Summary
여기 우리 현재 인간 iPS 세포 cardiomyocytes 기니 돼지 모델에서에서 파생 된 심장 근육 패치 이식 뒤 왼쪽된 심 실 cryoinjury의 유도 대 한 프로토콜.
Abstract
성인 포유류 심장의 제한 된 재생 능력 때문에 심근 경색 cardiomyocytes의 돌이킬 수 없는 손실에 결과. 이 손실 관련 된 양의 심장 근육의 질량 심장 마비로 이어질 수 있습니다. 심장 이식 외에 말기 심장 마비에 대 한 치료 치료 옵션이입니다. 장기 기증자 부족의 시대에, 기관 독립 치료 modalities 필요 합니다. 그러나 왼쪽 심 실 지원 장치는 유망한 치료 옵션을, 특히 대상 치료, 뇌졸중, 감염 및 bleedings 같은 그것의 부작용에 의해 제한으로입니다. 최근 몇 년 동안, 줄기 세포 주입, 심장 창시자 또는 심근 조직 공학 등 여러 가지 심장 복구 전략 조사 했습니다. 세포 생물학에 있는 최근 개선 cardiomyocytes 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)에서 파생 된 많은 양의의 분화에 대 한 수 있습니다. 평가에서 현재 심장 복구 전략의 하나는 인공 심장 조직 이식입니다. 설계 된 심장 직물 (EHT) 기본 심 혼 직물의 기능 특성을 가진 3 차원 생체 외에서 만든된 cardiomyocyte 네트워크입니다. 파생 된 hiPSC cardiomyocytes EHT 패치를 만들었습니다. 여기 우리 기니 돼지, hiPSC의 주입에 의해 다음에 왼쪽된 심 실 심근 cryoinjury의 유도 왼쪽된 심 실 벽에 EHT 파생에 대 한 프로토콜을 제시.
Introduction
심장 마비 환자의 수는 우리의 노후화 인구에서 증가 하고있다. 말기 심장 마비, orthotopic 심장 이식만 치료 치료 옵션입니다. 그러나, 특히 유럽 국가에서 증가 장기 기증자 부족이입니다. 따라서, 대체 치료 옵션이 필요 하다. 기계적 순환 지원에 최근 성과, 유망 하지만 특히 장기 실행, 출혈, 펌프 혈전 증 및 전염 성 합병증1같은 그것의 부작용에 의해 제한.
성인 인간의 마음의 생 재생 용량 매우 제한 됩니다. 따라서, 심장 재생 요법 말기 심장 마비 환자2,3에 대 한 대체 치료 옵션이 될 수 있습니다. 줄기 세포 기반 세포 주입 등 조직 엔지니어링 접근 되었습니다 다른 기법 설명3,,45.
인간 배아 줄기 세포 (hESC)로 서 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC), 효과적으로 저절로 심장 재생의 분야에 있는 주요 공적 이었던 인간의 cardiomyocytes6, 구타에 분화 될 수 있다 요법입니다.
심근 경색 후 심근을 대체 하 고 실패 심장의 기능을 향상, cardiomyocytes와 그들의 기계 및 전기 기본 마음으로 커플링의 적당 한 수의 생존은 필수적입니다. 인간 iPS 세포 파생 cardiomyocytes와 심장 재생 치료의 가능성을 조사, 적당 한 연구 모델 필요 하다. 이상적인 모델 한다 비용 있고 인간과 같은 생리학, 전기 생리학. 그러나 돼지 같은 큰 동물 모델의 관점에서 이상적인 것입니다,, 그 실험은 매우 비싼 하 고 대량의 cardiomyocytes 심 실 왼쪽에 효과 보려면 cardiomyocytes의 해당 번호를 대체 하는 데 필요한 것 돼지 경색 모델에서 작동 합니다.
예를 들어, 인간의 세포 기반 심장 재생으로 초등학교 생물학 질문에 대답, 세포 생존, vascularization, 및 전기 커플링, 작은 동물 모델은 더 적당 하다. 그들의 전기 생리학 더 밀접 하 게 인간7상황, 사용할 수 있는 작은 동물 모델에서 기니 돼지 쥐와 쥐, 가장 유용한 종입니다. 이 기니 돼지 모델에서 우리는 좌 심 실의 과거 cryoinjury 유도. 3 차원의 심근 경색 주입의 유도 후 1 주일 저절로 엉덩이 셀 파생 cardiomyocyte 치고 패치 수행 되었다. Cardiomyocyte 세포 생존 조직학 시험 주입 후 28 일 평가 했다.
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Protocol
동물은 실험실 동물의 원칙에 대 한 가이드 준수 인도적인 치료를 받은 하 고 준비 하 여 연구소의 실험 동물 자원, 건강의 국가 학회에 의해 출판. 책임 있는 지방 기관에 의해 모든 동물 프로토콜 승인 ('Amt에 Gesundheit und Verbraucherschutz, 제 슈 타트 함부르크' / 동물 프로토콜 # 109/16).
1. 동물을 구합니다
- 상업적으로 500-600 g 무게 여성 기니 피그를 얻을.
- 동물 감 금 소에 기존의 조건에서 그들을 집. 표준 쥐 차 우와 압력가 물 광고 libidum 피드.
2. transthoracic 심장 초음파
- 유도 챔버에서 기니 돼지를 놓고 isoflurane (2-3%)를 가진 동물을 anesthetize. 발가락-핀치에 응답의 부족에 의해 마 취의 깊이 확인 합니다.
- 지구 온난화 플랫폼 (40-42 ° C)에 마 취 기니 돼지 부정사 위치에 놓습니다. 코 콘 (isoflurane 1.5-2%)를 통해 마 취를 계속
- 면도 하 고 모 전기 면도기를 사용 하 여 기니 pig´s 가슴 depilate.
- Prewarmed (25 ° C) 초음파 트랜스듀서 젤을 적용 합니다. 변환기 15 MHz 보다 더 높은 주파수와 장착는 심장 초음파 시스템을 사용 합니다.
- 왼쪽된 다리와 기록 긴 축으로 오른쪽 목에서 직면 하 고 LV 꼭대기의 동시 시각화와 대동맥 밸브의 비행기에서 B 모드 이미지 guinea´s 돼지 흉부에 변환기를 배치 하 여 2 차원 parasternal 긴 축 보기를 취득 합니다. 수술 왼쪽 심 실 기능을 조사 합니다.
- 젖꼭지에 중반 수준에서 짧은 축 B 모드 보기를 90 °도 변환기를 설정 합니다.
참고: 다음 동물 또는 테이블에 즉시 전송 됩니다. 동물은 지속적으로 3 %isoflurane 마 취. 0.05 mg/kg 아트로핀 (인스턴트 메신저) 기계 환기 동안 증가 기관지 분 비를 피하기 위해 주입 됩니다.
3입니다. 수술
-
심근 경색의 유도
- 10 mL 주사기 21 G 바늘과 4-5 mg/kg carprofen 및 진통에 대 한 0.05 mg/kg buprenorphine 피하 주사. 아트로핀 0.5 mg/kg 피하 21 G 바늘과 10 mL 주사기로 주입 됩니다.
- 그것의 뒤에 기니 피그를 놓고 입과 코를 덮고 안 면으로 마 취를 유지 합니다. 뒷 발 (페달 반사의 부족) 곤란 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다.
- 기니 돼지의 다리를 확산 하 고 테이프를 사용 하 여 위치를 수정 합니다.
- 가슴 및 tracheal 지역 마 취 동물의 전기 면도기와 면도. 널리 요오드 기반 스크럽, 뒤에 80% 에탄올을 사용 하 여 영역을 소독. 이 소독 단계를 두 번 반복 합니다.
- Tracheal 지역에서 1.5 c m 세로 절 개를 수행 하 고 퉁 명 스럽게 부 기도 나타날 때까지 기도 취재 하는 근육. 18 G i.v. 정으로 기도 찔린 고 tracheal 튜브로 정의 유연한 부분을 삽입 합니다.
- 절차 동안 지속적으로 기니 피그를 송 풍 하는 동물 인공 호흡기를 tracheal 튜브를 연결 합니다.
참고: 이제 마 취 tracheal 튜브를 통해 isoflurane 3% 유지 (영감 지원 최대 영감 압력, 호흡 속도 환기: 100-120/분, 최대 영감 압력: 18-22 cm Hg 가슴은 오픈 하는 동안 코 빼기도 환기를 사용 하 여 ). - 첫 번째 있는 공간에서 시작 하는 리브 공간을 계산 하 여 5번째 있는 공간을 확인 합니다. 가 위는 트위터를 사용 하 여 기니 돼지의 왼쪽에 5 있는 공간에는 2 cm 가로 절 개를 수행 합니다. 작은 동물 견인을 삽입 합니다. 근육 해 부는 electrocautery와 있는 근육에 도달할 때까지 도달 되는 피하 조직을 제거 후 볼 수 있습니다.
- 부드럽게 해 부 늑 근육 핀셋으로 흉 막 공간에 도달 하 고 하나 왼쪽된 폐에 앞을 볼 수 때까지. 갈비뼈 사이 견인을 삽입 하 고 신중 하 게 심장의 좋은 전망의 얻을 때까지.
- 가 위 앞쪽 왼쪽된 심 실 벽의 지역에서 심장 약 1 cm를 엽니다. 유도 하는 좌 심 실의 cryoinjury 때 손상에서 그것을 보호 하기 위해 왼쪽된 폐에는 압축을 놓습니다.
- 3 분 액체 질소에 0.5 cm의 횡단면 직경 침식된 금속 스탬프 (알루미늄)의 끝을 놓습니다.
- 보도 질소 냉각 30에 대 한 심장의 왼쪽된 앞쪽 벽에 조사 s. 다음 그것을 따뜻하게 하는 스탬프 내부 배치는 전기 인 두기 (250 ° C)를 사용 하 여 마음에서 그것을 구분 합니다. 3 번 과거 심근 상해를 얻으려면이 절차를 반복 합니다. 심근의 희게 관찰 합니다.
- 최대 압력으로 폐를 팽창 (2에 대 한 호흡기의 유출 튜브를 클램핑 하 여 s), 폐의 atelectasis를 피하기 위해. 있는 공간에서 견인 기를 제거 합니다.
- 두 개의 3-0 봉합 갈비뼈를 닫습니다. 마지막 4-0 실행 갈비뼈 위에 근육 봉합. 피부의 폐쇄에 대 한 5-0 봉합 한 바늘을 사용 합니다.
- 1%는 isoflurane를 줄입니다. 동물 자연 호흡 tracheal 튜브를 제거 고 안 면 보호구 (isoflurane 2-3%)와 마 취를 계속 합니다.
- 마 취의 충분 한 깊이 모니터 뒷 다리를 곤란 하 게 하 여 반사의 부재를 보장. 다음 사용 하 여 단일 8-0 봉합 사를 기도에 찔린 사이트를 닫습니다. 3 단일 stich 4-0 봉합 상처를 닫습니다.
- 다음 5 일 동안 진통제에 대 한 buprenorphine (12 h 당 0.05 mg/kg) 및 carprofen (24 h 당 5 mg/kg)를 사용 합니다.
-
EHT (7 일 후에 cryoinjury)의 주입
- 유도 챔버에서 기니 돼지를 놓고 발가락-핀치에 응답의 부족에 의해 isoflurane 체크 마 취의 깊이 가진 동물을 anesthetize.
- 주사 4-5 mg/kg carprofen 및 0.05 mg/kg buprenorphine 피하 21 G 바늘과 10 mL 주사기와 마 취의 유도 후. 그것의 뒤에 기니 피그를 놓고 입과 코를 덮고 안 면으로 마 취를 유지 합니다.
참고: 마 취의 자족 뒷 발을 곤란에 의해 검사 되어야 한다. - 기니 돼지의 다리를 확산 하 고 테이프를 사용 하 여 위치를 수정 합니다.
- 3.1.4–3.1.6 단계에서에서 설명한 대로 미리 수술 준비를 수행 합니다. 가 위 핀셋을 사용 하 여 측면 왼쪽의 흉터 영역에서 2 cm 가로 피부 절 개를 수행 합니다.
- 부드럽게는 electrocautery를 사용 하 여 extrapleural 유착 해 부. 신중 하 게가 위로 흉 막 공간을 엽니다. 마음을 노출 하 늑 골 스프레더를 삽입 합니다.
- 시각적으로 건강 한 주변 심근에 비해 옅은 색으로는 경색의 영역을 식별 합니다. 경색 지역 위에 설계 된 심장 직물 패치를 놓습니다.
- 두 개의 8-0와 보안 양쪽에서 봉합입니다. (그림 1) 심장의 비 infarcted 영역에 패치를 확보 해야 합니다. 압력을 피하기 위해 atelectasis는 폐의 폐 부 풀 려. 있는 공간에서 견인 기를 제거 합니다.
- 두 개의 3-0 봉합 갈비뼈를 닫습니다. 마지막 4-0 실행 갈비뼈 위에 근육 봉합. 피부의 폐쇄에 대 한 5-0 봉합 한 바늘을 사용 합니다.
- 1%는 isoflurane를 줄입니다. 동물 자연 호흡 tracheal 튜브를 제거 고 안 면 보호구 (isoflurane 2-3%)와 마 취를 계속 합니다.
- 마 취의 충분 한 깊이 모니터 뒷 다리를 곤란 하 게 하 여 반사의 부재를 보장. 다음 사용 하 여 단일 8-0 봉합 사를 기도에 찔린 사이트를 닫습니다. 가까운 3 단일 상처를 4-0 봉합 바느질.
- 다음 5 일 동안 진통제에 대 한 buprenorphine (12 h 당 0.05 mg/kg) 및 carprofen (24 h 당 5 mg/kg)를 사용 합니다.
- EHT 이식 후 4 주 수행 transthoracic 심장 초음파 (2 단계에서 설명한) LV 기능을 지속적으로 모니터링 해야 합니다.
참고: EHT 주입 및 EHT 주입 하 여 심장 기능 향상을 위한 모니터링 하는 데 이식 후 4 주 전에 LV 기능을 모니터링 하는 - 안락사는 동물 IACUC 승인 프로토콜 및 수술 explant 추가 분석에 대 한 마음.
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Representative Results
이 기니 돼지 모델은 hiPSC의 주입 파생 EHT 패치 후 심장 재생을 조사 하는 적합 한 모델. 그것은 reproducibly 큰 과거 심근 상해에 이른다. 흉터 크기는 cryoinjury 후에 4 주 조직학에 의해 평가 됩니다. 메이슨 trichrome 얼룩이 보여 큰 과거 흉터 (그림 2). 흉터 크기8재현성 높은 학위를 반영 하는 부상된 동물의 많은 수에 유사 했다. 평균 25% 왼쪽된 심 실 심근의 흉터 조직으로 대체 되었다. 부분적으로 흉터 (그림 3a) remuscularized 대형 심근 이식 시연 Dystrophin 얼룩. 인간 Ku80에 대 한 얼룩 (그림 3b)이 새로 형성된 된 심근의 인간의 기원을 이었다. 높은 배율 이러한 이식 밀도가 포장된 myocytes 이루어져 밝혔다. 왼쪽된 심 실 기능 transthoracic 심장 초음파를 사용 하 여 모니터링 했다. 성공적인 EHT 이식 LVEF, 단축, 소수 지역 및 좌 심 실 끝 심장 확장 직경 (그림 4)에 있는 감소에서 개선에 의해 특징입니다.
그림 1: 이식 후 hEHT 패치. 이식 후 바로 (A) 패치. (B) 패치 이식 후 4 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 마 송에 경색의 결정의 trichrome 스테인드 파라핀 섹션 cryoinjury 후 28 일. 경색 거리 조직 대표 파란색 Masson의 trichrome 얼룩에 의해 결정 됩니다. 눈금 막대 = 2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Dystrophin와 인간 Ku80 얼룩. (A) 상처 영역 (B)에서 보여주는 큰 근육 제도 (갈색) 얼룩 Dystrophin 심장 sectioned 파라핀의 구 얼룩. 구-80 인간 특정 항 체 이다. 따라서 긍정적으로 얼룩진된 셀 (갈색)는 인간의 근원에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: transthoracic 심장 초음파를 사용 하 여 좌 심 실 M-모드 측정. (A) 기준 및 (B) cryoinjury 후 1 주일. (벨트: Intraventricular 심장, LV: 좌 심 실, 비밀 번호: 후부 벽). 측정 3 번 수행 됩니다. 기준선, cryoinfarction 후 1 주, 4 주 EHT 주입 후에 를이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
작은 동물 모델의 다양 한 세포 이식 다친된 마음9,,1011에 미치는 효과 연구에 사용할 수 있습니다. 우리는 모든 작은 동물 때문에 기니 피그 모델 모델의 (전기) 선택 생리학 인간의 가장 밀접 하 게 유사한. 작은 동물 모델의 장점은 간단한 주택, 관리 비용 및 몇 가지 노동입니다. 쥐 및 쥐에 비해 기니 pigs´ 심장 (전기) 생리학은 인 간에 게 더 유사한. 특히 심 혼 주파수는 낮은 (~250/min), 심 실 동작 잠재적인 고원 단계 프로그램과 현재 칼륨 나kr repolarization7에 대 한 중요 하다. 또한, 동물의 더 큰 크기는 특히 중요 한 다시 thoracotomy 상해의 유도 후 필요한 한 주 수술 용이. 그러나, 기니 피그는 몇 가지 경험을 요구 하는 마 취에 민감한.
Shiba 외., 50 mg/kg 케 타 민 및 2 mg/kg xylazine (i.p.) 기니 피그 심장 cryoinjury4anesthetize를 사용 하 여를 설명 합니다. 우리는 또한이 마 취 연대를 평가 했습니다. 단점 중 하나는 xylazine의 강력한 antidotes을 누락으로 인해 마 취 제 마약 효과 일시 중지 수 있다는 사실 이다. 기니 피그는 저 혈당의 위험이 높은 수술 절차 동안 고려, 우리는 그 효과 쉽게 제어 하 고 따라서 매우 짧은 마 취 회복 단계에 이르는 마 취 가스를 사용 하기로 결정 했다. 기관 절제술 절차에 걸쳐 안전 환기를 보장 하는 데 사용 됩니다. 오로 tracheal 삽 관 법은 기술적으로 매우 기니 피그에서 요구 하는 기도의 개통의 시각화는 종종 어려운 고 안전 삽 관 법을 보장할 수 없습니다.
심한 심근 상해를 유도 하는 곳을 알아내는-부상 하지만 그것은 정확 하 게 반영 하지 관상 동맥 질환 / 인 간에 있는 심근 경색. 이 점에서 젊은이 나 심지어는 국 소 빈 혈 reperfusion 상해 모델의 결 찰은 밀접 하 게 인간의 이상이. 그러나, 관상 동맥 해부학 기니 피그에는 광범위 한 담보 특징 이다. 따라서, 왼쪽된 앞쪽 내림차순 관상 동맥의 결 찰 reproducibly 기니 피그12,13큰 심근 부상에서 결과 하지 않습니다. 젊은이-결 찰 쥐 및 쥐에는 광대 한 개장 하 고 결국 앞쪽 벽,이 정도로 인간에서 볼 수 없는 특성의 숱이 이끌어 낸다. 기니 돼지 cryo-부상 모델 리 모델링 프로세스를 유도 하 고 심 실 벽의 하지만 정도로 숱이 더 밀접 하 게 닮는 심근 상해 인간에서 본. 따라서, 보다 안정적인 심근 부상을 cryoinjury 모델13를 선정 되었다. Periprocedural 사망률이 모델 주요 문제입니다. 처음에, 동물의 약 30%는 첫 번째 작업 중 또는 심장 손상 후 7 일 이내 사망 했다. 또 다른 30% 60%의 전반적인 사망률에 대 한 EHT 이식 회계 중 사망 했다. 몇 가지 수정을 사망률에 큰 감소 이어질. Isoflurane 무거운 타 액 분 비와 기관지 분 비를 유도 한다. 아트로핀 기관지 분 비를 감소 시키고 사망률 감소에 주요 요인 이었다. 두 번째 요소는 무 겁 게 사망률 감소는 마음에서 차가운 금속 스탬프 출시 납땜의 사용 이다. 따뜻한 물 심근에서 스탬프를 분리를 처음 사용 되었다. 그러나, 그것은 흉 강에서 물을 제거 하기 어려웠다. 남은 물 부정적인 영향을 호흡 하 고 animal´s 예 후를 악화 접착의 발전으로 이어질. 또 다른 수정 절차를 긍정적으로 영향을 압축 차가운 금속 스탬프에서 왼쪽된 폐의 보호 했다. 이러한 수정 후 구현된 사망률 EHT 이식에 대 한 또 다른 25%를 (를 포함 하 여 첫 수술 후 주) 심장 상해 작업에 대 한 ~ 20% 감소 했다. Cryo 상해의 유도 기술적으로 쉽게 작업을 나타내는 고 후 5-10 동물 감독 아래 운영 되어 일관 된 결과 얻을 수 있습니다. EHT 이식 더 요구 이며 재현성 결과 얻을 수 있습니다 때까지 감독 하에 약 20 수술은 것이 좋습니다.
처음에 우리는 마음을 헹 구 고, 따라서, 왼쪽된 심 실 벽에서 냉동된 프로브를 분리 하려면 따뜻한 식 염 수를 사용. 이 절차는 쉽게 처리할 하지만 호흡 실패의 위험을 증가 하는 흉부에 남아 있는 염 분의 몇 밀리 리터.
결론적으로, 묘사 된 기니 피그 모델 재현, 저렴 한 이며 일관 된 결과를 리드. 다시 작업 하기 전에 심장 상해의 존재를 평가 하 및 비-침략 적 가능한 도구를 제공 하는 심장 transthoracic 초음파 하 고 이식 이식 수행 됩니다.
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Disclosures
작가의 아무도 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 선언 있습니다.
Acknowledgments
이 연구에 대 한 받은 아무 자금 조달
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ventilator (VetFlo Dual Mode) | Kent Scientific | ||
| Forene | abbvie | 1000009819 | |
| Carprofen | Zoetis | 256692 | |
| Atropin | Braun | PZN 00648037 | |
| Buprenorphin | Sigma | ||
| Metal stamp | |||
| Electric soldering iron | Claytools | ||
| 3-0 prolene suture | Ethicon | ||
| 4-0 prolene suture | Ethicon | 662SLH | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | 8710H | |
| 8-0 prolene suture | Ethicon | 8841H | |
| Tungsten Carbide Scissor | FST | No. 14568-12 | |
| Stainless sterilization Container | FST | No. 20890-51 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11652-10 | |
| Extra fine Graefe Forceps | FST | No.11150-10 | |
| Forceps | FST | No. 11022-15 | |
| Halsted- Mosquito | FST | No. 13009-12 | |
| Forceps | FST | No.13003-10 | |
| Baby Mixter | FST | No. 13013-14 | |
| Needle holder (Castroviejo with Tungsten Casbide Jaws) | FST | No. 12565-14 | |
| Needle Holder (Halsey) | FST | No. 12501-13 | |
| Alm Retractor with Blumt Teeth | FST | No. 17008-07 | |
| Spring Scissor | FST | No. 15000-00 | |
| Compress 5x5 | Fink + Walter | PZN 08821417 | |
| Venflon Pro Safety | Becton Dickinson | PZN11123964 | |
| Cautery High Temp 2" | Bovie Medical Corporation | 0100607151011055 |
References
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