Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

Published: December 5, 2018 doi: 10.3791/58814
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute of Pharmaceutical Science, King's College London
* These authors contributed equally

Summary

Exosome הוא דור חדש של ספקיות שירות משלוח סמים. הקמנו פרוטוקול בידוד exosome עם תשואה גבוהה וטוהר למסירה siRNA. אנו גם אנקפסולציה siRNA שאינם ספציפיים שכותרתה fluorescently לתוך exosomes, חקר את ספיגת הסלולר של siRNA טעונים exosomes בתאים סרטניים.

Abstract

שלפוחית חוץ-תאית, ב- exosomes מסוים, לאחרונה השיגו עניין כמו סמים הרומן משלוח וקטורים עקב שלהם ממקור ביולוגי, שפע, ויכולת מהותי במשלוח המערכת של מולקולות שונות. עבודה זו מבססת פרוטוקול בידוד כדי להשיג תשואה גבוהה ועל טוהר גבוהה של exosomes למסירה siRNA. תאי הכליה עובריים אנושיים (תאים HEK-293) מתורבתים ב ביוריאקטור מבחנות וקצרו התרבות supernatant (המכונה לכאן בזמן שנסעתי בינוני ממוזגים) היא על בסיס שבועי כדי לאפשר העשרת HEK-293 exosomes. המדיום ממוזגים (ס מ) אינה מסומנת מראש של תאים מתים ופסולת התאית על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, הוא נתון ultracentrifugation על גבי כרית סוכרוז ואחריו צעד כביסה, כדי לאסוף את exosomes. מבודדים HEK-293 exosomes מאופיינים לביטוי סמן התשואה, מורפולוגיה, exosomal על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיק, כימות חלבון, מיקרוסקופ אלקטרונים cytometry זרימה, בהתאמה. RNA קטנים מפריעות (siRNA), המסומנת fluorescently Atto655, נטען exosomes על ידי אלקטרופורציה, עודף siRNA יוסר על ידי סינון ג'ל. ספיגת תאים בתאי סרטן PANC-1, לאחר דגירה 24 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, אושר על ידי cytometry זרימה. HEK-293 exosomes הם nm 107.0 ± 8.2 בקוטר. יחס יחס (P:P) exosome תשואה של חלקיקים-כדי-חלבון הם ב- 6.99 ± 0.22 × 1012 חלקיקים/mL ו חלקיקים10 ± 8.3 1.7 × 10/µg, בהתאמה. היעילות כימוס של siRNA ב exosomes הוא ~ 10-20%. 40% של התאים מראים אותות חיוביים עבור Atto655 ב 24 שעות שלאחר הדגירה. לסיכום, בידוד exosome על ידי ultracentrifugation על גבי כרית סוכרוז מציע שילוב של התשואה טוב וטוהר. siRNA היתה אפשרות לטעון בהצלחה לתוך exosomes על ידי אלקטרופורציה ונשלח לאחר מכן לתוך תאים סרטניים במבחנה. פרוטוקול זה מציע נוהל סטנדרטי של פיתוח שנטענו siRNA exosomes למסירה יעיל תאים סרטניים.

Introduction

Exosomes תת סוג של שלפוחית חוץ-תאית (EV) הנע בין 50-200 ננומטר בקוטר, מופרש על ידי סוגי תאים שונים כגון תאים חיסוניים1,2, סרטן בתאי3,4,5, 6 7תאי גזע. Exosomes יש גם הוכח להיות נוכח10,9,8,נוזלים פיזיולוגיים שונים11. השילוב של יכולת מובנית של exosomes נושאים שונים מולקולות (למשל, RNA וחלבונים)12,13,14 ומסירה יעיל של מולקולות אלה לתוך תאים הנמען 15 , 16 , 17 להתעניינות של הפוטנציאל שלהם כמו וקטורים משלוח סמים בקנה מידה ננו. מולקולות קטנות שונות לשמש נגד סרטן ותרופות אנטי דלקתיות הפגינו שיש לטעון בהצלחה לתוך exosomes, ונמסר היעד תאים18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. מעניין, חומצות גרעין כגון siRNA28,29 ו- microRNA30 יש גם בהצלחה נטענת לתוך exosomes ויה אלקטרופורציה, מועברת לתאי המטרה.

לאחרונה, ה-RNA הפרעה (RNAi) דרך קטן מפריעות RNA (siRNA) צברה יותר עניין כמנגנון המועדפת ב ג'ין להחרשת עקב ירידה לפרטים גבוה שלה, אפקט חזק, תופעות לוואי מינימליות וקלות של siRNA סינתזה28, 29. siRNAs הם מולקולות RNA גדילי זוגית ועד 19 נוקלאוטידים 25 אורך זה נוקאאוט mRNA מפעילים קטליטי רצף ספציפי. בשל משקל מולקולרי גדול שלה polyanionic הטבע, ספיגת פסיבי של siRNA עירום לתוך התאים הוא הפריע28,29. . זה גם לא אפשרי עבור siRNA עירום להיות מוזרק למחזור הדם מערכתית עקב להשפלה מהירה על ידי פלזמה nucleases31 לפיכך, ומגעים siRNA ב nanocarrier הסיוע יעילה של ספיגת של siRNA לתוך תאי היעד.

Exosomes הם מערכת אידיאלית לצורך כימוס siRNA המבנה שלו מורכבת גרעין חלול, מימית עטוף בקליפה bilayer פוספוליפיד. Exosomes לא רק יש יציבות טובה בדם, אך יש גם מאפיינים מיקוד טבעי כדי לספק RNA פונקציונלי לתוך תאים32. המחקר שנערך על ידי. אלוורז-Erviti et al. בהצלחה הפגינו יעיל מסירת siRNA אל מוחותיהם של עכברים באמצעות הנדסה לאחור exosomes עם כמעט אין סיבוכים31. זה זה שיערו כי טיפול המבוסס על exosome הוא בטוח יחסית יותר טיפולים אחרים כמו exosomes אינם משתכפלים endogenously תאים היה, לכן לא נספח מאפייני גרורתי15.

שיטות שונות דווחו לבודד בהצלחה exosomes תרבית תאים או נוזלים פיזיולוגיים. השיטה הפופולרית ביותר משתמש ultracentrifugation כדי הצניפה exosomes מן ההתחלה גשמי31,32,33. שיטה זו יכולה להיות די קשה על exosomes, בדרך כלל חלבונים פוחת משקעים שיתוף מדגם. שילוב ultracentrifugation עם הפרדה המבוססת על צפיפות כגון מעברי צבע סוכרוז הופכת שכיחה יותר, כדי לצמצם זיהום חלבון לבין הלא-exosomal ב-19,exosomes מבודדים34. גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות) מאפשר הפרדה בין exosomes של סוגים אחרים של שלפוחית חוץ-תאית (EV) על-ידי גודל ואני יכול גם לגרום לזיהום חלבון מינימלית אבל הוא מוגבל על ידי כמות קטנה של חומר זה יכול לעבד35, החל 36. לכידת Immunoaffinity משתמשת חרוזים מצופה נוגדנים לאגד exosomal פני שטח חלבונים כגון tetraspanins או הסמן השני התא הספציפי המאפשר ללכוד ספציפיות של exosomes יותר מאשר EVs או חלבונים אחרים, כמו גם לבודד את אוכלוסיית תתי exosomes של כל דגימות, אבל שוב הוא מוגבל על ידי כמות החל חומר והוא יקר36,37. מבוסס פולימר משקעים של exosomes נהגה להיות פופולרי מדי, אבל מאז זה משקעים גולמי למדי, זה מוביל גבוה שאינו exosomal שלפוחית וחלבון זיהום38,39.

אלקטרופורציה דווח על שלה יעילות כשיטה לטעון exosomes עם siRNA עקב חלבון צבירת15,28,31. גישות מבוססות-תקנים היו הפגינו שיהיה כדאי להעמיס חלבון יציבות ויעילות, אבל הוא לא רצויים בשל שלה רעילות תופעות לוואי של תרביות תאים סוכנים של שינוי בביטוי גנים הסלולר28. לפיכך, אלקטרופורציה כבר יותר בשימוש נרחב ב siRNA loading exosomes כמו זו שיטה בטוחה יותר. עם זאת, שיטת אופטימיזציה כימוס צריך להיות הוקמה על מנת לספק כמות מספקת של siRNA לאתר היעד עבור נוקאאוט גנטי חזק.

כאן, אנו מציעים פרוטוקול בידוד exosome משתמש המבוסס על צפיפות ultracentrifugation על גבי פשוט בודד 25% (w/w) סוכרוז כרית המבושלות דאוטריום תחמוצת, במקום הדרגתי צפיפות סוכרוז. זוהי שיטה חסכונית זה עוקף ההכנה הדרגתיות צפיפות מפרך, מאפשרת עיבוד של כמויות גדולות של החומר מתחיל, אולם התוצאה exosomes שלם של תשואה גבוהה וטוהר מתאים לטעינה הבאים עם siRNA. פלורסנט Atto655 מצומדת שאינם ספציפיים siRNA נטען לתוך הכליה עובריים אנושיים תאים (תאים HEK-293) נגזר exosomes ויה אלקטרופורציה ומסר לתאי סרטן אדנוקרצינומה בלבלב האנושי (PANC-1) אין ויטרו.

Protocol

1. תא תרבות בבקבוקון ביוריאקטור

Figure 1
איור 1: התרבות של תאים ביוריאקטור הבקבוק לייצור exosome. (א) פשוטה האנטומיה של הבקבוק ביוריאקטור. (B) התחלתי תרבות בתוך הבקבוק ביוריאקטור. ראה טבלה של חומרים ההרכב של נורמלי, מדולדל exosome בינוני קציר (C) ממוזגים בינוני (ס מ) ותחזוקה של תרבות הבקבוקון ביוריאקטור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. תרבות HEK-293 תאים נורמליים בינוני (ראה טבלה של חומרים; 5% CO2, 37 ° C) ולהרחיב אותם לתוך מבחנות x T75 4 (עד 90% confluent).
  2. הרטב את הקרום + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור על-ידי הוספת 50-100 מ ל בינונית רגילה בתוך המאגר בינוני + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור.
  3. לאסוף את כל התאים HEK-293 מ 4 x T75 ו resuspend אותם תוך 15 מ"ל של מדיום מדולדל exosome (ראה טבלה של חומרים).
  4. להוסיף התליה תא HEK-293 תא התא + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור באמצעות מזרק 20 מ"ל מחובר מילוי בוטה מחט (ראה טבלה של חומרים), עם טיפול להסרת כל בועה זה אולי יצרו.
  5. למלא מאגר בינוני הבקבוק ביוריאקטור בינונית רגילה כדי 500 מ"ל ולשמור הבקבוקון בחממה (5% CO2, 37 ° C) במשך שבוע.

2. ממוזגים בינוני (ס מ) קציר מן הבקבוק ביוריאקטור

  1. אחרי שבוע 1, למחוק את כל אמצעי בתוך המאגר בינוני + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור.
  2. להסיר כל המדיום בתא תא (קרי, ס מ) בעזרת מזרק 20 מ"ל מחובר מחט מילוי בוטה.
  3. להוסיף 50-100 מ ל בינונית רגילה המאגר בינוני.
  4. להוסיף 15 מ"ל של מדיום מדולדל exosome תא תא על-ידי הסרת המדיום הישן והוספת טרי בינוני מדולדל exosome באמצעות מזרק 20 מ"ל מחובר מחט מילוי בוטה.
  5. למלא מאגר בינוני הבקבוק ביוריאקטור בינונית רגילה כדי 500 מ"ל ולשמור הבקבוקון בחממה (5% CO2, 37 ° C) לשבוע נוסף.
    הערה: ניתן המשיך את התרבות במשך יותר משנה. עבור שלב 2.2, ס מ הקציר הראשון לא ישמש exosome בידוד, נמחקת. כדי להפוך את 2nd הקציר עוקבות, ס מ נשמרת exosome בידוד.

3. Exosome בידוד על גבי כרית סוכרוז

Figure 2
איור 2: בידוד ואפיון של exosomes. (א) ניקוי קדם שנקטפו ממוזגים בינוני (ס מ) של תאים מתים ופסולת תאים. (B) בידוד exosomes מ ס מ על גבי כרית סוכרוז. (ג) שטיפת צעד כדי להסיר סוכרוז וחלבונים משחיתה. Exosomes מבודד (D) היו אז נתון אפיון physicochemical, ביוכימי, מורפולוגיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. מראש נקה את ס מ (מתוך שלב 2.2) על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית ולסינון כדלקמן.
    1. צנטריפוגה ב 500 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור חדש ולבטל את גלולה. חזור על פעולה זו צנטריפוגה פעם נוספת, מחלים את תגובת שיקוע ומחיקת בגדר.
    2. Centrifuge את תגובת שיקוע מהשלב 3.1.1 ב g 2,000 x עבור 15 דקות ו- 4 ° C ולאחר מכן למחוק גלולה. לסנן פעם supernatant התאושש דרך מסננים מיקרומטר 0.22.
  2. במהלך פינוי מראש, הכינו 25% סוכרוז (w/w) פתרון דאוטריום תחמוצת על-ידי במדויק שוקל 1.9 גרם (± 0.001 g) של סוכרוז בשפופרת אוניברסלי ולאחר מכן מצטייד עם תחמוצת דאוטריום עד המשקל מגיע 7.6 g (± 0.001 g).
  3. למלא בהם את ultracentrifuge צינור (ראה טבלה של חומרים) עם 22.5 מ של מאושר מראש ס"מ. לפצות ס"מ 22.5 מ עם 0.22 מיקרומטר-מסוננים PBS אם אמצעי האחסון הנוכחי הוא פחות מזה.
  4. המקום כוס פיפטה (ראה טבלה של חומרים) בצינור, דרך זה, להוסיף 3 מ"ל של סוכרוז פתרון כך הפתרון יוצרת שכבה נפרדת מתחת ס מ.
  5. בזהירות המקום שפופרת המכילה שכבות ס"מ/סוכרוז פתרון לתוך הדלי של הרוטור והזזה (ראה טבלה של חומרים), ולאבטח את הדלי אל הרוטור.
  6. למקם את הרוטור ultracentrifuge (ראה טבלה של חומרים) ו ספין-g x 100,000 עבור h 1.5-4 מעלות צלזיוס.
  7. לאסוף 2 מ"ל של השכבה סוכרוז, להוסיף את זה לרשימת בקבוק ultracentrifuge (ראה טבלה של חומרים) המכיל 20 מ של סינון PBS צעד כביסה.
  8. למקם את הצינורות רוטור זווית קבועה (ראה טבלה של חומרים) ו ספין-g x 100,000 עבור h 1.5-4 מעלות צלזיוס.
  9. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה סרולוגית 10 מ ל, resuspend בגדר עם 400 PBS µL מסוננים. שמור את המניה exosome 4 ° C או-80 מעלות לאחסון לטווח הקצר ולטווח הארוך בהתאמה.

4. אפיון Exosome גודל ואת התשואה על ידי ננו-חלקיק מעקב ניתוח (נ)

  1. לעשות 1:1, 000-1:50, 000 דילולים של המניה exosome בכרך 1 מ"ל (מינימום µL 750) כדי להשיג 20-80 חלקיקים במסגרת צפייה נ מכשיר. התצוגה (ראה טבלה של חומרים).
  2. להזריק את המניה exosome מדולל החדרה נ מכשיר מדגם באמצעות מזרק 1 מ"ל, ויש את הגשוש טמפרטורה של מד חום לתוך הים רגש טמפרטורה.
  3. להגדיר את התוכנה נ (ראה טבלה של חומרים) להקלטת כדלקמן: 3 מידות סטנדרטיות, 30 s לכל, אפשרות טמפרטורה ידני לא מסומן; והזינו את הגורם לדילול תחת הכרטיסייה מתקדם .
  4. קבע את רמת המצלמה 13, להריץ את הסקריפט לכידה על תוכנת נ, הזרקת חבילה חדשה מדגם והזנת את טמפרטורת החדר לדוגמה כאשר תתבקש לעשות זאת לאחר קריאת כל.
  5. מוגדר הסף 4 לחלק לא חשפה ורשום את גודל מודאלי הממוצע ואת ריכוז החלקיקים של המניה exosome מן המדידות.

5. אפיון Exosome טוהר על ידי קביעת יחס של חלקיקים: חלבון

  1. מדד תכולת החלבון של המניה exosome על ידי bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון assay קיט (ראה טבלה של חומרים) כדלקמן.
    1. להכין מוגדרת על ידי סטנדרטים.
      1. להכין את רמת הריכוז הגבוה ביותר (500 µg/mL) על-ידי הוספת µL 45 של BSA פתרון מניות (2 מ"ג/מ"ל – המסופק בערכה assay) צינור microcentrifuge, ולהפוך אותו µL עד 180 עם PBS.
      2. למלא 8 צינורות microcentrifuge µL 90 ל- PBS.
      3. להפוך דילולים טורי (פקטור: 0.5) על-ידי לקיחת 90 µL סטנדרטי BSA הגבוהה והוספת זה לתוך microcentrifuge 1סנט צינור עם PBS (mix היטב), ואז לוקח 90 µL מהצינור הזה מוסיף אותו לתוך הצינור microcentrifuge 2nd .
      4. חזור על זה עד הצינור microcentrifuge השביעית. הצינור ה-8 יהיה רק PBS (קרי, הריק: 0 µg/mL).
    2. הכן את דגימות exosome על ידי דילול 1:2 של דגימות עם PBS ב הנפח הכולל של 90 µL (45 µL מדגם, µL 45 ל- PBS).
    3. הכינו את BCA עובד ריאגנט מיקס.
      1. לחשב את הנפח הכולל של BCA עובד ריאגנט צריך לערבב (50 µL לכל טוב, שבו כפילויות, לרבות תקני).
      2. לערבב את ריאגנטים BCA בודדים לפי היחס הבא: ריאגנט 25 חלקים ריאגנט ת 24 חלקים ריאגנט ב': 1 חלק ג
    4. לבצע את assay וניתוח.
      1. להוסיף 40 µL של כל מדגם רגיל ו exosome המוכן מעל לבאר של צלחת 96-ובכן (כפילות לכל תקן או לדוגמה).
        הערה: מאז זה וזמינותו ערכי צבע מוחלטים, טכניקה נכונה pipetting חיוני להשגת תוצאות מדויקות. פיפטות שינוי לאחר הוספת כל שכפול תקן/מדגם לתוך כל הבארות
      2. הוסף µL 50 של וזמינותו חלבון עובד ריאגנט לערבב כל טוב, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
        הערה: כדי למזער את הסטיות בין משכפל, להוסיף חלבון assay עבודה הכימית שכפול 1סט של מדגם/תקן, ואחריו של שכפול 2nd של התקן/המדגם זהה, לפני הוספתם 1סנט שכפול של מדגם אחר/תקן.
      3. למדוד את ספיגת במלון-562 ננומטר על הקורא צלחת (ראה טבלה של חומרים).
      4. להתוות עקומה סטנדרטיים מתוך הערכים ספיגת בסטנדרטים גבוהים, ולעבוד על ריכוז חלבון בכל מדגם באמצעות המשוואה של העקומה.
  2. לחשב את היחס של חלקיקים: חלבון על-ידי חלוקת התשואה exosome שהושג קודם לכן עם ריכוז חלבון של המניה exosome נמדד לעיל.

6. אפיון Exosomal סמן ביטוי על-ידי Cytometry זרימה

  1. תקופת דגירה 40 µL של exosomes (חלקיקים11 ≥1x10/mL) עם µL 10 של חרוזים לייטקס אלדהיד/סולפט (מדולל של מניות) של 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  2. להוסיף 5 µL בפתרון BSA 100 מיקרומטר (ראה טבלה של חומרים) לתערובת exosome-חרוז לריכוז סופי של 10 מ מ, תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.
  3. להוסיף 1 מ"ל ל- PBS, תקופת דגירה של 75 דקות-RT צינור microcentrifuge עם עצבנות קלה על מטרף נדנדה (~ 150 סל ד).
  4. Centrifuge את המתלים ב g x 580 למשך 5 דקות ב RT וזורקים את תגובת שיקוע.
  5. Resuspend בגדר עם 1 מ"ל של פתרון גליצין 100 מ מ (ראה טבלה של חומרים) דגירה למשך 30 דקות ב- RT.
  6. Centrifuge המתלה למשך 5 דקות ב- g 580 x. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 1 מ"ל של 3% FBS/PBS (ראה טבלה של חומרים).
  7. חזור על שלב זה כביסה ו resuspend בגדר ב 350 µL של 3% FBS/PBS.
  8. לחלק את המתלים צינורות 7, שכל אחד מהם מכיל 50 µL של השעיה, דגירה אותם עם fluorophore מצומדת anti-CD81, נוגדנים anti-CD9 ו- anti-CD63 ופקדים isotype שלהם המתאים (1:10 דילול), בהתאמה, למשך 45 דקות ב 4 º C. שמור 1 של הצינורות פקד מוכתם אלא שעברו עיבוד אותו.
  9. להוסיף 1 מ"ל של 3% FBS/PBS לכל צינור, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g 580 x ולמחוק את תגובת שיקוע.
  10. Resuspend בגדר עם 200-400 µL של 3% FBS/PBS ולנתח את הדגימה על cytometer זרימת (ראה טבלה של חומרים) תחת הערוצים המקובלים.

7. אפיון של מורפולוגיה Exosome על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM)

  1. לתקן את exosome דיספרסיות מימית בריכוזים נאותה כגון 1010 p/mL בתיקון פתרון (ראה טבלה של חומרים) למשך 15 דקות.
  2. המקום הדגימות על 300 mesh פחמן מצופה נחושת רשתות ולהשאיר לאוויר יבש.
  3. שלילית מכתים את הדגימות עם 0.22 מיקרומטר-מסוננים uranyl מימית אצטט (ראה טבלה של חומרים) במשך 4 דקות ואחריו שני 50% מתנול/H2O לשטוף (ראה טבלה של חומרים).
  4. האוויר יבש המדגם.
  5. לצפות את הדגימות תחת TEM (ראה טבלה של חומרים). הגדר את המתח מאיץ 80 kV ואת גודל ספוט-2. השתמש צמצם אובייקטיבית עם כל הדגימות.

8. siRNA כימוס לתוך Exosomes על ידי אלקטרופורציה

  1. מראש להרגיע את cuvette אלקטרופורציה (ראה טבלה של חומרים) על קרח למשך 30 דקות לפני אלקטרופורציה.
  2. מיקס 7.0 µg של exosomes (32 µL של 7 x 1012 p/mL במלאי ב- PBS) עם µg 0.33 של siRNA (12 µL מניות 2 מיקרומטר במים נטולי RNase) בצינור microcentrifuge. לבצע את עוצמת הקול µL 150 עם מאגר חומצה ציטרית (ראה טבלה של חומרים). Exosome יחס טוחנת siRNA הוא יצירת במקרה זה.
  3. להעביר את התערובת אלקטרופורציה cuvette. קאפ cuvette את ולמקם אותו האוחז cuvette electroporator (ראה טבלה של חומרים). סובב את גלגל מפנה 180° בכיוון השעון.
    הערה: ההגה יש להפעיל לחלוטין למצב נעול, על מנת cuvette ליצור קשר עם האלקטרודות.
  4. בחר את התוכנית אלקטרופורציה הרצוי (למשל, X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, וכו) ולהתחיל אלקטרופורציה על ידי לחיצה על לחצן התחל .
    הערה: דופק מוצלחת מסומן על-ידי הצגת "אישור" על התצוגה.
  5. פעם אחת electroporated, להסיר את cuvette לאחר דרך חזרה את הגלגל 180° נגד כיוון השעון. למשוך את הדגימה cuvette עם פיפטה פלסטיק עיבוד נוסף.

9. הסרת siRNA חינם באמצעות גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות)

  1. Equilibrate בעמודה שניה (2.9 ס"מ [H] x 1.3 ס מ [W]; ראה טבלה של חומרים) ע י העברת מ 3.5 ל- PBS מסוננים פעמיים.
  2. להמיס μL 150 של מדגם electroporated μL 350 ל- PBS מסוננים, להעביר את זה לעמודה שניה כדי לבצע את ההסרה siRNA חינם.
  3. לאסוף את השבר הראשון 500 μL זה eluted מן העמודה (F0).
  4. להוסיף 500 μL ל- PBS המסונן אל העמודה ולאסוף את השבר הבא 500 μL (F1).
  5. חזור על השלב הנ ל עד סך של 10 x 500 שברים μL (עד F9) נאסף. F1, F2 צריך להכיל את exosomes אנקפסולציה siRNA.
  6. לשטוף את העמודה עם PBS מסוננים (פעמיים, לפחות) כדי להסיר את כל שאריות הדגימה.

10. ספיגת במבחנה של siRNA טעונים Exosomes לתאי PANC-1

  1. הזרע התאים PANC-1 ב- 24-ובכן שטוח התחתונה צלחות (ראה טבלה של חומרים)-צפיפות של תאים 50,000 לכל טוב 24 שעןת לפני תפיסה ללמוד, דגירה התאים בחממה (5% CO2, 37 ° C).
  2. Exosomes Electroporate HEK-293 (7.0 μg) עם Atto655-siRNA (0.33 μg) לפי שלב 8.
  3. לטהר electroporated exosome לפי שלב 9 , resuspend ב μL 100 ל- PBS.
  4. להוסיף 50 μL של exosomes electroporated לתא PANC-1, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 4 שעות.
  5. איסוף תאים לאחר דגירה.
  6. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי, resuspend ב μL 200 ל- PBS סיבוב פוליסטירן-בתחתית צינור (ראה טבלה של חומרים).
  7. לנתח את התאים על ידי זרימת cytometer (ראה טבלה של חומרים) עם 10,000 אירועים רכשה עבור דגימה.
    הערה: האו ם-electroporated exosome-siRNA תערובת דגימות והתאים לא מטופל עם PBS מסוננים שימשו כפקדים.

Representative Results

אפיון physicochemical exosomes מבודדים מתאי HEK-293 (Exo HEK-293) מסוכמים בטבלה1. גודל נמדד באמצעות ננו-חלקיק מעקב כלי ניתוח (נ) היה 107.0 ± 8.2 ננומטר. Exosome התשואה מתאי HEK-293, גם נותחה באמצעות הכלי נ, היתה ב- 6.99 ± 0.22 x 1012 p/mL מ מ ל ~ 24 ס מ (המתקבל 2 סיבובים של קציר). טוהר Exo HEK-293 מוערך על ידי חישוב היחס חלקיקים-כדי-חלבון (P:P) היה 8.3 ± 1.7 × 1010 p/µg.

התפלגות גודל Exo HEK-293 מבודד מוצג באיור 3 א. ניתוח מורפולוגי שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הראה את מסכות HEK-293 היו מבנים כדוריים מעט מעל 100 ננומטר בגודלם (איור 3B). תוצאה זו מסכים עם זה מן המידה נ (איור 3 א). Exo HEK-293 מבודד היו חיוביות CD81, CD9, CD63, אשר הם סמנים הקנוני המשמש לזיהוי שלפוחית כמו exosomes (איור 3C).

עבור טיהור של exosomes באמצעות גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (איור 4), התאוששות אחוז של exosomes מחושב על ידי חלוקת מספר החלקיקים exosome הכולל התאוששה 10 השברים נאספים (F0-F9) עם exosome הראשוני מספר החלקיקים בשימוש, בזמן התאוששות אחוז של siRNA מחושב על ידי חלוקת עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל המתקבל F3, F4 F5 עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל המתקבל שברים 10 כל הנאספים. השחזור של exosome ושל siRNA פוסט-טיהור מחושב כמו 75.0% ו 80.4%, בהתאמה. היעילות כימוס של siRNA ב exosomes היה ~ 10-20%, מחושב באמצעות siRNA סטנדרטי העקומה נוסדה (איור 4C).

ניתוח איכותי של ספיגת במבחנה של exosomes טעון עם Atto655-siRNA פלורסנט מאת cytometry זרימה הראה כי PANC-1 תאים שטופלו exosomes אנקפסולציה siRNA טלקוה משמרת הגדול אות קרינה פלואורסצנטית (איור 5A) . PANC-1 תאים שטופלו exosomes אנקפסולציה siRNA נרשם אחוז גבוה מאוכלוסיית חיובי עבור Atto655 האות (39.4%) לעומת זאת שטופלו לפרוק exosomes siRNA תערובת (0.56%), אשר לאשר התצפית מעל ( איור 5B). מידת ספיגת הסלולר של siRNA (המבוטא ההבדל קיפול ערכי העוצמה (MFI) זריחה מרושע מזה של תאים שלא טופלו) נצפתה גם להיות גבוה משמעותית בתאים PANC-1 שטופלו exosomes אנקפסולציה siRNA (MFI קיפול ההבדל = 5.1) בהשוואה שטיפל עם התערובת exosome-siRNA (MFI מקפלים ההבדל = 1.1) (איור 5C). תצפיות אלה הפגינו exosomes אנקפסולציה siRNA הופנמו על ידי תאים PANC-1 ומסר כי הם ביעילות את siRNA intracellularly.

Figure 3
איור 3: הביוכימי וניתוח מורפולוגיה של HEK-293 exosomes. (א) גודל חלוקת HEK-293 exosomes באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיק (נ). העקומה הצגת היסטוגרמה-גבי 3 שונים לכידות במרווח s 30 אזורים אדומים שמשמעו סטיית תקן בין מדידות (n = 3). (B) הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) תמונות של נאיבי HEK-293 exosomes. סרגל קנה מידה: 100 ננומטר. (ג) גילוי של סמנים exosomal CD81, CD9, CD63 באמצעות cytometry זרימה על HEK-293 exosomes. Exosomes היו מצמידים אלדהיד/סולפט חרוזים לייטקס לפני זיהוי. מתחם Exosome-חרוזים היו לאחר מכן מוכתמות נוגדנים anti-CD81, אנטי-CD9 ו- anti-CD63 fluorophore מצומדת. מידת ביטוי סמני מבוטא ההבדל קיפול ערכי העוצמה (MFI) זריחה החציוני מזו של הפקד (מתחם exosome-חרוזים מוכתם את isotype המתאים). הערכים מבוטאים אומר ± SD, כאשר n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: Exosome טיהור פוסט-אלקטרופורציה. (א) • תנאי פרופילים (F0-F9) של exosomes Atto655-siRNA ו electroporated באמצעות גודל אי-הכללה של chormatography. ניתוח (B) נ Atto655-siRNA והן exosome של F0 כדי F9 באמצעות גודל אי-הכללה של chormatography. (ג) הכיול. עיקול Atto655 מתויג siRNA. עוצמות קרינה פלואורסצנטית התקבלו על-ידי קורא צלחת-Ex / Em: 640-10/680 ננומטר; רווח 2800. הערכים מבוטאים אומר ± SD (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: קליטת סלולר אנקפסולציה siRNA exosomes לתאי PANC-1-4 h (א) היסטוגרמות השוואת הסלולר קליטת exosomes לפרוק + תערובת siRNA ו exosomes אנקפסולציה siRNA. השוואה (B) של ספיגת של exosomes לפרוק + תערובת siRNA ב 4 שעות על ידי מגרש מדומה. (ג) ההבדל קיפול אומר קרינה פלואורסצנטית (MFI) ערכי העוצמה של הדגימות שנבדקו לעומת זו של תאים שלא טופלו. הערכים מבוטאים אומר ± SD, כאשר n = 3. P < 0.001. NS: לא משמעותי. חד-כיווני אנובה שימש לשם ניתוח סטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Exosome גודל1, 2
(אן אם)		 תשואה1,2,3
(p/mL)		 [חלבון] 2, 4
(µg/mL)		 יחס חלקיקים-כדי-חלבון (P:P)5
(p/µg)
HEK-293 107.0 ± 8.2 ב- 6.99 ± 0.22 x 1012 84.3 ± 9.8 8.3 ± 1.7 x 1010 
1 . מדוד באמצעות ננו-חלקיק מעקב ניתוח (כלי נ)
2 הערכים מבוטאים אומר ± SD, כאשר n = 3
3 התשואה שהושגה על-ידי תאים ממוזגים בינוני איחדו מ 2 סיבובים של קציר מ ביוריאקטור מבחנות (~ 24 מ"ל)
4 מדוד באמצעות ערכת assay חלבון
5 הערך שהושג באמצעות נוסחה: P:P יחס = תשואה / [חלבון]

טבלה 1: אפיון Physicochemical של exosomes.

Discussion

השגת תשואה סבירה exosome של תאים בתרבית, אשר מספיקים בשביל כמה סבבים של לימודי חוץ גופית בתוך או ויוו , הוא עדיין אתגר. לדברי היצרן, המבחנות ביוריאקטור נועדו לייצור נוגדנים וחלבונים עם תשואה גבוהה מתרבות של שורות תאים מונצחים שונים. דבר זה מאפשר לתאים ללא הרף להעשיר את המדיום תרבות עם המוצר הרצוי, והתוצאה היא מדיום ממוזגים מרוכז (ס מ) בתוך התא-התא. באופן תיאורטי, אותו הקונספט יהיה מועיל בייצור exosome של שורות תאים שונים, אכן culturing תאים אלה בתוך המבחנות ביוריאקטור הודגם להגדיל משמעותית את התשואה exosome40. המאגר בינוני גדול ברציפות אספקת חומרי הזנה ומסירה פסולת של התא לתא דרך קרום חדיר למחצה 10 kDa, ומאפשר תרבות ממושך ללא צורך כמויות גדולות של בינוני עם התאים, או רגיל מבחנות משתנה, אשר יכול בסופו של דבר להציל את העלות הכוללת ועבודה של ייצור גבוהה-סולם exosome40. גם הוכח כי המורפולוגיה, פנוטיפ, כמו גם את הפונקציות immunomodulatory של exosomes מבודדים תאים לטווח ארוך ביוריאקטור מבחנות שהתרבויות דומה לזה הטרייה תאים תרבותי ב רגיל 75 ס מ2 מבחנות40. תרבות של שורות תאים מונצחים אחרים כמקורות exosome בתוך הבקבוק ביוריאקטור יעזור לכן להגדיל את התשואה שלהם exosome תוך שמירה על תקינות ותפקוד שלהם. צורה זו של תרבות היא אולם לא ישים על ראשי תאים עם מחזורי חלוקה מוגבל, ואלה זה לא יכול להיות תרבותי בצפיפות גבוהה.

כיוון הקציר ס מ מתבצע אחת לשבוע, התאים בתרבות מעולם לא היו passaged, ניתן להניח כי התאים הבקבוקון ביוריאקטור לא צומחות ב טפט כמו התרבות התא הרגיל. הם ככל הנראה בצורת אשכולות עם נמק מרכזי, או פשוט ניתוק מן השטח למות אם התאים נמצאים גם confluent עבור טפט. בדיקה ויזואלית של התא לתא + בקבוקי שתייה צידניות ביוריאקטור אינה אפשרית לאשר הנחה זו, אבל הוא בא לידי ביטוי מספר גדול של תאים מתים שהתקבל במהלך מהקצירה ס מ. הסרת רגיל לקוי חסיד ותאי כלכלית מן הבקבוק ביוריאקטור יכול למנוע הצטברות של חומרים על קרום חדיר למחצה, אשר עלולה להשפיע לרעה על חילופי גז, חומרים מזינים, פסולת בין התא לתא את המדיום מאגר המים, ובכך מאפשר התרבות ממושך המבחנות ביוריאקטור עבור > 6 חודשים40. בהקשר זה, זה שאינו קבוע של גידול תאים של המבחנות ביוריאקטור הוא אידיאלי כפי אנו לשער כי היא מחקה את המצב האמיתי של הגידול בצמיחה ויוו באופן הדוק יותר התרבות תאים חד שכבתי המקובלת, יש לקוות כי exosomes הופק על ידי הסרטן בתאים הבקבוקון ביוריאקטור יהיה יותר דומה לזה מופרש על ידי גידולים בתוך vivo. זה יהיה מועיל במיוחד במחקרים בודקים התפקיד של גידול, נגזר exosomes בהתקדמות של הפתולוגיה הגידול. Exosomes נגזר הגידול דווח ממהותם, מעדיפים הביתה לרקמות שלהם של מקור32, לכן יש exosomes המיוצר במערכת מחקה שלהם ויוו הייצור גם יהיה רצוי במחקרים מסתכל חקר את היכולת מיקוד פסיבי של exosomes סמים nanocarriers.

היחס P:P דווח כפרמטר כדי להעריך את טוהר exosomes מבודדים ובלחות חלבונים של המדיום תרבות של נוזלים פיזיולוגיים שממנו היו exosomes הטרייה41. היחס P:P של 8.3 ± 1.7 × 1010 p/µg שהושגו במחקר זה נופל בתוך הטווח טוהר גבוהה המוצע במחקר. יחס זה מדגיש את הסכנה של שימוש ריכוז חלבון כדי לבטא את התשואה או מנה של exosomes מבודדים או שימוש במחקרים במורד הזרם בהתאמה, כמו זה אינו משקף את כמות exosomes זמין במדגם נתון בבעיה של חלבון האמיתי זיהום במהלך בידוד. נ באמצעות כלים כגון NanoSight, אשר מודד את ריכוז exosomes מבחינת מספר החלקיקים, היא דרך הגיונית יותר ומדויק לכמת exosomes.

שקילה ומדויקים במהלך הכנת הפתרון סוכרוז 25% תחמוצת דאוטריום חיוני כמו בשיטה זו הוא בידוד מבוסס-צפיפות. Exosomes יש מגוון צר של הנפקה צפיפות תמיסת סוכרוז כך מדויק הכנת כרית סוכרוז תפחית זיהום של הלא-exosomal שלפוחית כגון גופים אפופטוטיים להיפגע או שלפוחית גולג'י-derived במהלך בידוד42. מומלץ לא לשמור סוכרוז שאריות פתרון ולהשתמש בו גם לאחר יום אחד כדי למנוע סיכון של גורמים יכול לשנות את צפיפות כגון אובדן או תוספת של מים הפתרון על ידי אידוי או עיבוי של האוויר בצינור. שימוש של הרוטור והזזה חיוני גם במהלך צנטריפוגה על גבי כרית סוכרוז לאפשר העברה גם של exosomes מ ס הפתרון סוכרוז.

נסיגה של סוכרוז פתרון פוסט-צנטריפוגה הוא גם צעד עדין, זה כולל מציאת פשרה בין למקסם את כמות exosomes המשוחזר, ואני לא יותר מדי כי חלבון מאמצעי התרבות היא הציגה את הדגימה exosome מופנמים . הממשק בין הפתרון סוכרוז המדיום התנאי הוא שבו חלבונים של המדיום תרבות אוספים שלאחר צנטריפוגה, בדרך כלל ניתן לראות טבעת חום כהה, שיושב על הממשק. בידיים שלנו, מהאמנה 2 מ של כרית סוכרוז mL 3 הראשונית הוסיף הוא אמצעי האחסון האופטימלית מסכימה עם הפשרה שהוזכרו לעיל. אמצעי האחסון שמתואר פרוטוקול זה מיועדות הרוטורים מסוימים להשתמש; לכן, מומלץ כדי למטב את עוצמת הקול של סוכרוז כדי להיות מסוגר בעת שינוי קנה המידה למעלה או למטה את אמצעי האחסון עבור הסוגים של הרוטורים זמין במתקנים שונים. זה חשוב גם למנוע את הזכות אזור במרכז התחתון של הצינור בעת נסיגה של סוכרוז, כמו זה היא היכן חלקיקים של צפיפות גבוהה יותר מאשר סוכרוז המשקע יכול בדרך כלל ניתן לראות על גלולה תפר חוט רקמה אופווייט.

הצעד כביסה עם כמות יחסית גדולה של PBS מסייעת לצמצם עוד יותר את מידת חלבון זיהום במהלך exosome בידוד41. שלב זה חיוני גם הסרת עודפי סוכרוז exosomes כדי למנוע נזק osmotic exosomes עצמם או את מולקולות בתוך לומן exosomal, כמו גם להפחית את הסיכון של גידול חיידקי או פטרייתי במלאי exosome. מכינים את הפתרון סוכרוז ב דאוטריום תחמוצת יותר מאשר מים מסייעת להפחית את כמות סוכרוז צריך להשיג את הצפיפות הנפקה exosome לבידוד, ומכאן לצמצם את הסיכון של נזק osmotic והן זיהום מיקרוביאלי. לאחר צנטריפוגה הראשון על גבי כרית סוכרוז, המכיל exosome שכבה סוכרוז מסוגר ויצורפו לאיש, טוב, מגניב ניתן לאחסן ב 4 ° C ולעבד למחרת אם מתמודד עם אילוצי זמן.

לפי מיטב ידיעתנו, היחס טוחנת exosome/siRNA הוא גורם חשוב בקביעת יעילות אלקטרופורציה. ב פרוטוקול זה, השתמשנו יצירת כמו exosome יחס טוחנת siRNA. כפי היכולת כימוס של סוגים שונים של exosomes שונים, אנו ממליצים מאוד כדי להיות מותאם על בסיס מקרה לגופו. עם זאת, היעילות כימוס המוצע במסמך זה תמיד יכול להיות פרמטר עבור בחירת התנאים אלקטרופורציה אופטימלית.

בנוסף, צבירה של siRNA הוא האמין להיות אחד של הבעיה הנפוצה ביותר באלקטרופורציה. הוכח שאלקטרופורציה הזה יכול לגרום צבירה חזקה של siRNA, עושה את זה אפילו יותר קשה להיכנס exosomes. הצטברויות של siRNA מפורשים לעתים קרובות בטעות כפי ומגעים siRNA לפקדי ולכן ראוי exosome השתמשו במחקר זה כמו היווצרות של אגרגטים siRNA בלתי נמנע במהלך אלקטרופורציה28. כימוס אחוז יעילות שיטת טיהור שלנו מחושב באמצעות ערכים מנורמל כדי למזער את ההשפעה ממקורות אחרים, כגון רקע רעש, exosome ו- siRNA מצבורים שזה ישפיע על אמינות הנתונים. בהתבסס על הממצאים שלנו, היו מצבורים siRNA זניח שנצפתה על הבקרה מדגם קרי, באמצעות electroporated ו un-electroporated siRNA.

פרוטוקול זה הוכיח בהצלחה ומגעים siRNA לתוך exosomes, את הפנייה תאיים עוקבות של siRNA סרטן תאים בתוך חוץ גופית. לכן, סוגים שונים של exosomes של שורות תאים שונים יכול להיות מבודדת, מאופיין באמצעות פרוטוקול המוצעת ואת לאחר מכן עמוסה siRNA טיפוליים שונים עבור סוגים שונים של מטרות oncogenic ביטוי יתר סוגי סרטן שונים. יישום מעניין יהיה לחקור את משלוח siRNA ויעילות ספיגת באמצעות הגלגולים השונים של exosome מקור-יעד תא זוג חוץ גופית בתוך. זה אז יכול להיות מתורגם מודלים בבעלי חיים כדי להעריך את היעילות של הן את המשלוח ויעילות טיפולית אנקפסולציה siRNA exosomes ויוו.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

פ Faruqu ש ממומן על ידי הסוכנות ממשלת מלזיה Rakyat Amanah המג'לס (מרה). Xu ל' הוא הנמען של מארי קירי Sklodowska בודדים המלגות (אופק 2020) (H2020-MSCA-אם-2016). קיי טי אל-ג'מל מאשר מימון BBSRC (BB/J008656/1) וטרסט (WT103913). המחברים גם רוצה תודה ד ר פול לבנדר, ד ר דוד פחד (המחלקה לרפואה נשימתית, אלרגיה, קולג '-לונדון קינגס) למתן את electroporator.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zitvogel, L., et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell derived exosomes. Nature Medicine. 4 (5), 594-600 (1998).
  2. Raffai, R., Li, K., Wong, D., Hong, J. Therapeutic control of systemic inflammation & atherosclerosis with ApoE-polarized macrophage exosomes. Atherosclerosis. , e5-e6 (2017).
  3. Masamune, A., et al. Exosomes derived from pancreatic cancer cells induce activation and profibrogenic activities in pancreatic stellate cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 71-77 (2018).
  4. Gangoda, L., et al. Proteomic Profiling of Exosomes Secreted by Breast Cancer Cells with Varying Metastatic Potential. Proteomics. 17 (23-24), 1600370 (2017).
  5. Wozniak, M., Peczek, L., Czernek, L., Düchler, M. Analysis of the miRNA Profiles of Melanoma Exosomes Derived Under Normoxic and Hypoxic Culture Conditions. Anticancer Research. 37 (12), 6779-6789 (2017).
  6. Salimu, J., et al. Dominant immunosuppression of dendritic cell function by prostate-cancer-derived exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1368823 (2017).
  7. Lankford, K. L., et al. Intravenously delivered mesenchymal stem cell-derived exosomes target M2-type macrophages in the injured spinal cord. PLoS ONE. 13 (1), e0190358 (2018).
  8. Khalyfa, A., et al. Plasma Exosomes and Improvements in Endothelial Function by Angiotensin 2 Type 1 Receptor or Cyclooxygenase 2 Blockade following Intermittent Hypoxia. Frontiers in Neurology. 8, 709 (2017).
  9. Manek, R., et al. Protein Biomarkers and Neuroproteomics Characterization of Microvesicles/Exosomes from Human Cerebrospinal Fluid Following Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 55 (7), 6112-6128 (2018).
  10. Pathare, G., et al. Changes in V-ATPase subunits of human urinary exosomes reflect the renal response to acute acid/alkali loading and the defects in distal renal tubular acidosis. Kidney International. 93 (4), 871-880 (2018).
  11. Liao, Y., Du, X., Li, J., Lönnerdal, B. Human milk exosomes and their microRNAs survive digestion in vitro and are taken up by human intestinal cells. Molecular nutrition & food research. 61 (11), 1700082 (2017).
  12. Kim, J., et al. Cyclooxygenase-2 expression is induced by celecoxib treatment in lung cancer cells and is transferred to neighbor cells via exosomes. International Journal of Oncology. 52 (2), 613-620 (2017).
  13. Sterzenbach, U., et al. Engineered Exosomes as Vehicles for Biologically Active Proteins. Molecular Therapy. 25 (6), 1269-1278 (2018).
  14. Conigliaro, A., Fontana, S., Raimondo, S., Alessandro, R. Exosomes: Nanocarriers of Biological Messages. In Exosomes in Cardiovascular Diseases. 998, 23-43 (2017).
  15. El Andaloussi, S., Lakhal, S., Mäger, I., Wood, M. J. A. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (3), 391-397 (2013).
  16. Simhadri, V. R., et al. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS ONE. 3 (10), e3377 (2008).
  17. Santos, J. C., et al. Exosome-mediated breast cancer chemoresistance via miR-155 transfer. Scientific Reports. 8 (1), 829-829 (2018).
  18. Hadla, M., et al. Exosomes increase the therapeutic index of doxorubicin in breast and ovarian cancer mouse models. Nanomedicine. 11 (18), 2431-2441 (2016).
  19. Smyth, T., et al. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. Journal of Controlled Release. 199, 145-155 (2015).
  20. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  21. Kim, M. S., et al. Engineering macrophage-derived exosomes for targeted paclitaxel delivery to pulmonary metastases: in vitro and in vivo evaluations. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 14 (1), 195-204 (2018).
  22. Bellavia, D., et al. Interleukin 3- receptor targeted exosomes inhibit in vitro and in vivo Chronic Myelogenous Leukemia cell growth. Theranostics. 7 (5), 1333-1345 (2017).
  23. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  24. Tian, T., et al. Surface functionalized exosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy. Biomaterials. 150, 137-149 (2017).
  25. Zhuang, X., et al. Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular Therapy. 19 (10), 1769-1779 (2011).
  26. Iessi, E., et al. Acridine Orange/exosomes increase the delivery and the effectiveness of Acridine Orange in human melanoma cells: A new prototype for theranostics of tumors. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 648-657 (2017).
  27. Aqil, F., et al. Exosomal delivery of berry anthocyanidins for the management of ovarian cancer. Food & Function. 8 (11), 4100-4107 (2017).
  28. Shtam, T. A., et al. Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 1-10 (2013).
  29. Wahlgren, J., et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Research. 40 (17), e130-e130 (2012).
  30. Yang, J., Zhang, X., Chen, X., Wang, L., Yang, G. Exosome Mediated Delivery of miR-124 Promotes Neurogenesis after Ischemia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 7, 278-287 (2017).
  31. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology. 29 (4), 341-345 (2011).
  32. Wiklander, O. P. B., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-13 (2015).
  33. Varga, Z., et al. Radiolabeling of Extracellular Vesicles with 99m Tc for Quantitative In Vivo Imaging Studies. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 31 (5), 168-173 (2016).
  34. Smyth, T. J., Redzic, J. S., Graner, M. W., Anchordoquy, T. J. Examination of the specificity of tumor cell derived exosomes with tumor cells in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1838 (11), 2954-2965 (2014).
  35. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23430 (2014).
  36. Sharma, P., et al. Immunoaffinity-based isolation of melanoma cell-derived exosomes from plasma of patients with melanoma. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1435138 (2018).
  37. Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 247 (1), 163-174 (2001).
  38. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling. In Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols. , 235-246 (2011).
  39. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  40. Mitchell, J. P., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Increased exosome production from tumour cell cultures using the Integra CELLine Culture System. Journal of Immunological Methods. 335 (1-2), 98-105 (2008).
  41. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles? Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 1-6 (2013).
  42. Chiou, N. -T., Ansel, K. M. Improved exosome isolation by sucrose gradient fractionation of ultracentrifuged crude exosome pellets. Nature Protocol Exchange. , (2016).

Tags

חקר הסרטן גיליון 142 Exosome בידוד אפיון siRNA משלוח ספיגת הסלולר Nanocarrier
הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K.… More

Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter