Summary
在该协议中, 我们描述了实验性近视诱导小鼠使用新设计的眼镜和所需的技术, 以实现稳定和可重复的结果, 在眼睛参数测量。
Abstract
由于遗传操纵相对容易, 近视眼模型可以成为近视研究的有力工具。诱导动物近视的一个方法是在眼睛前放置几个星期的透明负片 (镜片引起的近视, lim)。然而, 现有的诱导和评价协议因实验室而异。在这里, 我们描述了一种非常实用和可重复的方法, 以诱导 lim 在小鼠使用新设计的眼镜。该方法将镜头稳定地固定在鼠标前的眼睛, 同时允许镜头被取下用于清洁或局部药物管理。表型鲁棒性强, 效率高, 方差小。这里描述的方法可以在断奶后立即应用于小鼠, 从而延长了实验的可能持续时间。我们还为在折射和轴向长度测量中实现可重复的结果提供了技术建议。我们希望这里描述的分步协议和详细的文章能够帮助研究人员更顺利地进行近视实验, 使数据在实验室之间具有可比性。
Introduction
近视眼的发病率最近急剧上升, 而其发病和进展的机制在很大程度上仍不知道1。近视最典型的表型是轴向长度 (al) 的伸长, 这增加了视网膜并发症甚至失明的风险2。为了更好地了解近视的发病机制, 发展有效的治疗方法, 有必要建立稳健的近视动物模型和稳定的表型评价。
简单地说, 诱导动物近视状态的方法有两种: 形式剥夺近视 (fdm) 和透镜性近视 (lim)3。前者在眼睛前放置扩散器或缝合眼睑, 以模糊图像, 这影响眼球的正常发育, 导致近视表型。后者将负镜头放置在眼睛前面, 以移动视网膜后面的焦点。视网膜检测焦点的移动, 拉长眼球, 重新调整视网膜和焦点。对于 fdm 来说, 在眼皮闭合或扩散器固定在眼睛前之后, 几乎不需要进一步的维护。对于 lim, 需要取下镜头进行清洁, 以保持其透明度。因此, fdm 在技术上相对容易被诱导。然而, fdm 和 lim 的机制是不同的, 哪种方法在人类中模仿近视仍在争论 3.lim 的优势之一是与 fdm 相比表型更强, 至少在小鼠4的情况下是如此。
用于诱导近视的动物包括小鸡 5、猴子6、树7、豚鼠8只和老鼠4.考虑到基因操纵的可能性、丰富的可用抗体和低繁殖成本, 小鼠可能是近视动物模型的首选。然而, 与其他较大的动物相比, 在老鼠眼睛前固定镜片或扩散器是相对困难的, 特别是对于断奶后的幼鼠。对于需要局部药物管理或多个临时眼睛测量的实验, 框架也是必须可拆卸的。另一个挑战是老鼠眼球的形态变化很小, 需要复杂的技术和设备来评估。到目前为止, 不同研究小组使用的不同诱导和测量协议使得很难在实验室之间比较和重复结果。需要一个包含详细信息的标准协议。
以前的作品描述了多种方法来固定镜头或扩散器在鼠标眼睛前面, 如胶合9,缝合10和头戴眼镜架 11,12。我们将现有的头戴式眼镜 11、12、13与我们新设计的框架相结合, 开发了一种改进的方案, 以诱导小鼠体内强壮高效的实验近视。该方案可应用于产后第21天 (第21页) 断奶后不久的幼鼠。我们还优化了稳定和精确评估表型的过程, 包括折射和 al。我们希望这种标准化的方案能够帮助近视小鼠成为更容易获得的近视研究模型。
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Protocol
庆应义奥大学医学院动物研究伦理委员会批准了所有程序, 这些程序都遵守了《关于在眼科和视力研究中使用动物的 arvo 声明》、《庆应义奥动物实验机构准则》大学和动物研究: 报告活体实验 (arrive) 关于在研究中使用动物的指南。
1. 为老鼠组装眼镜
- 准备组装眼镜所需的部件 (图 1a)。对于每个鼠标, 准备所有以下: 一个头戴尼龙棒, 一个较高的钛框架, 两个镜头与适当的权力, 根据实验的目的, 一个 m1.4 大小的螺丝, 长度为10毫米, 一个螺母为 m1.4 大小螺丝, 一个普通m1.4 尺寸螺杆垫圈, 厚度 0.3 mm, 以及两个人工指甲头 (材料表)。
注: 存在两种不同高度的帧。对于一个鼠标, 一个较高的帧和一个较低的帧用作集合。较高的框架应放在较低的框架之上, 以使视觉场对称。框架和镜片是作者研究小组专门设计和制造的。这些信息可通过与本文的相应作者联系获得。其他零件也可以在零售工具商店找到。 - 将左右眼的镜框分开组装。
- 将指尖排列到外面的方向, 以达到最佳的保护效果。将指尖和框架之间的角度调整为130°左右, 以避免遮挡鼠标视觉场 (图 1b)。使用氰基丙烯酸酯胶粘剂将人工指甲提示贴在框架上。
注: 指甲头可以帮助保护镜头不被鼠标划伤。指甲头的方向必须相反, 因为较高的框架和较低的框架分别用于右眼和左眼。 - 等待至少 12小时, 让胶粘剂完全干燥, 然后使用指甲钳调整指甲头的形状约1厘米 x1 厘米通过切割和修剪。
- 使用氰基丙烯酸酯胶粘剂将镜片贴在镜框上。用手将镜头放在镜框上, 并水平按住镜框。从镜片边缘注入氰基丙烯酸酯胶粘剂, 使胶粘剂通过表面张力传播。
注: 粘合剂会腐蚀镜头并影响其透明度, 因此请确保粘合剂只接触镜片的外围部分。采用0屈光度 (d) 平面透镜作为对照, 减镜诱导近视。在其他地方已经描述了不同功率的减镜 (–10 d 到-50d) 的影响.为了最大限度地提高近视诱因, 建议使用–30 d 镜头诱导近视。通过将镜头转换为 1.5 ml 微管的盖作为扩散器, 也可以通过同一器件诱导 fdm。
- 将指尖排列到外面的方向, 以达到最佳的保护效果。将指尖和框架之间的角度调整为130°左右, 以避免遮挡鼠标视觉场 (图 1b)。使用氰基丙烯酸酯胶粘剂将人工指甲提示贴在框架上。
- 将螺丝与从棒的扁平一侧的垫圈拧紧到尼龙棒上。在实验前分别准备眼镜和冰棍, 并准备进一步使用 (图 1c)。
注: 协议可以在此处暂停。
2. 折射和 al 基线的测量。
- 在眼球两侧使用含有 5 mgml tropicamide 的一滴肌剂和 5 mgml 盐酸苯乙胺来扩张瞳孔。在全身麻醉前等待至少5分钟。
注: 在全身麻醉下扩张瞳孔会导致可逆性白内障, 影响测量后。在全身麻醉前, 一定要扩张瞳孔, 等待至少5分钟。肌剂的一滴 (约0.05 毫升) 足以扩张小鼠眼的瞳孔, 而更多的肌剂不会对以下步骤造成伤害。 - 把老鼠置于全身麻醉之下。轻轻地抓住鼠标的后部皮肤, 防止鼠标撞到眼睛, 直到它完全麻醉。判断全身麻醉的深度是足够的, 如果老鼠不移动, 当它被放在桌子上自由。
注: 咪唑安定 (40μg/100μl)、medetomidine (7.5μg/100μl) 和酒石酸丁醇 (50μg/100μl) 的组合, 用于体积为 0.01 ml·腹腔内注射的小鼠全身麻醉。一般情况下, 小鼠入睡所需时间不到5分钟。长时间的全身麻醉会导致体温低和心跳缓慢。为了避免全身麻醉对测量的潜在影响, 建议在注射麻醉剂后10分钟内完成所有测量。麻醉鸡尾酒中提供的布托酚提供了大约4小时的镇痛。全身麻醉的适当配方可能因机构而异。 - 使用红外光反应器4、9、14测量鼠标眼的折射。调整鼠标眼睛之一的方向, 将第一个 purkinje 图像保持在瞳孔的中心, 并测量沿光轴的折射。测量后, 用相同的程序测量相反的眼睛 (图 2a)。
注: 折射的测量值受到鼠标眼沿光轴的位置的强烈影响。确保第一个 purkinje 图像在距离瞳孔中心±3度的范围内对齐。光谱域光学相干层析成像 (sd-oct) 系统的工作台可用于折射测量中瞳孔方向的微调 4。 - 使用 sd-oct 系统4、15、16测量小鼠眼的 al。将 al 定义为从角膜顶点到光纤附近最亮边界的距离 (图 2b)。
注: 与折射的测量类似, al 受到鼠标眼方向的强烈影响。角膜顶点可以通过角膜表面的点状反射来证实。视网膜侧的边界在视神经点将是非常模糊的。稍微调整方向, 让边界足够清晰, 可以测量, 但距离视神经不要太远。
3. 将框架固定在鼠标颅骨上。
- 应用0.1% 纯化的透明质酸钠滴眼液, 以防止每只眼睛干燥。
注: 眼睛表面的眼珠会影响折射值和轴向长度测量值。在所有测量完成之前, 不要在麻醉后使用滴眼液。 - 将麻醉鼠标的下巴放在由粘土或任何东西制成的斜坡上, 使头颅的前面水平为水平。
- 使用70% 乙醇棉签消毒耳朵和眼睛之间的头发和头皮。
- 用手术剪刀和推子切割耳朵和眼睛之间的皮肤, 以露出大约0.8 厘米2的头骨。使用牙科蚀刻液和棉签去除骨膜。在每只老鼠手术前, 用70% 的乙醇对手术剪刀和推子进行消毒。
注: 可能需要剪下头发并戴上无菌手套。 在本程序前检查相关动物护理委员会的规定。在大多数情况下, 牙科蚀刻液可以发现作为自固化牙科粘合剂系统的附件之一。如果牙科蚀刻液不可用, 请改用70% 的乙醇。 - 组装一组没有镜头的框架, 以帮助将棒固定在正确的位置。把镜框放在鼠标头上。仔细调整框架的位置, 以确保两只眼睛都在空框的中间。
- 使用自固化牙科粘合剂系统将棒贴在鼠标头上。注意不要让粘附系统的液体流入鼠标眼睛。
注: 使用自固化牙科粘合剂系统的方法在不同的产品。请仔细阅读说明。
注意: 牙科粘合剂系统中的某些试剂可能有毒。 - 等待大约 5分钟, 并在不改变棒位置的情况下小心地脱下框架和螺母 (图 3a)。
- 腹腔内注射 0.75 mg/kg 盐酸阿蒂帕梅唑, 帮助小鼠更快地从麻醉中恢复。将鼠标放入单个保持架, 直到完全恢复。不要让鼠标无人看管, 直到它恢复了足够的意识, 以保持胸骨的清醒。协议可以在这里暂停。
4. 近视眼诱导的启动和事后的维护
- 手术后等待至少 24小时, 让小鼠完全从麻醉中恢复。抓住棍子, 用镜片把它放在镜框上。诱导从此时开始 (图 3b)。
注: 为了最大限度地减少麻醉恢复过程中的不适, 并给足够的时间使牙科粘合剂系统凝固, 强烈建议在小鼠完全从麻醉中恢复后, 将其放在框架上。胶粘剂系统的树脂水泥将完全覆盖头皮的伤口。因此, 不需要具体的手术后治疗, 以防止感染和改善术后疼痛。就在第一次穿上镜框后, 老鼠就会过度意识到镜头的存在, 并对其进行大量的划伤。总的行为将在几个小时后恢复正常。带镜片的老鼠可以与正常的老鼠保持相同的密度。 - 至少每周两次, 用棉签擦拭框架和指甲头清洗, 以保持镜片的透明度。
注: 没有必要把鼠标麻醉下删除和穿上框架。为老鼠坐着提供支持, 而不是在与它们合作的同时让它们被绞死, 可以减少痛苦。- 如果需要进行临时测量, 请将鼠标置于麻醉之下, 并按照前面所述对鼠标进行测量。诱导可以在小鼠从麻醉中恢复后继续进行。
- 每周至少清洁两次笼子。
注: 这有助于保持镜头的清晰度。在鼠标和保持架底部之间放一个网过滤食物残渣也可能是有帮助的。 - 监测体重和总的行为。在整个实验过程中, 将它们与同龄未接触的小鼠进行比较。
注: 除了一些划痕行为外, 未治疗的小鼠实验小鼠之间没有明显的变化, 包括体重。
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Representative Results
首先, 检查是否准备好了所有必要的部件 (图 1a)。一块组装的眼镜的例子如图 1b所示。除了框架和螺母的主体外, 所有其他部件都是一次性的, 为每只鼠标。一组完整的眼镜如图 1c所示。更改两个帧之间的角度, 以适应不同年龄的鼠标。
折射测量的一个例子如图 2a所示。这是一个由-30 d 镜头诱导的鼠标眼, 从 p21 开始, 为期3周。请注意, 在 x 轴和 y 轴中, 凝视都应控制在接近0度的地方, 这意味着鼠标看到的是相机9的正前方。图 2b显示了一个由为小鼠调谐的 sd-oct 系统拍摄的整个眼睛图像的示例, 以及眼睛每个部分的定义。一般来说, sd-oct 系统直接显示实际测量值。
图 3a显示了粘附在鼠标头上的棒的图像。伤口的边界应至少3毫米远离眼睛, 以避免影响眼睑的功能。棒停留在鼠标头上, 直到诱导结束, 并提供了固定眼镜的基础。牙科粘合剂系统的粘合强度应足以在整个实验中固定眼镜约3至4周。组装眼镜, 如图 3b所示。两片眼镜应该是相当对称的。
有组织的结果如图 4所示。在本实验中, 0 d 平面镜片固定在左眼前, 内部控制和-30 d 镜片固定在右眼前诱导近视 (c57b6 j 小鼠, 诱导开始于 p21, n = 4)。在诱导开始后, 每周测量一次折射和 als, 为期三周。与 0 d 平面镜片相比,-3 0 d 在折射和 al 中都诱发了强烈的近视转移。折射的变化在第一周达到高峰, 在接下来的两周里保持不变。在 al 中, 近视眼的变化与对照眼的变化从第一周开始就有显著差异, 在接下来的两周里, 差异越来越大。
图 1: 安装在头骨上的眼镜的设计.(a) 组装鼠标眼镜所需的所有部件。(b) 框架的位置和眼睛右侧的指甲尖的例子。(c) 一套组装眼镜的例子。调整关节部分, 以改变框架的角度, 以适应不同年龄的小鼠。这个数字是从江泽民, x. 等 4 修改, 可在知识共享归因4.0 国际许可证下。http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, 我的时间, 我的请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 折射和 al 测量的示例图像.(a) 使用红外光折变器测量近视眼睛折射的图像。(b) 使用 sd-oct 系统对老鼠眼睛进行 al 测量的样本图像和眼球每个部分的定义。这个数字是从江泽民, x. 等 4 修改, 可在知识共享归因4.0 国际许可证下。http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, 我的时间, 我的请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 手术后一只老鼠的图像.(a) 一只老鼠在手术后粘附棍子的例子。(b) 一只两边都有眼镜的老鼠。这个数字是从江泽民, x. 等 4 修改, 可在知识共享归因4.0 国际许可证下。http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, 我的时间, 我的请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 以-30 d 镜片和 0 d 镜片为内部对照, 对4只小鼠进行为期三周的近视诱导随访结果.(a) 三个星期的折射变化。诱导一周后可以观察到突然的变化。(b) 相比之下, al 的变化相对较小。星号标记显示了眼睛之间的统计意义, 眼睛之间分别戴 0 d 和-30 d 镜头, 每周。*p < 0.05, ** p < 0.01。学生考试。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 小鼠近视的推荐流程图.这里显示的流程图代表了一种可能的模式诱导近视的小鼠。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
为了确保眼镜稳定地固定在鼠标头上, 需要非常注意该协议中的几个步骤。在使用牙科粘合剂系统之前, 必须完全取出骨膜。头骨上的血也需要小心清理。虽然在粘合剂应用后立即进行一点微调是可以接受的, 但在胶粘剂系统干燥之前, 不要频繁移动棒。仔细遵循粘合剂系统的指示, 特别是最终混合物中每个成分的比例。当抓住鼠标在维护眼镜或手术后的后续测量时, 不要将棍子与鼠标的身体一起掌握。头骨和棍子之间的相对运动是导致棍子掉落的最常见原因。有了适当的手术和掌握技能, 在包括 2 0个人在内的3周实验中, 掉落木棍的人数将少于1人。
头发和食物残渣可能会滑入眼睛和镜片之间的间隔。这不仅会影响镜片的透明度, 还可能对角膜表面造成物理损伤。为了保持镜头的透明度, 每周至少需要进行两次清洗。这也将使小鼠有机会训练面部, 以减少角膜并发症的发生。在框架和皮肤之间留出约1毫米的空间, 让鼠标闪烁。这个框架可能会使老鼠很难通过上面的网格到达笼子外的食物。因此, 建议将食物直接放在笼子的地板上。把笼子换成干净的笼子大约每周两次, 也有助于保持镜片的清洁。肮脏的镜片通过形式剥夺机制成为扩散器诱发近视。这可能会扭曲数据, 使结果难以解释, 因为有证据表明, fdm 和 lim 是病因3中不同的模型系统。
由于小眼睛体积小, 测量到的眼睛参数往往不稳定。我们推荐舍费尔博士为折射测量9开发的红外光反应器和用于 al4的 sdoct 系统 (见材料表)。这两个系统都提供了足够的信息来判断测量值的可靠性, 以确保测量的可重复性。对于折射, 如以前的报告所述, 保持轴 4,14 上的测量是极其重要的。将凝视控制保持在±3度以内可以得到稳定的结果。为了实现这种精确的测量, sdoct 系统的管在调整鼠标眼睛的方向时可能会很有帮助。对于 al 测量, 角膜顶点上的反射光和光纤附近最亮的边界是两个可靠的解剖标记, 可确保此测量的可重复性。
这里描述的协议在一周内诱发小鼠明显的近视状态。虽然该机制尚不清楚, 但折射和 al 的变化不一定是平行的。由于 al 在一周后一直变得近视, 我们建议总共做三次测量: 之前, 一周和三周后的诱导。图 5显示了近视诱导的示例流程图。根据上一次报告4, 从第21页开始, 使用-30 d 镜片的时候, 建议使用-30 d 镜片, 实验持续4周以上, 实验可能会产生很高的严重角膜并发症, 影响测量值, 加速镜片的消耗.最常见的并发症是角膜疤痕。老鼠不能清洁他们的脸和眼皮穿着框架, 这可能是并发症的原因。
该协议中描述的设备可在断奶后立即应用于小鼠 (第21页)。这可能在一定程度上导致观察到的强表型4。框架是可拆卸的, 没有全身麻醉。这不仅可以让研究人员轻松清理镜片, 还可以使局部药物输送成为可能4。另一个优点是, 镜头可以很容易地变成扩散器或不同的偏光片 (例如, 加上镜头) 的镜头, 这扩大了这种方法的可能性。这种方法的一个局限性是, 手术需要一些实践, 然后才能稳定地坚持框架的整个实验。测量还需要耐心来收集可靠的数据。
老鼠是不可替代的动物模型, 具有基因操纵的可能性和较低的繁殖成本。希望这里描述的方案能够使小鼠实验近视成为更实用的近视研究模型。
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Disclosures
鼠标眼镜的设计已申请专利 (第201741349号申请)。
Acknowledgments
我们感谢 m. t. pardue 就 sdoct 提供的建议, f. 舍费尔就折射和角膜曲率的测量提供了建议, sanshouo 先生再现了三维框架数据 miyauchi m;k. tsubota;y. 田中;s. 近都;c. shoda;m. Ibuki;y. miwa;y. hagiwara;a. 石田;y. tomita;y. kada;e. yotsukura;高桥;和王玉刚进行了关键的讨论。这项工作得到了教育、文化、体育、科学和技术部向传统知识提供的科学研究援助赠款 (kakenhi, 编号 15k10881) 的支持。这项工作还得到了 tsubota 实验室 (日本东京) 为近视研究提供的赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| screw | NBK | SNZS-M1.4-10 | |
| washer | MonotaRO | 42166397 | |
| nut | MonotaRO | 42214243 | |
| stick | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| frame | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| lenses | RAINBOW CONTACT LENS | none | customized for mice use by the company |
| cyanoacrylate glue | OK MODEL | MP 20g | |
| dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | super bond | contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull |
| infrared photorefractor | Steinbeis Transfer Center | none | designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen |
| Spectral domain OCT | Leica | R4310 | |
| Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution | Santen | Mydrin-P | |
| midazolam | Sandoz K.K. | SANDOZ | components for the anesthetic |
| medetomidine | Orion Corporation | Domitor | components for the anesthetic |
| butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | components for the anesthetic |
| 0.1 % purified sodium hyaluronate | Santen | Hyalein | |
| atipamezole hydrochloride | Zenoaq | antisedan |
References
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