Summary
exosome 마약 배달 사업자의 새로운 세대입니다. 우리는 높은 수율 및 순도 siRNA 전달 exosome 격리 프로토콜을 설립. 우리는 또한 exosomes에 놓여있는지 이라는 일반적인 siRNA를 캡슐화 하 고 siRNA 로드 exosomes 암 세포에서의 세포질 통풍 관을 조사.
Abstract
특정 exosomes에 extracellular 소포 최근에 얻고 있다 관심 소설 약으로 그들의 생물 학적 기원, 풍부, 및 다양 한 생체의 세포 전달에 본질적인 기능 전달 벡터. 이 작품을 높은 수율 및 순도의 siRNA 전달에 대 한 exosomes는 격리 프로토콜을 설정 합니다. 인간 미 발달 신장 세포 (HEK 293 세포) 생물 플라스 크에서 교양 그리고 문화 표면에 뜨는 (hereon 조절된 매체 라고도 함)는 HEK 293 exosomes의 농축 수 있도록 매주 수확. 바른된 매체 (CM)는 미리 죽은 세포 및 세포질 파편의 차등 원심 분리에 의해 지워지고 자당 쿠션 세척 단계는 exosomes를 수집 하 여 다음에 ultracentrifugation를 복종 된다. 격리 된 HEK 293 exosomes는 특징 수율, 형태학 및 exosomal 마커 식 나노 추적 분석, 단백질 정량화, 전자 현미경, cytometry, 각각. Atto655, 라벨 붙일 작은 간섭 RNA (siRNA), electroporation에 의해 exosomes에 로드 되 고 초과 siRNA 젤 여과 의해 제거 됩니다. 37 ° C에서 24 시간 배양 후 PANC-1 암 세포에 세포 통풍 관 cytometry에 의해 확인 된다. HEK 293 exosomes 107.0 ± 8.2 nm 직경에 있다. Exosome 수율 및 입자에 단백질 비율 (P:P) 비율은 6.99 ± 0.22 × 1012 입자/mL와 µ g/8.3 ± 1.7 × 1010 입자, 각각. Exosomes에 siRNA의 캡슐화 효율은 ~ 10-20%. 셀의 40% 후 부 화에서 24 h Atto655에 대 한 긍정적인 신호를 보여줍니다. 결론적으로, exosome 격리 자당 쿠션에 ultracentrifugation 좋은 수율 및 순도의 조합을 제공합니다. siRNA electroporation에 의해 exosomes에 성공적으로 로드 될 수 있고 이후 암 세포에 전달 생체 외에서. 이 프로토콜은 암 세포에 효율적인 배달 siRNA 로드 exosomes를 개발 하기 위한 표준 절차를 제공 합니다.
Introduction
Exosomes는 50-200 nm 직경, 면역 세포1,2등 다양 한 셀 형식에 의해 분 비에서 이르는 extracellular 소포 (EV)의 하위 유형, 암 세포3,,45, 6 줄기 세포7및. Exosomes 또한 다양 한 생리 적 체액8,9,,1011에 표시 되었습니다. 다양 한 생체 (예를 들어, RNA 및 단백질)12,,1314 수행 exosomes의 고유의 능력 및 받는 사람 세포에 이러한 생체의 효과적인 납품의 조합 15 , 16 , 17 나노 약물 전달 벡터로 그들의 잠재력에 대 한 관심을 끌었다. 다양 한 작은 분자는 항 암 및 항 염증 제 약 exosomes에 성공적으로 로드 되어야 증명 되었고 대상 셀18,,1920, 에 전달 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. 흥미롭게도, siRNA28,29 및 예측에 관한30 같은 핵 산도 exosomes 통해 electroporation에 성공적으로 로드 된 있고 대상 세포에 전달.
최근, RNA 간섭 (RNAi) 통해 작은 간섭 RNA (siRNA) 얻고 있다 더 많은 관심과 선호 하는 메커니즘으로 유전자 침묵의 높은 특이성, 강력한 효과, 최소한의 부작용 및 siRNA 합성28의 용이성 때문에 29. siRNAs는 19에서 25 뉴클레오티드 길이에서 그 트리거 시퀀스 관련 촉매 mRNA 최저에 이르기까지 이중 가닥 RNA 분자. 큰 분자량 및 polyanionic 자연, 세포로 알몸 siRNA의 수동 통풍 방해28,29이다. 그것도 하지 알몸 siRNA 플라즈마 nucleases31에 의해 급속 한 저하로 인해 조직의 순환에 주입 가능. 따라서, 캡슐화는 nanocarrier에 siRNA의 대상 셀에 효과적인 배달 및 siRNA의 원조 것 이다.
Exosomes는 siRNA 캡슐화에 대 한 이상적인 시스템의 구조는 인지질 bilayer에 의해 포위 하는 빈, 수성 코어 구성. Exosomes 뿐만 아니라 혈액에 좋은 안정성을가지고 하지만 자연 대상 속성 셀32로 RNA 기능을 제공 하는. 알바 레즈-Erviti 그 외 여러분 에 의해 성공적으로 실시 하는 연구를 사용 하 여 쥐의 두뇌에 siRNA의 효과적인 전달 거의 없이 합병증31exosomes 설계 설명 했다. 그것은 exosome 기반 치료는 비교적 안전 하 게 다른 치료 보다 셀 것이 고 따라서 전이성 속성15를 전시 하지 않습니다 exosomes endogenously 복제 하지 않는 가설입니다.
다양 한 방법은 성공적으로 세포 배양 또는 생리 적 체액에서 exosomes를 분리 보고 되었습니다. 가장 인기 있는 방법 작은 시작 소재31,,3233에서 exosomes를 ultracentrifugation를 사용 합니다. 이 메서드는 exosomes 및 일반적으로 샘플에서 공동 침전 물 단백질에 아주 가혹한 될 수 있습니다. Ultracentrifugation 자당 그라디언트 등 밀도 기반 분리와 결합을 줄이기 위해 격리 된 exosomes19,34에서 단백질과 비 exosomal 오염 더 일반적인 되고있다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에서 분리 수 있습니다 exosomes의 extracellular 소포 (EV)의 크기에 의해 최소한의 단백질 오염을 발생 시킬 수 있습니다 하지만 시작35, 처리할 수 있는 물자의 작은 금액으로 제한 됩니다. 36. Immunoaffinity 캡처의 하위 인구를 고립 시키는 뿐만 아니라 tetraspanins 또는 exosomes 보다는 EVs의 특정 캡처 수 있도록 다른 셀 전용 마커 같은 exosomal 표면 단백질 또는 다른 단백질에 묶는 항 체로 입힌 구슬을 사용 하 여 exosomes에서 전체 샘플, 하지만 다시 시작 물자의 양에 의해 제한 됩니다 이며 비용이 많이 드는36,37. Exosomes의 강 수 폴리머 기반도, 인기를 사용 하지만 오히려 원유 강 수 때문에, 리드는 더 높은 비 exosomal 기 및 단백질 오염38,39.
Electroporation은 단백질 집계15,,2831인 siRNA와 exosomes을 로드 하는 방법으로는 비 효율에 대 한 보고 되었습니다. Transfection 기반 접근 더 나은 효율성과 단백질 안정성, 로드를 시연 했다 하지만 독성 및 세포 유전자 식28변경 transfection 요원의 부작용 바람직하지 않다. 따라서, electroporation은 안전한 방법으로 siRNA exosomes에 로드에 더 널리 사용 되었습니다. 그러나, 최적화 된 캡슐화 방법 강력한 유전자 최저에 대 한 대상 사이트에 siRNA의 충분 한 양의 제공 하기 위해 설립 될 필요가 있다.
여기, 우리는 단지 하나의 25% (w/w) 자당 쿠션 자당 밀도 기울기 보다는 중수소 산화물, 준비에 밀도 기반 ultracentrifugation를 사용 하 여 exosome 격리 프로토콜을 제안 합니다. 이것은 힘 드는 밀도 그라데이션 준비 circumvents 및 소재, 시작의 대용량의 처리 수 아직 높은 수율 및 순도 siRNA와 후속 로드에 대 한 적합 한 그대로 exosomes에서 결과 비용 효율적인 방법. 형광 Atto655 활용 된 일반적인 siRNA electroporation 통해 인간 미 발달 신장 세포 (HEK 293 세포) 파생 된 exosomes에 로드 되었고 인간의 췌 장 선 암 (PANC-1) 암 세포에 전달 생체 외에서.
Protocol
1. 세포 배양 생물 플라스 크에
그림 1: exosome 생산을 위한 생물 플라스 크에 세포의 문화. (A) 단순 생물 플라스 크의 해부학. (B) 시작 생물 플라스 크에 문화. 정상 및 exosome 고갈 중간 (C) 수확 조절 매체 (CM)의 구성과 문화 생물 플라스 크에서의 유지 보수에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 일반 매체 에서 HEK 293 세포 문화 (참조 자료의 테이블; 5% CO2, 37 ° C) (90% 합칠)까지 4 x T75 플라스 크에 그들을 확장 하 고.
- 생물 플라스 크의 막 생물 반응 기 플라스 크의 중간 저수지에서 일반 매체의 50-100 mL를 추가 하 여 젖은.
- T75 resuspend x 4에서 모든 HEK 293 세포를 수집 exosome 고갈 매체 의 15 mL에 그들 ( 재료의 표참조).
- 무딘 채우기에 연결 20 mL 주사기를 사용 하 여 생물 플라스 크의 셀 구획 HEK 293 세포 현 탁 액 추가 형성 수 있습니다 모든 거품을 제거 하는 주의 ( 재료의 표참조), 바늘.
- 기입 생물 플라스 크의 중간 저수지 일반 매체 와 500 mL, 유지 (5% CO2, 37 ° C) 인큐베이터에서 플라스 크에 일주일 동안.
2. 바른된 매체 (CM) 생물 플라스 크에서 수확
- 1 주일 후, 생물 플라스 크의 중간 저수지에서 모든 매체를 버리십시오.
- 모든 매체를 제거 무딘 채우기 바늘에 연결 된 20 mL 주사기를 사용 하 여 셀 구획 (즉, CM).
- 중간 저수지를 일반 매체 의 50-100 mL를 추가 합니다.
- 오래 된 매체를 제거 하 고 신선한 exosome 고갈 매체 무딘 채우기 바늘에 연결 된 20 mL 주사기를 사용 하 여 추가 하 여 셀 구획에 exosome 고갈 매체 의 15 mL를 추가 합니다.
- 기입 생물 플라스 크의 중간 저수지 일반 매체 와 500 mL, 유지 (5% CO2, 37 ° C) 인큐베이터에서 플라스 크를 다른 주에 대 한.
참고: 문화 1 년 이상 계속 될 수 있다. 2.2 단계, 첫 번째 추수에서 CM exosome 절연을 위해 사용 되지 않습니다 및 삭제 됩니다. 2차 및 후속 수확, CM exosome 격리에 대 한 유지 됩니다.
3. Exosome 격리 자당 쿠션에
그림 2: 절연 및 exosomes의. (A) 전 개간 수확된 조절된 매체 (CM)에서 죽은 세포 및 세포 잔해. (B) 자당 쿠션에 CM에서 exosomes을 분리. (C) 세척 자당 및 오염 단백질 제거 하는 단계. (D) 격리 exosomes 했다 다음 물리 화학, 생화학 및 형태학 상 특성을 받게 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 미리 다음과 같이 차등 원심 분리와 여과 (2.2 단계)에서 CM를 선택을 취소 합니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리기 새로운 튜브에는 상쾌한 전송 및 삭제는 펠 릿. 이 원심 분리 단계를 반복 한 번 더는 상쾌한 복구 하 고 펠 릿을 삭제 합니다.
- 3.1.1 2000 x g 15 분 및 4 ° C에 단계에서 상쾌한 원심 고 펠 릿을 삭제. 복구 된 표면에 뜨는 한 번 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
- 전 개간, 동안 보편적인 튜브에 자당의 1.9 g (± 0.001 g)으로 정확 하 게 무게와 다음 토 핑 중수소 산화물과 무게 7.6 g (± 0.001 g)에 도달할 때까지 의해 중수소 산화물에 25% (w/w) 자당 솔루션을 준비 합니다.
- ultracentrifuge 채우기 튜브 ( 재료의 표참조) 사전 허가 CM. 메이크업 0.22 μ m 필터와 22.5 mL에 CM의 22.5 mL와 그 보다 작은 경우 현재 볼륨 PBS.
- 장소는 유리 튜브에 ( 재료의 표참조)를 플라스틱, CM 아래 별도 레이어를 형성 하는 솔루션을 자당 솔루션의 3 개 mL를 추가, 그것을 통해.
- 신중 하 게 튜브를 포함 하는 장소 스윙 아웃으로 터의 양동이로 CM/자당 솔루션 계층 ( 재료의 표참조)로 터에 양동이 확보.
- ultracentrifuge로 회전자를 배치 ( 재료의 표참조)와 1.5 h 4 ° c.에 대 한 100000 x g에서 스핀
- 자당 층의 2 개 mL를 수집 하 고는 ultracentrifuge 병이 추가 ( 재료의 표참조) PBS 세척 단계에 대 한 필터링의 20 mL를 포함 하.
- 고정 각으로 터 튜브를 넣습니다 ( 재료의 표참조)와 1.5 h 4 ° c.에 대 한 100000 x g에서 스핀
- 조심 스럽게 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 400 µ L 필터링 PBS 가진 펠 릿을 resuspend. 4 ° C 또는 단기 및 장기 저장을 위한-80 ° C에서 각각이 exosome 재고를 유지.
4. Exosome 크기와 나노 분석 (NTA)를 추적 하 여 항복의 특성
- 확인 1:1, 000-1:50, 000 희석 exosome 재고는 주권의 보기 프레임에 20-80 입자를 얻기 위하여 1 mL (최소 750 µ L) 볼륨에서의 계측 ( 재료의 표참조) 표시.
- 실로 NTA 악기 샘플 1 mL 주사기를 사용 하 여 희석된 exosome 주식을 주입 하 고 온도 프로브에 온도계의 온도 프로브를 삽입 합니다.
- NTA 소프트웨어 설정 ( 재료의 표참조) 다음과 같이 녹음: 3 표준 측정, 30 s 각, 수동 온도 옵션을 선택 하지 않은; 그리고 고급 탭의 희석 비율을 입력 합니다.
- 13 카메라 수준을 설정 하 고 샘플의 신선한 배치를 주입 하 고 각 독서 후 메시지가 표시 되 면 샘플 챔버의 온도 입력 NTA 소프트웨어에서 캡처 스크립트를 실행.
- 4 이후 분석 부분에 대 한 임계값을 설정 하 고 평균 모달 크기와 입자 농도 측정에서 exosome 재고 합니다.
5. 입자: 단백질 비율 결정에 의해 Exosome 순도의 특성
- 측정 한 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과 의해 exosome 재고의 단백질 콘텐츠 다음과 같습니다 ( 재료의 표참조)을 키트.
- 준비는 표준 정의.
- Microcentrifuge 튜브에 BSA 재고 솔루션 (2 mg/mL-분석 결과 키트에 제공 된)의 45 µ L을 추가 하 여 높은 농도 (500 µ g/mL)의 표준 준비 하 고 PBS 가진 최대 180 µ L.
- PBS의 90 µ L로 8 microcentrifuge 튜브를 채우십시오.
- 직렬 희석 확인 (요소: 0.5) 표준 높은 BSA에서 90 µ L를 복용 하 고 1st microcentrifuge에이 추가 하 여 튜브 PBS (잘 믹스), 다음이 튜브에서 90 µ L를 복용 하 고 2nd microcentrifuge 튜브에 추가.
- 7 microcentrifuge 튜브까지이 반복 합니다. 8 튜브 그냥 PBS 됩니다 (즉, 빈: 0 µ g/mL).
- (샘플의 45 µ L, PBS의 45 µ L) 90 µ L의 전체 볼륨에 PBS와 1:2 희석 함으로써 exosome 샘플 을 준비 합니다.
- BCA 시 믹스 작업을 준비 합니다.
- BCA 시 혼합 필요 (잘, 중복, 표준을 포함 하 여 당 50 µ L) 작업의 전체 볼륨을 계산 합니다.
- 다음 비율에 따라 개별 BCA 시 약을 혼합: 25 부품 a: 24 시 부품 시 b: 1 부분 시 약 c.
- 분석 결과 및 분석을 수행 합니다.
- 각 표준 및 exosome 샘플 96 잘 접시 (각 표준 및 샘플에 대 한 중복)의 우물에 위의 준비의 40 µ L를 추가 합니다.
참고:이 색도계 분석 결과 이므로, 적절 한 pipetting 기술은 정확한 결과 달성 하기 위해 중요 한 이다. 우물의 각 각 표준/샘플 복제를 추가한 후 펫을 변경 - 50 µ L의 단백질 분석 결과 각 음에 시 약 믹스 작업을 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.
참고: 복제 사이의 편차를 최소화 하기 위해 추가 단백질 분석 결과 작업 시 약/샘플, 표준의 1세인트 복제에 이어서 1st 에 그것을 추가 하기 전에 동일한 샘플/표준의 2nd 복제 다른 샘플/표준의 복제. - 562에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에 nm ( 재료의 표참조).
- 표준의 흡 광도 값에서 표준 곡선을 플롯 하 고 곡선의 방정식을 사용 하 여 각 샘플의 단백질 농도 밖으로 작동.
- 각 표준 및 exosome 샘플 96 잘 접시 (각 표준 및 샘플에 대 한 중복)의 우물에 위의 준비의 40 µ L를 추가 합니다.
- 준비는 표준 정의.
- 위의 측정 exosome 재고의 단백질 농도와 이전 얻은 exosome 수율을 나누어 입자: 단백질 비율을 계산 합니다.
6. Cytometry Exosomal 마커 식의 특성
- 실 온 (RT)에서 15 분 동안 10 µ L의 알데하이드/황산 라텍스 구슬 (주식에서 undiluted)와 exosomes (≥1x1011 입자/mL)의 40 µ L를 품 어.
- 100 µ M BSA 솔루션의 5 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 10 mM 최종 농도 달성 하기 위해 실시간에 15 분 동안 품 어 exosome 비드 혼합물에
- PBS의 1 mL을 추가 하 고 락 통 (~ 150 rpm)에 가벼운 동요와 microcentrifuge 튜브에 RT에서 75 분 동안 품 어.
- 580 x g RT에서 5 분 동안에 현 탁 액을 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 100mm 글리신 솔루션의 1 mL와 펠 릿 resuspend ( 재료의 표참조) 및 실시간에서 30 분 동안 품 어
- 원심 580 x g. 삭제에서 5 분 동안 정지는 상쾌한 고 3%의 1 mL와 펠 릿 resuspend FBS/PBS ( 재료의 표참조).
- 이 세 단계를 반복 하 고 3%의 350 µ L에서 펠 릿 resuspend FBS/PBS.
- 정지 7 튜브, 서 스 펜 션의 50 µ L 각 분열과 fluorophore 활용 된 안티-CD81, 안티 CD9 및 안티-CD63 항 체와 그들의 해당 isotype 컨트롤 들을 품 어 (1시 10분 희석), 각각, 4 ° c.에서 45 분 1 흠 없는 제어 하지만 동일한 처리를 겪고 튜브의 유지.
- 3 %FBS / PBS 각 튜브, 580 x g에 5 분 동안 원심 및 삭제는 상쾌한의 1 mL를 추가 합니다.
- 3%의 200-400 µ L로 펠 릿 resuspend FBS/PBS 교류 cytometer에 샘플을 분석 하 고 ( 재료의 표참조) 적절 한 채널에서.
7. 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 Exosome 형태학의 특성
- 솔루션 해결에 1010 p/mL 같은 적절 한 농도에서 exosome 수성 분산을 수정 ( 재료의 표참조) 15 분.
- 300에 샘플 카본 코팅 메쉬 격자 구리 장소와 공기를 떠나 건조.
- 부정적인 얼룩 0.22 μ m 필터링 수성 uranyl 아세테이트와 샘플 ( 재료의 표참조) 4 분 뒤에 2 개의 50% 메탄올/H2O 세척 ( 재료의 표참조).
- 공기 건조는 샘플.
- 가장 아래 샘플을 관찰 ( 재료의 표참조). 80에서 가속 전압을 설정 kV와 2 자리 크기. 객관적인 조리개를 사용 하 여 모든 샘플.
8입니다. siRNA Electroporation에 의해 Exosomes로 캡슐화
- 미리 진정 electroporation 베트 ( 재료의 표참조) electroporation 전에 30 분 동안 얼음에.
- 믹스 7.0 µ g exosomes (PBS에 7 x 1012 p/mL 재고에서 32 µ L)의 microcentrifuge 튜브에 siRNA (RNase 무료 물에서 2 µ M 재고에서 12 µ L)의 0.33 µ g. 볼륨을 연산 버퍼 150 µ L에 게 ( 재료의 표참조). SiRNA 어 금 니 비율 exosome 1:60이 경우 이다.
- 전송 혼합물 electroporation 베트. 모자는 멧 고는 electroporator의 베트 소유자에 ( 재료의 표참조). 터 닝 바퀴 시계 방향으로 180 ° 회전 합니다.
참고: 바퀴 전극을 연결할 베트에 잠긴 위치로 완전히 설정할 수 있어야 합니다. - 원하는 electroporation 프로그램 선택 (예: X-01 X-05, A-20, T-20, T-30, 등) 시작 버튼을 누르면 electroporation 시작.
참고: 성공적인 펄스 디스플레이에 "확인"을 표시 하 여 표시 됩니다. - Electroporated 한 번 후 다시 180 ° 바퀴 시계 반대 방향으로 베트를 제거. 추가 처리를 위해 플라스틱 피 펫과 멧에서 샘플을 철회.
9. 무료 siRNA 사용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 제거
- SEC 열 equilibrate (1.3 x 2.9 cm [H] cm [W]; 참조 테이블의 재료) 필터링 된 PBS의 3.5 mL를 두 번 전달 하 여.
- 필터링 된 PBS의 350 μ에서 electroporated 샘플의 150 μ를 녹이 고 무료 siRNA 제거를 수행 하기 위해 SEC 열이 전송.
- 열 (F0)에서 첫 번째 500 μ 분수는 eluted를 수집 합니다.
- 열 필터링 된 PBS의 500 μ를 추가 하 고 500 μ 분수 (F1)를 수집 합니다.
- (F9) 최대 10 x 500 μ 분수의 총 수집 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다. F1 및 F2 siRNA 캡슐화 exosomes를 포함 해야 합니다.
- 필터링 된 PBS 가진 열 세척 (두 번 이상) 모든 샘플 잔류물을 제거 하려면.
10. 생체 외에서 PANC-1 셀에 siRNA 로드 Exosomes의 이해
- 이해 하기 전에 잘 24 h 당 50, 000 셀의 밀도에 24-잘 평면-하단 플레이트 ( 재료의 표참조)에 씨앗 PANC-1 셀 공부 하 고 인큐베이터 (5% CO2, 37 ° C)에서 세포를 품 어.
- Atto655-siRNA와 Electroporate HEK 293 exosomes (7.0 μ g) (0.33 μ g) 8 단계에의하여.
- 9 단계에 의하여 electroporated exosome 정화 하 고 PBS의 100 μ에 resuspend.
- Electroporated exosomes의 50 μ PANC-1 셀을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 4 h에서 품 어.
- 부 화 후 세포를 수집 합니다.
- 살 균 PBS의 1 mL로 세포 세척 및 폴리스 티 렌 라운드-하단에 PBS의 200 μ에 resuspend 튜브 ( 재료의 표참조).
- 교류 cytometer 세포 분석 ( 재료의 표참조) 10000 이벤트 샘플 당 인수.
참고: 유엔 electroporated exosome siRNA 혼합 샘플 및 필터링 된 PBS 가진 치료 셀 컨트롤으로 사용 되었다.
Representative Results
HEK 293 세포 (HEK 293 엑 소)에서 분리 된 exosomes의 물리 화학적 특성은 표 1에 요약 되어 있습니다. 나노 분석 (NTA) 악기를 추적을 사용 하 여 측정 크기 107.0 ± 8.2 nm 이었다. 또한 NTA 악기를 사용 하 여 분석 HEK 293 세포에서 Exosome 항복 6.99 ± 0.22 x 1012 p/mL ~ 24 CM (수확의 2 라운드에서 얻은)의 mL에서 했다. HEK 293 엑 소 입자에 단백질 비율 (P:P)를 계산 하 여 평가의 순도 8.3 ± 1.7 × 1010 p / µ g 이었다.
격리 된 HEK 293 엑 소의 크기 분포는 그림 3A에 표시 됩니다. 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 형태소 분석을 보여주었다 HEK 293 엑 소 구형 구조 약간 100 nm의 크기 (그림 3B). 이 결과 NTA 측정 (그림 3A)에서 그와 함께 동의합니다. 격리 된 HEK 293 엑 소 CD81 CD9, CD63, exosomes (그림 3C)으로 소포를 식별 하는 데 사용 하는 정식 마커는 긍정적인 했다.
크기 배제 크로마토그래피 (그림 4)를 사용 하 여 exosomes의 정화에 대 한 exosomes의 비율 복구는 10 조각에서 수집 (F0-F9) 초기 exosome와 복구 총 exosome 입자 수를 나누어 계산 했다 입자 수 사용, siRNA의 백분율 복구 모든 10 분수 수집에서 얻은 총 형광 강도 F3, f 4와 f 5에서 얻은 총 형광 강도 나누어 계산 했다. 복구 exosome와 siRNA의 후 정화 각각 75.0%, 80.4%로 계산 되었다. Exosomes에 siRNA의 캡슐화 효율 10 ~ 20%, siRNA 표준 곡선 설립 (그림 4C)를 사용 하 여 계산 했다.
생체 외에서 exosomes cytometry 형광 Atto655-siRNA와 로드의 이해의 질적 분석 PANC-1 셀 siRNA 캡슐화 exosomes로 치료 (그림 5A) 형광 신호에 큰 변화를 기록 했다 . SiRNA 캡슐화 exosomes로 치료 PANC-1 세포 인구는 Atto655 신호 (39.4%)에 비해 언로드된 exosomes와 siRNA 혼합물 (0.56%), ( 위에 관찰을 뒷받침 하는 치료에 대 한 긍정적인의 더 높은 비율 기록 그림 5B). (치료 되지 않는 셀의 의미 형광 강도 (MFI) 값에 배 차이로 표현) 하는 siRNA의 세포질 통풍 관의 정도 또한 PANC-1 셀 siRNA 캡슐화 exosomes (MFI 배 취급에 상당히 높은 것으로 관찰 되었다 차이 = 5.1) exosome siRNA 혼합물으로 치료에 비해 (MFI 배 차이 = 1.1) (그림 5C). 이러한 관측 시연 siRNA 캡슐화 exosomes PANC-1 세포에 의해 내 면화 했다 그리고 그들은 효과적으로 전달 되도록는 siRNA 침.
그림 3: 생화학 및 HEK 293 exosomes의 형태 분석. (A) 나노 추적 분석 (NTA)를 사용 하 여 HEK 293 exosomes의 크기. 곡선 표시 3 가지에서 겹쳐 히스토그램 측정 사이의 표준 편차를 나타내는 빨간색 영역 30 s 간격에 캡처 (n = 3). (B) 순진한 HEK 293 exosomes의 전송 전자 현미경 (TEM) 이미지. 눈금 막대: 100 nm. (C) CD81 CD9, CD63 exosomal 마커의 검출 cytometry HEK 293 exosomes에 사용 하 여. Exosomes는 검색 전에 알데하이드/황산 라텍스 구슬에 결합 했다. 구슬 Exosome 복합물 fluorophore 활용 CD81 안티, 안티-CD9 및 안티-CD63 항 체와 스테인드 이후 했다. 마커의 표현의 정도 컨트롤 (exosome 구슬 단지 해당 isotype 물)의 중간 형광 강도 (MFI) 값에 배 차이로 표현 됩니다. 값 ± SD, 의미 표현 된다 n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Exosome 정화 게시물-electroporation. (A) 크기 제외 chormatography를 사용 하 여 Atto655-siRNA와 electroporated exosomes의 차입 프로필 (F0-F9). (B) 주권 Atto655-siRNA와 크기 제외 chormatography를 사용 하 여 f 9에 F0에서 exosome의 분석. (C) 보정 곡선 Atto655의 siRNA 이라는. 형광 강도에서 플레이트 리더에 의해 가져온 전 / Em: 640-10/680 nm; 2800 이득. 값은 ± SD 의미 표시 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 4 헤에 PANC-1 셀에 siRNA 캡슐화 exosomes의 세포질 통풍 관 (A) 히스토그램 언로드된 exosomes + siRNA 혼합물 및 siRNA 캡슐화 exosomes의 세포질 통풍 관을 비교. 언로드된 exosomes + 모조 색상 플롯에 의해 4 h에서 siRNA 혼합물의 통풍 관의 (B) 비교. (C) 의미에서 배 차이 형광 강도 (MFI) 값 테스트 샘플의 치료 세포에 비해입니다. 값 ± SD, 의미 표현 된다 n = 3. P < 0.001. NS: 중요 하지. 일방통행 ANOVA는 통계 분석을 위해 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| Exosome | 크기1, 2 (nm) |
1,2,3 항복 (p/mL) |
[단백질] 2, 4 (µ g/mL) |
입자에 단백질 (P:P) 비율5 (p / µ g) |
| HEK 293 | 107.0 ± 8.2 | 6.99 ± 0.22 x 1012 | 84.3 ± 9.8 | 8.3 ± 1.7 × 1010 |
|
1 측정 된 나노 분석 (NTA 악기) 추적을 사용 하 여 2 값은 표시 의미 ± SD, n = 3 3 수확량 생물 플라스 크 (~ 24 mL)에서 수확의 2 라운드에서 풀링된 세포 조절 매체에 의해 얻은 4 측정 된 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 수식을 사용 하 여 얻은 5 값: P:P 비율 = 항복 / [단백질] |
||||
표 1: exosomes 물리 화학적 특성
Discussion
배양된 세포에서 괜찮은 exosome 수율을 얻기는 생체 외에서 또는 vivo에서 학문의 여러 라운드를 위해 충분히 아직도 도전 이다. 제조 업체에 따라 생물 플라스 크 항 체와 다양 한 불멸 하 게 셀 라인의 문화에서 높은 수확량을 가진 단백질의 생산을 위해 예정 되었다. 지속적으로 배양 세포 격실에 집중된 조절된 매체 (CM) 인 원하는 제품을 풍부 하 게 셀 수 있습니다. 이론적으로, 동일한 개념은 다양 한 세포 선에서 exosome 생산에 도움이 될 것 이라고 하 고 크게 exosome 수익률40증가 입증 되었다 실제로 생물 플라스 크에서이 세포를 배양. 큰 중간 저수지 지속적으로 영양분을 공급 하 고 셀, 접촉 되도록 중간 또는 일반의 큰 볼륨을 필요로 하지 않고 장기 문화를 허용 10 kDa 세미-투과 할 멤브레인 통해 셀 구획에서 폐기물을 제거 합니다. 전반적인 비용과 대규모 exosome 생산40의 노동 변화 플라스 크는 궁극적으로 저장할 수 있습니다. 그것은 또한 exosomes의 immunomodulatory 기능 뿐만 아니라 형태, 표현 형 절연 장기 생물 플라스 크 문화 비슷합니다 일반 75 c m2 플라스 크40에서 경작 하는 세포에서 공급 하는 세포를 시연 했다. 생물 플라스 크에서 exosome 소스로 다른 불멸 하 게 셀 라인의 문화 것 따라서 그들의 무결성과 기능을 유지 하면서 자신의 exosome 수율을 향상 도움이 됩니다. 그러나이 형태의 문화 제한 부문 주기와 1 차 셀에 적용 되지 않습니다을 수 없는 수 교양 높은 밀도 이다.
CM의 수확은 매주 수행 문화에 셀은 결코 passaged 때문에, 그것은 생물 플라스 크에 세포는 일반 세포 배양 같은 단층에 성장 하지 추측 될 수 있다. 그들은 가장 가능성이 괴 센터 클러스터 형성 또는 단순히 셀은 너무 confluent는 단층에 대 한 다이 고 표면에서 분리. 생물 플라스 크의 셀 구획의 육안 검사가이 가정을 확인 불가능 하지만 CM 수확 년도 죽은 세포의 많은 수에 의해 반영 된다. 제대로 부착 하 고 가능한 비 세포 생물 플라스 크에서의 정기적인 제거 가스, 영양분과 세포 구획 및 매체 간의 폐기물의 교환에 부정적인 영향을 줄 수 있는 반 투과성 막에 자료의 구축을 방지할 수 있습니다. 저수지, 되므로 장기 문화에 대 한 생물 플라스 크 > 6 개월40. 이러한 맥락에서 생물 플라스 크에 세포 성장의이 아닌 규칙은 이상적 우리가 추측 그것은 기존의 단층 세포 배양 보다 더 밀접 하 게 종양 성장에서 vivo에서 의 실제 상태를 모방 하 고 그것은 기대 하는 exosomes 암 생물 플라스 크에 세포 종양 vivo에서 분 비 하는 더 비슷한 것에 의해 제작. 이 특히 종양 병 리의 진행 성에 서 종양에서 파생 된 exosomes의 역할에 보고 하는 연구에 도움이 될 것 이다. 종양에서 파생 된 exosomes 기원32의 그들의 조직에 본질적으로 하 고 우선적으로 가정에 보고, 따라서 그들의 vivo에서 흉내 낸 시스템에서 생산 하는 exosomes 생산 또한 것 보고 연구에 마약 nanocarriers로 exosomes의 수동 타겟팅 기능을 탐색합니다.
P:P 비율에서 exosomes41에서 공급 된 생리 적 체액의 문화 매체에서 단백질 오염에서 분리 된 exosomes의 순수성 평가를 매개로 보고 되었다. 8.3 ± 1.7 × 1010 p / µ g이이 연구에서 얻은 P:P 비율 범위 내에서 고 순도 연구에서 제안 된 폭포. 이 비율은 단백질 농도 표현를 사용 수확량 또는 절연 또는 사용 다운스트림 연구에 각각,이 exosomes 단백질의 문제를 주어진 샘플에서 사용할 수 있는 실제 금액을 반영 하지 않는다 exosomes의 복용량의 위험을 강조 격리 하는 동안 오염입니다. Exosomes 입자 수 농도 측정, NanoSight 등 악기를 통해 NTA exosomes 측정의 더 합리적이 고 정확한 방법입니다.
정확한 무게 중수소 산화물에서 25% 자당 해결책의 준비 동안이 방법은 밀도 기반 격리로 결정적 이다. Exosomes 범위가 다소 좁은 부유 밀도의 자당 솔루션에 자당 쿠션의 정확한 준비 격리42동안 apoptotic 시체 같은 비 exosomal 소포 또는 소포 Golgi 파생의 오염을 감소 시킬 것 이다 그래서. 그것은 튜브에 공기의 응축 또는 증발에 의해 손실 등의 밀도 변경할 수 있는 요인의 위험 또는 추가 솔루션에 물의 피하기 위해 1 일 후에 사용 하 고 남은 자당 솔루션 지키려고 하지 좋습니다. 스윙 아웃으로 터의 사용 자당 솔루션에도 마이그레이션 exosomes의 CM에서 있도록 자당 쿠션에 원심 분리 동안 필수입니다.
자당 솔루션 후 원심 철수 섬세 한 단계 이며 또한 그것은 복구 된, 그리고 너무 많은 문화 매체에서 단백질 철회 exosome 샘플을 소개 하는 exosomes의 양을 극대화 사이 타협을 찾는 포함 . 자당 솔루션 및 조건 매체 간의 인터페이스 이며 어디 문화 매체에서 단백질 후 원심 분리, 수집 하는 것 일반적으로 어두운 갈색 링 인터페이스에 앉아 볼 수 있습니다. 우리의 손에서 추가 초기 3 mL에서 자당 쿠션의 2 개 mL를 철수은 위에서 언급 한 타협을 동의 최적의 볼륨입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 볼륨은 특정로 터 사용; 따라서, 위로 또는 아래로 다른 시설에서 사용할 수 있는 터의 종류에 대 한 볼륨을 확장 하는 때 철회 하는 자당의 볼륨을 최적화 하는 것이 좋습니다. 그것은 또한 미색 펠 릿으로 볼 수는 자당이 자당 보다는 더 높은 조밀도의 입자 앙금을 것 이며 일반적으로 수로 철수 하는 때 튜브의 하단 중앙에 지역 권리를 피하기 위해 중요 한.
상대적으로 많은 양의 PBS로 세척 단계 더 exosome 격리41동안 단백질 오염 정도 줄이기 위해 도움이 됩니다. 이 단계 또한 자체 또는 exosomal 루멘 내의 생체는 exosomes 삼 투 손상을 방지 하기 위하여 exosomes에서 초과 자당을 제거 세균 및 곰 팡이 성장 exosome 재고의 위험을 감소에 필수적 이다. 삼투성 손상 및 미생물 오염 위험을 줄이고 따라서 물 격리 exosome 부유 밀도 달성 하는 데 필요한 자당의 양을 줄일 하는 데 도움이 보다는 중수소 산화물에서 자당 솔루션을 준비. 자당 쿠션, exosome 포함 된에 첫 번째 원심 분리 후 자당 레이어 철회 하 고 PBS에 추가 4 ° C에 저장 하 고 시간 제약에 직면 하는 경우는 다음 날 처리 수 있습니다.
우리의 지식 최선을 exosome/siRNA 어 금 니 비율은 electroporation의 효율성 결정에 있는 중요 한 요소 이다. 이 프로토콜에서 우리는 siRNA 어 금 니 비율 exosome로 1:60를 사용. Exosomes의 다른 종류의 캡슐화 능력은 다른, 우리가 좋습니다이 사건에-의해-사건을 기준 최적화. 그러나, 여기에 제안 된 캡슐화 효율 항상 최적의 electroporation 조건 선택 하기 위한 매개 변수 수입니다.
또한, siRNA의 aggregation electroporation에 가장 일반적인 문제 중 하나가 될 여겨진다. 그것은 입증 그 electroporation exosomes 입력을 더욱 만드는 siRNA의 강한 집계를 일으킬 수 있다. siRNA 집계는 종종 실수로 exosome 따라서 적절 한 컨트롤로 캡슐화 siRNA의 siRNA의 형성은 electroporation28동안 피할 수이 연구에 사용 되었다로 해석 됩니다. 우리의 정화 방법의 비율 캡슐화 효율 배경 잡음, exosome 및 siRNA 집계 데이터의 신뢰성에 영향을 미칠 것 이라고 하는 같은 다른 소스에서 영향을 최소화 하기 위해 정규화 된 값을 사용 하 여 계산 됩니다. 우리의 연구 결과 바탕으로, 무시할 siRNA 집계는 컨트롤 샘플 즉, electroporated 및 유엔 electroporated siRNA를 사용 하 여에서 관찰 했다.
이 프로토콜은 성공적으로 exosomes로 siRNA의 캡슐화를 설명 하 고 암에는 siRNA의 그들의 연속적인 세포내 전달 세포 에 생체 외. 따라서, 다양 한 종류의 다른 세포에서 exosomes 수 절연 및 특징 제안 된 프로토콜을 사용 하 고 이후에 다른 암에-표현 종양 대상의 종류에 대 한 다양 한 치료 siRNA와 로드. 응용은 exosome 소스 대상 셀 쌍 체 외의 다양 한 순열을 사용 하 여 siRNA 전달 및 통풍 관 효율을 탐구 하는 것입니다. 이 다음 모두 배달의 효율성 및 siRNA 캡슐화 exosomes의 치료 효율을 평가 하기 위해 동물 모델에 번역 될 수 있다 vivo에서.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
F. N. Faruqu 집회 Amanah Rakyat (마라) 말레이시아 정부 기관에 의해 자금입니다. L. 쑤 마리 퀴리 Sklodowska 개별 동호회 (Horizon 2020) (H2020-MSCA-IF-2016) 받는 사람입니다. K. T. 알-자 말 BBSRC (BB/J008656/1) 및 Wellcome 트러스트 (WT103913)에서 자금을 인정 합니다. 저자 또한 박사 폴 라벤더와 박사 데이비드 두려움 (부의 호흡과 알레르기, 왕의 대학 런던)는 electroporator을 제공 하는 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
| EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
| Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
| Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
| Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
| MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
| Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
| CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
| Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
| Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
| NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
| Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
| Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta - 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
| Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
| 24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
| Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | Composition | ||
| Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
| Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
| Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
| 25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
| 3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
| 100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
| 100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
| Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
| Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
| Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
| 50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
| SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |
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