Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Brug af rekombinant Fusion proteiner i et fluorescerende Protease Assay Platform og deres i-gel genopretning

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58824
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Biotechnology Research Department, Gedeon Richter Plc
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en detaljeret procedure for en nyligt udviklede protease assay platform udnytter N-terminale hexahistidine/maltose-bindende protein og fluorescerende proteiner-smeltet rekombinant substrater knyttet til overfladen af nikkel-nitrilotrieddikesyre syre magnetiske Agarosen perler. En efterfølgende i-gel analyse af assay prøverne adskilt af sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese er også præsenteret.

Abstract

Proteaser er intensivt undersøgt enzymer på grund af deres væsentlige roller i flere biologiske veje af levende organismer og i patogenesen; Derfor er de vigtige stof mål. Vi har udviklet en magnetisk-Agarosen-perle-baserede assay platform for undersøgelse af proteolytiske aktivitet, som er baseret på brugen af rekombinant fusion protein substrater. For at demonstrere brugen af denne analyse system, præsenteres en protokol på eksemplet med human immundefekt virustype 1 (HIV-1) protease. Den indførte assay platform kan udnyttes effektivt i den biokemiske karakterisering af proteaser, herunder enzym aktivitet målinger i mutagenese, kinetic, hæmning eller specificitet undersøgelser, og det kan være egnet til høj overførselshastighed substrat screening eller kan tilpasses til andre Proteolytiske enzymer.

I denne analyse system, anvendt substraterne indeholder N-terminale hexahistidine (hans6) og maltose-bindende protein (MBPS) tags, kavalergang websteder for tobak etch virus (TEV) og HIV-1 proteaser og en C-terminale fluorescerende proteiner. Substraterne kan fremstilles effektivt i Escherichia coli celler og uden sammenligning renset ved hjælp af nikkel (Ni) - Chelat - belagte perler. Under analysen fører proteolytiske kløvningen af perle-attached substrater til frigivelse af fluorescerende kavalergang fragmenter, der kan måles af fluorimetry. Derudover kan kavalergang reaktioner analyseres af sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). En protokol til i-gel genopretning af assay komponenter er også beskrevet, som delvis genopretning af fluorescerende proteiner giver deres påvisning baseret på Molekylær vægt og fluorescens.

Introduction

Proteolytiske enzymer, der hører til de mest intensivt undersøgte enzym grupper på grund af deres betydning i stofskifteveje og industrielle applikationer. Deres centrale rolle i virussygdomme, regulering af blodpropper, cancer, og hjerte-kar- og neurodegenerative sygdomme gør proteaser fremtrædende mål inden for drug discovery. Derfor, en detaljeret karakterisering af substrat specificitet og hæmmer profilering af protease (PR) af interesse er afgørende og er fortrinsvis udført af hurtig, omkostningseffektiv og robust biokemiske assays1,2, 3.

I dag er størstedelen af in vitro-protease assays anvendes inden for drug discovery for sammensatte profilering er homogen, fluorescerende peptid-baseret, og høj overførselshastighed screening (HTS)-kompatibel platforme4. Derudover mærket peptider er ikke kun egnet til biblioteket screening, men de tilbyder også fantastiske værktøjer til bestemmelse af enzymet kinetiske parametre på de valgte substrater. I andre tilfælde, hvor mærkning af substratet ikke er muligt, kan adskillelse-baserede assays give en mulig løsning for at vurdere de kinetiske egenskaber af proteolytiske reaktioner3.

Generelt, in vitro-protease assays er baseret på brug af to typer af underlag: kort peptider eller hele proteiner. I de tilfælde, hvor kløvningen af korte peptid sekvenser afspejler egenskaberne kavalergang tilstrækkeligt, følgende standard metoder er gældende: (i) undersøge standard protein substrater såsom oxideret insulin B-kæden, (ii) test kommercielt tilgængelige substrater af andre proteaser, (iii) screening syntetiske og fluorescently mærket peptid biblioteker lavet af kombinatorisk kemi, eller (iv) bruge genetiske metoder, for eksempel, biologiske vise teknologier5, 6. Udover de konventionelle klassificering, andre roman platforme er også tilgængelige for substrat generation (f.eks. dannelse af proteomet-afledte peptid biblioteker7 eller særlige undertyper af genetiske metoder, som den rekombinante fusion protein-baserede substrater8,9,10,11,12).

Alle de ovennævnte substrat typer og assays har deres egne fordele og begrænsninger, og udviklingen af assay formater ved at kombinere og/eller forbedre fordelene af de kendte platforme er stadig i efterspørgslen. Her beskriver vi en protokol for en adskillelse-baserede fluorescerende protease assay, der udnytter rekombinant substrater. Disse fusion proteiner består af hans6 og MBP tags smeltet til en kontrol kavalergang site af TEV PR, som efterfølges af substrat sekvens af interesse, som er direkte forbundet til en C-terminale fluorescerende proteiner (FP) (figur 1A). Kloning af en DNA-sekvens kodning for en spaltning site af interesse i den kloning kassette kan udføres af en enkelt ligatur reaktion i udtryk plasmidet, som tidligere har været linearisering af restriktionsendonukleaser.

Figure 1
Figur 1: Princippet om fluorescerende protease assay. (A) den skematisk fremstilling af en fluorescerende substrat og sin spaltning af human immundefekt virustype 1 (HIV-1) protease er vist. Pilen angiver kavalergang position inden for matrix/kapsid kavalergang site sekvens af HIV-1 protease (VSQNY * PIVQ). (B) fluorescerende substrater kan bruges til at analysere enzym reaktioner ved Ni-NTA magnetisk-perle-baserede analyse og polyacrylamid gelelektroforese, så godt, som det fremgår af arbejdsprocesdiagram. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Selvom proteolytiske assays ved hjælp af lignende rekombinante protein substrater indeholdende en affinitet tag, et proteolytisk kavalergang websted og en fluorescerende proteiner-have allerede blevet beskrevet8,9,10, systemet præsenteret her agter at integrere og forbedre på fordelene ved disse metoder. En vigtig forskel er, at fusion protein substrater i denne analyse-perron er udstyret med MBP at øge protein opløselighed13 og indeholde en kontrol kavalergang site for TEV PRs. Desuden indeholder substraterne nye generation fluorescerende proteiner, som er meget stabil og har en monomere form at forhindre substrat sammenlægning. Udover den tidligere udgivne anvendelsen af mTurquoise2 - og mApple-smeltet former14viser her vi også resultater givet ved hjælp af en rekombinant substrat, der indeholder en monomere forbedret gul fluorescerende proteiner (mEYFP) fluorescerende tag. Herved vi demonstrere kompatibiliteten af systemet med andre fluorescerende proteiner og repræsentere nogle generelle typer af resultater, der kan erhverves af protease assay.

Rekombinant fusion proteiner er udtrykt i E. coli BL21(DE3) celler og anvendes som bærestof for analysen i en nikkel-nitrilotrieddikesyre syre (Ni-NTA)-belagt magnetisk-Agarosen-perle-attached form. C-terminale spaltningsprodukter er befriet fra perle overfladen i supernatanten ved spaltning af protease af interesse. Efter adskillelse af supernatanten (som indeholder enzymet og spaltningsprodukterne) fra de magnetiske perler, kan fluorescens måles for at bestemme kavalergang egenskaber af enzymet. I modsætning til de tidligere beskrevne metoder, er i systemet præsenteres her, mængder af substrat og C-terminale spaltningsprodukter entydigt kvantificeret baseret på en detaljeret substrat kalibreringsmetode. Analyse system kan støttes af SDS-PAGE analyse af assay prøver; en efterfølgende fluorescerende i-gel visualisering kan anvendes umiddelbart efter elektroforese eller i-gel genopretning af nondenatured og denatureret fluorescerende komponenter, henholdsvis14.

Fleksibilitet og struktur i kloning kassetten giver mulighed for en tid - og cost-effektive indsættelse af en bred vifte af sekvenser i konstruktionen og dermed fremmer generation af substrat biblioteker. Da alle assay trin er automation - og HTS-kompatibel, kan systemet være særligt attraktivt for, for eksempel, kan også blive udnyttet effektivt for industrielle protease inhibitor screening protease specificitet målinger og mutagenese undersøgelser, eller det og/eller antiviralt lægemiddel udvikling, så godt.

Enzym kinetiske parametre (kkat, Kjærm) kan bestemmes af den udviklede adskillelse-baseret analyse; Det kan derfor egnet til at udføre individuelle enzym kinetic målinger, som tid-kursus, substrat-afhængige og hæmning undersøgelser. Dette beviser, at rekombinant fusion protein substrater give gode alternativer til de ofte udnyttet syntetiske oligopeptide substrater, og på grund af deres høje lighed med polyprotein substrater, de repræsenterer de naturligt forekommende enzym-substrat interaktioner mere præcist.

Protocol

1. generation af substrat-kodning udtryk plasmider

  1. Linearize pDest, hans6- MBP-FP udtryk plasmid af PacI og NheI restriktionsendonukleaser. I generation af pDest, hans6- MBP-FP, se Bozóki et al.14.
    1. Tilsæt pDest, hans6- MBP-FP udtryk plasmid 1.500-2.000 µg, 2 µL af PacI og NheI restriktionsendonukleaser, 10 µL af 10 x buffer (Se Tabel af materialer), og nukleasen-gratis vand (NFW) til 100 µL i et microcentrifuge rør.
    2. Inkuber reaktionsblanding ved 37 ° C i 1 time.
  2. Tilføj 20 µL af 6 x DNA lilla lastning farvestof til reaktionsblandingen og adskille spaltningsprodukterne ved elektroforese, ved hjælp af 1%-agarosegel. Anvende et 1 kB DNA ladder som standard.
  3. Skyl gel for 15 min i 20 mL af TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM eddikesyre, 1 mM EDTA, pH 8,5) indeholdende 20 µL af SYBR green løsning og punktafgifter band af den lineariseret plasmid ud af agarosegel, ved hjælp af en skarp værktøj.
    Bemærk: Mens lysende gel af en mørk-læsning blå transilluminator (DRBT), lineært pDest, hans6- MBP-FP plasmid vises som et diskret og lyse band på omkring 7-8 kB.
  4. Rense lineariseret udtryk plasmid fra gel skive ved hjælp af en gel udvinding kit ifølge producentens anvisninger.
  5. Indsæt substrat sekvens i lineariseret pDest, hans6- MBP-FP udtryk plasmid.
    1. Bind frem (FWD) og de omvendte (REV) E. coli codon-optimeret oligonukleotid primere kodning for substrat sekvens af interesse.
      Bemærk: De udglødet primere vil være flankeret af sammenhængende enderne svarende til PacI og NheI begrænsning liv1975 kavalergang lokaliteter (figur 2).
      1. Mix 150 ng af lineariseret udtryk plasmid med 200 ng FWD og 200 ng af REV oligonukleotid primere i en 0,2 mL Polymerasekædereaktionen (PCR) rør og justere lydstyrken til 17 µL ved at tilføje NFW.
      2. Inkuber blandingen på 65 ° C i 2 min. og derefter, ved 4 ° C i mindst 2 min.
    2. Udføre indsættelse af de udglødet primere i den lineariseret plasmid af ligatur.
      1. Tilføje 2 µL af T4 ligase buffer (10 x) og 1 µL af T4 ligase til den blanding, der indeholder den lineariseret plasmid og udglødet primere.
      2. Inkuber ligatur blandingen ved 16 ° C i 16 h.

Figure 2
Figur 2 : Oligonukleotid primere, der koder for et proteolytisk kavalergang site sekvens. Frem og bak primere indkode VSQNY * PIVQ kavalergang site sekvens af HIV-1 PR. Efter udglødning supplerende oligonukleotid primere, indeholder korte dobbelt-strenget DNA sticky ender, svarende til PacI og NheI restriktionsendonukleaser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Omdanne 100 µL af BL21(DE3) kompetente celler af 5 µL af ligatur blanding og sprede celler på lysogeny bouillon (LB) agar plader der indeholder ampicillin.
    Bemærk: De fluorescerende proteiner vil være i den samme åbne læsning ramme med N-terminalen fusion tags kun efter en vellykket ligatur. Et par dage efter transformation, vil kolonier (indeholdende udtryk plasmid kodning for indsatte kavalergang webstedet af interesse) vise synlig fluorescens med eller uden brug af en DRBT.
  2. Forberede glycerol bestand fra de afbillede kolonier.
    1. Vask en diskret koloni i et 50 mL-centrifugerør indeholdende 5 µL af LB medium indeholdende ampicillin (i en endelig koncentration på 100 µg/mL).
    2. Inkuberes ved 37 ° C i 8 h under konstant omrystning på 220 omdrejninger så, høste cellerne ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
    3. Forsigtigt suspendere celler i 1 mL 80% glycerol løsning (fortyndes med destilleret vand) og tilføje 500 µL af 10 mM MgCl2 løsning til suspensionen.
    4. Overføre suspension til en indefrysning tube og gemme lagre ved-70 ° C.
  3. Kontrollere rækkefølgen af de genererede plasmid DNA-sekventering.
    1. Tilføje 10 µL af glycerol bestanden (udarbejdet i trin 1.7) til 5 mL af LB medium indeholdende 100 µg/mL ampicillin i et 50 mL-centrifugerør.
    2. Inkuber suspension ved 37 ° C i 16 h under konstant omrystning på 220 rpm; så, høste cellerne ved centrifugering ved 2.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    3. Isolatet udtryk plasmid fra celle pellet ved et plasmid miniprep kit (Se Tabel af materialer) i henhold til fabrikantens anvisninger, og bruge den renset plasmid til DNA-sekventering.
      Bemærk: til sekvensering, 5'-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3' (frem) og 5'-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3' (omvendt) oligonukleotid primere kan anvendes.

2. angivelse af fluorescerende substrater

  1. Forberede starter kultur.
    1. Tilføje 10 µL af glycerol bestanden (udarbejdet i trin 1.7) til 5 mL af LB medium indeholdende 100 µg/mL ampicillin i et 50 mL-centrifugerør.
    2. Inkuber suspension ved 37 ° C i 15 h under konstant omrystning på 220 rpm.
  2. Overføre bakteriekulturen (5 mL) 50 ml frisk LB medium indeholdende 100 µg/mL ampicillin i en 500 mL sterilt erlenmeyerkolben.
  3. Vokse celler ved 37 ° C til en absorbans på 0,6-0,8 på en 600 nm bølgelængde, mens løbende ryste på 220 rpm.
    Bemærk: Hvis en tetracyclin behandling skal anvendes på trin 2.5, er det ikke anbefales at dyrke celler til en absorbans på mere end 0,6 på 600 nm.
  4. Tilføje isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til 1 mM endelige koncentration til at fremkalde protein udtryk.
  5. Hvis en tetracyclin behandling ikke anvendes, inkuberes kultur i 3 timer ved 37 ° C under konstant omrystning på 220 rpm og fortsætte protokol med trin 2.6. Hvis en tetracyclin behandling anvendes, fortsat protokol med trin 2.5.1-2.5.3.
    Bemærk: Nogle FPs produceret af E. coli celler kan have en længere modning tid (Se tidligere arbejde)16,17; i disse tilfælde, kan protein oversættelse være valgfrit arresteret af tetracyklin behandling, for at øge det fluorescerende udbyttet af substratopløsningen.
    1. Inkuber cellesuspension i 2 timer ved 37 ° C under konstant omrystning på 220 rpm; derefter tilføje en tetracyklin løsning (i en endelig koncentration på 200 µg/mL).
    2. Inkuber cellekultur efter modning tid fluorescerende protein valg ved 37 ° C, mens løbende ryste på 220 rpm.
  6. 2 x 25 ml af kultur at rengøre 50 mL centrifugeglas og høste cellerne ved centrifugering ved 4.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
  7. Supernatanten og gemme de bakterielle celle pellets ved-70 ° C i mindst 1 time.
    Bemærk: Celler, der indeholder de udtrykte fluorescerende substrater vise synlig fluorescens med eller uden brug af en DRBT.

3. celle forstyrrelser

  1. Placer den frosne celle pellet på is og lad den tø op i 15 min.
  2. Tilsættes 2 mL lysisbuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 0,05% Tween 20, pH 8) til pellet og suspendere cellerne.
  3. Tilføje 10 µL af frisklavede phenylmethanesulfonyl-fluor (PMSF) protease hæmmer løsning (8,7 mg/mL, opløst i ethanol) til suspensionen.
  4. Tilsæt 2 mg lysozym og 20 enheder af DNase til suspension og ophæve den.
  5. Inkuber suspension på isen til 15 min og vortex det lejlighedsvis.
  6. 2 x 1 mL af suspensionen overføres til 1,5 mL microcentrifuge rør og sonikeres suspensioner i 3 min., i runder af 10 s ultralydbehandling og 5 s af hvile.
  7. Centrifugeres rør på 10.000 x g i 20 min. ved stuetemperatur; derefter fjerne fluorescerende supernatanten (fjernes bakteriel celle lysate) omhyggeligt fra hver tube og overføre det til nye microcentrifuge rør.
    Bemærk: Ryddet lysates der indeholder fluorescerende substratet vise synlig fluorescens med eller uden brug af en DRBT og kan opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger. IKKE fryse den. Ryddet lysates kan udnyttes direkte til prøveforberedelse i protease assay (Se afsnit 4.1) eller også kan bruges til substrat rensning (Se trin 4.5.1).

4. Ni-NTA magnetisk-perle-baserede protease assay

Bemærk: På grund af fleksibiliteten i assay platform, det kan være optimeret til mange forskellige typer af undersøgelser. Af denne grund og på grund af forskellen i aktivitet rate af enzymer valg, nogle af parametrene assay (hvor det er angivet) kan ikke være udtrykkeligt beskrevet men skal optimeres til de enkelte mål, eksperimenterende design. Som en vejledning angives parametrene for nogle typer af undersøgelser på de særlige trin.

  1. Forberedelse af prøver
    1. Generation af substrat-attached magnetiske perler
      1. Placer en lukket 2 mL lav-protein-binding (Se Tabel af materialer) microcentrifuge tube indeholder nye eller genanvendes (Se afsnit 4.7) Ni-NTA magnetiske Agarosen perler i et magnetisk partikel koncentrator (MPC).
        Bemærk: Mængden af anvendt perle suspension er at være indstilles på grundlag af det eksperimentelle design. Vi brugt 1 mL af magnetisk bead løsning (5%, v/v) ved hvert forsøg.
      2. Perlerne kan holde sig til væggen og/eller i låget af microcentrifuge rør; derfor slå MPC hovedet i hver retning for at sikre, at alle perlerne er indsamlet.
      3. Fjern supernatanten og kassér den.
      4. Vaske perlerne af lysisbuffer.
        1. Tilføje 1,8 mL lysisbuffer til perlerne og fjerne det lukkede rør fra MPC.
        2. Suspendere perlerne i røret ved omrystning og/eller dreje rør hovedet indtil prøven er fuldstændig homogene.
        3. Læg tuben tilbage i MPC og slå det op og ned at indsamle perler.
        4. Åbn tuben og supernatanten.
      5. 1,0-1,8 mL tilsættes den ryddet lysate (udarbejdet i trin 3.7) til perlerne og fjerne røret fra MPC.
      6. Drej det lukkede rør hovedet indtil perlerne er fuldstændig homogene og langsomt dreje røret af en rotator ved stuetemperatur i 30 min.
      7. Læg det i MPC og fjerne cellen ryddet lysate fra perlerne og låget.
        Bemærk: Cellen ryddet lysate kan blive kasseret eller gemt til yderligere brug (Se bemærkningen efter trin 3.7).
      8. Tilføj 1% Tween 20 (pH 7) til substrat-attached magnetiske perler (SAMBs).
        Bemærk: SAMBs vise synlig fluorescens med eller uden brug af en DRBT.
    2. Vask af SAMBs
      1. Placer røret med SAMB suspension i MPC og supernatanten.
      2. Vask SAMBs 3 x med hver buffer: i) 1,8 mL 1% Tween 20 (pH 7); II) 1,8 mL vask buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazol, 0,05% Tween 20, pH 7); III) 1,8 mL af kavalergang buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7).
        Bemærk: Proceduren for vask, under trin 4.1.1.4. Kavalergang buffer kan ændres efter de eksperimentelle behov, men det anbefales at tjekke manualen om Ni-NTA magnetiske perler til at bestemme kompatibilitet.
    3. Forberedelse af SAMB stamopløsningen
      1. Tilføje en spaltning buffer til de vasket SAMBs at skabe en SAMB stamopløsning.
        Bemærk: Efter tilføjelsen af bufferen, gør ikke ryste eller vende røret på hovedet. Mængden af kavalergang buffer afhænger af den enkelte eksperimentelle design og skal være beregnet baseret på antallet af magnetiske perler (Se trin 4.1.1.1) og på diskenheder skal bruges i trin 4.1.4.2. 2 mL rør, er den anvendte volumen op til 1.900 µL (Se tabel 1). Den anbefalede magnetiske bead tæthed af stamopløsningen SAMB er 2% - 10% (v/v).
        Studere type Volumen af kavalergang buffer (µL)
        S-afhængige målinger (Fig 4) 1600
        Tidsforløb målinger (figur 5A) 1600
        Hæmning undersøgelse (figur 5B) 1900
        pH afhængighed undersøgelse (Fig 6) 1400

        Tabel 1: Volumen af kavalergang buffer, der bruges til at forberede SAMB stamopløsning i de forskellige typer af målinger.
      2. Fjern det lukkede rør fra MPC. Bruge SAMB stamopløsningen straks eller opbevares ved 4 ° C i op til 24 timer.
    4. Generation af assay prøver ved hjælp af stamopløsningen SAMB
      Bemærk: Detaljerne i denne del af analysen er stærkt afhængige af den enkelte eksperimentelle design (prøve typer er vist i tabel 2).
      Prøvetypen Noter
      Reaktion prøve (R) -bruges til at vurdere kavalergang egenskaber
      -indeholder både enzymet og substrat i kavalergang buffer
      Substrat blindprøve (B) -bruges til at vurdere spontan substrat dissociation (Se trin 4.6.2)
      -indeholder kun substrat i kavalergang buffer
      Substrat kontrolprøve (C) -for detemining substratkoncentrationen (Se trin 4.6.3)
      -indeholder kun substrat i eluering buffer

      Tabel 2: Prøve typer af Ni-NTA magnetisk-perle-baserede protease assay.
      1. Forberede assay prøver 2 mL af lav-protein-bindende microcentrifuge rør.
        Bemærk: Andre lavt proteinindhold bindende plast bagværk kan også bruges. Bruge runde eller flad bund rør til at sikre den frie bevægelighed for SAMBs. Se det anbefalede antal rør i tabel 3.
        Studere type RASMUSSEN B C
        S-afhængige målinger (Fig 4) 5 5 2
        Tidsforløb målinger (figur 5A) 6 6 2
        Hæmning undersøgelse (figur 5B) 7 7 1
        pH afhængighed undersøgelse (Fig 6) 5 5 1

        Tabel 3: Antal krævede 2 mL microcentrifuge rør for hver prøvetype i de påviste undersøgelser.
      2. Suspendere SAMB stamopløsningen indtil homogenitet og overføre beløbet af substratet skal analyseres i Reaktionerne straks ind i prøven hætteglas. Den anbefalede mængde er 25-300 µL, men det er ud fra den enkelte eksperimentelle design (tabel 4).
        Bemærk: Check, hvis alle SAMBs er blevet målt i bunden af rørene. SAMBs kan holde sig til mur af røret, som kan fordreje assay resultater. Hvis forskellige mængder skal måles sekventielt, starte aliquoting med den højeste lydstyrke og forsøger at minimere ændringen af pipetter og/eller pipette tips.
        Studere type RASMUSSEN B C
        S-afhængige målinger (Fig 4) 25 – 50 – 100 – 150-250 25 – 50 – 100 – 150-250 25
        Tidsforløb målinger (figur 5A) 25 25 25
        Hæmning undersøgelse (figur 5B) 120 120 120
        pH afhængighed undersøgelse (Fig 6) 100 100 100

        Tabel 4: Mængden af SAMB opløsning målt i prøven hætteglas af hver prøvetype i de undersøgelser, der påviste.
      3. Placer prøveglassene indeholdende aliquoted SAMB suspension i MPC og lidt flytte MPC frem og tilbage.
      4. Omhyggeligt fjernes supernatanten fra SAMBs og kassér den.
      5. Fjerne rør fra MPC og tilføje beregnede mængden af reaktion buffer (kavalergang eller eluering buffer [100 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 7]) forsigtigt til SAMBs.
        Bemærk: Beregne buffer volumen efter den enkelte eksperimentelle design (tabel 5). 2 mL rør er anbefalede endelige mængden af reaktionsblandingen (volumen af reaktion buffer tilføjes i dette trin + bind af løsningen føjes taktfast 4.2.3) 50-150 µL. Sørg for, at alle af SAMBs er skyllet i den ekstra buffer. Eluering buffer benyttes i stedet for kavalergang buffer i tilfælde af substrat-kontrolprøver (C). For en hæmning undersøgelse anbefales hæmmer af valg skal føjes til dette trin.
        Studere type Volumen af reaktion buffer (µL)
        S-afhængige målinger (Fig 4) 68 µL kavalergang buffer
        Tidsforløb målinger (figur 5A) 68 µL kavalergang buffer
        Hæmning undersøgelse (figur 5B) 67.3 µL kavalergang buffer + 0,7 µL hæmmer lagerfører løsning *
        pH afhængighed undersøgelse (Fig 6) 69,5 µL kavalergang buffer **

        Tabel 5: volumen af reaktion buffer i de undersøgelser, der påviste. * Amprenavir blev løst i dimethylsulfoxid; amprenavir stamopløsninger (lige fra 1 nM til 1 µM koncentrationer) blev anvendt for hæmmende undersøgelse (Se figur 5B). ** PH-værdien af de anvendte kavalergang buffer varierede fra pH 6.0-8,5.
      6. Tæt låg af rørene. Prøverne er nu klar til analysen.
        Bemærk: Prøverne kan opbevares ved 4 ° C i op til 24 timer, men opbevaring gælder kun, hvis SAMB stamopløsningen blev brugt umiddelbart efter forberedelsen (Se trin 4.1.3.2).
  2. Indledning af proteolytiske reaktioner
    1. Forberede proteolytisk enzym løsning alt efter de eksperimentelle behov.
      Bemærk: Det anbefales at bruge en spaltning buffer til at opløse og/eller fortynde enzymet. Protokoller til rensning af HIV-114 og TEV PRs18 har været offentliggjort tidligere.
    2. Angiv thermoshaker agitation sats (600 rpm) og inkubation temperatur (tabel 6).
      Studere type Inkubation temperatur (° C)
      S-afhængige målinger (Fig 4) 37
      Tidsforløb målinger (figur 5A) 37
      Hæmning undersøgelse (figur 5B) 37
      pH afhængighed undersøgelse (Fig 6) 30

      Tabel 6: inkubation temperaturer anvendes i forskellige undersøgelse typer. For HIV-1 PR anbefales 37 ° C, mens 30 ° C er anbefalet for TEV PR.
    3. Tilføje enzym løsning til reaktion prøver for initialisering af proteolytiske reaktioner.
      Bemærk: Substrat tom (B) og C prøver, tilføje kavalergang buffer (enzym buffer) og eluering buffer, henholdsvis. Diskenheden er skal beregnes efter de enkelte eksperimentelle behov (tabel 7). 2 mL rør er den anbefalede endelige mængden af reaktionsblandingen (volumen af reaktion buffer tilføjede i trin 4.1.4.5 + rumfang af opløsning skal tilføjes i dette trin) 50-150 µL.
      Studere type Mængden af enzymet løsning/enzym buffer/eluering buffer (µL)
      S-afhængige målinger (Fig 4) 2
      Tidsforløb målinger (figur 5A) 2
      Hæmning undersøgelse (figur 5B) 2
      pH afhængighed undersøgelse (Fig 6) 0,5

      Tabel 7: Mængden af enzymet løsning/enzym buffer/eluering buffer tilføjet under initialisering af assay prøver i forbindelse med de påviste undersøgelser.
    4. Ophidse perlerne omhyggeligt ved at forsigtigt flytte rørene, og placere rør straks i den allerede ryster thermoshaker.
      Bemærk: Manuel prøve opsigelse (Se afsnit 4.3) tager længere tid end indledningen; Derfor anbefales registreret forsinkelser på mindst 2 min. mellem reaktioner indvielser.
    5. Inkuber prøveeksemplarer efter den eksperimentelle design (tabel 8).
      Studere type Inkubation gange (min)
      S-afhængige målinger (figur 4A) 7
      S-afhængige målinger (figur 4B) 120
      Tidsforløb målinger (figur 5A) 0-2,5-5 – 10 – 15 – 20
      Hæmning undersøgelse (figur 5B) 10
      pH afhængighed undersøgelse (Fig 6) 60

      Tabel 8: Inkuberingstider anvendes til analyse prøver i forskellige måleenheder.
  3. Termination af de proteolytiske reaktioner
    1. Tag prøven ud af shaker, 30 s før slutningen af inkubation, og spinde det straks.
    2. Placer røret på MPC, lad det stå i 15 s, og lidt flytte MPC frem og tilbage.
    3. Åbn låget og overføre supernatanten omhyggeligt til en plade eller en ny tube.
      NOTE: Rør ikke de koncentrerede perler med spidsen af en pipette. Indsamlede supernatanten C prøver og R prøver med en høj grad af spaltning kan vise synlig fluorescens med eller uden brug af en DRBT.
  4. Fluorescerende påvisning
    1. Overføre 2 x 30 µL af adskilte prøve analysere til en sorte halve-området mikrotiterplade.
    2. Måle fluorescens ved hjælp af passende excitations- og filtre.
      Bemærk: Måle den grundlæggende fluorescens af kavalergang buffer og eluering buffer, så godt. Filter kombinationer skal vælges baseret på den målte fluorescerende proteiner (tabel 9).
      Fluorescerende proteiner Excitation filtre (nm) Emission filtre (nm)
      mTurqiouse2 355/40 460/25
      mEYFP 544/15 590/10
      mApple 544/15 590/10

      Tabel 9: Excitations- og filtre bruges til at registrere forskellige fluorescerende proteiner.
  5. Kalibrering
    Bemærk: For at generere kalibreringskurverne taktfast 4.6.1, fluorescens intensitetsværdierne af kavalergang - eller eluering-buffer-løst renset substrater ved forskellige koncentrationer skal måles.
    1. Rense de fluorescerende substrater.
      Bemærk: For rensning, SAMBs af substrat blindprøver (B) analyseres efter protease assay kan afhentes eller en ny SAMB suspension kan også tilberedes (Se afsnit 4.1.1 og 4.1.2).
      1. Placer en tube med SAMBs ophængt i 1 mL af kavalergang buffer (2-10%, v/v) til MPC og indsamle de magnetiske perler ved at dreje MPC hovedet i hver retning.
      2. Åbn tuben og fjern kavalergang buffer, både fra røret og låget.
      3. Fjerne røret fra MPC og tilføje 400-600 µL af eluering buffer til SAMBs.
      4. Langsomt dreje det lukkede rør med en rotator ved stuetemperatur i 5 min.
      5. Placer røret på MPC og indsamle perler ved at dreje MPC hovedet.
      6. Fjern supernatanten indeholdende den renset intakt fluorescerende substrat (eluatet) og overføre det til en ny lav-protein-bindende microcentrifuge tube.
        Bemærk: Eluatet viser tydeligt fluorescens med eller uden brug af en DRBT.
    2. Udføre Parallelbuffer udveksling ved hjælp af to 0,5 mL 10K ultrafiltrering enheder.
      1. Måle halv mængde rede eluat (200-300 µL) i hver ultrafiltrering enhed.
      2. Efter hver centrifugering trin, fortynde koncentreret eluatet i først og de anden ultrafiltrering enheder ved eluering buffer og kavalergang buffer, henholdsvis.
      3. Efter inddrivelsen, justere koncentreret prøverne løst i de forskellige buffere til den samme lydstyrke, mellem 120-200 µL.
        Bemærk: Nu proteinindholdet i kavalergang buffer-løst underlaget er identisk med eluering buffer-løst underlag; Derfor, det er ikke nødvendigt at bestemme protein indhold af denne på trin 4.5.3, hvis metoden bruges til at måle proteinkoncentration interfererer med EDTA.
    3. Bestemme substraterne proteinindhold opløst enten i eluering eller kavalergang buffer ved måling af absorbans ved 280 nm.
      Bemærk: Andre metoder (fx Bradford eller bicinchoninic syre (BCA) assays) kan også bruges til at måle proteinkoncentration, men mulig interferens med EDTA (findes i bufferen til eluering) eller absorbansen af fluorescerende underlaget skal være overvejet. Den indledende proteinindhold substratopløsning skal anvendes i trin 4.5.4 anbefales at være mellem 0,4-2,0 mg/mL for at generere en kalibrering kurven i et passende interval. Se tabel 10 for udryddelse koefficienter.
      Substrat Molekylær vægt
      (Da)      		 Extinction koefficient
      (M-1 cm-1, på 280 nm målt i vand)
      Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 72101.7 96845
      Hans6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 72042.7 95355
      Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP 72367.1 94325
      Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple 72145.9 105200

      Tabel 10: Molekylær vægt og udryddelse koefficienter for forskellige rekombinant fluorescerende fusion protein substrater.
    4. Forberede en dobbelt seriel fortynding i mindst otte trin, både fra eluering - og kavalergang-buffer-løst underlag løsninger, med eluering eller kavalergang buffer for fortynding, hhv.
    5. Overføre 30 µL af hver fortynding punkt til en sorte halve-området mikrotiterplade.
    6. Måle fluorescens med en fluorimeter, ved hjælp af indstillingen i trin 4.4.2.
      Bemærk: Måle den grundlæggende fluorescens af både kavalergang og eluering buffer.
  6. Evaluering af analysen
    1. Plot kalibreringskurverne.
      1. Beregne koncentrationen (i mM) af renset substrat løsninger (bruges i trin 4.5.4), baseret på proteinindhold bestemmes i trin 4.5.3.
      2. Rette relative fluorescens intensitetsværdierne (RFU) af punkterne, seriel fortynding af grundlæggende RFU værdierne for den anvendte fortynding buffer (kavalergang buffer eller eluering buffer).
      3. Afbilde de korrigerede RFU værdier mod den molære koncentration af kavalergang - eller eluering-buffer-løst renset substrater og udføre en lineær regression (kraft skæringspunkt til nul).
        Bemærk: En høj Rasmussen2 værdi (˃0.97) angiver en god lineær korrelation mellem fluorescens og koncentrationen af de fluorescerende proteiner. I dette tilfælde kan hældningen på regressionslinjen bruges til at vurdere koncentrationen af komponenterne assay i det undersøgte område i trin 4.6.2 og 4.6.3. Eksperimentelle fejl og data punkt distribution kan påvirke troværdigheden af kalibreringen; således, en grafisk evaluering kan udføres ved hjælp af zoom-in grafer (som vist i figur 3), for at kontrollere, om R2 og slope værdier er påvirket af dataene.
    2. Beregning af C-terminale fluorescerende kavalergang produkt i reaktion prøver.
      1. Rette RFU værdierne af hver R prøve med RFU værdierne af de tilsvarende B-prøve.
      2. Beregne koncentrationen af kavalergang produkt (i mM) i reaktion prøver ved at dividere den korrigerede RFU værdier af hældningen af kavalergang-buffer-baseret kalibrering kurve (Se trin 4.6.1.3).
    3. Beregne substratkoncentrationen af anvendte i reaktion prøver.
      1. Rette RFU værdier af C-prøven med RFU værdien af den grundlæggende eluering buffer.
      2. Beregne koncentrationen af det eluted substrat (i mM) i supernatanter af C-prøve ved at dividere deres korrigeret RFU værdier af hældningen på eluering-buffer-baseret kalibrering kurve (Se trin 4.6.1.3).
      3. Bestemme substratkoncentrationen af (i mM) SAMB stamopløsningens bruges til at oprette assay prøver i trin 4.1.4.2, baseret på følgende ligning:
        Equation 1
        Her, er cSAMB den molære koncentration af SAMB stamopløsningen forberedt på punkt 4.1.3; cC er den molære koncentration af det eluted substrat i C prøven beregnes på trin 4.6.3.3; Vr er mængden af reaktionsblandingen oprettet ved tilsætning af reaktion buffer i trin 4.1.4.5 og enzym buffer i trin 4.2.3.; og VSAMB er mængden af SAMB stamopløsning i C prøven (trin 4.1.4.2).
      4. Beregne den molære koncentration af substrater i hver R stikprøve baseret på den molære koncentration af SAMB stamopløsningen (i mM) Ifølge volumen (i µL) målt i hver reaktion prøveglas på trin 4.1.4.2.
    4. Udføre databehandling.
      NOTE: Dataanalyse afhænger af formålet med forsøget. Videoen viser et eksempel for databehandling af et substrat-afhængige kinetisk undersøgelse på HIV-1 PR bruger hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat. Indledende hastighed værdier beregnes ud fra antallet af C-terminale kavalergang fragmenter og plottes mod de anvendte substratkoncentrationen. De kinetiske parametre bestemmes af en Michaelis-Menten ikke-lineær regressionsanalyse.
  7. Genanvendelse af de magnetiske perler
    Bemærk: Efter at have udført en analyse, magnetiske Agarosen perler kan indsamles og genvindes.
    1. Indsamle de anvendte magnetiske perler med MPC og supernatanten.
      1. Vaske perler med 1,8 mL af de følgende buffere, i den rækkefølge givet: regeneration buffer A (0,05% Tween 20, 0,5 M NaOH), regenerering buffer B (0,05% Tween 20), regenerering buffer C (0,05% Tween 20, 100 mM EDTA, pH 8), regenerering buffer B, regenerering buffer D () 0,05% Tween 20, 100 mM NiSO4, pH 8), regenerering buffer B og regenerering buffer E (0,5% Tween 20, 30% ethanol, pH 7).
        Bemærk: Proceduren for vask, under trin 4.1.1.4.
    2. Gemme de genvundne perler i regenerering buffer E ved 4 ° C.

5. side analyse

  1. Forberedelse af prøver
    Bemærk: Efter udførelsen af Ni-NTA magnetisk-perle-baserede assay, assay analysere kan analyseres af side. I dette tilfælde skal du springe over trin 5.1.1 og 5.1.2. Det er dog også muligt at analysere den rensede fluorescerende substrater løsning og/eller deres kavalergang fragmenter efter-løsning fordøjelse med protease af interesse. I dette tilfælde fortsætte protokol med trin 5.1.1.
    1. Forberede den renset fluorescerende substratopløsning efter trin 4.5.1.
    2. Udføre i løsning fordøjelsen.
      1. Udveksle eluering buffer med kavalergang buffer i 0,5 mL 10K ultrafiltrering enhed og alikvot prøver at blive fordøjet i 1,5 mL microcentrifuge rør.
        Bemærk: For SIDERS analyse, vi aliquoted 68 µL af hver substrat, men antallet af prøveglassene og mængde af substratopløsning være aliquoted kan være optimeret efter de enkelte eksperimentelle design.
      2. Tilføje enzym løsning til prøverne.
        Bemærk: For SIDERS analyse, vi anvendte 2 µL af HIV-1 PR, forberedt som beskrevet af Bozóki et al.14, men volumen kan være optimeret efter de enkelte eksperimentelle design. Det anbefales at bruge kavalergang buffer til at opløse og/eller fortynde enzymet.
      3. Inkuber prøveeksemplarer efter forsøgets udformning.
        Bemærk: For SIDERS analyse, vi rugede reaktionsblandingen til 45 min. ved 37 ° C, men inkubationstiden og temperatur skal indstilles efter forsøgets udformning.
      4. Opsige reaktionen ved at udføre trin 5.1.3.
    3. Forberede side prøven.
      Bemærk: De fluorescerende-substrat-holdige prøver kan være forberedt på siden ved en nondenaturing eller en denaturering metode. Følg trin 5.1.3.1 eller 5.1.3.2, for brug af nondenaturing eller denaturering betingelser.
      1. Forberede en nondenatured prøve: Bland 30 µL af prøven med 6 µL af 6 x nondenaturing prøve-loading bufferen (300 mM Tris, 20% glycerol, 0,05% bromophenol blå, pH 6,8).
      2. Forberede en denatureret prøve: Bland 30 µL af prøven med 6 µL af 6 x denaturering prøve-loading bufferen (300 mM Tris, 20% glycerol, 0,05% bromophenol blå, 12% SDS, 100 mM β-mercaptoethanol, pH 6,8) og varme prøver ved 95 ° C i 10 min.
  2. SDS-PAGE analyse
    Bemærk: Du kan vælge, hvis kun nondenatured (udarbejdet i trin 5.1.3.1) prøver der skal analyseres, en indfødt side kan også udføres. I dette tilfælde springe afsnit 5.3.
    1. Forberede en SDS-polyacrylamid gel (brug 14% adskillelse og 4% stabling gel) og fyld tanken med elektroforese buffer (2,5 mM Tris, 19,2 mM glycin, 0,01% SDS).
    2. Tilføje prøver (udarbejdet i trin 5.1.3.1 eller 5.1.3.2) brønde i en polyacrylamid gel og udføre elektroforese på 120 V spænding.
    3. Fjerne gel kassette fra modulet kører og placere gel i en vask tank.
      Bemærk: Nondenatured prøver er allerede synlige i gelen, selv med det blotte øje eller med en DRBT.
  3. I-gel genopretning og påvisning af fluorescerende proteiner
    Bemærk: For at registrere de fluorescerende proteiner i denatureret prøver (udarbejdet i trin 5.1.3.2) på DRBT, SDS skal vaskes ud fra gel, at delvist renaturere proteiner.
    1. ~ 100 mL destilleret vand tilsættes til gel og skyl gel mindst i 30 min.
      Bemærk: For at forbedre SDS fjernelse, erstatte vand hver 10 min, eller skylle op til 60 min.
    2. Visualisere de fluorescerende proteiner ved hjælp af en DRBT, eller UV billeddannelse.
  4. Konventionelle Coomassie farvning af gel
    1. Pletten gel med Coomassie strålende blå farvestof til at visualisere nonfluorescent proteiner.

Representative Results

Figur 1A viser skematisk af en repræsentativ fluorescerende rekombinante protein substrat, som kan behandles af HIV-1 PR på dens specifikke kavalergang site sekvens. Figur 1B repræsenterer substrat produktion og deres mulige applikationer i protease assays, herunder Ni-NTA magnetisk-perle-baserede analyse og/eller side.

For at få pålidelige data af fluorimetry, er en kalibrering procedure påkrævet, for at bestemme mængderne af fluorescerende substrater og spaltningsprodukter. For dette, fluorescens intensitetsværdier af de forskellige substrater i forskellige buffer betingelser skal måles og skal være korreleret med deres koncentration i de analyserede koncentrationsområde (figur 3). Slope værdier kalibreringskurverne kan anvendes til at bestemme mængderne af substrater og spaltningsprodukter i assay prøver. Skråningerne af kalibreringskurverne er uafhængige af kavalergang site sekvenser indsat i substrater (tabel 11) og kan potentielt bruges til en række substrater smeltet til den samme type af fluorescerende proteiner. Zoom-in grafer er vist for alle lineære regressioner til at forstørre de lavere koncentrationsintervaller (figur 3). Det er vigtigt at bemærke, at kalibreringen skal udføres omhyggeligt, fordi en korrekt fordeling af datapunkter er nødvendige for en pålidelig kalibrering. Af denne grund, er dobbelt seriel fortynding anvendt til at forberede prøverne for kalibrering, fordi R2 -værdien angiver en god korrelation mellem koncentrationen af fluorescerende proteiner og fluorescens kun hvis et tilstrækkeligt antal datapunkter har været brugt til at dække det hele koncentrationsområde. Desuden kan eksperimentelle fejl stærkt påvirker nøjagtigheden af kalibreringen; således er en grafisk regression linjer kan man evaluere også nødvendigt.

En bred vifte af enzymatisk målinger kan udføres af protease assay, herunder en undersøgelse af effekten af substratkoncentrationen på reaktion hastighed (figur 4A). Af ikke-lineær regression, kan dataene bruges til at bestemme enzym kinetiske parametre (f.eks. vmax og Km). En utilstrækkelig perle suspension og spredning og en forkert reaktion opsigelse kan forårsage suboptimale resultater (figur 4B), som ikke er egnet til beregning af pålidelige enzym kinetic værdier.

En afhængighed af produkt formation på tid kan bestemmes ved analyse (figur 5A) (f.eks. under optimering af kavalergang reaktion parametre). Enzymaktivitet i nærværelse af en inhibitor kan også blive undersøgt (figur 5B) til bestemmelse af det aktive enzym koncentration og hæmmende konstant. Ved hjælp af samme metode, kan virkningerne af andre hæmmere også blive screenet af analysen.

Protease assay er nyttigt at undersøge virkningerne af pH på enzymaktiviteten, samt. Figur 6A repræsenterer afhængighed af enzymaktivitet pH ved eksemplet med TEV PR, som har en bred optimale pH interval (pH 6-9). Hvis pH afhængighed af enzymaktivitet er studeret (eller enzymer har en sur pH optimal skal måles), er det nødvendigt at overveje at affinitet bindingen af rekombinant substrater til perlerne kan begrænses på lidt sure pH-værdi. En forhøjet dissociation af substrater fra perler (fig. 6B) kan forårsage en forvrængning af analyse resultater. For at overveje de spontane substrat dissociation fra glasperler, skal de målte reaktion prøver rettes af de af B prøver.

Figur 7 viser, at de nondenatured fluorescerende proteiner kan differentieres i gelen baseret på deres farver, ved hjælp af blå lys ved gennemlysning (figur 7A). Hvis Molekylær vaegten af substrater/kavalergang fragmenter er nødvendige, kan denaturering betingelser også bruges til prøveforberedelse, fordi fluorescerende proteiner kan være delvist renatured i gelen, og kan blive opdaget af UV belysning (Figur 7B) eller af Coomassie farvning (figur 7C). Hvis R prøver analyseres, er kun de C-terminale spaltningsprodukter synlige (fig. 7C), mens de N-terminale kavalergang fragmenter og de uncleaved substrater forbliver knyttet til perlerne. Lejlighedsvis, proteiner kan denatureres delvist trods ved hjælp af nondenaturing betingelser (figur 7C), og mens de nondenatured proteiner er mere rigelige, denatureret former er også påvises i prøven. Dette fænomen påvirke ikke påvisning af proteolytiske kavalergang men skal overvejes i forbindelse med kvantitative densitometri af nondenatured prøver.

Selv om den detaljerede beskrivelse er vist kun til en 2 mL-rør-baserede assay, kan analysen være tilpasset til 96-brønd plade-baserede systemer (figur 8), som er allerede blevet testet med succes i vores laboratorium (ikke vist). 96-brønd plade-tilpasset format er fuldt kompatibel med fluorimetri og elektroforese analyser, så godt, og de opnåede data kan også blive evalueret baseret på de metoder, der er beskrevet i denne hvidbog.

Figure 3
Figur 3 : Kalibreringskurver. Repræsentative substrat kalibreringskurverne er påvist med eksempel på to rekombinant substrater smeltet til forskellige C-terminale fluorescerende tags: (A og B) hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 og (Christensen og D ) Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoom-i tal er også vist at repræsentere den lineære regression af datamærker i 0-0.005 mM substrat koncentrationsområde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4 : Bestemmelse af enzymet kinetiske parametre. Substrat-afhængige kinetic målinger blev udført af HIV-1 PR (på en aktiv slutkoncentration af 41.2 nM). Indledende hastighed værdier blev afbildet mod substratkoncentrationen og en Michaelis-Menten ikke-lineær regressionsanalyse blev udført. Fejllinjer udgør SD (n = 2). (A) A repræsentative optimale resultat er vist med eksempel på hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple fusion protein substrat. (B) en repræsentativ suboptimal resultatet vises også for hans6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 substrat, hvor fastsættelse af passende substrat koncentrationer var problematisk på grund af en utilstrækkelig homogenisering af stamopløsningen SAMB , mens relativt høje fejlene skyldes forkert reaktion opsigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Gang-kursus og hæmmende undersøgelse. (A) Hans 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP rekombinant fusion protein substrat (i en endelig koncentration på 0.00326 mM) blev kløvet af HIV-1 PR (på en aktiv slutkoncentration af 41.2 nM), og frigivelsen af fluorescerende PIVQ-mEYFP proteolytiske fragmenter blev målt til udføre et tidsforløb analyse. Målingerne blev foretaget på fem forskellige tidspunkter. Fejllinjer udgør SD (n = 2). (B) hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP blev brugt som substrat (på 0.0015 mM) til at bestemme den hæmmende effekt af amprenavir på aktiviteten af HIV-1 PR (i en samlet koncentration på 163.8 nM). Ved at plotte dataene, de halv maksimal hæmmende koncentration (IC50) kunne vurderes og aktive enzym koncentration (en aktiv slutkoncentration af 41.2 nM) af det anvendte HIV-1 PR kunne også blive beregnet på grundlag af hæmning kurve. Fejllinjer udgør SD (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Studere afhængighed af enzymaktivitet og spontane substrat dissociation på pH. (A) at hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (i 0,033 mM) blev brugt til at måle enzymaktiviteten i TEV PR (i en endelig total koncentration af 91.42 nM) i kavalergang bufferen indstillet til en forskellige pH mellem vifte af 6,5 til 8,5. Fejllinjer udgør SD (n = 2). De plottede data har været offentliggjort tidligere14. (B) baseret på de relative fluorescerende intensitetsværdierne af substrat blindprøver, spontane dissociation af hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (0,033 mM) fra de magnetiske perler blev undersøgt ved hjælp af kavalergang buffer med en forskellige pH, mellem 6.0-8,5. De plottede data har været offentliggjort tidligere14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Afsløre proteiner i gelen af forskellige metoder. (A) Uncleaved og HIV-1 PR-fordøjet fusion protein substrater efter nondenaturing prøveforberedelse blev visualiseret af blå lys ved gennemlysning efter SDS-PAGE. Kavalergang reaktion blev udført af-løsning fordøjelsen. (B) umiddelbart efter siden, kun nondenatured proteiner kunne være opdaget i gel UV belysning, mens efter fjernelse af SDS, de tidligere denatureret fluorescerende proteiner blev delvist renatured og kan spores. Prøverne blev udarbejdet fra supernatanter af Ni-NTA magnetisk-perle-baserede analyse. (C) Coomassie farvning kan også bruges til påvisning af protein, efter i-gel genopretning. SDS-stede i gel-kan forårsage den delvise denaturering af indfødte protein, men i native prøver, de nondenatured former er mere rigelige. Prøverne blev udarbejdet fra supernatanter af Ni-NTA magnetisk-perle-baserede analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 8
Figur 8 : 96 brønde plade-baserede tilpasning af assay platform. (A) analysen kan udføres, ikke kun i 2 mL rør men i wells af en 96-brønd plade, så godt. Her viser vi den skematisk repræsentation for anvendelse af analysen at studere en fiktiv protease specificitet ved hjælp af en serie af fluorescerende substrater, som kan indeholde wild-type (wt) eller muterede (mut-1-mut-4) kavalergang site sekvenser. Til håndtering af de magnetiske perler, er en 96-brønd kompatibel magnetiske partikel koncentrator (MPC) skal anvendes i eksperimenter. Alle de anførte mængder er relateret til en enkelt brønd. For at sammenligne kavalergang effektiviteten af de forskellige substrater, kan substrat omdannelse vurderes ud fra procentdelen af substrat-blank-korrigeret RFU værdier af reaktion prøver, overvejer substrat-blank-korrigeret RFU værdier af de relaterede substrat kontrolprøver som 100. (B) efter fluorimetry, de adskilte analysere af analysen prøver kan også analyseres af side og fluorescerende proteinkomponenter kan analyseres direkte eller efter-gel genopretning i tilfælde af nondenaturing og denaturering prøve forberedelse, henholdsvis. De tre forskellige assay prøve typer er også illustreret i hver figur: C = substrat kontrol, B = substrat tom, og R = reaktion. Substrat kontrolprøver er i eluering buffer, mens Tom substrat og reaktion prøver i kavalergang buffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Buffer Fluorescerende proteiner CV % af pisterne (%)
Eluering mTurquoise2 6,04
Kavalergang 9,11
Eluering mApple 10.92
Kavalergang 12,68

Tabel 11: koefficient for afvigelsesværdier (CV %) på skråninger af substrat kalibreringskurver. For at teste, om fluorescens af rekombinante protein substrater er afhængig af webstedet indsatte kavalergang, blev kalibreringer udført af række mApple - og mTurquoise2-smeltet substrater (seks varianter for hver, der indeholder forskellige kavalergang site sekvenser af HIV-1 protease), begge i eluering og kavalergang buffere. Vi fandt, at CV % værdier af skråninger er under 15% i alle tilfælde, som indebærer, at et enkelt substrat kalibrering kan udnyttes til evaluering af de forskellige målinger foretaget af substrat varianter indeholder samme fluorescerende tag.

Discussion

På grund af de intensive industrielle og akademiske undersøgelser af Proteolytiske enzymer og de konstante krav om hurtig og billig HTS-kompatible protease assay platforme i overensstemmelse hermed, har vi udviklet en magnetisk-perle-baserede fluorescerende protease assay. Analysen er baseret på brugen af rekombinant fusion proteiner, som kan være nye alternativer til almindeligt udnyttede syntetiske peptid substrater.

I formatet udviklede assay er fusion protein substrater immobiliseret på overflader af Ni-Chelat-belagt magnetiske Agarosen perler. Substrat udlæg er fastsat af N-terminalen hans6 affinitet tag fusion protein, som er direkte smeltet til en MBP tag for at lette den foldning og øge vandopløseligheden af substrat13. MBP er efterfulgt af kavalergang lokaliteter af TEV PR og en protease af interesse. Den tidligere kan tjene som en kontrol kavalergang site i analysen, mens sidstnævnte kan behandles af protease skal undersøges. Webstedet kavalergang er udskiftelige; en kort dsDNA sekvens kodning for webstedet spaltning af interesse kan indsættes i den fleksible kloning kassette af udtryk plasmid af ligatur. Rekombinant fusion proteiner indeholder en yderst stabil, monomere fluorescerende proteiner tag på C-terminal, som gør det muligt for slutpunkt påvisning af de enzym-befriet, fluorescerende C-terminale spaltningsprodukter frigives ved proteolytiske spaltning ( Figur 1A). De renset fluorescerende intakt substrater løst i forskellige buffere bruges også til kalibrering til at vurdere de molære substrater og spaltningsprodukter. Derudover efter fluorimetry, kan assay komponenter analyseres af SDS-PAGE, så godt. Begge (nondenatured) native og denaturerede fluorescerende proteiner kan visualiseres i gelen, umiddelbart efter elektroforese eller efterfølgende i-gel genopretning, henholdsvis. Denne ekstra procedure-i kombination med en konventionel Coomassie strålende blå farvning-kan anvendes effektivt til kontrol af analyse resultater (figur 1B).

Analyseprocedure består af enkle, let at udføre trinnene i en lav-volumen format, der kan være fuldt ud tilpasset til en høj overførselshastighed automatisk miljø. Dog anses uafhængigt fra at udføre analysen, enten manuelt eller med en automatiseringssystem, følgende dele af analysen for at være af afgørende betydning og har brug for særlig opmærksomhed under udførelsen af proceduren. i) ensartethed af magnetisk bead løsning. En homogen magnetisk bead løsning skal anvendes i hele analysen, både i oprensning og vaske trin. Især, afhænger pålideligheden af protease assays stærkt af korrekt aliquoting stamopløsninger substrat-attached magnetisk bead (SAMB). For at øge effektiviteten af suspension og spredning, anbefales det at indstille perle fusion mellem 2% og 10% (v/v). Under prøveforberedelse, brug af buffere suppleret med nonionisk detergent (såsom Triton X-100 eller Tween 20) op til 2% kan også mindske overholdelsen af de magnetiske perler af plast overflader. Overholdelse af perlerne til væggene i stikprøven hætteglas kan undgås, hvis perle suspensioner anvendes forsigtigt på bunden af hætteglas i stedet for på vægge af prøveglassene. Homogenitet af de magnetiske perler under enzymatisk reaktion er også kritisk og kan sikres ved løbende at ryste prøverne på 600 rpm under inkubation. Perler er korrekt spredt i afrundede eller fladbundede plast bagværk, mens brugen af V-bund hætteglas ikke anbefales. En suboptimal resultat forårsaget af forkert perle homogenisering er repræsenteret i figur 4B. II) ophør af reaktion prøver.  En anden fordel ved metoden er at den enzymatiske reaktion kan opsiges uden brug af denaturering varmebehandling eller ethvert potentielt interfererende kemiske agenser15. Opsigelse kan foretages blot ved at adskille de magnetiske perler fra reaktionsmiljøet, ved hjælp af en konventionel magnetiske partikel koncentrator. Mens fjernet reaktion bufferen indeholder det aktive enzym og de genererede C-terminale fluorescerende spaltningsprodukter, forbliver de uncleaved substrater knyttet til perlerne. På grund af tilstedeværelsen af det aktive enzym i reaktion buffer skal adskillelse procedure udføres omhyggeligt for pålidelig slutpunkt påvisning. Før du placerer prøve hætteglas til koncentratoren, anbefales det at anvende et kort spin centrifugering. Efter markedsføring af rør i koncentratoren, give mindst 15 s for perler skal indsamles. Lille bevægelse i den separator og tilbage kan lette indsamlingen af perlerne. Overvej venligst at under en manuelt udførte separation, opsigelse normalt tager mere tid end indledningen af reaktionerne. Derfor anbefales en ca. 2 min. registreret forsinkelse mellem Indvielserne hvis den samme inkubationstiden skal anvendes på alle prøver.

Princippet om den beskrevne proteolytiske assay er forholdsvis simpelt; men alsidighed i systemet er garanteret af den fleksible og stabile substrat struktur. Den enkelte optimering af analysen kan begrænses kun af affinitet perler forenelighed med de anvendte betingelser, reagenser og tilsætningsstoffer. I overensstemmelse med producentens protokol fandt vi også, at affinitet bindingen af substrater til Ni-NTA perle overflader væsentligt svækker på pH ≤ 6,515. Derfor anbefales det at anvende substrat blindprøver parallelt med reaktion prøver, og satsen for spontan substrat dissociation skal tages i betragtning under evalueringen af resultaterne.

I de tilfælde, hvor magnetisk-perle-baserede assays ikke kan udføres på grund af brugen af perle-uforenelige komponenter eller en lav pH, kan i løsning fordøjelse af de oprensede rekombinant substrater anvendes også. I disse tilfælde reaktion blandinger kan analyseres ved elektroforese, og proteinerne kan visualiseres i gelen baseret på den beskrevne protokol. For at undersøge proteolytiske aktivitet, kan i løsning fordøjelse og i-gel påvisning af proteiner også være alternative redskaber i fluorimetry. En nyhed af designet substrat-systemet er anvendelsen af en i-gel genopretning trin efter denatureringen SDS-PAGE. Mens indfødte (nondenatured) fluorescerende proteiner, bevarer deres fluorescens under elektroforese er egenskaben fluorescerende afskaffet ved denaturering (figur 7B). Dog kan fluorescens af denaturerede proteiner inddrives delvist ved fjernelse af SDS fra gel. Således, en adskillelse af reaktion komponenter ved hjælp af denaturering betingelser gør ikke kun fluorescens-baseret men identifikationen Molekylær-vægt-baserede muligt. En anden fordel ved fluorescerende i-gel påvisning i forhold til analysen af en Coomassie farvede gel er, at de (native eller renatured) fluorescerende proteiner let kan identificeres i gelen baseret på deres fluorescens (Se figur 7). Dette kan være vigtigt, hvis kavalergang reaktioner er udført i prøver indeholdende nonfluorescent forurenende stoffer eller protein, der meget ligner Molekylær vægten af hinanden.

Protease assays bruger ligeledes designet substrater er allerede blevet offentliggjort tidligere8,9,10, og selv om webstedet spaltning af interesse i disse sager var også placeret mellem en affinitet tag og en fluorescerende proteiner, assay systemet præsenteret her ikke kun gentager de beskrevne ideer men kombinerer de forskellige fordele ved de tidligere platforme og også afslutter dem med yderligere forbedringer: i) udnyttelsen af en MBP fusion partner, ii) den tilstedeværelsen af en TEV PR kontrol kavalergang site, iii) brugen af nyligt manipuleret monomere FPs, og iv) anvendelse af en unik substrat kalibreringsmetode. Analysen, selv var specielt designet til at være nyttig for enzymet specificitet og kinetiske studier i en sikker, tid - og omkostningseffektiv måde, uden behov for dyre instrumentation. Metoden har til formål at være et egnet og billig værktøj for både industrielle og akademiske forskningsformål. På grund af fleksibilitet i kloning kassetten af udtryk plasmid, kan systemet være velegnet til hurtig og billig generation af rekombinant substrat biblioteker. Den heri beskrevne assay er et muligt redskab til gennemførelsen af substrat specificitet, enzym mutagenese, og hæmning undersøgelser og også give et alternativ til at udføre enzymkinetik. Assay platform (fra bakteriel celle forstyrrelser til bestemmelse af kinetiske parametre) kan tilpasses til en HTS - og automatisering-baseret miljø og potentielt, kan der anvendes i industrielle protease inhibitor screening og/eller antiviral medicin udvikling. Tilpasning af assay for konkurrencedygtige proteolyse er derudover også fremover omfanget af vores laboratorium. I sådan en konkurrencedygtig assay, to forskellige substrater-hver indeholder en forskellig kavalergang site smeltet til en forskellige C-terminale fluorescerende tag-er beregnet til at bruges samtidig i de samme kavalergang reaktion for at undersøge præference i den undersøgte enzym til de givne mål sekvenser. Desuden er brug af en 96-brønd plade-tilpasset assay form (figur 8) også at være optimeret til mutation screening ved hjælp af en række substrater med modificerede kavalergang site sekvenser i tilfælde af cystein proteaser.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Værket var delvist understøttet af GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "PHARMPROT teaming" projekt og også finansieres af videregående institutionelle Excellence-programmet af ministeriet af menneskelige kapaciteter i Ungarn, inden for rammerne af den Bioteknologi tematiske program af University Debrecen. Forfatterne er taknemmelig for medlemmerne af det laboratorium for Retroviral biokemi for deres videnskabelige hjælp under assay udvikling og også for deres tålmodighed under optagelserne assay (især til Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz og Vanda Toldi, der vises i baggrunden i videoen). Forfatterne vil også gerne sige særlig tak til Gedeon Richter Plc., især til Dr. Zoltán Urbányi for at tillade Beáta Bozóki arbejde i Institut for biokemi og molekylærbiologi som en Gæsteforsker. Forfatterne ønsker også at udvide deres taknemmelighed over for György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi og Zoltán Király fra multimedie- og E-learning Center for teknisk af Universitet Debrecen for den faglige bistand i lyd og video produktion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10K Amicon tubes Merck-Millipore UFC501096
2-Mercaptoethanol (β-ME) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  M6250
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 Bio-Rad 1610148
Acetic acid  Merck 100063
Agarose SERVA 11404.04
Alpha Imager HP gel documentation system ProteinSimple
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  A3678
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  A9518
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge Beckman Coulter 392185
Black half-area plates Greiner bio-One 675086
Bromophenol blue Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  B0126
CutSmart buffer (10x) New England Biolabs B7204S For plasmid linearization (step 1.1.1)
Dark Reader transilluminator Clare Chemical Research DR-45M
DNase I  New England Biolabs M0303L
Dynamag-2 magnetic particle concentrator Thermo Fischer Scientific 12321D
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells  Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) C600003
Ethanol Merc-Millipore 100983
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  798681
Gel Loading Dye, Purple (6X) New England Biolabs B7024S
Glycerol Merck 356350
Glycine Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  G7126
High-Speed Plasmid Mini Kit GeneAid PD300
Imidazole Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  56750
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) AM9464
Jouan CR 412 centrifuge Jouan CR412
Labinco LD-76 Rotator  Labinco 7600
Luria-Bertani (LB) broth Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  L3022
Lysozyme  Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  L6876
Magnesium chloride Scharlau MA0036
MERCK eurolab ultrasonic bath MERCK USR54H
Millifuge Eppendorf spin centrifuge Millipore CT10
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell Bio-Rad
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  T9281
NanoDrop 2000 Thermo Fischer Scientific
NheI-HF restriction endonuclease New England Biolabs R3131L
Nickel(II) sulfate (NiSO4) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  656895
Ni-NTA magnetic agarose beads  Qiagen 36113
Orbital shaker Biosan OS-20
PacI restriction endonuclease New England Biolabs R0547L
PageBlue Protein Staining Solution  Thermo Fischer Scientific 24620
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  P7626
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes  Eppendorf 22431102
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
Snijders Press-to-Mix shaker  Gemini 34524
Sodium-acetate trihydrate Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S7670
Sodium-chloride Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S9888
Sodium-hydroxide  Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S5881
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain Thermo Fischer Scientific S7563
T4 DNA ligase Promega M180A
Thermo shaker Biosan TS-100 with SC-24 accessory block
Tris Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  T1503
Tween 20 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  P2287
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter Wallac Oy, Turku, Finland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meldal, M. Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition. Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).
  2. Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).
  3. Zhang, G. Protease assays. The Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda, MD. (2012).
  4. Woelcke, J., Hassiepen, U. Fluorescence-based biochemical assay formats. A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. Chen, T. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2010).
  5. Richardson, P. L. The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development. Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).
  6. Diamond, S. L. Methods for mapping protease specificity. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).
  7. Schilling, O., Overall, C. M. Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites. Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).
  8. Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates. Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).
  9. Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).
  10. Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate. Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).
  11. Branchini, B. R., et al. Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).
  12. Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases. Microbial Cell Factories. 13 (1), 44 (2014).
  13. Fox, J. D., Waugh, D. S. Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).
  14. Bozóki, B., et al. A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening. Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).
  15. Mótyán, J. A., Miczi, M., Bozóki, B., Tözsér, J. Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates. Data in Brief. 18, 203-208 (2018).
  16. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15, 47-51 (2018).
  17. Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains. PLoS One. 8, e75991 (2013).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).

Tags

Biokemi spørgsmålet 143 rekombinant fusion protein substrat protease assay Ni-NTA magnetiske Agarosen perler fluorescerende proteiner i-gel genopretning human immundefekt virus type 1 protease
Brug af rekombinant Fusion proteiner i et fluorescerende Protease Assay Platform og deres i-gel genopretning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bozóki, B., Mótyán,… More

Bozóki, B., Mótyán, J. A., Miczi, M., Gazda, L. D., Tőzsér, J. Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation. J. Vis. Exp. (143), e58824, doi:10.3791/58824 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter