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Neuroscience

प्रलोभन और प्रायोगिक अदूरदर्शिता के एक Murine मॉडल का मूल्यांकन

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58822
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 2
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम नए डिजाइन चश्मा और नेत्र पैरामीटर माप में स्थिर और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक कलाओं का उपयोग कर चूहों में प्रयोगात्मक अदूरदर्शिता प्रलोभन की पूरी प्रक्रिया का वर्णन ।

Abstract

निकट दृष्टि से Murine मॉडल क्योंकि अपेक्षाकृत आसान आनुवंशिक हेरफेर की दृष्टि अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है । एक तरह से जानवरों में अदूरदर्शिता के लिए प्रेरित करने के लिए सप्ताह के लिए आंखों के सामने स्पष्ट ऋण लेंस रखा है (लेंस-अदूरदर्शिता, लिम) । हालांकि, प्रलोभन और मूल्यांकन के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल प्रयोगशाला से प्रयोगशाला तक बदलती हैं । यहाँ, हम नए डिजाइन चश्मा का उपयोग कर चूहों में लिम प्रेरित करने के लिए एक बेहद व्यावहारिक और reproducible विधि का वर्णन किया. विधि लेंस को हल करता है माउस आंख के सामने छुरा जबकि लेंस की सफाई या सामयिक दवा प्रशासन के लिए ले जाया जा करने के लिए अनुमति देता है । phenotype मजबूत और कुशल है, और विचरण छोटा है । यहाँ वर्णित विधि को प्रातः के ठीक बाद चूहों पर लागू किया जा सकता है जो प्रयोगों के लिए संभावित अवधि को विस्तारित करता है. हमने भी reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए तकनीकी सलाह दी है अपवर्तन और अक्षीय लंबाई माप । हमें उंमीद है कि कदम दर कदम प्रोटोकॉल यहां वर्णित है और विस्तृत लेख मदद कर सकता है शोधकर्ताओं ने अदूरदर्शिता के साथ अदूरदर्शिता प्रयोगों और अधिक सुचारू रूप से प्रदर्शन और प्रयोगशालाओं भर में तुलनीय डेटा बनाते हैं ।

Introduction

निकट दृष्टि की व्यापकता नाटकीय रूप से हाल ही में वृद्धि हुई है, जबकि इसकी शुरुआत और प्रगति के तंत्र अभी भी काफी हद तक पता नहीं है1। अदूरदर्शिता की सबसे विशेषता phenotype के अक्षीय लंबाई (अल) है, जो रेटिना जटिलताओं या यहां तक कि2अंधापन के लिए जोखिम बढ़ जाती है के बढ़ाव है । बेहतर दृष्टि से रोगजनन को समझने और प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए, सुदृढ़ कमबीन पशु मॉडल और स्थिर phenotype मूल्यांकन आवश्यक हैं.

संक्षेप में, दो तरीकों जानवरों में कमबीन राज्यों उत्प्रेरण के लिए मौजूद हैं: फार्म-अभाव निकट दृष्टि (FDM) और लेंस प्रेरित अदूरदर्शिता (लिम)3। पूर्व स्थानों आंख के सामने विसारक या सीवन पलक छवि है, जो गोलक के सामांय विकास को प्रभावित करता है, एक अदूरदर्शिता phenotype में जिसके परिणामस्वरूप । बाद में जगह शूंय आंख के सामने लेंस को रेटिना के पीछे फोकल प्वाइंट ले जाने के लिए । रेटिना ध्यान की पारी का पता लगाता है और गोलक को रेटिना और फोकल प्वाइंट फिर से संगठित करने के लिए लंबी है । FDM के लिए, के बाद पलक बंद कर दिया है या विसारक आंख के सामने तय किया गया है, लगभग कोई आगे रखरखाव की जरूरत है । लिम के लिए, लेंस को साफ करने के लिए इसे पारदर्शी रखने के लिए बाहर ले जाने की जरूरत है । इस प्रकार, FDM अपेक्षाकृत आसान है तकनीकी रूप से प्रेरित किया जाना है । हालांकि, FDM और लिम के तंत्र अलग हैं, और जो विधि मानव बेहतर में अदूरदर्शिता की नकल3बहस के तहत अभी भी है । लिम की शक्तियों में से एक मजबूत phenotype FDM के साथ तुलना में है, पर कम चूहों के मामले में4.

जानवरों कि अदूरदर्शिता उत्प्रेरण के लिए इस्तेमाल किया गया है लड़कियों5, बंदरों6, ट्री shrews7, गिनी सूअरों8, और चूहों4शामिल हैं । आनुवंशिक हेरफेर की संभावना को ध्यान में रखते हुए, प्रचुर मात्रा में उपलब्ध एंटीबॉडी, और प्रजनन के लिए कम लागत, चूहों अदूरदर्शिता के पशु मॉडल के रूप में पहली पसंद किया गया हो सकता है. हालांकि, अन्य बड़े जानवरों के साथ तुलना में, माउस आंख के सामने लेंस या विसारक फिक्सिंग, विशेष रूप से युवा चूहों के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल है जैसे प्रातः के बाद ठीक है । प्रयोगों है कि सामयिक दवा प्रशासन या एकाधिक अंतरिम आंख माप की जरूरत के लिए, यह भी फ्रेम हटाने योग्य होने के लिए आवश्यक है । एक अंय चुनौती माउस गोलक, जो परिष्कृत टेकनीक और उपकरणों के मूल्यांकन की जरूरत के छोटे रूपात्मक परिवर्तन है । तिथि करने के लिए विभिन्न अनुसंधान टीमों में इस्तेमाल अलग उत्प्रेरण और मापने प्रोटोकॉल यह प्रयोगशालाओं में परिणाम की तुलना और दोहराने के लिए कठिन बना. विवरण के साथ एक मानक प्रोटोकॉल की जरूरत है ।

पिछले काम करता है कई तरीकों का वर्णन करने के लिए लेंस या इस तरह के gluing9के रूप में माउस आंख, के सामने विसारक ठीक,10 सिलाई और सिर पर रखा आंख मारना फ्रेम11,12। हम संयुक्त मौजूद सिर आंख मारना टेकनीक11,12,13 हमारे नए डिजाइन फ्रेम के साथ घुड़सवार चूहों में मजबूत और कुशल प्रयोगात्मक अदूरदर्शिता उत्प्रेरण के लिए एक उन्नत प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए । प्रोटोकॉल जन्मोत्तर दिवस 21 (p21) में प्रातः के बाद जल्द ही युवा चूहों के लिए लागू किया जा सकता है । हम भी phenotypes के स्थिर और सटीक मूल्यांकन के लिए प्रक्रियाओं को अनुकूलित सहित अपवर्तन और अल । हमें उंमीद है कि इस मानकीकृत प्रोटोकॉल कमबीन चूहों निकट दृष्टि अनुसंधान के लिए एक और अधिक आसानी से सुलभ मॉडल बनाने में मदद कर सकते हैं ।

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Protocol

कईयो विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन के पशु अनुसंधान पर आचार समिति द्वारा सभी प्रक्रियाओं को अनुमोदित किया गया नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए ARVO बयान का पालन, कईयो पर पशु प्रयोग पर संस्थागत दिशानिर्देश विश्वविद्यालय, और पशु अनुसंधान: में Vivo प्रयोगों की रिपोर्टिंग (पहुंच) अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए दिशानिर्देश ।

1. चूहों के लिए चश्मा कोडांतरण

  1. चश्मा (आंकड़ा 1a) कोडांतरण के लिए आवश्यक भागों तैयार करते हैं । प्रत्येक माउस के लिए, सभी निंनलिखित तैयार: एक सिर पर घुड़सवार नायलॉन स्टिक, एक उच्च और एक कम टाइटेनियम फ्रेम, प्रयोग के प्रयोजन के अनुसार उचित शक्तियों के साथ दो लेंस, 10 मिमी की लंबाई के साथ एक एम 1.4 आकार पेंच, एम 1.4 आकार पेंच के लिए एक नट, एक सादा एम 1.4 आकार पेंच के लिए वॉशर ०.३ mm की मोटाई के साथ, और दो कृत्रिम नाखून युक्तियां (सामग्री की तालिका) ।
    नोट: फ़्रेम के दो प्रकार के विभिंन ऊंचाइयों के साथ मौजूद हैं । एक माउस के लिए, एक उच्च फ्रेम और एक कम फ्रेम एक सेट के रूप में उपयोग किया जाता है । उच्च फ्रेम निचले लोगों के ऊपर रखा जाना चाहिए ताकि दृष्टि क्षेत्रों सममित बनाने के लिए । फ्रेम और लेंस विशेष रूप से डिजाइन किए है और लेखकों के अनुसंधान समूह द्वारा निर्मित । ये इस आलेख के संगत लेखकों से संपर्क करके उपलब्ध हैं । अंय भागों में खुदरा उपकरण की दुकानों में पाया जा सकता है ।
  2. सही और बाईं आंख के लिए अलग से फ्रेम इकट्ठा ।
    1. सबसे अच्छा सुरक्षात्मक प्रभाव को प्राप्त करने के लिए बाहर की दिशा का सामना करने के लिए नख टिप की व्यवस्था. नाखून टिप और फ्रेम के बीच कोण को समायोजित करने के बारे में १३० ° होने के लिए माउस दृष्टि क्षेत्र मास्किंग से बचने के लिए (आंकड़ा 1b) । cyanoacrylate चिपकने का उपयोग कर फ्रेम करने के लिए कृत्रिम नख युक्तियों का पालन करें ।
      नोट: नाखून युक्तियों के लिए माउस से खरोंच जा रहा से लेंस की रक्षा में मदद कर सकते हैं । नख युक्तियों की दिशा विपरीत होनी चाहिए क्योंकि उच्च फ़्रेम और निचली फ़्रेम का उपयोग क्रमशः दाहिनी आँख और बायीं आँख के लिए किया जाता है.
    2. चिपकने वाला सूखी पूरी तरह से दो, तो एक कील क्लिपर का उपयोग करने के लिए नाखून युक्तियां के आकार को समायोजित करने के बारे में 1 सेमी × 1 सेमी के काटने और trimming से होने के लिए कम से 12 ज रुको ।
    3. cyanoacrylate चिपकने का उपयोग कर फ्रेम करने के लिए लेंस का पालन करें । हाथ से फ्रेम पर लेंस रखो और फ्रेम क्षैतिज पकड़ । cyanoacrylate चिपकने वाले लेंस के किनारे से सुई और सतह तनाव से चिपकने वाला प्रसार करते हैं ।
      नोट: चिपकने वाला लेंस घिस जाएगा और अपनी पारदर्शिता को प्रभावित है, तो यकीन है कि चिपकने वाला ही लेंस के परिधीय भाग छू कर । का प्रयोग करें 0 diopter (डी) नियंत्रण और ऋण लेंस के रूप में plano लेंस निकट दृष्टि प्रेरित । ऋण लेंस के विभिंन शक्तियों का प्रभाव (-10 डी से-५० d) कहीं और वर्णित किया गया है4। निकट दृष्टि प्रलोभन को अधिकतम करने के लिए,-30 डी लेंस निकट दृष्टि उत्प्रेरण के लिए सिफारिश की है । FDM भी बस विसारक के रूप में १.५ मिलीलीटर microtube की टोपी में लेंस बदलकर एक ही उपकरण के साथ प्रेरित किया जा सकता है ।
  3. नायलॉन छड़ी के फ्लैट की ओर से वॉशर के साथ एक साथ छड़ी में पेंच कस । प्रयोग से पहले आँख का चश्मा और छड़ें तैयार करें और आगे उपयोग के लिए शेयर (figure 1c).
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

2. अपवर्तन और अल आधार रेखा की माप ।

  1. mydriatic एजेंट की एक बूंद लागू करें जिसमें 5 मिलीग्राम/एमएल tropicamide और 5 मिलीग्राम/एमएल phenylephrine हाइडरोक्लॉराइड के पुतले को चौड़ा करने के लिए गोलक के प्रत्येक तरफ । सामान्य संज्ञाहरण से पहले कम से कम 5 मिनट के लिए रुको ।
    नोट: सामान्य संज्ञाहरण के तहत पुतली फैली प्रतिवर्ती मोतियाबिंद जो बाद में माप को प्रभावित करता है के कारण होगा । हमेशा सामान्य संज्ञाहरण से पहले पुतली का विस्तार और कम से 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें । mydriatic एजेंट की एक बूंद (लगभग ०.०५ मिलीलीटर) माउस आंख की पुतली को चौड़ा करने के लिए पर्याप्त है, जबकि अधिक एजेंट निम्न चरणों में कोई नुकसान नहीं होगा ।
  2. सामांय संज्ञाहरण के तहत माउस रखो । माउस की पीठ त्वचा को धीरे से पकड़ अपनी आंख bumping से माउस रखने के लिए जब तक यह पूरी तरह से anaesthetized है । ंयायाधीश सामांय संज्ञाहरण की गहराई के लिए पर्याप्त है अगर माउस के आसपास जब यह मेज पर स्वतंत्र रूप से डाल दिया है कदम नहीं है ।
    नोट: मिदाजोलम का एक संयोजन (४० μg/100 μL), medetomidine (७.५ μg/100 μL) और butorphanol tartrate (५० μg/100 μL) की मात्रा के साथ चूहों के लिए सामान्य संज्ञाहरण के लिए यहाँ उपयोग किया जाता है ०.०१ मिलीलीटर/जी intraperitoneal इंजेक्शन । आम तौर पर, कम 5 मिनट की जरूरत है चूहों के लिए सो जाते हैं । सामान्य संज्ञाहरण के लंबे समय के कारण कम शरीर का तापमान और धीमी गति से दिल की धड़कन । माप करने के लिए सामान्य संज्ञाहरण के संभावित प्रभाव से बचने के लिए, संवेदनाहारी के इंजेक्शन के बाद 10 मिनट के भीतर सभी माप परिष्करण की सिफारिश की है. संवेदनाहारी कॉकटेल में प्रदान की butorphanol analgesia के लगभग 4 घंटे प्रदान करते हैं । सामांय संज्ञाहरण के लिए उचित नुस्खा संस्थानों द्वारा अलग हो सकता है ।
  3. एक अवरक्त photorefractor4,9,14का उपयोग कर माउस आंख के अपवर्तन को मापने । पुतले के केंद्र में पहली Purkinje छवि रखने के लिए और ऑप्टिकल अक्ष के साथ अपवर्तन को मापने के लिए माउस आंखों में से एक की दिशा को समायोजित करें । माप के बाद, एक ही प्रक्रिया (चित्रा 2a) के साथ विपरीत आँख को मापने.
    नोट: अपवर्तन के लिए मापा मान दृढ़ता से ऑप्टिक अक्ष के साथ माउस आंख की स्थिति से प्रभावित है । पहली Purkinje छवि सुनिश्चित करें कि शिष्य के केंद्र से ± 3 डिग्री के भीतर गठबंधन है । वर्णक्रमीय डोमेन ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (एसडी-OCT) प्रणाली के कार्यक्षेत्र अपवर्तन माप4में शिष्य की दिशा के ठीक ट्यूनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. एक एसडी OCT प्रणाली4,15,16का उपयोग माउस आंख के अल उपाय । corneal शिखर से ऑप्टिकल तंत्रिका (चित्रा बी) के पास प्रतिभाशाली सीमा तक की दूरी के रूप में अल परिभाषित करें ।
    नोट: अपवर्तन की माप के साथ इसी तरह, अल दृढ़ता से माउस आंख की दिशा से प्रभावित है । corneal शीर्ष बिंदु की तरह कॉर्निया की सतह पर प्रतिबिंब की पुष्टि की जा सकती है । रेटिना पक्ष की सीमा ऑप्टिकल तंत्रिका के बिंदु पर बहुत धुंधला हो जाएगा । सीमा को मापने के लिए काफी स्पष्ट है लेकिन बहुत दूर ऑप्टिकल तंत्रिका से नहीं जाने के लिए दिशा थोड़ा समायोजित करें ।

3. माउस Cranium पर फ्रेम का निर्धारण ।

  1. प्रत्येक आंख पर सूखापन को रोकने के लिए ०.१% शुद्ध सोडियम hyaluronate नेत्र ड्रॉप की एक बूंद लागू करें ।
    नोट: आंख की सतह पर आई ड्रॉप अपवर्तन और अक्षीय लंबाई माप के मूल्यों को प्रभावित करेगा । जब तक सभी माप किया जाता है संज्ञाहरण के बाद आँख ड्रॉप का उपयोग न करें ।
  2. एक मिट्टी या कुछ का बना ढलान पर anesthetized माउस के ठोड़ी रखो एक तकिया के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है cranium के अग्रिम विमान क्षैतिज हो ।
  3. बाल और कान और ७०% इथेनॉल के साथ कपास झाड़ू का उपयोग आंखों के बीच खोपड़ी निष्फल ।
  4. कान और आंखों के बीच त्वचा कट शल्य कैंची और चिमटी का उपयोग कर के बारे में ०.८ सेमी2 के लिए खोपड़ी बेनकाब करने के लिए । periosteum को दूर करने के लिए दंत नक़्क़ाशी तरल और कपास झाड़ू का प्रयोग करें । सर्जिकल कैंची और चिमटी प्रत्येक माउस की सर्जरी से पहले ७०% इथेनॉल के साथ निष्फल ।
    नोट: बाल कतरन और बाँझ दस्ताने पहनने की आवश्यकता हो सकती है ।  इस प्रक्रिया से पहले संबंधित पशु देखभाल समिति के प्रावधानों की जांच करें । ज्यादातर मामलों में, दंत नक़्क़ाशी तरल स्वयं का इलाज दंत चिपकने वाला सिस्टम में अनुलग्नकों में से एक के रूप में पाया जा सकता है । यदि दंत नक़्क़ाशी तरल उपलब्ध नहीं है, के बजाय ७०% इथेनॉल का उपयोग करें ।
  5. सही स्थिति पर छड़ी ठीक करने में मदद करने के लिए लेंस के बिना फ्रेम का एक सेट इकट्ठा । माउस सिर पर फ्रेम रखो । ध्यान से दोनों आंखें खाली फ्रेम के बीच में है सुनिश्चित करने के लिए फ्रेम की स्थिति को समायोजित करें ।
  6. एक स्वयं का इलाज चिकित्सकीय चिपकने वाला सिस्टम माउस सिर पर छड़ी संलग्न करने के लिए उपयोग करें । माउस आंख में पालन प्रणाली प्रवाह का तरल जाने के लिए नहीं सावधान रहना ।
    नोट: स्व-इलाज दंत चिपकने वाला सिस्टम का उपयोग करने के लिए विधि उत्पादों के बीच अलग है । अनुदेश को ध्यान से देखें ।
    चेतावनी: दंत चिपकने वाला प्रणाली में एजेंट के कुछ विषाक्त हो सकता है ।
  7. के बारे में 5 मिनट के लिए रुको और दूर ले फ्रेम और अखरोट ध्यान से छड़ी की स्थिति को बदलने के बिना (3 ए आंकड़ा) ।
  8. सुई ०.७५ मिलीग्राम/kg atipamezole हाइडरोक्लॉराइड intraperitoneally को संज्ञाहरण से उबरने के लिए माउस को और अधिक जल्दी मदद करते हैं । एक व्यक्ति के पिंजरे में माउस डाल जब तक पूरी तरह से बरामद । छोड़ माउस उपेक्षित जब तक यह पर्याप्त चेतना को फिर से प्राप्त किया है स्टर्नल recumbency बनाए रखने के लिए नहीं है । प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है ।

4. अदूरदर्शिता प्रेरण और रखरखाव के बाद की दीक्षा

  1. शल्य चिकित्सा के बाद कम से 24 घंटे के लिए प्रतीक्षा करने के लिए माउस संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक हो । छड़ी समझ और लेंस के साथ फ्रेम पर डाल दिया । प्रलोभन इस समय बिंदु (चित्र बी) में शुरू होता है ।
    नोट: संज्ञाहरण से वसूली के दौरान असुविधा को कम करने और coagulate करने के लिए दंत चिपकने वाला प्रणाली के लिए पर्याप्त समय दे, यह अत्यधिक पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद चूहों के बाद फ्रेम पर डाल करने के लिए सिफारिश की है. चिपकने वाला प्रणाली के राल सीमेंट पूरी तरह से खोपड़ी की कटौती को कवर किया जाएगा । इसलिए, कोई विशिष्ट शल्य चिकित्सा उपचार के बाद संक्रमण को रोकने और शल्य चिकित्सा दर्द को सुधारने के लिए आवश्यक है । सही फ्रेम पर डालने का पहला समय के बाद, चूहों लेंस के अस्तित्व के प्रति सचेत हो जाएगा और यह एक बहुत खरोंच । कुछ घंटों के बाद सकल व्यवहार वापस सामान्य हो जाएगा । लेंस के साथ चूहों को सामान्य चूहों को इसी घनत्व के साथ रखा जा सकता है.
  2. फ्रेम निकालें और लेंस की पारदर्शिता को बनाए रखने के लिए सप्ताह में कम से दो बार सूती झाड़ू के साथ लेंस और नख युक्तियों को साफ करें ।
    नोट: यह आवश्यक नहीं है हटाने और फ्रेम पर डालने के लिए संज्ञाहरण के तहत माउस डाल दिया । पर बैठने के लिए चूहों के लिए एक समर्थन प्रदान करते हैं, बजाय उन्हें लटका होने के साथ काम करते हुए उन्हें संकट को कम कर सकता है.
    1. यदि एक अंतरिम माप आवश्यक है, संज्ञाहरण के तहत माउस रखो और माउस को मापने के रूप में पहले वर्णित है । प्रलोभन के बाद जारी किया जा सकता है माउस संज्ञाहरण से उबरने ।
  3. सप्ताह में कम से दो बार पिंजरे को साफ करे ।
    नोट: यह लेंस स्पष्टता बनाए रखने के लिए मदद करते हैं । माउस और पिंजरे के नीचे के बीच एक शुद्ध डाल करने के लिए खाना स्क्रैप छानने का भी मददगार हो सकता है ।
  4. शरीर के वजन और सकल व्यवहार की निगरानी । पूरी प्रायोगिक प्रक्रिया के दौरान इसी उम्र से अछूते चूहों के साथ उनकी तुलना करें.
    नोट: कुछ खरोंच व्यवहार के अलावा, शरीर के वजन सहित कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन अनुपचारित चूहों के साथ प्रयोग चूहों के बीच पाया जाता है ।

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Representative Results

सबसे पहले, अगर सभी आवश्यक भागों तैयार कर रहे है की जांच करें (आंकड़ा 1a) । इकट्ठे चश्मा का एक टुकड़ा का एक उदाहरण चित्रा 1bमें दिखाया गया है । फ्रेम और अखरोट के मुख्य शरीर के अलावा, अंय सभी भागों प्रत्येक माउस के लिए प्रयोज्य हैं । पूरा चश्मा का एक सेट चित्रा 1cमें दिखाया गया है । माउस को विभिंन युगों के साथ फ़िट करने के लिए दो फ़्रेम के बीच का कोण बदलें ।

अपवर्तन मापन का एक उदाहरण आरेख 2aमें दिखाया गया है. यह एक माउस p21 से शुरू 3 सप्ताह के लिए एक-30 डी लेंस से प्रेरित नजर है । ध्यान दें कि टकटकी दोनों एक्स और वाई धुरी जिसका अर्थ है कि माउस9कैमरे के सामने सही देख रहा है में 0 डिग्री के करीब नियंत्रित किया जाएगा । चित्रा बी एक पूरी आंख एक एसडी OCT प्रणाली चूहों और आंख के प्रत्येक भाग की परिभाषा के लिए देखते द्वारा उठाए गए छवि का एक उदाहरण से पता चलता है । आम तौर पर, एसडी-OCT सिस्टम वर्तमान वास्तविक मापा मूल्य सीधे ।

माउस सिर करने के लिए पालन छड़ी की एक छवि 3ए में दिखाया गया है । कट की सीमा से कम 3 मिमी होना चाहिए आंख से दूर पलक के समारोह को प्रभावित करने से बचने के लिए । छड़ी प्रलोभन के अंत तक माउस सिर पर रहता है और चश्मा ठीक करने के लिए नींव प्रदान करता है । दंत चिपकने वाला प्रणाली के चिपकने वाला शक्ति के बारे में 3 से 4 सप्ताह के लिए पूरे प्रयोग के दौरान चश्मा के निर्धारण के लिए पर्याप्त माना जाता है । चित्रमें दिखाए गए अनुसार चश्मा असेंबल । चश्मा के दो टुकड़े काफी सममित होना चाहिए ।

Presentative परिणाम चित्रा 4में दिखाया गया है । इस प्रयोग में, 0 डी plano लेंस आंतरिक नियंत्रण और-30 डी लेंस के रूप में बाईं आंखों के सामने तय की थी सही आंख के सामने ठीक से दृष्टि प्रेरित (C57B6/जे चूहों, प्रलोभन p21 से शुरू किया गया, n = 4) । अपवर्तन और ALs तीन सप्ताह के लिए प्रलोभन की शुरुआत के बाद एक सप्ताह में एक बार मापा गया । 0 डी plano लेंस के साथ तुलना में,-30 डी दोनों अपवर्तन और अल में एक मजबूत कमबीन बदलाव प्रेरित किया । अपवर्तन का परिवर्तन पहले सप्ताह में शिखर पर पहुँच गया और निम्न दो सप्ताह के लिए सपाट रहने लगा. अल में कमबीन आंखें और नियंत्रण आंखों के परिवर्तन के बीच का अंतर पहले सप्ताह से महत्वपूर्ण था और बड़ा हो गया और निंनलिखित दो हफ्तों में बड़ा ।

Figure 1
चित्रा 1: खोपड़ी घुड़सवार चश्मा का डिजाइन । (क) सभी भागों माउस चश्मा कोडांतरण के लिए आवश्यक है । (ख) फ्रेम की स्थिति का एक उदाहरण और आँख के दाईं ओर के लिए कील टिप. (ग) इकट्ठे चश्मे के एक सेट का एक उदाहरण । विभिन्न युगों में चूहों के लिए फिट करने के लिए फ्रेम का कोण बदलने के लिए संयुक्त भाग को समायोजित करें । यह आंकड़ा जियांग, एक्स एट अल4, एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण ४.० अंतरराष्ट्रीय लाइसेंस के तहत उपलब्ध से संशोधित किया गया है । http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: अपवर्तन और अल के माप का नमूना छवियों । (क) एक कमबीन आंख के लिए अपवर्तन माप की एक छवि एक अवरक्त photorefractor का उपयोग कर । (ख) एक एसडी-OCT प्रणाली और आंख गेंद के प्रत्येक भाग की परिभाषा का उपयोग कर माउस आंख के एक अल माप का एक नमूना छवि । यह आंकड़ा जियांग, एक्स एट अल4, एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण ४.० अंतरराष्ट्रीय लाइसेंस के तहत उपलब्ध से संशोधित किया गया है । http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सर्जरी के बाद एक माउस की एक छवि । (एक) छड़ी का पालन करने के लिए सर्जरी के बाद एक माउस का एक उदाहरण । (ख) दोनों पक्षों में चश्मा के साथ एक चूहा । यह आंकड़ा जियांग, एक्स एट अल4, एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण ४.० अंतरराष्ट्रीय लाइसेंस के तहत उपलब्ध से संशोधित किया गया है । http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक तीन सप्ताह का पालन के Presentative परिणाम-निकट दृष्टि प्रलोभन चार चूहों में-30 डी लेंस और आंतरिक नियंत्रण के रूप में 0 डी लेंस का उपयोग कर । (क) तीन सप्ताह के लिए अपवर्तन का परिवर्तन. प्रलोभन के एक सप्ताह बाद अचानक परिवर्तन देखा जा सकता है । (ख) इसके विपरीत, अल में परिवर्तन अपेक्षाकृत हल्के थे । तारांकन चिह्न ने प्रत्येक सप्ताह में क्रमशः 0 d और-30 d लेंस पहने हुए आंखों के बीच सांख्यिकीय महत्व दिखाया । *p < ०.०५, * *p < ०.०१. छात्र टी-टेस्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: चूहों में अदूरदर्शिता उत्प्रेरण के लिए अनुशंसित फ़्लोचार्ट. फ़्लोचार्ट यहां दिखाया चूहों में अदूरदर्शिता उत्प्रेरण के लिए एक संभव पैटर्न का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

सुनिश्चित करें कि चश्मा माउस सिर पर छुरा तय किया जा करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में कई कदम बहुत ध्यान दिया जाना चाहिए । periosteum पूरी तरह से दंत चिपकने वाला प्रणाली का उपयोग करने से पहले हटा दिया जाना चाहिए । खोपड़ी पर खून की भी देखभाल के साथ-साथ सफाई की जरूरत होती है । जबकि एक छोटे से ठीक ट्यूनिंग चिपकने वाला के आवेदन के बाद स्वीकार्य सही है, चिपकने वाला सिस्टम शुष्क करने से पहले अक्सर छड़ी कदम नहीं है । सावधानी से चिपकने वाली प्रणाली के अनुदेश का पालन करें, विशेष रूप से अंतिम मिश्रण के प्रत्येक घटक का अनुपात । जब चश्मा या सर्जरी के बाद अनुवर्ती माप के रखरखाव के दौरान माउस समझ, एक साथ माउस के शरीर के साथ छड़ी समझ में नहीं है । खोपड़ी और छड़ी के बीच रिश्तेदार आंदोलन छड़ी के नीचे छोड़ने का सबसे लगातार कारण है । उचित सर्जरी और लोभी कौशल के साथ, व्यक्तियों की संख्या है कि छड़ी नीचे ड्रॉप एक 3 में से कम होगा 20 व्यक्तियों सहित सप्ताह के प्रयोग ।

बाल और खाद्य स्क्रैप आंख और लेंस के बीच अंतराल में फिसल सकता है । यह केवल लेंस की पारदर्शिता को प्रभावित नहीं करेगा, लेकिन यह भी संभावित कॉर्निया सतह शारीरिक रूप से नुकसान । लेंस की पारदर्शिता रखने के लिए, प्रत्येक सप्ताह सफाई के कम से दो बार आवश्यक हैं । यह भी चूहों कॉर्निया के लिए जटिलताओं की घटनाओं को कम करने के लिए चेहरे को संवारने का मौका दे देंगे । फ्रेम और त्वचा के बीच के बारे में 1 मिमी के लिए एक जगह छोड़ने के लिए माउस झपकी अनुमति देते हैं । फ्रेम यह मुश्किल चूहों के लिए ऊपर ग्रिड के माध्यम से पिंजरे के बाहर भोजन तक पहुंचने के लिए कर सकते हैं । इसलिए, यह सीधे पिंजरे के फर्श पर खाना डाल करने के लिए सिफारिश की है । के बारे में दो बार एक सप्ताह के लिए साफ एक में पिंजरे भी लेंस साफ रखने में मदद मिलेगी बदल जाते हैं । गंदा लेंस फार्म-अभाव तंत्र के माध्यम से निकट दृष्टि उत्प्रेरण विसारक बन जाते हैं । यह डेटा विषम और परिणाम के बाद से सबूतों से पता चला कि FDM और लिम एटियलजि3में अलग मॉडल सिस्टम है व्याख्या करने के लिए कठिन हो सकता है ।

माउस आंख के छोटे आकार के कारण, मापा आंख मापदंडों अस्थिर हो जाते हैं । हम refraction माप के लिए डॉ Schaeffel द्वारा विकसित अवरक्त photorefractor की सिफारिश9 और अल4 के लिए एक SDOCT प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें). दोनों प्रणालियों मापा मूल्य की विश्वसनीयता को पहचानने के लिए पर्याप्त जानकारी मौजूद माप की पुनरावृत्ति सुनिश्चित करने के लिए । अपवर्तन के लिए, पिछली रिपोर्टों में तर्क के रूप में, इस पर माप को बनाए रखने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है-अक्ष4,14. 3 डिग्री ± के भीतर टकटकी नियंत्रण रखते हुए स्थिर परिणाम प्राप्त कर सका । इस सटीक माप को प्राप्त करने के लिए, SDOCT प्रणाली की ट्यूब उपयोगी हो सकता है जब माउस आंख की दिशा tweaking. अल माप के लिए, corneal शिखर पर परिलक्षित प्रकाश और ऑप्टिकल तंत्रिका के पास प्रतिभाशाली सीमा दो विश्वसनीय संरचनात्मक निशान है कि इस माप की पुनरावृत्ति सुनिश्चित कर रहे हैं ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक सप्ताह के भीतर चूहों में महत्वपूर्ण कमबीन राज्यों प्रेरित किया । हालांकि तंत्र अभी भी अज्ञात है, अपवर्तन और अल में परिवर्तन जरूरी समानांतर नहीं हैं । चूंकि अल एक सप्ताह के बाद कमबीन बढ़ रखा है, हम अनुशंसा करते है कि कुल में तीन बार किया जा करने के लिए माप: से पहले, एक सप्ताह और तीन सप्ताह के बाद प्रलोभन । दृष्टि प्रेरण के लिए उदाहरण फ़्लोचार्ट्स में से एक चित्रा 5में दिखाया गया है । पिछले रिपोर्ट4के आधार पर, p21 से शुरू करने और प्रयोग-30 डी लेंस लिम के लिए सिफारिश कर रहे हैं । प्रयोगों के लिए पिछले पर 4 सप्ताह गंभीर कॉर्निया जटिलताओं की उच्च घटना हो सकता है कि मापा मूल्य को प्रभावित और लेंस की खपत में तेजी लाने के . सबसे लगातार जटिलता corneal scarring है । चूहे फ्रेम पहने अपने चेहरे और पलकें साफ नहीं कर सकते, जो जटिलता के लिए कारण हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित उपकरण प्रातः (p21) के ठीक बाद चूहों पर लागू किया जा सकता है. यह आंशिक रूप से मजबूत phenotype4मनाया करने के लिए योगदान कर सकते हैं । फ्रेम सामान्य संज्ञाहरण के बिना हटाने योग्य है । इससे न केवल शोधकर्ता आसानी से लेंस को साफ कर सकते हैं, बल्कि सामयिक दवा वितरण को भी संभव बना देते हैं4. एक और ताकत है कि लेंस आसानी से विसारक या विभिंन diopters के साथ लेंस में बदल सकता है (जैसे, प्लस लेंस), जो इस विधि की संभावनाओं को बढ़ाता है । इस विधि की एक सीमा है कि सर्जरी के कुछ अभ्यास की जरूरत से पहले फ्रेम पूरे प्रयोग के लिए छुरा का पालन किया जा सकता है । माप भी धैर्य की जरूरत है विश्वसनीय डेटा इकट्ठा ।

चूहों आनुवंशिक हेरफेर की संभावना है और प्रजनन के लिए कम लागत के साथ अपूरणीय पशु मॉडल हैं । हमें उंमीद है कि प्रोटोकॉल यहां वर्णित चूहों में प्रयोगात्मक अदूरदर्शिता दृष्टि अनुसंधान के लिए एक और अधिक व्यावहारिक मॉडल बना सकता है ।

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Disclosures

माउस ताल के डिजाइन एक पेटेंट (आवेदन no. २०१७४१३४९) के लिए आवेदन किया गया है ।

Acknowledgments

हम M.T. परड़े पर सलाह के लिए SDOCT, F. Schaeffel पर सलाह के लिए धंयवाद अपवर्तन और corneal वक्रता के मापन के लिए, श्री Sanshouo तीन आयामी फ्रेम डेटा, M. Miyauchi पुनः बनाने के लिए; K. Tsubota; Y. तनाका; एस. कोंदो; C. ्ोडा; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. Hagiwara; A. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; ड. Yotsukura; K. ताकाहाशी; और महत्वपूर्ण चर्चाओं के लिए वाई. वांग. यह काम शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी (MEXT) टी के मंत्रालय से वैज्ञानिक अनुसंधान (KAKENHI, संख्या 15K10881) के लिए अनुदान inAid द्वारा समर्थित किया गया था । यह काम भी Tsubota प्रयोगशाला, Inc (टोक्यो जापान) से निकट दृष्टि अनुसंधान के लिए अनुदान द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
screw NBK SNZS-M1.4-10
washer MonotaRO 42166397
nut MonotaRO 42214243
stick DMM Make none designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame DMM Make none designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses RAINBOW CONTACT LENS none customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue OK MODEL MP 20g
dental adhesive resin cement SUN MEDICAL super bond contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor Steinbeis Transfer Center none designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT Leica R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution Santen Mydrin-P
midazolam Sandoz K.K. SANDOZ components for the anesthetic
medetomidine  Orion Corporation Domitor components for the anesthetic
butorphanol tartrate  Meiji Seika Pharma Vetorphale components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate Santen Hyalein
atipamezole hydrochloride Zenoaq antisedan

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४३ अदूरदर्शिता माउस कार्यप्रणाली पशु मॉडल तंत्रिका विज्ञान औषधि प्रशासन
प्रलोभन और प्रायोगिक अदूरदर्शिता के एक Murine मॉडल का मूल्यांकन
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Jiang, X., Kurihara, T., Ikeda, S.… More

Jiang, X., Kurihara, T., Ikeda, S. i., Kunimi, H., Mori, K., Torii, H., Tsubota, K. Inducement and Evaluation of a Murine Model of Experimental Myopia. J. Vis. Exp. (143), e58822, doi:10.3791/58822 (2019).

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