM) vid 4 ° C.
    2. Aseptiskt klipp ut UC med en kirurgisk sax på ca 5-10 cm i längd och samla det snart efter nyfödda föddes genom kejsarsnitt.
    3. Omedelbart placera UC i ett 50 mL plaströr och tillsätt 20-30 mL alpha MEM i röret.
    4. Lagra UC vid rumstemperatur (RT) tills det transporteras till laboratoriet.
      Obs: Aseptiska UC kan lagras i serumfritt medium på RT för upp till 2 dagar. UC som erhållits från närliggande sjukhus kan därför samlas om det levereras till lab inom 2 dagar.
  2. Dissekera UC.
    1. Förbereda en plastbricka, steriliserad sax och pincett, 10 mL pipetter, 25 mL pipetter, två 60 mm vävnadsodling rätter, fosfatbuffrad saltlösning (PBS), renade enzymet blandar (se Tabell för material, rekonstitueras med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i en koncentration av 13 Wünsch enheter/mL och lagras vid-80 ° C), och en 500 mL flaska minskade serum medium (se Tabell för material).
    2. Värm upp PBS, renade enzymet blandar, minskat serum medium och odlingsmedium [alfa MEM innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% antibiotika-antimycotic lösning (AA) lagras vid 4 ° C] till RT.
    3. Ta ut UC från röret och placera den i en plastbricka.
    4. Väga och dissekera 5 g av UC med en steriliserad sax.
    5. Häll 10 mL 70% etanol över UC för sterilisering med 10 mL pipett.
    6. Tvätta UC med 10 mL PBS två gånger med 10 mL pipett.
    7. Placera UC i en steriliserad 60 mm vävnadsodling maträtt (se figur 1, steg 1).
    8. Tillsätt 10 mL av minskade serum medium i skålen.
    9. Tillsätt 0,5 mL renat enzym blandningar för att nå en slutlig koncentration på cirka 0,62 Wünsch enheter/mL.
      Obs: Användning av renade enzymet blandningar istället för traditionella kollagenas har visat sig förbättra avkastningen och livskraften hos UC-MSCs isoleras från UC.
    10. Skär UC i 2-3 mm bitar med steriliserad sax och pincett (se figur 1, steg 2).
      Obs: Denna process tar ca 30 min.
    11. Inkubera UC bitar vid 37 ° C i 30 min i en 5% CO2 inkubator.
    12. Skär delvis smält UC bitarna i mindre bitar som enkelt flöda genom 25 mL pipett.
      Obs: Denna process tar ca 30 min.
    13. Inkubera UC mindre bitar vid 37 ° C i 15-45 min i en 5% CO2 inkubator.
      Obs: Inkubationen måste fortsätta tills homogenates blir trögflytande. Totala koktiden är ca 120 min. I fallet med UCs från prematura spädbarn, men kan koktiden kortas eftersom de lätt kapas och rötas.
  3. Isolera UC-MSCs.
    1. Förbereda fyra 50 mL plaströr och en 500 mL flaska av odlingsmedium.
    2. Dela UC Homogenatet i två 50 mL plaströr med 25 mL pipett med cirka 7,5 mL i varje rör.
    3. Tillsätt 20 mL odlingsmedium i varje rör och blanda väl.
    4. Filtrera varje UC Homogenatet genom en 100 µm cell SIL placeras ovanpå en ny 50 mL samling tub, med 25 mL pipett för att samla UC-derived celler.
      Obs: Denna process tar ca 15 min varje, som den smälta UC-lösningen är klibbig.
    5. Centrifugera två rör vid 1 000 x g i 5 min.
    6. Försiktigt Aspirera supernatanten och kassera den.
    7. Återsuspendera cell pellets i två rör med 5 mL odlingsmedium.
    8. Överför cellen till en ny 60 mm platta och kultur vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (se figur 1, steg 3).
  4. Kultur UC-MSCs.
    1. Värma upp PBS, trypsin-EDTA (0,25 w/v%), och kultur medium (alpha MEM som innehåller 10% FBS och 1% AA) till RT.
    2. När celler kopplas till en 60 mm platta, ta bort odlingsmediet och tvätta med 5 mL PBS två gånger för att ta bort skräp och röda blodkroppar.
      Obs: Bifogade celler visas vanligtvis 3-5 dagar efter inledande plätering (se figur 1, steg 4).
    3. Byt ut odlingssubstratet två gånger per vecka och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator fram till 90-100% konfluens.
      Obs: Detta tar vanligtvis 7-14 dagar efter första plätering.
    4. Tvätta cellerna med 5 mL PBS två gånger, tillsätt 0,5 mL av trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C i 5-10 min.
    5. När celler blir rundade av och fristående, tillsätt 9 mL odlingsmedium och blanda väl att inaktivera trypsin.
    6. Överför cellen till en ny 100 mm platta och kultur vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (se figur 1, steg 5).
    7. Byt ut odlingssubstratet två gånger per vecka och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator fram till 90-100% konfluens.
      Obs: Detta tar vanligtvis 4-8 dagar efter inledande plätering.
    8. Tvätta cellerna med 10 mL PBS två gånger, tillsätt 1 mL av trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C i 5-10 min.
    9. När celler blir rundade av och fristående, tillsätt 9 mL odlingsmedium och blanda väl att inaktivera trypsin.
    10. Överföra cellsuspensionen i två nya 100 mm plattor och kultur vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (se figur 1, steg 5).
    11. Upprepa subkultur (1:2 Delningar) tills tionde passage (se figur 1, steg 5).
      Obs: Eftersom celler odlade mindre konfluenta villkor tenderar att nå tidigare spridning gripande, är det viktigt att passagen celler med en split-förhållande 1:2.
    12. Använda celler på femte till åttonde passage för cell surface markör analys, cell differentiering assay och andra experiment.
      Obs: För att hålla kraftig spridning så länge som möjligt, odlas celler allmänt under mer än 70-80% konfluenta villkor.

2. ytan markör uttryck för UC-MSCs

  1. Förbereda celler i en 100 mm platta och separera dem med 1 mL av trypsin-EDTA vid 37 ° C i 5-10 min.
  2. Tillsätt 9 mL odlingsmedium och centrifugera vid 1 000 x g i 5 min.
  3. Aspirera supernatanten och kassera den.
  4. Omsuspendera cell pellets med 10 mL PBS och centrifugera vid 1 000 x g för 5 min. Upprepa detta tvätt två gånger.
  5. Att resuspendera cellerna med flöde flödescytometri (FCM) buffert (PBS som innehåller 2 mM EDTA och 10% blockerande reagens) ~ 1 × 106 celler/ml.
  6. Över 50-100 µL cellsuspension i ett 1,5 mL rör; Lägg till fykoerytrin (PE)-konjugerade antikroppar mot CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 eller HLA-DR; och inkubera på is för 45 min.
  7. Tvätta cellerna med FCM buffert två gånger och tillsätt 50-100 µL av 0,2% viabilitet dye lösning (se Tabell för material).
  8. Inkubera vid RT i 15 min, tvätta cellerna med FCM buffert två gånger och filter celler genom en sil med 70 µm i cellen.
  9. Kör celler genom FCM och analysera de erhållna resultaten med FCM programvaran enligt tillverkarens anvisningar.

3. Trilineage differentiering av UC-MSCs

  1. Utföra adipogenesis.
    1. Förbered en cellsuspension i odlingsmedium vid en koncentration på 5 × 103 celler/mL.
    2. Tallrik 1 mL cellsuspension i en 12-well platta och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för ~ 24 h.
    3. Byta ut odlingssubstratet med adipogena differentiering medium (se Tabell av material) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för 2-3 veckor. Ändra adipogena differentiering medium två gånger i veckan.
    4. Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
    5. Inkubera cellerna i 4% formaldehydlösning i 30 min på RT.
    6. Tvätta cellerna med PBS tre gånger och med 60% isopropanol tre gånger.
    7. Förbereda 0,5% olja röd O lösning genom att lösa upp 84 mg olja röd O i 10 mL 100% isopropanol och lägga till 6,7 mL destillerat vatten. Färga celler med 1 mL 0,5% olja röd O lösning på RT i 20 min.
    8. Tvätta cellerna med 60% isopropanol tre gånger och visualisera under ett mikroskop.
  2. Utföra osteogenesis.
    1. Förbered en cellsuspension i odlingsmedium vid en koncentration på 1 × 104 celler/mL.
    2. Tallrik 1 mL cellsuspension i en 12-well platta och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för ~ 24 h.
    3. Byta ut odlingssubstratet med osteogeneic differentiering medium (se Tabell av material) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för 1-2 veckor. Ändra osteogent differentiering medium två gånger i veckan.
    4. Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
    5. Inkubera cellerna i 4% formaldehydlösning i 30 min på RT.
    6. Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
    7. Förbered 2% alizarin Röd S lösning genom att lösa upp 200 mg alizarin Röd S med 10 mL destillerat vatten. Färga celler med 1 mL 2% alizarin Röd S lösning på RT för 3 min.
    8. Tvätta brunnarna med PBS tre gånger och visualisera under ett mikroskop.
  3. Utföra kondrogenes.
    1. Förbered en cellsuspension i odlingsmedium vid en koncentration på 1,6 × 107 celler/mL.
    2. Placera en 5 µL droppe av cellsuspensionen på mitten av brunnen i en 12-well platta (micromass kulturer) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för 2-3 h.
    3. Varsamt tillsätt 1 mL av chondrogenic differentiering medium (se Tabell av material) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för 4-7 dagar. Ändra chondrogenic differentiering medium två gånger i veckan.
    4. Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
    5. Inkubera cellerna i 4% formaldehydlösning i 30 min på RT.
    6. Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
    7. Bered 0,05% toluidin blå genom upplösning 250 mg toluidin blå med 500 mL 0,1 M natrium acetatbuffert med pH 4,1. Färga celler med 1 mL 0,05% toluidin blå lösning på RT i 30 min.
    8. Tvätta cellerna med PBS tre gånger och visualisera under ett mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Förfarandena från UC samling till MSC kultur sammanfattas i figur 1. UC på ca 5-10 cm i längd kan samlas från alla nyfödda levereras av kejsarsnitt. UC börjar utvecklas i 4-8: e graviditetsveckan och fortsätter att växa fram till 50-60 cm i längd, som visas i figur 2. Det finns två artärer (A), en ven (V), cord foder (CL) och Whartons gelé (WJ) i UC, som skildras i figur 3 och figur 4. UC-MSCs kan isoleras från alla sladd regioner eller hela sladden13. Eftersom UC från spädbarn med tidig graviditetsdiabetes ålder är skört och svårt för dissekering i en enda sladd region, är UC-MSCs isolerade från hela sladd11,12. I området i närheten finns det flera metoder att isolera MSCs från UC, som inkluderar den explant metod14 och enzymatisk nedbrytning metod15, plus deras derivat16. På grund av den längre kultur cykel, lägre avkastning, och tidigare spridning gripandet är associerad med explant metod17,18, odlas UC-MSCs genom enzymatisk nedbrytning metod som illustreras i figur 5 och Figur 6.

Minimivillkoren för att definiera MSCs fastställs av ISCT och innehålla deras surface markör karakterisering19. För att bestämma ytan markör uttryck, UC-MSCs från prematura och fullgångna spädbarn inkuberas med lämpliga PE-konjugerade antikroppar och analyseras med flödescytometri. De är positiv för MSC signatur markörer (CD73, CD90, CD105) men negativ för monocyt/makrofag (CD14), endotelceller (CD34), hematopoetiska (CD19, CD45) och stora histocompatibility komplex (HLA-DR) markörer, som visas i figur 7.

Enligt ISCT kriterier19, måste MSC ha mesodermala differentiering kapacitet bedöms av en trilineage differentiering assay. Utvärdera trilineage differentiering kapacitet, förmås UC-MSCs från prematura och fullgångna spädbarn att differentieras till osteocyter, adipocyter och kondrocyter standard i vitro differentiering villkor. I figur 8visas de är väl differentierade i alla tre typer av bröstkörtlarna celler.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk bild av isolering och kultur av UC-MSCs. Steg 1. 5-10 cm av UC samlat aseptiskt från placenta vävnad. Steg 2. Renade enzymet blandning-rötas UC bitar. Steg 3. Kultur av UC-MSCs vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Steg 4. Bifogade UC-MSCs visades på 3 dagar efter första plätering. Steg 5. Subkultur av UC-MSCs. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : UC från foster/spädbarn levereras vid olika graviditetsdiabetes ålder. UCs från foster/spädbarn på 19-38: e graviditetsveckan visas. Det ökar storleken på UC med gestationsålder. Skala barer = 8 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Avsnittsvy av UC från prematura och fullgångna spädbarn. Det finns två artärer (A), en ven (V), cord foder (CL) och Whartons gelé (WJ) i ek från prematura och fullgångna spädbarn. Storleken av dessa vävnader varierar med graviditetsdiabetes åldrar. Skala barer = 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Anatomi av UC. (A), 5 cm av UC från benämner spädbarn. (B) tvärsnitt av UC. (C) dissekerade delvis UC. Det finns två artärer (A), en ven (V), cord foder (CL) och Whaltons gelé (WJ). UC från spädbarn i tidigare graviditetsdiabetes åldrar är särskilt sköra och svårt att vara dissekeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : UC dissektion med renade enzymet blandningar. (A) 5-10 cm av UC. (B) 2-3 mm bitar av UC. (C) renade enzymet blandning-rötas UC bitar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Morfologi av UC-MSCs från prematura och fullgångna spädbarn. (A och E) UC-MSCs på passagen nummer 1 (P1) före byte av odlingsmedium (A: X40; E: X200). (B och F) UC-MSCs P1 efter byte av odlingsmedium (B: X40; F: X200). (C och G) UC-MSCs på P3 (C: X40; G: X200). (D och H) UC-MSCs på P5 (D: X40; H: X200). Skala barer = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Surface markör uttryck för UC-MSCs från prematura och fullgångna spädbarn. CD73/CD90/CD105-positiva och CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-negativ fenotyper finns i UC-MSCs från både prematura (22 veckor graviditetsveckan) och termen (37 veckor dräktighet) spädbarn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 : Trilineage mesenkymala differentiering av UC-MSCs från prematura och fullgångna spädbarn. UC-MSCs från prematura (22 veckor graviditetsveckan) och termen (37-40 veckor graviditetsveckan) spädbarn är differentierade i fettceller (visualiseras av olja röd O), osteocyte (visualiseras av alizarin Röd S), och chondrocyte (visualiseras av toluidin blå). Bilder togs på 200 x. Skala barer = 50 µm. En del av denna siffra har anpassats från Iwatani et al.11Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MSCs kan isoleras från en mängd olika vävnader och är heterogen population av celler som gör inte alla express samma fenotypiska markörer. Här, skisserat vi ett protokoll som guidar insamling och dissektion av UC från prematura och fullgångna spädbarn och möjliggör isolering och kultur av UC-MSCs. Efter detta protokoll, har vi framgångsrikt isolerade UC-MSCs som uppfyller ISCT kriterier19 från foster/spädbarn levereras på 19-40: e graviditetsveckan och visat att de representerar vissa aspekter av svårbehandlad sjukdom patofysiologi under prenatal utveckling11,12.

I BM-derived MSCs (BM-MSCs), yngre givare-derived BM-MSCs generellt Visa större proliferativ och differentiative potential än äldre motsvarigheter och håll mer potential för cell terapi20,21. Likaså rapporterades prematura UC-MSCs isolerade från foster avbröts på 8-12 veckor graviditetsveckan att uppvisa mer kraftfull proliferation och differentiering jämfört med termen UC-MSCs isolerade från nyfödda levereras vid 37-40 veckors dräktighet22. Trots skillnaderna i gestationsålder och sladd region avslöjade UC-MSCs isolerad med detta protokoll också en mer kraftfull spridning av prematura UC-MSCs än termen UC-MSCs12.

Ett avgörande steg i detta protokoll är UC dissektion med renade enzymet blandningar som är sammansatt av kollagenas I och II och dispase. Som beskrivs i de representativa resultat, varierade styvheten hos UC dramatiskt med graviditetsdiabetes ålder (figur 2). För att uppnå optimal dissekering av UC, blandar inkubationstiden av renade enzymet behöver justeras till styvheten i de enskilda UC. Generellt, det tar oftast längre för termen UC än prematura UC. Bland befintliga metoder att isolera MSCs från UC, väljer vi den enzymatiska nedbrytning metod15 över explant metod14 som kan leda till en längre kultur cykel, lägre avkastning och tidigare spridning gripandet17,18. En viktig ändring av metoden enzym matsmältningen är användningen av renade enzymet blandningar istället för traditionella kollagenas, som möjliggör en effektiv och konsekvent dissekering av UC från foster/spädbarn med variabel graviditetsdiabetes åldrar.

En begränsning av detta protokoll är användningen av hela sladden att isolera MSCs från UC. Eftersom UC-MSCs kan isoleras från alla sladd regioner eller hela sladden13, är UC-MSCs isolerade från hela sladden i detta protokoll. Detta beror på genomförbarheten av UC dissektion från prematura spädbarn. Potentiella variationen i andelen varje sladd region kan dock begränsa de strikt jämförelsen mellan UC-MSCs isolerat av detta protokoll.

UC-MSCs används alltmer som en källa av mesenkymala stromaceller för prekliniska och kliniska studier8,9. Trots detta ökade användning saknas en samsyn om metoder för UC-MSCs isolering fortfarande, vilket kan resultera i olika cellpopulationer bedöms vara de samma UC-MSCs. Detta protokoll kommer slutligen hjälpa forskarna förstå härledning och funktionella egenskaper hos UC-MSCs bättre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av Grants-in-Aid för Scientific Research (C) (bevilja nummer: 25461644) och unga forskare (B) (bevilja nummer: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) av JSPS KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6, (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9, (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2, (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25, (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43, (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6, (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16, (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13, (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91, (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35, (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65, (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17, (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97, (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12, (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22, (17), 2425-2439 (2013).
Isolering och karakterisering av navelsträngen-derived mesenkymala stamceller från prematura och benämner spädbarn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter