Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å karakterisere nucleosome partikler på enkelt-molekylet nivå bruker statisk og time-lapse atomic force mikroskopi (AFM) imaging teknikker. Overflate functionalization metoden beskrevet tillater for fangst av strukturen og dynamikken i nucleosomes i høy oppløsning på nanoskala.

Abstract

Chromatin, som er en lang kjede av nucleosome underenheter, er et dynamisk system som gjør at for slike kritiske prosesser som utryddelse og transkripsjon ta sted i eukaryote celler. Dynamikken i nucleosomes gir tilgang til DNA ved replikering og transkripsjon machineries og bidrar kritisk til molekylære mekanismer underliggende chromatin funksjoner. Single-molekylet studier som atomic force mikroskopi (AFM) imaging har bidratt betydelig til vår nåværende forståelse av rollen som nucleosome strukturen og dynamikken. Gjeldende protokollen beskriver trinnene slik at høyoppløselig AFM Bildeteknikker å studere strukturelle og dynamiske egenskapene til nucleosomes. Protokollen er illustrert av AFM data innhentet for centromere nucleosomes der H3 histone er erstattet med sin motpart centromere protein (CENP-A). Protokollen starter med montering av mono-nucleosomes bruker en kontinuerlig fortynning metoden. Utarbeidelse av glimmer underlaget functionalized med aminopropyl silatrane (APS-glimmer) som brukes for nucleosome avbilding er avgjørende for den AFM visualiseringen av nucleosomes beskrevet og prosedyren for å forberede underlaget er tilgjengelig. Nucleosomes satt på APS-glimmer overflaten er først fotografert med statisk AFM, som fanger et øyeblikksbilde av befolkningen nucleosome. Slike parametre som størrelsen på DNA pakket rundt nucleosomes kan måles fra analyser av disse bildene, og denne prosessen er også beskrevet. Time-lapse AFM imaging prosedyre i væsken er beskrevet for høyhastighets time-lapse AFM som kan ta flere bilder av nucleosome dynamics per sekund. Endelig er analyse av nucleosome dynamics aktivere kvantitative karakterisering av dynamisk prosessene beskrevet og illustrert.

Introduction

I eukaryote celler er DNA svært komprimert og organisert i kromosomer. 1 det første nivået av DNA organisasjonen i et kromosom er samlingen av nucleosomes i hvilke 147 bp DNA er tett pakket rundt en histone octamer kjerne. 2 , 3 nucleosome partikler montere på en lang DNA-molekyl som danner en chromatin matrise som er så organisert til en svært kompakt kromosom enhet er dannet. 4 demontering av chromatin gir tilgang til gratis DNA kreves av kritiske cellulære prosesser som gene transkripsjon og genom replikering, antyder at chromatin er et svært dynamisk system. 5 , 6 , 7 forstå de dynamiske egenskapene til DNA på ulike chromatin nivåer er kritisk viktig for Klargjørende genetisk prosesser på molekylært nivå hvor feil kan føre til celledød eller utvikling av sykdommer som kreft. 8 chromatin egenskap av stor betydning er dynamikken i nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 høy stabilitet disse partiklene er tillatt for strukturelle karakterisering av krystallografisk teknikker. 2 hva disse studier mangel er dynamisk detaljer om nucleosomes som mekanismen av DNA pakke dem ut fra histone kjernen; dynamisk veien som kreves for transkripsjon og replikering. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 videre spesielle proteiner kalt remodeling faktorer har blitt vist å lette demontering av nucleosomal partikler17; iboende dynamikken i nucleosomes er imidlertid den avgjørende faktoren i denne prosessen som bidrar til hele demontering prosessen. 14 , 16 , 18 , 19

Single-molekylet teknikker som enkelt-molekylet fluorescens19,20,21og optisk overlapping (pinsett)13,18,22,23 AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 har vært medvirkende i å forstå dynamikken i nucleosomes. Blant disse metodene, AFM har flere enestående og attraktiv funksjoner. AFM gjør det mulig å visualisere og karakterisere personlige nucleosomes samt de lengre matriser27. Fra AFM bilder, kan viktige egenskaper av nucleosome struktur som DNA pakket rundt histone kjernen være målt 10,14,26,28; en parameter som er sentrale for karakterisering av nucleosome unwrapping dynamics. Forbi AFM har undersøkelser avdekket nucleosomes svært dynamiske systemer og at DNA kan spontant pakke fra histone kjernen14. Den spontane pakke dem ut av DNA fra nucleosomes ble direkte visualisert ved AFM opererer i time-lapse modus når avbilding gjøres i vandige løsninger 14,26,29.

Ankomsten av høyhastighets time-lapse AFM (HS-AFM) instrumentering gjort det mulig å visualisere nucleosome unwrapping prosessen på millisekund tidsskala 14,15,24. HS-AFM 16,30 studier av centromere bestemte nucleosomes avdekket flere nye funksjoner i nucleosomes sammenlignet med den kanoniske typen. Centromere nucleosomes utgjør av en centromere, en liten del av kromosomet kritisk viktig for kromosom segregering31. I motsetning til kanoniske nucleosomes i bulk chromatin inneholder histone kjernen i centromere nucleosomes CENP-A histone i stedet for histone H332,33. Som følge av denne histone substitusjon, DNA innpakning i centromere nucleosomes er ~ 120 bp i stedet for ~ 147 bp for kanoniske nucleosomes; en forskjell som kan føre til forskjellige morphologies av centromere og Kanonisk nucleosomes matriser34, antyder at centromere chromatin gjennomgår høyere dynamics sammenlignet med meste ett. Romanen dynamikken vises ved centromere nucleosomes i HS-AFM16,30 studier eksemplifiserer den unike muligheten av denne single-molekylet teknikken direkte visualisere egenskapene strukturelle og dynamisk nucleosomes. Eksempler på disse funksjonene er kort beskrevet og illustrert på slutten av papiret. Denne utviklingen ble gjort utbygging av romanen protokoller for AFM avbildning av nucleosomes, samt modifikasjoner av eksisterende metoder. Målet med protokollen beskrevet her er å gjøre disse spennende fremskritt i enkelt-molekylet AFM nucleosome studier tilgjengelig for alle som ønsker å benytte disse teknikkene i sine chromatin undersøkelser. Mange av teknikkene gjelder for problemer utenfor studiet av nucleosomes og kan brukes til undersøkelser av andre protein og DNA systemer rundt. Noen eksempler på slike programmer finnes i publikasjoner35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 og utsikter til AFM studier av ulike biomolecular systemer er gitt i av29,50,51,53,54.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kontinuerlig fortynning montering av Mono-nucleosomes

  1. Generere og rense en ca 400 bp DNA substrat som inneholder en off-sentrert Widom 601 nucleosome posisjonering sekvens. 55
    Merk: For å begrense uønsket dannelsen av di-nucleosomes, hver arm flankert posisjonering sekvensen bør ikke overstige ~ 150 bp.
    1. Bruk plasmider pGEM3Z-601 sammen med designet primerne og forsterke substrat DNA bruker PCR. 423 bp underlaget med 122 og 154 bp lengder brukt her, bruke frem (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3 ") og bakover (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3") primere.
    2. Legge rør som inneholder reaksjonsblandingen å en termisk cycler forvarmet til 95 ° C. Kjøre følgende program for 33 sykluser etter en innledende rødsprit i 5 min på 95 ° C: 30 s rødsprit 95 ° C, 30 s annealing på 49 ° C, 35 s utvidelse ved 72 ° C. Angi filtypen endelige ved 72 ° C i 10 min etter 33 sykluser.
    3. Rense fra PCR blandingen ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig PCR rensing Kit. Når eluting DNA fra kolonnen PCR opprydding, bruke 10 mM Tris buffer (pH 7.5) i stedet for kit leveres elueringsbufferen.
      Merk: Ta ekstra forsiktighet for ikke å overføre buffere mellom punktene rensing. En forurenset eluent kan forårsake problemer nedstrøms når måling DNA konsentrasjon og/eller kan endre start salt konsentrasjonen av nucleosome montering blandingen.
  2. Bestemme DNA konsentrasjonen av måler absorbansen renset DNA på 260 nm.
    1. Samle en tom på UV VIS spektrofotometer ved hjelp av bare 10 mM Tris pH 7,5 elueringsbufferen. Samle en måling av renset DNA.
  3. Med konsentrasjonen fastsatt, aliquot 25 pmol av renset DNA i et 0,6 mL microfuge rør og plasserer den i en vakuum sentrifuge til løsningen er knapt synlig. Dette er vanligvis 30 minutter til 1 time.
    Merk: DNA underlaget er nå klar for nucleosome montering. Ellers protokollen kan pauses her og DNA lagret på 20 ° C før bruk.
  4. Sett microfuge røret som inneholder de 25 pmol DNA på isen og legge nucleosome montering komponentene i tabell 1i den angitte rekkefølgen. Når alle komponenter er lagt, fjerne blanding fra isen og ruge ved romtemperatur (RT) for 30 min.
    Merk: Det er viktig at saltinnholdet lager histone bufferstørrelsen anses når beregning av NaCl måtte oppnå 2 M siste konsentrasjonen. 15 , 56
  5. Samle på nucleosomes ved å redusere 2 M salt konsentrasjonen av blandingen til 200 mM bruker en kontinuerlig overføringshastighet fortynning. 57
    1. Fyll en sprøyte med 100 µL fortynning bufferen som inneholder 10 mM Tris pH 7.5 og plassere den på en sprøytepumpe.
    2. Direkte nålen på sprøyten gjennom pre punktert hull i hetten microfuge røret, sikrer kontakt er laget med montering blanding (figur 1).
    3. Kjør sprøytepumpen med en rate på 0.75 µL/min for 120 min.
      Merk: Den resulterende 100 µL løsningen inneholder 250 nM nucleosomes og 200 mM NaCl.
    4. Overføre blandingen til en 10 K MWCO dialyse knapp og dialyze mot 200 mL pre kjølt (4 ° C) lav salt bufferen som inneholder 10 mM Tris pH 7.5, 0,25 mM EDTA og 2,5 NaCl, for 1 hr på 4 ° C.
  6. For å vurdere histone innholdet i samlingen nucleosome, forberede en usammenhengende SDS side gel med 15% skille og 6% stabling som beskrevet tidligere30.
    1. Aliquot 10-20 µL av nucleosome lager slik microfuge og legge 4 x Laemmli eksempel Buffer til en fungerende konsentrasjon av 1-2 x. 58
    2. Som en kontroll, Gjenta dette preparatet i et separat microfuge rør for 1-2 µg av histone aksjer. Varme prøvene på 95 ° C for ~ 5 min.
    3. Laste inn eksemplene i tilstøtende baner til hverandre på gel. Legge til eksempel buffer ubrukte banene å fremme med bandet migrasjon.
    4. Løpe gel på 65 V til fargestoff fronten beveger seg gjennom stabling gel. Når skiller gel, øke til 150 V og kjøre til fargestoff foran har overført helt ut av gel.
    5. Demontere geleelektroforese enheten og forsiktig overføre gel til en flekker container fylt med dd H2O. La gel sitte i 5 min med mild agitasjon. Gjenta denne prosessen to ganger mer med fersk dd H2O brukes hver gang.
      Merk: Coomassie flekken brukes i denne protokollen krever ikke typisk fikse trinnene som trengs for Coomassie flekker (se Tabell for materiale). Hvis det brukes en Coomassie forberedelse, justere fikse trinnene etter behov.
    6. Fjerne vannet fra den endelige skylling og legge akkurat nok flekken å dekke gel. La gel sitte med mild agitasjon for minst 1 time.
      Merk: For omrøring, beholderen flekker kan plasseres på alle apparater som fremmer bevegelse av flekken over gel samtidig holde gel dekket i væske.
    7. Fjerne flekken fra beholderen og skyll gel med dd H2O. Erstatt dd H2O og suge gel for 30 min med mild agitasjon. (Gel bør vises som vist i figur 2, med klare separasjon av histone bandene.)
  7. Lagre nucleosomes på 4 ° C før bruk.
    Merk: Når lagret i disse forholdene, nucleosomes forblir stabil i flere måneder. Protokollen kan pauses her.

2. functionalization av glimmer overflate for statisk AFM Imaging av Nucleosomes

  1. Forberede en 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS lager løsning i deionisert vann som beskrevet. 30 store 1 mL dele denne løsningen på 4 ° C før bruk.
    Merk: Dele kan lagres i mer enn et år på 4 ° C. 59
  2. Forberede en fungerende APS 1:300 løsning for glimmer endring av oppløsning 50 µL av 50 mM APS aksjer i 15 mL dd H2O.
    Merk: Denne fungerende løsning kan lagres ved romtemperatur i flere dager.
  3. Klipp 1 x 3 cm strimler av glimmer fra høykvalitets glimmer ark (se Tabell for materiale for glimmer her).
    1. Kontroller at stykket passer når den plasseres diagonalt i søppel. Bruk spissen av skarp pinsetter, barberblad eller teip, deler lag av glimmer til både sider er fersk kløyvde og stykket er så tynn som ~0.1 mm (figur 3A). Umiddelbart plassere glimmer stykket i APS fylt cuvette og ruge i 30 min (figur 3B).
  4. Overføre glimmer stykket til søppel fylt med dd H2O og nyte 30 s (Figur 3 c). Helt tørr begge APS-glimmer stripen under en argon flyt.
    Merk: En ikke-vevd cellulose og polyester renrom tørke (anbefalt tørk i materiale) kan brukes til å hjelpe i wicking vann fra kanten av glimmer når du tørker.
  5. Bruk tørr glimmer stripen er nå for eksempel utarbeidelse. Ellers lagre stykket i en ren, tørr cuvette (figur 3D).
    Merk: Ekstra lagringsplass i et vakuum for 1-2 h anbefales når miljøet er fuktig. Protokollen kan pauses her.

3. forberedelse av Nucleosome prøver på APS-glimmer for statisk AFM Imaging

  1. Bruke double-faced teip til flere magnetiske pucker og legg dem til side.
  2. Kuttet APS-glimmer underlaget til ønsket størrelse (1 x 1 cm rutene MM AFM instrumentet brukes her). Plassere brikkene i en ren Petriskål og holde dekket.
  3. Forberede tre fortynninger av de sammensatte nucleosomes (siste nucleosome konsentrasjoner av 0.5, 1.0, og 2.0 nM) bruker en 0.22 µm filtrert buffer inneholder 10 mM HEPES pH 7.5 og 4 mM MgCl2.
    Merk: For å begrense tap av nucleosomes på lav siste konsentrasjonen, fortynninger bør gjøres én om gangen, umiddelbart før deponering på APS-glimmer.
  4. Sette inn 5-10 µL av fortynnet nucleosome prøven i sentrum av APS-glimmer stykket, og la ruge i to minutter. Forsiktig rense utvalget med 2-3 mL dd H2O fjerne alle buffer-komponenter. Etter hver ~0.5 mL dd H2O brukes, forsiktig risting glimmer for å fjerne overflødig rense vannet.
    Merk: En engangs sprøyte anbefales for dette skyllingsprosess trinnet.
  5. Tørr avsatt prøven under en lys flyt av ren argongass.
    Merk: Utvalget er nå klar til å avbildes eller kan lagres i et vakuum regjering eller desiccator fylt med argon. Prøver forberedt og lagret som har blitt avbildet ett år etter forberedelse uten kvalitetstap. Protokollen kan pauses her.

4. statisk AFM avbildning av Nucleosomes

  1. Montere en AFM tips tips holderen for. Bruke et tips som har en våren konstant ~ 40 N/m og en resonansfrekvens mellom 300 og 340 kHz (se Tabell for materiale for utkragning brukt her).
  2. Montere utvalget utarbeidet i del 3 på AFM scenen er forsiktig med å kontakte eksempel overflaten.
  3. Plasser laser over hengende til summen er nådd og justere vertikal og lateral nedbøyning verdiene nær null.
  4. Tune AFM sonden å finne sin resonansfrekvens og justere amplituden stasjonen og sette bildestørrelsen til 100 x 100 nm. Klikk engasjere seg for å begynne tilnærmingen.
  5. Når nærmet, gradvis optimalisere Amplitude Setpoint til overflaten av prøven er tydelig. Øke skanning størrelsen til 1 x 1 µm og oppløsningen 512 x 512 piksler. Klikk Kopier-knappen etterfulgt av knappen engasjere begynne bildeopptak.
    Merk: Bildene i Figur 4 vise glatt bakgrunnen som kan forventes når imaging prøvene.
  6. Analysere nucleosome prøven, åpne fanget ved hjelp av AFM instrumenter analyseprogramvare.
    1. Flat bildet med en polynom linje subtraksjon eller lignende funksjon.
    2. Angi fargetabellen for å gjenspeile den laveste verdien for minimum og den høyeste verdien for maksimal. Registrere disse verdiene for hvert bilde som de vil være nødvendig i et senere trinn.
      Merk: Hvis disse verdiene ikke brukes, høyde data vil være feil i senere analyse som tverrsnitt av nucleosome kjerner vises som omkranser like, i stedet for varierende høyde.
    3. Eksportere avbildningen som et TIFF-bilde på den opprinnelige størrelsen. Fjern merket noen alternativer for å lagre bildet med en kantlinje eller skala barer.
    4. Åpne bildet i analyseprogramvare som kan omkrets målinger.
    5. Angi x, y og z skalaer å matche bildet.
    6. Som en intern lengde kalibrering, måle og registrere omkrets gratis DNA fra den ene enden til den andre. For denne kalibreringsfaktoren, bruke målingene til å generere et histogram og passer det med en normalfordeling (Gaussian). Dele toppen midten (x-c) på underlaget lengden på base parene.
      Merk: Denne verdien er bildet bestemt omregningsfaktoren fra nanometer til base parene av DNA.
    7. Mål og registrere omkrets av begge armene for hver nucleosome fra gratis slutten av armen til midten av kjernen, konsekvent (figur 5A).
    8. For hver nucleosome kjerne, samle to full bredde på halv maksimal (FWHM) verdier fra en vinkelrett par kjernen tverrsnitt målinger (figur 5B gjennomsnittlig to FWHM målinger og trekke halvparten av den resulterende verdien fra hver nucleosome arm til riktig for den oppmålte lengden fra Avslutt/oppføring DNA til midten av kjernen som er ikke del av arm lengde.
    9. Dele hver arm lengde beregnet kalibreringsfaktoren (trinn 4.5.6) å få lengder i DNA base parene.
    10. Beregne omfanget av DNA innpakning ved å trekke nucleosome arm summen fra total base par lengden av pakket underlaget. Tegne disse verdiene som et histogram og passe peak(s) med en normalfordeling (Gaussian) å få mener pakket base parene av DNA for nucleosome befolkningen.
    11. Beregne gjennomsnittlig nucleosome høyden fra de målte tverrsnitt. Tegne inn dette som et histogram og passe peak(s) med en normalfordeling (Gaussian) å få høyde befolkningen nucleosome.

5. time-Lapse AFM avbildning av Nucleosome Dynamics

  1. Montere AFM spissen på spissen holder. En sonde med vår konstant på ca 0,1 N/m og en resonansfrekvens av 7-10 kHz kan brukes (se listen materialer for utkragning brukt her).
  2. Knytte en 1 x 1 cm stykke APS-glimmer til en magnetisk puck med dobbel-pinne tape og montere pucken på AFM instrumentet.
  3. Fortynn nucleosomes til en 1 nM konsentrasjon i en 0.22 µm filtrerte tenkelig buffer inneholder 10 mM HEPES pH 7.5 og 4 mM MgCl2.
  4. Innskudd 5-10 µL av fortynnet nucleosome i sentrum av den glimmer stykket for 2 min. skyll avsatt prøven med 20µL tenkelig bufferstørrelsen to ganger. Etter den andre skyll, holde et slippverktøy Imaging buffer på overflaten.
  5. Bruke oversiden kameraet for å finne tips og tilnærming til overflaten manuelt til spissen er ~ 100-500 µm fra overflaten.
  6. Legge til flere tenkelig buffer for å fylle gapet mellom spissen og overflaten. I dette eksemplet er ca 50 µL tenkelig bufferen tilstrekkelig til å fylle gapet. Finne en resonans topp for tipset.
  7. Starte datastyrt tilnærming til overflaten. Når nærmet, begynn bildebehandling med en 1-2 µm området velge en ~ 500 nm interesseområde. Med dette området rundt valgt, justere oppkjøpet Datatetthet til 512 x 512 bildepunkter.
  8. Juster settpunkt spenningen og kjøre amplituden parametere for å forbedre bildekvaliteten. En gratis amplituden til 10 nm eller mindre og en skanning rate på ~ 2 Hz kan brukes til å ta kvalitet bilder. Et eksempel på nucleosome dynamics tatt ved hjelp av time-lapse AFM er vist i figur 6.

6. høyhastighets Time-Lapse AFM avbildning av Nucleosome Dynamics

Merk: Protokollen nedenfor er gitt for HS-AFM instrumentet utviklet av gruppen Ando (Kanazawa University, Kanazawa, Japan). 60

  1. Forberede APS-glimmer flytende bildebehandling.
    1. Fest stangen glass til AFM skanner scenen med glass stangen - skanner lim (se Tabell for materiale). La denne tørke i minst 10 min.
    2. Gjør ~0.1 mm tykk sirkulær stykker av glimmer 1,5 mm diameter ved å slå dem fra en større glimmer ark. Bruke HS-AFM glimmer glass rod limet (se Tabell for materiale) legge ved denne glimmer stykke glass stangen på HS-AFM og tørr, urørt i minst 10 minutter. Cleave lag med trykkfølsomme bånd til et godt cleaved lag er sett på båndet.
    3. Fortynne 1 µL av 50 mM APS aksjer i 99 µL av dd H2O lage en 500 µM APS løsning. Innskudd 2,5 µL av denne løsningen på fersk kløyvde glimmer overflaten og la functionalize i 30 min.
      Merk: For å hindre tørke av overflaten mens functionalizing, lokket av et 50 mL konisk sentrifuge rør kan passe med en fuktig filter papir og plassert over skanneren. APS aksjen er utvannet 3 ganger mindre for flytende tenkelig enn for statisk imaging for å kontrollere dynamikken til en rate som kan observeres med AFM.
    4. Skyll glimmer med 20 µL av dd H2O ved å bruke flere ~ 3 µL skyller. Fjern vann helt etter hver skylling ved å plassere en ikke-vevd tørke på kanten av glimmer. Etter den endelige skylling, plassere ~ 3 µL av dd H2O på og la den sitte i minst 5 minutter å fjerne alle nonspecifically bundet APS.
  2. Plasserer sonden i HS-AFM holderen og Plasser holderen på AFM scenen med spissen grossist. Skyll abonnenten bruker ~ 100 µL av dd H2O etterfulgt av to ~ 100 µL skyller av 0.22 µm filtrert nucleosomes imaging buffer som inneholder 10 mM HEPES pH 7.5 og 4 mM MgCl2.
  3. Med skyller gjort, fylle kammeret med ~ 100 µL av nucleosome imaging buffer, submerging spissen. Juster cantilever posisjon før det er truffet med laser. Skyll den APS-glimmer med 20 µL av filtrerte nucleosome imaging buffer, bruker ~ 4 µL per skylling.
  4. Fortynne 1 µL av nucleosome montering aksjer i 250 µL av filtrerte nucleosome imaging bufferen for en endelig nucleosome konsentrasjon av 1 nM. Innskudd 2,5 µL av dette fortynning på overflaten og la det sitte for 2 min. skyll overflaten med ~ 4 µL av nucleosome imaging buffer to ganger. Etter den endelige skylling, la overflaten dekket i imaging buffer.
    Merk: Hvis overflaten ikke er rense etter deponeringen nucleosome prøven, overflaten vil raskt bli overfylt.
  5. Angi skanner og eksempel på spissen holder slik at prøven er ansiktet ned. For å begynne tilnærming, kan du bruke funksjonen auto-tilnærming med en settpunkt amplitude, ens nær gratis oscillation amplituden A0.
    Merk: Ideelt sett ens = 0,950, men opererer på 82% av0 fungerer også hvis forsiktig.
  6. Juster settpunkt til vel spores overflaten.
    Merk: For å minimere om overføring av energi fra AFM spissen til nucleosome prøven, amplituden hengende bør holdes liten, med amplituder så lavt som 1 nm optimal.
  7. Angi bildeområdet rundt 150 x 150 nm til 200 x 200 nm med oppkjøpet hastighet på ~ 300 ms per imaging ramme.
    Merk: Denne størrelsen er vanligvis nok til å fange dynamikken i flere nucleosomes samtidig. En mindre befolkede overflate kan kalle for endringer av disse parametrene. Den foreslåtte bildefrekvensen er nok til å fange nucleosome dynamics som looper, skyve og pakke dem ut, blant annet (se representant resultater delen nedenfor).

7. analyse av Nucleosome Dynamics tatt ved hjelp av Time-Lapse AFM

  1. Konvertere bilder fra HS AFM datatypen (ASD) til TIFF-bilder.
    1. Flate bilder ved hjelp av AFM systemets analyseprogramvare med fly eller linjen funksjoner til bakgrunnen har uniform kontrast.
    2. Angi bildekontrast (fargeskala) automatisk.
      Merk: Kontrasten kan justeres manuelt for presentasjon formål, men ikke for analyse. Dette fører til høyde detaljer tapt i den konverterte bilder.
    3. Lagre det valgte utvalget av bilder som en MOV-fil. Fjern feltet skala og grensen alternativer før du lagrer.
      Merknader: Ikke gjør analyse på bilder som har skala i rammen. Disse endre størrelsen på bildet og vil føre til falske målinger.
    4. Konvertere MOV-filen til tiff-bilder ved hjelp av en passende programvare (se Tabell for materiale). Bruk samme bildefrekvens for konvertering som ble brukt ved oppretting av MOV-filen.
  2. Åpne bilder i en måling programvare kan dette målet for arm lengde kontur målinger, skriver (se Tabell for materiale).
    1. Angi bildedimensjonene tilsvare de som det ble tatt.
    2. Måle kontur lengden av hver nucleosome arm fra slutten av armen til midten av nucleosome kjernen og Registrer målinger i et regneark (figur 4A).
    3. Måle lengden av pakket DNA underlaget i rammer etter en nucleosome pakker opp. Bruk denne for en film spesifikk kalibrering av nm/bp forholdet som brukes for nucleosome innpakning beregninger
    4. Samle to tverrsnitt profiler for nucleosome kjernen og to for nakne DNA (figur 4B).
    5. Importere tverrsnitt profilene til et regnearkprogram og normalisere plott ved å trekke den laveste z-verdien fra alle punkter i profilen.
    6. Beregn høyden og full bredde på halv maksimum (FWHM) for hvert tverrsnitt og beregne gjennomsnittet for verdiene fra to profiler for hver ramme.
  3. Trekk halvparten av FWHM-verdien fra hver av nucleosome armene er plottet som et spredningsdiagram sammen med den beregnede summen for armene.
    1. Beregne den mener omkrets fra DNA målingene gjort for DNA i rammer etter nucleosome pakket.
    2. Bestemme kalibreringsfaktoren nm/bp ved å dele de mener omkrets av gratis DNA av base par lengden av DNA underlaget. Bruk denne verdien til å beregne nucleosome innpakning i hver ramme, som beskrevet i delen 5.12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mono-nucleosomes ble først forberedt på AFM imaging eksperimenter ved hjelp av en kontinuerlig fortynning montering metode (figur 1). De forberedt nucleosomes ble deretter kontrollert usammenhengende SDS-siden (figur 2). En glimmer overflate ble neste functionalized bruker APS, som fanger opp nucleosomes på overflaten samtidig opprettholde en jevn bakgrunn for høyoppløselig imaging (Figur 3). Nucleosomes ble avsatt på APS-glimmer og ble deretter fotografert med statisk AFM imaging. En kontroll for montering og deponering, H3 mono-nucleosomes var forberedt og fotografert bruker statisk AFM. Et bilde av H3 mono-nucleosomes (figur 4A) gir et øyeblikksbilde av befolkningen nucleosome slik den øyeblikk før deponering, bekrefter at nucleosomes ble vellykket samlet. 2 nM nucleosome avsetning gitt en jevn fordeling av nucleosome og DNA partikler over overflaten og lite til ingen stimlet ble observert.

Med H3 kontroll forsamlingen en suksess, ble presentert metodene neste brukt til studiet av CENP-A nucleosomes. Statisk AFM avbildning av dette eksemplet (figur 4B) avslørte at forsamlingen var en suksess. For å demonstrere påvirkning av nucleosome konsentrasjon på overflaten partikkel tetthet, CENP-A nucleosomes avsatt på 1 nM (figur 4B), sammenlignet med 2 nM brukes for H3 (figur 4A). Dette resulterte i en redusert overflaten partikkel tetthet for CENP-A prøven til omtrent en halv at av H3 prøve. Fra statisk AFM bilder, mono-nucleosomes høyde og slå nummeret var preget (figur 5). Begge vinkelen mellom gratis DNA armene og lengden på gratis DNA armene ble brukt til å bestemme antall DNA svinger i den individuelle nucleosome.

Tidsinnstilt AFM bildebehandling av nucleosomes i buffer ble brukt til å visualisere generell spontan unwrapping atferden til nucleosomes (figur 6). Måle vinkelen mellom nucleosome armer og omkrets av armene tillatt for slå nummeret bestemmes i hver av rammer under denne unwrapping prosessen (Figur 6 ABC). Så slå nummeret i nucleosome minsker, er en tilsvarende reduksjon i nucleosome kjernen volumet også observert (figur 6C). Høyhastighets time-lapse AFM ble deretter brukt å undersøke mer intrikate nucleosome dynamikken som var savnet bruker standard tidsinnstilt bildebehandling. Evne til denne teknikken å fange dynamikken over lang tid var avgjørende for visualisering av en langdistanse translokasjon av en CENP-en nucleosome kjerne (figur 7) som ble fanget i løpet av ~ 1200 rammer. Denne teknikken var også kritisk fange sjelden overføring av en CENP-en nucleosome kjerne fra en DNA substrat til en annen (Figur 8). Rask bilde fangst rate (~ 300 ms/ramme) gjort visualisering av denne dynamiske hendelsen mulig, som det bare tok flere rammer å fullføre.

Tabell 1: reagenser som trengs for kontinuerlig salt gradient nucleosome montering. Hver av komponentene som er oppført er lagt til microfuge røret som inneholder renset DNA. Dette bør gjøres i rekkefølgen som reagenser er oppført i tabellen, med vann og NaCl lagt først, etterfulgt av H2A/H2B dimer og histone tetramer lagt siste. Hvis pre foldet histone octamers brukes, legge på samme forhold som for tetramer over. * Legg merke til NaCl innhold i hver av de histone og justere den 5 M NaCl for å legge til følgelig finalen [NaCl] bør tilsvare 2M.  (Se tabell av materialer).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for Sprøytepumpe brukes for Mikroskala nucleosome montering. Montering blandingen er posisjonert til å være i kontakt med slutten av sprøytenålen. Som fortynning er bufferen levert av sprøytepumpen til montering blanding konsentrasjonen av NaCl er redusert, fremme nucleosome montering. Dette tallet er tilpasset fra Stumme-Diers et al. 30 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: SDS side av sammensatte nucleosomes. Baner 1 og 2 inneholder H3-octamer og CENP-A montering av histones, henholdsvis. Baner 3 og 4 inneholder sammensatte H3 nucleosomes og sammensatte CENP-A nucleosomes, henholdsvis. Sammenligning av de sammensatte nucleosomes til histone eneste kontrollene i baner, bekrefte at nucleosomes ble riktig montert. Den tegneserie skjematisk over hver kjørebane angir hvilke histone komponenter finnes. Dette tallet er tilpasset fra Stumme-Diers et al. 30 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjematisk av prosessen å forberede APS functionalized glimmer ved AFM avbildning av nucleosomes. (A) et stykke glimmer ~0.1 mm tykkelse har begge sider fersk kløyvde. (B) kløyvde glimmer brikken er umiddelbart plasseres diagonalt i søppel som inneholder APS løsningen og angis å ruge for 30 min. (C) følgende the APS functionalization trinn, APS-glimmer stykket overføres til søppel fylt med dd H2 O for en 30 s skylling. (D) APS-glimmer er lagret i søppel før bruk.   Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel AFM bilder av H3 og CNEP-A nucleosomes. (A) Eksempelbilde av H3 mono-nucleosomes avsatt på APS-glimmer, tatt ved hjelp av statisk AFM. Hvert lyse blob er en nucleosome kjerne partikkel med flankemanøveren DNA regionene vises som noodle-lignende. Lenge noodle-lignende funksjonene er gratis DNA partikler som ikke er forbundet med en histone kjerne. For dette bildet brukte en 2 nM nucleosome konsentrasjon som gir en jevn fordeling over overflaten, med liten eller ingen trengsel. (B) eksempelfilen nucleosome ble avsatt på 1 nM og fylles mye mindre enn 2 nM i (A). Dette demonstrerer den direkte effekten nucleosome fortynning har på overflaten tettheten av nucleosomes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: visuell fremstilling av analyse som benyttes for å karakterisere tekstbryting og -høyden på nucleosome partikler. (A) A representant nucleosome partikkel fra bilder som vises i figur 3. Omkrets av hver nucleosome arm måles fra slutten av armen til midten av kjernen (stiplet grønn linje).  Plotting tverrsnitt profiler (rød og blå linjer) av en nucleosome produsere kurvene i (B) fra disse kurver, høyde og bredde detalj av partikkel kan bestemmes.  (C) skjematisk av de ulike pakket statene i nucleosomes. (D) hver innpakket stat er preget med vinkelen mellom DNA armene, antall DNA snur og bp innpakket DNA. Skala Bar = 20 nm. Dette tallet er tilpasset fra Lyubchenko et al. 24 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Eksempel på time-lapse AFM bilder fange den spontane pakke dem ut av nucleosomes. (A) A rekke påfølgende AFM bilder av spontane unwrapping nucleosomes fanget av kontinuerlig skanning i bufferen. Hver ramme er 200 nm og bilder ble tatt med en hastighet på ~ 170 s per bilde. (B) som unwrapping prosessen pågår i hver ramme, lengdene av nucleosome økningen, (C) resulterer i en reduksjon i DNA snur seg i nucleosome. Slå nummeret kan fastslås fra de målte lengdene (svart) eller vinkelen mellom nucleosome armene (rød). Så slå nummeret synker, en reduksjon i nucleosome volum er også observert (blå kurve, høyre akse). Hver ramme er 200 x 200 nm i størrelse. Dette tallet er tilpasset fra Lyubchenko et al. 24 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. Demonstrasjon av høyhastighets time-lapse AFM høy kapasitet for lang bilde oppkjøpet ganger (A) A bildegalleri valgt fra mer enn 1200 rammer demonstrere translokasjon virkemåten til en CENP-en nucleosomes kjerne. Hvert bilde ble tatt med en hastighet på ~ 300 ms/ramme. (B) kontur lengdemål fra den ene enden av DNA underlaget CENP-A kjernen brukes til å karakterisere denne lang translokasjon prosessen. Skala Bar = 25 nm. Dette tallet er tilpasset fra Stumme-Diers et al. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8. Eksempel på en dynamisk nucleosome kjernen overføring tatt ved hjelp av høyhastighets time-lapse AFM (figur tilpasset fra Stumme-Diers et al. 16 (A) valgte rammer demonstrere spontan overføring av en CENP-A nucleosome core fra en DNA substrat til en annen. Denne prosessen fant sted innenfor flere rammer som ble tatt med en hastighet på ~ 300 ms/ramme. (B) en skjematisk av overføringsprosessen vises i (A). Skala Bar = 25 nm. Dette tallet er tilpasset fra Stumme-Diers et al. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet ovenfor er ganske enkel og gir svært reproduserbar resultater, men noen viktige saker kan vektlegges. Functionalized APS-glimmer er et viktig medium for å få pålitelige og reproduserbar. En høy stabilitet av APS-glimmer er en av de viktigste funksjonene i dette underlaget som tillater en å forberede tenkelig underlaget på forhånd for bruk som kan brukes i minst to uker etter forberedes. 59 , 61 imidlertid overflaten kan bli skadet av damp lim hvis det brukes til glimmer montering på metall pucken. Derfor er det anbefalt å bruke dobbel kølle tape for glimmer montering som beskrevet i protokollen (inndeling 2). Når bruk av lim er nødvendig, for eksempel anbefaler noe brukernes bruk lim for montering av glimmer på metall disker for bildebehandling i væske, følgende endret fra det som er beskrevet i delen 6.1.3 for eksempel utarbeidelse for HS-AFM imaging . Glimmer er limt til metall disken eller andre solid materiale og kløyvde når limet er styrket. Blåse glimmer med argon fjerne potensielle damp lim. Deretter glimmer kan være kløyvde med en teip og APS glimmer fungerende løsning plassert for å dekke fersk kløyvde glimmer stripen. Mengden av løsningen er avhengig av glimmer stripestørrelse. Tillate APS reagere i 30 min. For å minimere fordampning, kjøre reaksjonen i en våt Petriskål. Bruk følgende fremgangsmåte: suge lab tørke papir og sted er nederst i Petriskål. Plasser en 5 mm tykk plast disk på våtservietter og oppføre det unngå kontakt med vann i bunnen av Petriskål metall disken limt glimmer. Etter 30 min, fjerne samlingen glimmer/disk og rense glimmer overflaten med dd vann og pipette som beskrevet i delen 6.1.3. Er klar for eksempel avsetning. APS konsentrasjonen må justeres i eksperimenter med DNA, selv om arbeider APS løsning (1:300) beskrevet i delen 2.2 bør være et godt utgangspunkt. De tre ganger høyere konsentrasjonen av APS (1: 100) ble brukt i protokollen beskrevet i delen 6.1.3 der prosedyren for avbilding av nucleosomes med HS-AFM er beskrevet.

Protokollen beskrevet er basert på glimmer functionalization med APS. Dette er den mest robuste, svært reproduserbare og enkel prosedyre. Den eneste ulempen er at APS, aminopropyl silatrane er ikke kommersielt tilgjengelig. Imidlertid prosedyren for APS syntese er enkelt og protokollen for syntese dens er beskrevet i detalj. 59 hvis syntese prosedyren er problematisk, kommersielt tilgjengelig reagens, aminopropyltriethoxy silane (APTES) kan brukes for glimmer functionalization (AP-glimmer). Samme ark gir protokollen for utarbeidelse av AP-glimmer bruker damp av APTES. Prosedyren ble testet og brukes til bildebehandling topologisk forskjellige typer DNA, 35,,36,,50,,62,,63 og forskjellige protein-DNA komplekser inkludert nucleosomes. 27 , 50 , 64 tilsvarende til APS-glimmer, AP-glimmer er stabil ukene og kan tilberedes i grupper på forhånd; AP-glimmer er så glatt som APS-glimmer og heller ufølsom til buffer sammensetningen, slik eksemplene kan tilberedes i buffer løsninger med pH-verdier opp til pH10 og ioniske styrker mellom 1 mM og 200 mM av NaCl. 59 , 65 den eneste ulempen med bruk av AP-glimmer er muligheten for aminopropyl silane å hydrolyze og montere i tilslag på overflaten under time-lapse imaging i vann, selv om denne prosessen er ganske tregt med aggregat som kan preget på overflaten, så høy oppløsning av DNA kan oppnås. 35 hydrolyse av silatrane moiety er meget langsom, så ingen synlige oppsamlinger vises under langsiktige imaging; 26 , 35 , 56 , 66 , derfor APS-glimmer er å foretrekke underlaget sammenlignet med AP-glimmer hvis imaging i vann er ansatt. For reproduserbarhet bruker APTES, anbefales destillasjon av reagensen i utarbeidelsen av AP-glimmer. Protokollen for APTES destillasjon er beskrevet i papir 59.

AFM, opererer som en enkelt molekyl teknikk, med nucleosome konsentrasjoner på området nanomolar og at nucleosomes kan spontant distansere på slike lave konsentrasjoner. Ifølge våre data 25skjer dissosiasjon i dusinvis av minutter tyder på at utvalget for AFM studier bør være forberedt like før avsetning. Noen vaskemidler som 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS) øke nucleosome stabiliteten, så nucleosomes øke levetiden ved flere størrelsesordener 25, men bruken av vaskemidler bør gjøres med forsiktighet. Vi viste i 25 at stabilisering av nucleosomes er ledsaget av endring av rekkefølge spesifisitet, så nucleosome selv med bruken av slike sekvensen bestemt motiv som Widom 601 mal montere uten en spesifisitet av binding til 601 sekvens.

Det finnes en rekke viktige saker med metoden foreslått i forhold til andre AFM eksempel forberedelse metoder. Først APS-glimmer og AP-glimmer underlag er stabile ukene og kan tilberedes i grupper på forhånd; overflatene er jevne og heller ufølsom til buffer sammensetningen slik eksemplene kan tilberedes i buffer løsninger med pH-verdier opp til pH10 og ioniske styrker mellom 1 mM og 200 mM av NaCl. 59 , 65 ingen av de eksisterende metodene samsvarer med disse egenskapene. Andre AFM er en enkel molekyl teknikk og krever et lite utvalg. Den beskrevne protokollen opererer med nanoskala mengder utarbeidelse. Tredje i time-lapse AFM studier, og datainnsamling HS-AFM er det en betydelig mengde tid å generere og karakterisere datasett som er kjøpt. Metodikk beskrevet her er godt egnet for å analysere hundrevis av AFM bilder.

Eksempel forberedelse metodikken er ikke begrenset til nucleosome type prøver. Heller det er ufølsom for protein-DNA komplekser og allerede er brukt et antall proteiner gjenkjenne bestemte sekvenser på DNA, f.eks restriksjoner enzymer 67,68,69, enkelt-strandet DNA bindende proteiner 44,45,56,70,71 sammen med komplekse protein systemer involvert i DNA replikering 47,72 og rekombinasjon68,73. Viktigere, er HS-AFM aktivert på disse systemene å følge dynamikken i disse systemene.  Disse studiene gjør det mulig å bruke utviklet metodikk karakterisering av nucleosome matriser som foreslått i og belyse rollen av slike centromere spesifikke proteiner som centromere protein B (CENP-B) eller C (CENP-C) i samlingen centromere og forstå deres rolle i utviklingen av mange kreft33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatter bidrag: YLL og MSD utformet for prosjektet. MSD samlet nucleosomes. MSD og ZS utført AFM eksperimenter og data analyser. Alle forfattere skrev og redigeres manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Tags

Biokjemi problemet 143 AFM time-lapse nucleosome chromatin dynamikk struktur histones enkelt - molekylet DNA epigenetics imaging
Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T.,… More

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter