Summary
Bu protokol için deneysel miyopi yeni tasarlanmış teşvik kullanarak farelerde gözlük ve oküler parametre ölçümlerde istikrarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmesi için gerekli teknik tam işlemi açıklar.
Abstract
Miyopi fare modeli nispeten kolay genetik manipülasyon nedeniyle miyopi araştırma için güçlü bir araç olabilir. Miyopi hayvanlarda ikna etmek için bir yolu açık lensler gözlerinin önünde eksi hafta (miyopi, objektif kaynaklı LIM) koymaktır. Ancak, teşvik ve değerlendirme için kaybolmamış protokolleri Laboratuvar Laboratuvar değişiklik gösterir. Burada, yeni tasarlanmış LIM kullanarak farelerde gözlük ikna etmek için son derece pratik ve tekrarlanabilir bir yöntemi açıklanmıştır. Stabil fare göz önünde objektif lens temizleme veya topikal alınan sağlar yöntemi düzeltmeleri yönetim uyuşturucu. Fenotip sağlam ve verimli ve varyans küçüktür. Burada açıklanan yöntemi fareler için doğru olan deneyler için olası süresini uzatır sütten sonra uygulanabilir. Biz de verdi teknik danışmanlık kırılma ve Aksiyel uzunluk ölçüleri tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmesi için. Biz burada anlatılan adım adım Protokolü umut ve ayrıntılı makale araştırmacı miyopi deneyler miyopi ile daha düzgün gerçekleştirmek ve verileri laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilir yapmak yardımcı olabilir.
Introduction
Miyopi yaygınlığı son zamanlarda önemli ölçüde artmıştır, onun başlangıçlı ve ilerleme mekanizması iken hala büyük ölçüde1bilinmeyen. Miyopi en karakteristik fenotip Retina komplikasyonları veya bile körlüğü2riskini artırır Aksiyel uzunluğu (AL), uzama var. Daha iyi anlamak miyopi patogenezi ve etkili tedavileri geliştirmek için sağlam miyop hayvan modelleri ve istikrarlı fenotip değerlendirme gereklidir.
Kısaca, hayvanlarda miyop Birleşik inducing için iki yöntem var: form-yoksunluğu miyopi (FDM) ve objektif kaynaklı miyopi (LIM)3. Eski difüzörler göz önünde yerleştirir veya bir miyop fenotip kaynaklanan göz küresi, normal gelişimini etkiler görüntü gizlemek için göz kapağı tasarlamak. Lensler odak noktasının retinanın arkasında taşımak için göz önünde eksi ikinci yerler. Retina odak kayması algılar ve retina ve odak noktası yeniden hizalamak için göz küresi uzatıyor. FDM için göz kapağı kapalı veya difüzör göz önünde sabit sonra daha da neredeyse hiç bakım gereklidir. LIM için lens şeffaf tutmak için temizlik için alınması gerekir. Böylece, FDM Teknik olarak indüklenen nispeten kolaydır. Ancak, FDM ve LIM mekanizmaları farklıdır ve hangi yöntemi taklit eden insan miyopi daha iyi hala tartışma3altında. FDM ile en az olması durumunda fareler4kıyasla daha güçlü fenotip LIM güçlerinden biri.
Miyopi inducing için kullanılan hayvan kızlar5, maymunlar6, ağaç shrews7, eskiden şiling şimdi pigs8ve fareler4içerir. Genetik manipülasyon, bol kullanılabilir antikorlar ve ıslahı için düşük maliyet olasılığı göz önüne alındığında, fareler miyopi hayvan modeli olarak ilk seçenek olabilirdi. Ancak, diğer daha büyük hayvanlar ile karşılaştırıldığında, lens veya fare göz önünde difüzörler sabitleme sütten sonra nispeten hakkı gibi genç fareler için özellikle zordur. Topikal ilaç idaresi ya da birden fazla geçici göz ölçümleri ihtiyacınız deneyler için çerçeve çıkarılabilir olmak için de gereklidir. Başka bir sorun sofistike teknik ve değerlendirmek için aygıtları ihtiyacı fare göz küresi küçük morfolojik değişimdir. Bugüne kadar farklı inducing ve farklı araştırma ekipleri içinde kullanılan iletişim kurallarını ölçme karşılaştırmak ve sonuçları laboratuvarlar arasında yinelemek zorlaştırıyorsun. Detayları ile standart bir protokol gereklidir.
Önceki çalışır lens veya difüzörler910 ve başa takılan koruyucu gözlük çerçeve11,12dikiş, yapıştırma gibi fare göz önünde düzeltmek için birden çok yöntem nitelendirdi. EXIST başa takılan gözlüğü teknikleri11,12,13 sağlam ve verimli deneysel miyopi farelerde inducing için ameliorated bir protokol geliştirmek için bizim yeni tasarlanmış çerçeve ile birlikte. Protokol yakında Doğum sonrası gün 21 (p21) sütten sonra genç fareler için uygulanabilir. Biz de işlemleri kırılma ve AL dahil fenotipleri kararlı ve hassas değerlendirilmesi için optimize. Umarız bu standart protokolü miyop fareler miyopi araştırma için daha kolay erişilebilir bir model yapmak için yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları hayvan araştırma Keio Üniversitesi Tıp Fakültesi, Etik Komitesi tarafından onaylanmış ARVO kullanım hayvan Ophthalmic ve vizyon araştırma, hayvan deney Keio, kurumsal yönergeler için bildirime Üniversite ve hayvan araştırma: araştırma hayvanlarda kullanımı için raporlama, In Vivo deneyler (varış) kuralları.
1. montaj gözlük fareler için
- Gözlük (Şekil 1a) montajı için gerekli parçaları hazırlayın. Tüm aşağıdaki her fare için hazırlamak: bir başa takılan naylon sopa, bir daha yüksek ve bir alt titanyum çerçeve, deneme, bir M1.4 boyutu vida 10 mm uzunluğunda, M1.4 boyutu vida için bir somun, bir düz amacı göre uygun güçleri olan iki lens M1.4 boyutu vida ile 0.3 mm kalınlık için yıkayıcı ve iki yapay tırnak ipuçları (Malzemeler tablo).
Not: İki tür çerçeveleri ile farklı yükseklikte mevcut. Bir fare için bir daha yüksek kare ve bir alt çerçeve kümesi olarak kullanılır. Daha yüksek çerçeveler yukarıda daha düşük olanlar vizyon alanları simetrik yapmak için koymak gerekir. Çerçeveleri ve lensler özel olarak tasarlanmış ve yazarın araştırma grubu tarafından üretilmiştir. Bu karşılık gelen yazarlar bu makalenin irtibata geçerek mevcuttur. Diğer parçaları perakende aracı mağazalar bulunabilir. - Sağ ve sol göz için çerçeve ayrı ayrı bir araya getirin.
- En iyi koruyucu etkiyi elde etmek için dış yönde yüz için tırnak ucu düzenlemek. Tırnak ucu ve fare görme alanı (Şekil 1b) maskeleme önlemek için yaklaşık 130 ° olmak çerçeve arasındaki açıyı ayarlayın. Yapay tırnak ipuçları siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak çerçeveye uygun.
Not: Tırnak ipuçları objektif fare tarafından çizilmesini korunmasına yardımcı olabilir. Tırnak ipuçları yönünü ters olması gerekir çünkü daha yüksek kare ve daha düşük kare sağ göz ve sol göz için sırasıyla kullanılır. - En az 12 h sonra kullanın tırnak şeklini ayarlamak için bir tırnak makası kurumasını yapıştırıcı izin vermek için bekleyin 1 cm × 1 cm hakkında kesme ve kırpma için ipuçları.
- Objektifin siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak çerçeveye uygun. El ile çerçeve objektif koyun ve çerçeve yatay tutun. Objektif kenarından siyanoakrilat yapıştırıcı enjekte ve yüzey gerilimi tarafından yapışkan yayılmasına izin.
Not: Yapışkan objektif sarsmak ve onun şeffaflık etkisi, böylece yapıştırıcı sadece lens periferik parçası dokunur emin olun. 0 diyoptri (D) plano lens miyopi ikna etmek için objektif eksi ve denetimi olarak kullanabilirsiniz. Lensler (–50 D –10 D) eksi farklı güçlerin etkisi oldu başka bir bölümünde4. Miyopi rüşvet en üst düzeye çıkarmak için –30 D lens miyopi inducing için tavsiye edilir. FDM da 1.5 mL microtube difüzör olarak kap içine sadece objektif değiştirerek aynı cihazla indüklenen.
- En iyi koruyucu etkiyi elde etmek için dış yönde yüz için tırnak ucu düzenlemek. Tırnak ucu ve fare görme alanı (Şekil 1b) maskeleme önlemek için yaklaşık 130 ° olmak çerçeve arasındaki açıyı ayarlayın. Yapay tırnak ipuçları siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak çerçeveye uygun.
- Naylon sopa ile birlikte yıkayıcı sopa düz tarafındaki içine sıkıştırın. Gözlükleri ve sopa deneyin önce sırasıyla hazırlamak ve daha fazla kullanım için (resim 1 c) stok.
Not: Protokol burada duraklatılmış.
2. kırılma ve AL temel ölçümleri.
- 5 mg/mL tropicamide ve göz küresi her tarafında 5 mg/mL phenylephrine hidroklorür içeren mydriatic Ajan öğrenci dilate bir damla uygulanır. En az 5 dk önce genel anestezi için bekleyin.
Not: Genel altında öğrenci Dilate anestezi daha sonra ölçüm etkileyen tersinir katarakt neden olur. Her zaman daha önce genel anestezi öğrenci dilate ve en az 5 dakika bekleyin. Bir damla (yaklaşık 0.05 mL) mydriatic aracı daha fazla ajan aşağıdaki adımları için hiçbir zarar vermez iken fare gözün gözbebeği genişledi yeter. - Genel anestezi altında fare koymak. Fareyi yavaşça fare tamamen anaesthetized kadar onun göz darbeleme tutmak için arka cilt kavramak. Eğer serbestçe masaya konur zaman fareyi hareket değil var olmak yeterli için genel anestezi derinliği Yargıç.
Not: Midazolam (40 μg/100 μL), medetomidine (7,5 μg/100 μL) ve butorphanol tartarat (50 μg/100 μL) bir arada burada 0,01 mL/g mayi enjeksiyon hacmi ile fareler için genel anestezi kullanılıyor. Genel olarak, daha az 5 dk fareler için uykuya ihtiyaç vardır. Genel anestezi uzun süre düşük vücut sıcaklığı ve yavaş kalp atışı neden olur. 10 dakika içinde tüm ölçümler anestezik enjeksiyon sonra kaplama ölçüm için genel anestezi potansiyel etkisini önlemek için önerilir. Anestezik kokteyl sağlanan butorphanol yaklaşık 4 saat analjezi sağlar. Genel anestezi için doğru tarifi kurumlar tarafından farklı olabilir. - Bir kızılötesi photorefractor4,9,14kullanarak fare göz kırılma ölçmek. Bir fare gözlerini ilk Purkinje görüntü öğrenci Merkezi'nde tutmak ve optik eksen boyunca kırılma ölçmek için yönünü ayarlayın. Ölçüm sonra aynı işlemleri (Şekil 2a) ters gözle ölçmek.
Not: kırılma için ölçülen değer güçlü optik eksen boyunca fare göz konumunu etkilenmiştir. İlk Purkinje görüntü öğrenci Merkezi'nden ±3 derece içinde uyumlu olduğunu emin olun. Spektral alan optik koherens tomografi (SD-Ekim) sistemi tezgah kırılma ölçümleri4öğrenci yönünü ince ayar için kullanılabilir. - Bir SD-Ekim sistemi4,15,16kullanarak fare göz AL ölçmek. Yapay kornea izdüşümü olan uzaklığı en parlak sınırına yakın optik sinir (Şekil 2b) tanımlamak için kullanılır.
Not: Kırılma ölçümü ile benzer, AL güçlü fare göz yönüne göre etkilenir. Kornea vertex kornea yüzeyi noktası gibi yansıma tarafından onaylanabilir. Retina yan sınır noktasında optik sinir çok puslu olacak. Yönünü ölçmek için yeterince açık ama çok uzak olmayan optik sinir olmak sınır izin için biraz ayarlayın.
3. fare kafatası üzerine çerçeve fiksasyonu.
- Bir damla %0,1 saf sodyum hyaluronate göz damla kuruluk her göze önlemek için geçerlidir.
Not: Damla göz yüzeyi kırılma ve Aksiyel uzunluk ölçüm değerleri etkiler. Tüm ölçümler yapılır kadar damla sonra anestezi kullanmayın. - Çene imzalat fare topraktan yapılmış bir yamaç koymak ya da bir şey kafatasının ayarlıyoruz uçağa yetişmek için bir yastık yatay olarak kullanılabilir.
- Saç sterilize ve kulakları ve gözleri % 70 etanol ile pamuk bez kullanarak arasında kafa derisi.
- Kulakları ve gözleri için kafatası cerrahi makas ve cımbız kullanarak 0.8 cm2 hakkında ortaya çıkarmak için arasında deriyi kesme. Diş gravür sıvı ve pamuklu çubukla kapaklarini kaldırmak için kullanın. Cerrahi makas ve cımbız ile % 70 etanol her fare ameliyattan önce sterilize.
Not: saç kırpma ve steril eldiven giymiş gerekli olabilir. Daha önce bu yordamı ilgili hayvan bakımı Komitesi hükümleri kontrol edin. Çoğu durumda, diş gravür sıvı ekleri biri olarak kendi kendine tedavi diş yapışkanlı sisteminde bulunabilir. % 70 etanol diş gravür sıvı yoksa, bunun yerine kullanın. - Bir dizi kare sopa doğru pozisyon çözülmesine yardımcı olmak için lens olmadan bir araya getirin. Çerçeveleri fare başının koy. Dikkatli bir şekilde her iki gözde boş çerçevenin ortasında olduğundan emin olmak için çerçeveler konumunu ayarlamak.
- Diş yapışkanlı sistem kendi kendini tedavi üzerine fare kafa sopanın bağlamak için kullanın. Uyun sistem akış fare göz içine sıvı bırakmamaya dikkat et.
Not: kendi kendine tedavi diş yapışkanlı sistemi kullanma yöntemi ürünler arasında farklıdır. Belgili tanımlık öğretim dikkatli bakın.
Uyarı: Bazı reaktifleri diş yapışkanlı sisteminde toksik olabilir. - Yaklaşık 5 dakika bekleyin ve çerçeve ve fındık dikkatle sopa (Şekil 3a) konumunu değiştirmeden almak.
- İntraperitoneally fare kurtarma anestezi daha hızlı bir şekilde yardım için 0.75 mg/kg atipamezole hidroklorid enjekte. Fare kadar tamamen iyileşti bireysel bir kafesin içine koymak. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar fareyi sahipsiz bırakmayın. Protokol burada duraklatılmış.
4. miyopi indüksiyon ve daha sonra bakım inisiyasyon
- Anesteziden tamamen kurtarmak fare izin için ameliyattan sonra en az 24 saat bekleyin. Sopa kavramak ve lensler ile çerçeve koymak. Rüşvet vasıl bu zaman nokta (Şekil 3b) başlar.
Not: anestezi kurtarma sırasında rahatsızlık en aza indirmek ve koagüle diş yapışkanlı sistem için yeterli zaman vermek için fareler tam anesteziden kurtarıldı sonra çerçeve üzerinde koymak için önerilir. Reçine çimento yapışkanlı sisteminin tam kafa derisi kesilmiş kapsar. Bu nedenle, hiçbir belirli sonrası cerrahi tedavi bulaşmasını önleme ve ameliyat sonrası ağrı ameliorating için gereklidir. Çerçeve üzerinde koyarak hemen sonra ilk kez, fareler bilinçli objektif varlığını sona erecek ve çok bir çizik. Brüt davranış olacaktır geri normale birkaç saat sonra. Lensler ile fare ile aynı yoğunluğu normal farelere tutulabilir. - Çerçeve çıkarın ve lensler ve tırnak ipuçları pamuk temizleme bezi ile haftada iki kez objektif şeffaflığı korumak için en az temizleyin.
Not: Kaldırma ve çerçeveyi yerleştirme için anestezi altında fare koymak gerek yoktur. Onları onlarla çalışma sıkıntı azaltmak olabilir iken asmak yerine oturmak fareler için bir destek sağlar.- Geçici bir ölçüm gerekli ise, anestezi altında fare koymak ve daha önce açıklandığı gibi fare ölçün. Rüşvet anesteziden kurtarma fare sonra devam edilebilir.
- Kafes haftada en az temizleyin.
Not: Bu yardım objektifin netliği koruyun. Fare ve gıda artıkları filtrate için kafes alt arasında net koyarak da yararlı olabilir. - Vücut ağırlığı ve brüt davranış izleyin. Onlarla aynı bütün deneysel işlemi sırasında el değmemiş fareler yaş karşılaştırın.
Not: tırmalamak bazı davranışları hariç, vücut ağırlığı dahil olmak üzere hiçbir önemli değişiklik tedavi edilmezse fareler ile deney fareler arasında bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk olarak, gerekli parçalar (Şekil 1a) hazırlanan denetleyin. Bir parça monte gözlük örneği Şekil 1badımında gösterilir. Çerçeveleri ve fındık ana gövdesini hariç, diğer tüm bölümleri için her fare kullanılıp atılır. Tamamlanan gözlük bir dizi resim 1 cile gösterilir. Fare ile farklı yaş sığdırmak için iki kare arasındaki açıyı değiştirmek.
Kırılma ölçümü örneği Şekil 2agösterilir. 3 hafta boyunca p21 başlayan bir-30 D lens tarafından indüklenen fare gözdür. Not bakışları fare9kamera önünde görme anlamına gelir x ve y ekseni 0 derece yakın kontrol. Şekil 2b fareler ve göz her bölümü tanımı için ayarlanmış bir SD-Ekim sistemi tarafından alınan tüm göz görüntü bir örneği gösterilir. Genel olarak, SD-Ekim sistemleri doğrudan gerçek ölçülen değeri mevcut.
Görüntüyü sopa head Şekil 3aiçinde gösterilen fare yapıştırılır. Kesme sınırı en az 3 mm göz kapağı işlevi etkileyen önlemek için göz uzak olmalıdır. Sopa fare kafasına rüşvet sonuna kadar kalır ve gözlük düzeltmek için temel oluşturur. Diş yapışkanlı sistem yapıştırıcı gücü yetecek kadar gözlük fiksasyon yaklaşık 3-4 hafta bütün deneyin sırasında olması gerekiyordu. Gözlük Şekil 3b' gösterildiği gibi bir araya getirin. İki adet gözlük oldukça simetrik olmalıdır.
Presentative sonuçları Şekil 4' te gösterilmiştir. Bu deneyde, iç kontrol olarak sol gözlerinin önünde 0 D plano lensler tespit edildi ve -30 D lens miyopi ikna etmek için sağ gözü önünde sabit (C57B6/J fareler, rüşvet p21, n başladı = 4). Kırılmalar ve ALs haftada üç haftadır rüşvet başında sonra ölçüldü. 0 D plano lensler ile karşılaştırıldığında,-30 D kırılma ve AL güçlü bir miyop kayma indüklenen. Kırılma değişimin ilk haftasında zirveye ve aşağıdaki iki hafta boyunca düz kaldı. AL miyop gözlerini değişikliği ve denetim gözler arasındaki farkı ilk haftadan çok önemliydi ve aşağıdaki iki hafta içinde daha büyük ve daha büyük oldu.
Şekil 1: kafatası monte gözlük tasarımını. (bir) tüm parçaları fare gözlük montajı için gerekli. (b) çerçeve ve çivi konumunu örneği göz sağ tarafında için ipucu. (c) monte gözlük bir dizi örneği. Fareler için farklı yaşlarda uyacak çerçeve açısını değiştirmek için ortak bölümü ayarlayın. Bu rakam Jiang, ark4, bir Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisansı altında kullanılabilir X. değiştirildi. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: örnek görüntüleri kırılma ve ark. ölçüm (bir) kırılma ölçümü için kızılötesi bir photorefractor kullanarak bir miyop göz görüntüsünü. (b) A örnek görüntü SD-Ekim sistemi ve göz topu her parçası tanımını kullanarak fare göz bir AL ölçüm. Bu rakam Jiang, ark4, bir Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisansı altında kullanılabilir X. değiştirildi. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: ameliyattan sonra bir fare görüntüsünü. (bir) bir örnek bir fare sopa kalarak için ameliyattan sonra. (b) bir fare ile her iki taraf içinde gözlük. Bu rakam Jiang, ark4, bir Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisansı altında kullanılabilir X. değiştirildi. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: miyopi rüşvet iç kontrol-30 D lens ve 0 D lensler kullanarak dört farelerde, üç haftalık takip Presentative sonuçları. (bir) değişiklikleri kırılmalar üç haftadır. Ani bir değişiklik bir hafta sonra rüşvet görülebilir. Buna ek olarak, (b) değişiklikleri AL için nispeten hafif. Yıldız işaretleri her hafta içinde sırasıyla 0 D ve -30 D lens takmış gözler arasında istatistiksel anlamlar gösterdi. p < 0,05, **p < 0,01. Öğrenci t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: miyopi farelerde inducing için akış çizelgesi önerilir. Burada ortaya akış çizelgesi miyopi farelerde inducing için olası bir desen temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stabil fare kafasına düzeltilmesi için gözlük emin olmak için bu iletişim kuralı birkaç adımda büyük ilgi ödenmesi gerekir. Diş yapışkanlı sistemi kullanmadan önce kapaklarini tamamen kaldırılması gerekir. Kafatası kan da özenle temizlenmesi gerekiyor. Biraz ince ayar şu yapışkan uygulama sonra kabul edilebilir olsa da, sopa Kapa çeneni yapışkanlı sistem önce sık sık hareket ettirmeyin. İzlemek belgili tanımlık öğretim yapışkanlı sisteminin dikkatle, özellikle oranı her bileşenin son karışımı. Ne zaman fare kavramak gözlük veya ameliyattan sonra takip ölçümleri bakım sırasında sopa fare gövdesi ile birlikte kavramak değil. Kafatası ve sopa arasında göreli hareket aşağı düşüyor sopa en sık nedenidir. Uygun cerrahi ve açgözlü beceri ile sopa damla sayisi daha az 20 bireyler de dahil olmak üzere 3 haftalık deneme olurdun.
Kıllar ve gıda artıkları aralığı göz ve objektif arasında kayma. Bu sadece objektif saydamlığını etkisi, ama aynı zamanda potansiyel olarak kornea yüzey fiziksel olarak zarar. Tutmak için en az iki kez temizlik, objektif, saydamlığını gerekli her hafta. Bu da fareler kornea komplikasyonlar insidansı azaltmak için yüz damat fırsatı verecektir. Çerçeve ve fare yanıp için izin vermek için cilt arasında yaklaşık 1 mm için bir boşluk bırakın. Çerçeve gıda dışında Kafes Izgara yukarıdaki üzerinden ulaşmak fareler için zorlaştırabilir. Bu nedenle, bu gıda kafesin zemininde doğrudan koymak için tavsiye edilir. Kafesin içine iki kez bir hafta için temiz bir da lens tutmaya yardımcı olacaktır Değiştir Temizle. Kirli lens miyopi formu-yoksunluğu mekanizması ile inducing difüzörler haline. Bu veri çarpık ve delillerin FDM ve LIM etyoloji3farklı model sistemleri olduğunu gösterdi beri yorumlamak zor sonuç olun.
Fare göz küçük boyutu nedeniyle, ölçülen göz parametreleri kararsız olma eğilimindedirler. Kızılötesi photorefractor kırılma ölçümü9 ve AL4 için bir SDOCT sistemi için Dr Schaeffel tarafından geliştirilen öneririz (bkz. Tablo malzeme). Her iki sistemin ölçüm tekrarlanabilirlik sağlamak için ölçülen değeri güvenilirliğini yargılamak için yeterli bilgi mevcut. Kırılma için önceki raporlarında, iddia bu ölçüm eksen üzerinde4,14korumak son derece önemlidir. ±3 derece bakışları kontrol tutmak istikrarlı sonuçlar alabilir. Bu hassas ölçüm elde etmek için SDOCT sistem tüp fare göz yönünü verdiği zaman yararlı olabilir. AL ölçüm için kornea vertex ve optik sinir yakınındaki en parlak sınır yansıyan ışığı bu ölçüm tekrarlanabilirlik sağlamak iki güvenilir anatomik işaretleri vardır.
Burada açıklanan protokol farelerde önemli miyop Birleşik bir hafta içinde indüklenen. Mekanizma hala bilinmemekle birlikte, kırılma ve AL değişiklik değildir mutlaka paralel. AL bir hafta sonra miyop büyüyen devam aldığından, üç kez toplam olarak yapılması gereken ölçüm önerilir: daha önce bir hafta ve üç hafta sonra rüşvet. Şekil 5' te örnek akış çizelgeleri miyopi indüksiyon için birini gösterdi. P21 başlatma ve kullanma önceki rapor4, dayalı - 4 hafta ölçülen değer etkisi ve lens kullanımı hızlandırmak şiddetli kornea komplikasyonlar insidansının yüksek üzerinde olabilir için LİM'i deneyler için son 30 D lens tavsiye edilir . Kornea skarlasma en sık komplikasyondur. Fareler onların yüzleri ve göz kapakları hangi komplikasyon nedeni olabilir çerçeve giyen temizlik yapamaz.
Bu protokol için açıklanan cihaz şu (p21) sütten sonra fareler için uygulanabilir. Bu kısmen4gözlenen güçlü fenotip katkıda bulunabilir. Genel anestezi çıkarılabilir bir çerçevedir. Bu sadece araştırmacı lensler kadar kolayca temizlemek, aynı zamanda topikal ilaç teslim olası4olun sağlar. Lensler difüzörler veya lensler ile farklı diyoptriden içine kolayca değiştirilebilir başka bir güçtür (e.g., artı lensler), bu yöntem'ın imkanlarını genişletir. Bu yöntemin bir sınırlama çerçeveleri stabil için bütün deneyin yapıştırılır önce ameliyat biraz pratik ihtiyacı var. Ölçümler ayrıca güvenilir veri toplamak için sabır gerekir.
Fareler yeri doldurulamaz hayvan modeli ile genetik manipülasyon ve düşük maliyetli ıslahı için onun olasılığı vardır. Biz burada açıklanan deneysel miyopi farelerde miyopi araştırma için daha pratik bir model yapmak umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Fare gözlük tasarımı için bir patent (uygulama No 201741349) uygulanmıştır.
Acknowledgments
M.T. Pardue SDOCT, F. Schaeffel kırılma ve kornea eğriliği, Bay Sanshouo üç boyutlu çerçeve veri, M. Miyauchi eğlence için tedavinin tavsiye için tavsiye için teşekkürler; K. Tsubota; Y. Tanaka; S. Kondo; C. Shoda; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. Hagiwara; A. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; E. Yotsukura; K. Takahashi; ve Y. Wang kritik tartışmalar için. Bu eser için bilimsel araştırmalara (KAKENHI, sayı 15 K 10881) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) TK. hibe inAid tarafından desteklenmiştir Bu eser grant miyopi araştırma Tsubota Laboratuvarı, Inc (Tokyo Japonya) tarafından da desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| screw | NBK | SNZS-M1.4-10 | |
| washer | MonotaRO | 42166397 | |
| nut | MonotaRO | 42214243 | |
| stick | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| frame | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| lenses | RAINBOW CONTACT LENS | none | customized for mice use by the company |
| cyanoacrylate glue | OK MODEL | MP 20g | |
| dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | super bond | contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull |
| infrared photorefractor | Steinbeis Transfer Center | none | designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen |
| Spectral domain OCT | Leica | R4310 | |
| Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution | Santen | Mydrin-P | |
| midazolam | Sandoz K.K. | SANDOZ | components for the anesthetic |
| medetomidine | Orion Corporation | Domitor | components for the anesthetic |
| butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | components for the anesthetic |
| 0.1 % purified sodium hyaluronate | Santen | Hyalein | |
| atipamezole hydrochloride | Zenoaq | antisedan |
References
- Dolgin, E. The myopia boom. Nature. 519 (7543), 276-278 (2015).
- Ohno-Matsui, K. Pathologic Myopia. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia, Pa). 5 (6), 415-423 (2016).
- Morgan, I. G., Ashby, R. S., Nickla, D. L. Form deprivation and lens-induced myopia: are they different. Ophthalmic & Physiological Optics. 33 (3), 355-361 (2013).
- Jiang, X., et al. A highly efficient murine model of experimental myopia. Scientific Reports. 8 (1), 2026 (2018).
- Torii, H., et al. Violet Light Exposure Can Be a Preventive Strategy Against Myopia Progression. EBioMedicine. 15, 210-219 (2017).
- Smith, E. L. 3rd, et al. Effects of Long-Wavelength Lighting on Refractive Development in Infant Rhesus Monkeys. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6490-6500 (2015).
- Gawne, T. J., Siegwart, J. T., Ward, A. H., Norton, T. T. The wavelength composition and temporal modulation of ambient lighting strongly affect refractive development in young tree shrews. Experimental Eye Research. 155, 75-84 (2017).
- Wu, Y., et al. Early quantitative profiling of differential retinal protein expression in lens-induced myopia in guinea pig using fluorescence difference two-dimensional gel electrophoresis. Molecular Medicine Reports. , (2018).
- Schaeffel, F., Burkhardt, E., Howland, H. C., Williams, R. W. Measurement of refractive state and deprivation myopia in two strains of mice. Optometry and Vision Science. 81 (2), 99-110 (2004).
- Tkatchenko, T. V., Shen, Y., Tkatchenko, A. V. Mouse experimental myopia has features of primate myopia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1297-1303 (2010).
- Faulkner, A. E., Kim, M. K., Iuvone, P. M., Pardue, M. T. Head-mounted goggles for murine form deprivation myopia. Journal of Neuroscience Methods. 161 (1), 96-100 (2007).
- Gu, Y., et al. A Head-Mounted Spectacle Frame for the Study of Mouse Lens-Induced Myopia. Journal of Ophthalmology. 2016, 8497278 (2016).
- Siegwart, J. T. Jr, Norton, T. T. Goggles for controlling the visual environment of small animals. Laboratory Animal Science. 44 (3), 292-294 (1994).
- Tkatchenko, T. V., Tkatchenko, A. V. Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 67-71 (2010).
- Chou, T. H., et al. Postnatal elongation of eye size in DBA/2J mice compared with C57BL/6J mice: in vivo analysis with whole-eye OCT. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3604-3612 (2011).
- Park, H., et al. Assessment of axial length measurements in mouse eyes. Optometry and Vision Science. 89 (3), 296-303 (2012).
