Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu

doi: 10.3791/58806 Published: January 26, 2019

Summary

İnsan göbek kordonu (UC) sonucu olarak preterm, terim perinatal dönemde elde edilebilir ve teslimat postterm. Bu protokol için biz yalıtım ve UC kaynaklı mezenkimal kök hücre (UC-MSCs) karakterizasyonu fetusa/bebeklerde 19-40 hafta gebelik açıklar.

Abstract

Mezenkimal kök hücre (MSCs) önemli bir tedavi potansiyel var ve Biyomedikal alanında artan ilgi çekmek. MSCs aslında izole ve kemik iliği (BM) ile karakterize, sonra yağ dokusu, synovium, cilt, diş hamuru ve gibi plasenta, fetal ekleri dahil olmak üzere dokularda elde göbek kordon kanı (UCB) ve (UC) göbek kordonu. MSCs türdeş olmayan hücre nüfus (1) plastik Standart kültür koşulları, (2) yüzey marker ifade CD73 bağlılığı kapasiteli olan+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- fenotipleri ve adipositler, osteocytes ve olarak şu anda hücresel terapisi (ISCT) için uluslararası toplum tarafından tanımlanan kondrosit, (3) trilineage farklılaşma. BM MSCs en çok kullanılan kaynak olsa da, BM aspirasyon invaziv doğası onun erişilebilirlik etik sınırlar. MSCs yayılması ve ayırt etme kapasitesini elde BM Genel olarak donör yaş ile düşüş. Buna ek olarak, fetal MSCs UC elde edilen güçlü yayılması ve ayırt etme kapasitesi gibi avantajlara sahip. Bu genellikle tıbbi atık olarak kabul edilir gibi UC örnekleme için etik endişe vardır. İnsan UC amniyon boşluğu büyüme gebelik 4-8 hafta devam ile geliştirmeye başlar ve 50-60 cm uzunluğunda erişene dek büyüyen tutar ve tüm yeni doğan teslim süresi sırasında ayrılmış olabilir. Dirençli hastalıklar Patofizyoloji bir anlayış kazanmak için UC kaynaklı MSCs (UC-MSCs) üzerinden çeşitli gestasyonel yaş teslim bebekler kullandık. Bu protokol için yalıtım ve karakterizasyonu UC-MSCs fetusa/bebeklerde üzerinden 19-40 hafta gebelik açıklanmaktadır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mezenkimal kök hücre (MSCs) ilk olarak izole edilmiştir ve kemik iliği (BM)1,2 karakterize ama ayrıca çok çeşitli dokuların yağ dokusu, synovium, cilt, diş hamuru ve fetal ekleri dahil olmak üzere elde edilebilir 3. MSCs çoğalırlar ve adipositler, osteocytes ve kondrosit ayırmak bir türdeş olmayan hücre nüfus olarak tanınıyor. Buna ek olarak, MSCs yaralanma sitelere geçiş, bastırmak ve bağışıklık yanıtı, modüle yeteneğine sahip ve tadilat ve onarım yaralanma. Şu anda, farklı kaynaklardan gelen MSCs karşı dirençli hastalıklar, Greft - versus - host hastalığı, kalp krizi ve beyin enfarktüsü4,5 de dahil olmak üzere bir dizi hücre tedavisi için bir kaynak olarak ilgi çekti var .

BM MSCs en iyi karakterize kaynağı olsa da, BM aspirasyon invasiveness erişilebilirlik etik sınırlar. MSCs yayılması ve ayırt etme kapasitesini elde BM Genel olarak donör yaş ile düşüş. Buna ek olarak, fetal MSCs gibi plasenta, göbek kordon kanı (UCB), fetal ekleri elde edilen ve göbek kordonu (UC) örnekleme ve sağlam yayılması ve ayırt etme kapasitesi6 ile ilgili daha az Etik kaygılar da dahil olmak üzere avantajları var , 7. ise plasenta fetomaternal kabul genellikle tıbbi atık olarak atılır fetal ekleri arasında UCB ve UC fetal bir organ olarak kabul edilir. Buna ek olarak, plasenta ve UCB örneklenmiş olup ise plasenta ve UC toplanan ve yenidoğan doğumdan sonra işlenen yeni doğan teslimat, tam şu anda toplanan gerek. Buna göre UC hücre terapisi8,9için umut verici bir MSC kaynağıdır.

İnsan UC amniyon boşluğu progresif genişlemesi 4-8 hafta gebelik ile geliştirmeye başlar, 50-60 cm uzunluğunda kadar büyümeye devam ediyor ve yeni doğan teslim10bütün döneminde ayrılmış olabilir. Dirençli hastalıklar Patofizyoloji bir anlayış kazanmak için UC kaynaklı MSCs (UC-MSCs) üzerinden çeşitli gestasyonel yaş11,12, teslim bebekler kullanın. Bu protokol için yalıtmak ve UC-MSCs fetusa/bebeklerde 19-40 hafta gebelik karakterize nasıl açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İnsan örnekleri kullanım için bu çalışmada Kobe Üniversitesi Lisansüstü Tıp Fakültesi (onay No 1370 ve 1694) Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve onaylanmış kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır.

1. yalıtım ve UC-MSCs kültürü

Not: UC-MSCs kültürlü, başarılı bir şekilde izole edilmiş ve genişletilmiş (daha fazla geçiş sayı 4) 200'den fazla gelen UCs bu protokole tabi. 200'den fazla arasında UCs, % 100 göstermiştir başarılı UC-MSC yalıtım, % 15 büyüme tutuklama göstermiştir ve % 80'den fazla başarılı UC-yüksek lisans genişleme göstermiştir az % 5 daha az kaza sonucu kirlenme, göstermiştir.

  1. UC toplamak.
    1. 50 mL plastik tüp hazırlamak, aseptik bir makas ve alpha 500 mL şişe kartal'ın en az gerekli Orta (Alfa MEM) 4 ° C'de modifiye
    2. Aseptik UC yaklaşık 5-10 cm uzunluğunda, cerrahi makas ile kesme ve yenidoğan doğumdan kısa bir süre sonra sezaryenle toplamak.
    3. Hemen UC bir 50 mL plastik tüpü yerleştirin ve 20-30 mL Alfa MEM tüp içine ekleyin.
    4. Laboratuvara taşınır kadar UC oda sıcaklığında (RT) depolar.
      Not: Aseptik UC 2 gün için serum-Alerjik orta RT depolanabilir. Bu nedenle, bu 2 gün içinde laboratuvara teslim edilir Eğer komşu hastanelerden alınan UC toplanabilir.
  2. UC incelemek.
    1. Hazırlamak bir plastik tepsi, steril makas ve forseps, 10 mL Pipetler, 25 mL Pipetler, iki 60 mm doku kültürü yemekleri, fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), (bkz: Tablo malzemelersteril PBS bir konsantrasyon ile yeniden düzenlendi, saflaştırılmış enzim karışımları 13 Wünsch adet/ml ve-80 ° C'de depolanan) ve düşük serum orta 500 mL şişe ( Tablo malzemelerigörmek).
    2. PBS, saflaştırılmış enzim ısınma karışımları, serum orta ve kültür orta [Alfa MEM içeren % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 antibiyotik antimycotic çözüm 4 ° C'de depolanan (AA)] RT. için azaltılmış
    3. UC tüp alıp plastik bir tepsiye yerleştirin.
    4. Tartmak ve UC 5 g steril bir makas ile incelemek.
    5. 10 mL % 70 etanol UC 10 mL pipet kullanarak sterilizasyon için üzerine dökün.
    6. UC iki kez 10 mL pipet kullanarak PBS 10 mL ile yıkayın.
    7. UC bir steril 60 mm doku kültürü tabak yerleştirin (bkz. Şekil 1, adım 1).
    8. 10 mL düşük serum orta çanağı içine ekleyin.
    9. Yaklaşık 0.62 Wünsch adet/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için saflaştırılmış enzim karışımları 0.5 mL ekleyin.
      Not: Arıtılmış enzim karışımları geleneksel collagenase yerine kullanımı verimi artırmak için gösterilmiştir ve UC UC-MSCs canlılığı izole.
    10. UC sterilize makas ve forseps (bkz: Şekil 1, adım 2) ile 2-3 mm parçalar halinde kesin.
      Not: Bu işlem yaklaşık 30 dakika sürer.
    11. UC adet 30 dk % 5 CO2 kuluçka için 37 ° C'de kuluçkaya.
    12. Kısmen sindirilmiş UC parçalar kolayca 25 mL pipet ile akışı daha küçük parçalar halinde kesin.
      Not: Bu işlem yaklaşık 30 dakika sürer.
    13. 15-45 dk % 5 CO2 kuluçka için 37 ° C'de daha küçük UC adet kuluçkaya.
      Not: Kuluçka homogenates viskoz olana kadar devam etmesi gerekiyor. Yaklaşık 120 dk toplam sindirim zamanı. Bunlar kolayca kesmek ve sindirilmiş UCs preterm bebeklerde kullanarak söz konusu olduğunda, ancak, sindirim süresi kısaltılabilir.
  3. UC-MSCs yalıtmak.
    1. Dört 50 mL Plastik tüpler ve kültür orta 500 mL şişe hazırlayın.
    2. İki 50 mL Plastik tüpler yaklaşık 7.5 mL her tüp ile 25 mL pipet kullanarak UC homogenate bölün.
    3. Kültür orta 20 mL her tüpün içine ekleyin ve iyice karıştırın.
    4. Her UC homogenate UC elde edilen hücreleri toplamak için 25 mL pipet kullanarak bir yeni 50 mL toplama tüpü üstüne, bir 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre.
      Not: Sindirilir UC çözüm yapışkan olduğundan bu işlem yaklaşık 15 dk her, alır.
    5. 1000 x g 5 min için de iki tüpler santrifüj kapasitesi.
    6. Dikkatle süpernatant Aspire edin ve bunu.
    7. Hücre topakları iki tüp ile kültür orta 5 mL resuspend.
    8. Bir yeni 60 mm plaka ve kültüre %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de içine hücre süspansiyon transfer (bkz: Şekil 1, adım 3).
  4. Kültür UC-MSCs.
    1. PBS kadar tripsin-EDTA (0,25 w/v%), sıcak ve kültür orta (Alfa MEM % 10 FBS ve % 1'aa içeren) için RT.
    2. Hücreleri 60 mm plakasına eklendiğinde, kültür orta kaldırmak ve iki kez enkaz ve kırmızı kan hücreleri kaldırmak için PBS ile 5 mL yıkayın.
      Not: Ekli hücreler genellikle görünür, 3-5 gün sonra ilk kaplama (bkz: Şekil 1, adım 4).
    3. Haftada iki kez kültür orta yerine takın ve % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de % 90-100 confluency kadar kuluçkaya.
      Not: Bu genellikle 7-14 gün sonra ilk kaplama alır.
    4. 5 mL PBS de içeren hücreleri iki kez yıkama, tripsin-EDTA 0.5 mL ekleyin ve 5-10dk için 37 ° C'de kuluçkaya.
    5. Ne zaman hücreleri yuvarlak haline ve müstakil, kültür orta 9 mL ekleyin ve iyice karıştırın tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için.
    6. Bir yeni 100 mm plaka ve kültüre %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de içine hücre süspansiyon transfer (bkz: Şekil 1, adım 5).
    7. Haftada iki kez kültür orta yerine takın ve % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de % 90-100 confluency kadar kuluçkaya.
      Not: Bu genellikle 4-8 gün sonra ilk kaplama alır.
    8. PBS 10 mL içeren hücreleri iki kez yıkama, tripsin-EDTA 1 mL ekleyin ve 5-10dk için 37 ° C'de kuluçkaya.
    9. Ne zaman hücreleri yuvarlak haline ve müstakil, kültür orta 9 mL ekleyin ve iyice karıştırın tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için.
    10. İki yeni 100 mm plakaları ve % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de kültür içine hücre süspansiyon transfer (bkz: Şekil 1, adım 5).
    11. Alt kültür (1:2 bölmeleri) kadar onuncu geçit tekrar (bkz: Şekil 1, adım 5).
      Not: Çünkü daha az konfluent koşullar altında kültürlü hücreleri önceki nükleer silahların yayılmasına karşı tutuklama ulaşmak için geçiş Hücreleri Böl 1:2 oranında için önemlidir.
    12. Hücreleri beşinci-sekizinci geçit hücre yüzey marker analizi, hücre farklılaşması tahlil ve diğer deneyler için kullanın.
      Not: Dinç yayılması mümkün olduğunca uzun süre tutmak için hücreleri genellikle daha fazla % 70-80 konfluent koşullar altında kültürlü.

2. UC-MSCs yüzey Marker ifade

  1. 100 mm plaka hücrelerde hazırlamak ve onları tripsin-EDTA 5-10 dk 37 ° C'de 1 mL ile ayırmak.
  2. 1000 x g 5 min için de kültür orta ve santrifüj 9 mL ekleyin.
  3. Süpernatant Aspire edin ve o atın.
  4. Hücre topakları PBS 10 mL ile resuspend ve 5 dakika süreyle santrifüj 1000 x g de iki kez bu çamaşır adımı yineleyin.
  5. Akış Sitometresi (FCM) arabellek (2 mM EDTA ve % 10 engelleme reaktif içeren PBS) içeren hücreleri ~ 1 × 106 hücre/mL resuspend.
  6. 50-100 µL hücre süspansiyon, 1,5 mL tüp içine transfer; phycoerythrin (PE) Ekle-Birleşik CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 veya HLA-DR; karşı antikor ve 45 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
  7. FCM hücrelerle yıkama iki kez tampon ve 50-100 µL % 0,2 canlılığı boya çözüm ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).
  8. RT 15 dk, FCM arabellek iki kez hücrelerle yıkama ve Filtre hücreleri için 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla kuluçkaya.
  9. Hücreleri FCM çalıştırın ve üreticinin yönergelerine göre FCM yazılımını kullanarak elde edilen sonuçları çözümleyebilirsiniz.

3. Trilineage UC-MSCs farklılaşma

  1. Adipogenesis gerçekleştirin.
    1. Kültür orta konsantrasyonu 5 × 103 hücre/mL, bir hücre süspansiyon hazırlamak.
    2. 1 mL hücre süspansiyon bir 12-şey plaka, plaka ve 37 ° c ~ 24 h için % 5 CO2 kuluçka kuluçkaya.
    3. Adipojenik farklılaşma orta ile kültür orta yerine ( Tablo malzemelerigörmek) ve % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 2-3 hafta kuluçkaya. Adipojenik farklılaşma orta haftada iki kez değiştirin.
    4. PBS hücrelerle üç kez yıkayın.
    5. 30 dk RT. az için % 4 formaldehit çözüm hücrelerde kuluçkaya
    6. Hücreleri PBS üç kez ve % 60 isopropanol ile üç kez yıkayın.
    7. % 0,5 yağ kırmızı O çözüm hazırlamak petrol 84 mg çözülerek kırmızı O % 100 isopropanol ve 6.7 mL ekleyerek 10 ml distile su. 1 mL % 0,5 yağ kırmızı O çözeltisi RT, 20 dk hücrelerle leke.
    8. % 60 isopropanol hücrelerle üç kez yıkama ve mikroskop altında görselleştirmek.
  2. Osteogenesis gerçekleştirin.
    1. Kültür orta bir konsantrasyon 1 × 104 hücre/ml, bir hücre süspansiyon hazırlamak.
    2. 1 mL hücre süspansiyon bir 12-şey plaka, plaka ve 37 ° c ~ 24 h için % 5 CO2 kuluçka kuluçkaya.
    3. Kültür orta osteogeneic farklılaşma orta ile değiştirin ( Tablo malzemelerigörmek) ve % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 1-2 hafta kuluçkaya. Osteojenik farklılaşma orta haftada iki kez değiştirin.
    4. PBS hücrelerle üç kez yıkayın.
    5. 30 dk RT. az için % 4 formaldehit çözüm hücrelerde kuluçkaya
    6. PBS hücrelerle üç kez yıkayın.
    7. % 2 alizarin kırmızı S çözüm alizarin 200 mg çözülerek hazırlamak kırmızı S 10 mL distile su ile. 1 mL % 2 alizarin kırmızı S çözeltisi RT, 3 dk hücrelerle leke.
    8. Wells PBS ile üç kez yıkama ve mikroskop altında görselleştirmek.
  3. Chondrogenesis gerçekleştirin.
    1. Kültür orta bir konsantrasyon 1,6 × 107 hücre/mL, bir hücre süspansiyon hazırlamak.
    2. 5 µL damlacık hücre süspansiyon, bir 12-şey plaka (micromass kültürleri) kuyuya ortasına üzerine yerleştirin ve % 5 CO2 kuluçka için 2-3 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. Yavaşça chondrogenic farklılaşma orta 1 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ve 4-7 gün için % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya. Chondrogenic farklılaşma orta haftada iki kez değiştirin.
    4. PBS hücrelerle üç kez yıkayın.
    5. 30 dk RT. az için % 4 formaldehit çözüm hücrelerde kuluçkaya
    6. PBS hücrelerle üç kez yıkayın.
    7. % 0.05 toluidin blue çözüm toluidin blue 250 mg ile 500 mL 0.1 M sodyum asetat arabelleği pH 4.1 ile çözülerek hazırlayın. 1 mL 30 dk için RT, % 0.05 toluidin blue çözeltisi içeren hücreleri leke.
    8. PBS hücrelerle üç kez yıkama ve mikroskop altında görselleştirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

UC koleksiyonundan yordamlar MSC kültürüne Şekil 1' de özetlenmiştir. UC yaklaşık 5-10 cm uzunluğunda tüm yenidoğan sezaryenle teslim dan toplanabilir. UC 4-8 hafta gebelik geliştirmeye başlar ve Şekil 2' de gösterildiği gibi 50-60 cm uzunluğunda, kadar büyümeye devam ediyor. İki damar (A), bir damar (V), kordon astar (CL) ve Wharton'ın Jelly (WJ) UC içinde Şekil 3 ve Şekil 4tasvir vardır. UC-MSCs tüm kordon bölgeler ve bütün kordon13ayrılmış olabilir. UC bebeklerde erken gestasyonel yaş ile gelen kırılgan ve tek kord bölge içine diseksiyon için zor olduğundan, UC-MSCs bütün kordon11,12' den izole edilmiştir. Explant yöntemi14 ve enzimatik sindirim yöntemi15artı onların türevleri16dahil MSCs UC, gelen izole etmek için birkaç yöntem vardır. Daha uzun kültür döngüsü, daha düşük verim ve daha önceki nükleer silahların yayılmasına karşı tutuklama explant yöntemi17,18ile ilişkili nedeniyle, UC-MSCs Şekil 5 ve 'da gösterildiği gibi enzimatik sindirim yöntemi tarafından kültürlü Şekil 6.

MSCs tanımlamak için en az bir ölçüt ISCT tarafından kurulan ve onların yüzey marker karakterizasyonu19içerir. Yüzey marker ifade belirlemek için UC-MSCs erken Doğum ve terimi bebeklerin dan uygun PE Birleşik antikorlar ile inkübe ve akış sitometresi tarafından analiz. Onlar MSC imza işaretleri (CD73, CD90, CD105) için olumlu ama monosit/makrofaj (CD14), endotel için negatif (CD34), (CD19, CD45) hematopoetik ve MHC kompleksi (HLA-DR) işaretleri, Şekil 7' de gösterilen şekilde olur.

ISCT ölçütü19göre MSC trilineage farklılaşma tahlil tarafından değerlendirildi Mezodermal farklılaşma kapasite sahip olmalıdır. Trilineage ayırt etme kapasitesini değerlendirmek için UC-MSCs erken Doğum ve terimi bebekler üzerinden osteocytes, adipositler ve standart vitro farklılaştırma koşullar altında kondrosit ayırt etmek için indüklenen vardır. Şekil 8' de gösterildiği gibi üç tür mezodermal hücre iyi farklılaşmış olduklarını.

Figure 1
Resim 1 : İzolasyon ve UC-MSCs kültürünü Şematik diyagramı. Adım 1. 5-10 cm UC aseptik plasental doku toplanan. Adım 2. Enzim karışımı sindirilmiş UC adet saf. Adım 3. UC-MSCs kültür %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de. Adım 4. Ekli UC-MSCs 3 gün sonra ilk kaplama göründü. Adım 5. UC alt kültür-MSCs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : UC fetusa/bebeklerde üzerinden çeşitli gestasyonel yaş teslim. UCs fetusa/bebeklerde 19-38 hafta gebeliğin üzerinden gösterilir. UC boyutunu gestasyonel yaş ile artar. Ölçek çubukları 8 cm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : UC kesit görünümü üzerinden erken Doğum ve terimi bebekler. Erken Doğum ve terimi bebekler iki arterler (A), bir damar (V), kordon astar (CL) ve Wharton'ın Jelly (WJ) UC içinde vardır. Bu doku boyutlarını gestasyonel yaş ile değişebilir. Ölçek çubukları 2 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : UC anatomisi. (A) dönem 5 cm UC, bebek. (B) UC kesiti. (C) kısmen UC kesmiştim. Orada iki arterler (A), bir damar (V), kordon astar (CL) ve Whalton'ın jöle (WJ). UC bebekler daha önce gebelik yaştan itibaren özellikle kırılgan ve disseke zor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Saf enzim karışımları kullanarak UC diseksiyon. (A) UC 5-10 cm. (B) 2-3 mm UC parçaları. (C) enzim karışımı sindirilmiş UC adet saf. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : UC-MSCs erken Doğum ve terimi bebekler üzerinden morfolojisi. (A ve E) UC-MSCs geçit sayı 1 (P1) kültür orta (A: X40; değiştirme önce E: X200). (B ve F) UC-MSCs P1 kültür orta (B: X40; replasmanı sonrası adlı F: X200). (C ve G) UC-MSCs P3, (C: X40; G: X200). (B ve H) UC-MSCs P5, (D: X40; H: X200). Ölçek çubukları 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 : Su yüzüne UC-MSCs marker ifade erken Doğum ve terimi bebekler. CD73/CD90/CD105-pozitif ve CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-negatif fenotipleri UC-MSCs erken Doğum (22 haftalık gebelik) ve dönem (37 hafta gebelik) bebekler bulundu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8 : UC MSCs Trilineage mezenkimal farklılaşma erken Doğum ve terimi bebekler üzerinden. UC-MSCs erken Doğum (22 haftalık gebelik) ve dönem (37-40 hafta gebelik) bebekler adipocyte Ayrıştırılan (tarafından görüntülenmeyecektir kırmızı O yağ), osteocyte (alizarin tarafından görüntülenmiştir kırmızı S) ve kondrosit (toluidin blue tarafından görüntülenir). Görüntüleri 200 x alındı. Ölçek çubukları 50 µm =. Bu rakam bir parçası Iwatani vd.11' den uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MSCs dokular çeşitli ayrılmış olabilir ve tüm express aynı fenotipik işaretleri yapmak hücre türdeş olmayan nüfus vardır. Burada, biz, erken Doğum ve terimi bebeklerin kılavuzları koleksiyonu ve UC diseksiyon ve yalıtım ve UC-MSCs kültürünü sağlayan bir protokol sıraladı. Bu iletişim kuralı başarıyla gelen fetusa/bebeklerde 19-40 gebelik haftasından itibaren teslim ve zorlu hastalık patofizyolojisi bazı yönlerini temsil ettikleri gösterdi ISCT ölçüt19 yerine getirmek UC MSCs yalıtıncaya Doğum öncesi geliştirme11,12sırasında.

MSCs BM kaynaklı (BM-MSCs), Genç donör kaynaklı BM-MSCs genellikle büyük göre daha büyük proliferatif ve differentiative potansiyel göstermek ve hücre terapisi20,21daha fazla potansiyele sahip. Benzer şekilde, 8-12 haftalık gebelik iptal fetusa dan izole preterm UC MSCs daha dinç yayılması ve terim UC-MSCs 37-40 hafta gebelik22teslim yenidoğan gelen izole göre farklılaşma sergilemek bildirildi. Gebelik yaşı ve kordon bölgesinde farklılıklara rağmen UC-MSCs bu iletişim kuralı ile izole Ayrıca dönem UC-MSCs12' den bir daha dinç hızla çoğalmak-in erken UC-MSCs saptandı.

Bu iletişim kuralı içinde önemli bir adım olan saflaştırılmış enzim karışımları ile UC diseksiyon olduğunu oluşan collagenase ı ve II ve dispase. Temsilcisi sonuçlarında belirtildiği gibi UC sertliği Gebelik yaşı (Şekil 2) ile önemli ölçüde değişik. UC en uygun diseksiyon elde etmek için bireysel UC sertliği için ayarlanması gereken kuluçka süresi arıtılmış enzim karışımları. Genel olarak, genellikle dönem daha erken UC UC için daha uzun sürer. MSCs UC üzerinden yalıtmak için mevcut yöntemler arasında üzerinde daha uzun kültür döngüsü, daha düşük verim ve daha önceki nükleer silahların yayılmasına karşı tutuklama17,18neden olabilir explant yöntemi14 enzimatik sindirim yöntemi15 seçin. Enzim sindirim yönteminin önemli bir değişiklik arıtılmış enzim karışımları bir UC etkin ve tutarlı diseksiyon fetusa/bebeklerde değişken gestasyonel yaş ile gelen sağlar geleneksel collagenase yerine kullanılır.

MSCs UC dan izole etmek için bütün kordon kullanımı bu protokol kısıtlamasıdır. UC-MSCs tüm kordon bölgeler ve bütün kordon13izole olabileceğinden, UC-MSCs bu iletişim kuralı tüm kablosunu etkilenmezsiniz. Bu UC diseksiyon preterm bebeklerde dan fizibilite kaynaklanmaktadır. Ancak, her kordon bölgesinin oranındaki potansiyel varyasyon UC-MSCs bu iletişim kuralı tarafından izole arasında sıkı karşılaştırma sınırlayabilir.

UC-MSCs preklinik ve klinik çalışmalar8,9için giderek mezenkimal stromal hücre kaynağı olarak kullanılmaktadır. Bu artan rağmen UC-MSCs izolasyon yöntemleri üzerinde bir fikir birliği hangi farklı hücre popülasyonlarının içinde aynı UC MSCs kabul neden olabilir hala kayıp, kullanımdır. Bu iletişim kuralı sonuçta türetme ve UC-MSCs fonksiyonel özellikleri daha iyi anlama araştırmacılar yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu iş için Scientific Research (C) Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir (sayı vermek: 25461644) ve genç bilim adamları (B) (sayılar vermek: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) JSP'ler KAKENHI in.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6, (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9, (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2, (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25, (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43, (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6, (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16, (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13, (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91, (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35, (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65, (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17, (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97, (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12, (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22, (17), 2425-2439 (2013).
Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).More

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter