Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bruk av rekombinant Fusion proteiner i en fluorescerende Protease analysen plattform og deres i-gel-Renaturation

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58824
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Biotechnology Research Department, Gedeon Richter Plc
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi den detaljert prosedyren en nylig utviklet protease analysen plattform N-terminal hexahistidine maltose-binding protein og fluorescerende protein-smeltet rekombinant underlag festet til overflaten av nikkel-nitrilotriacetic Acid magnetiske agarose perler. En påfølgende i-gel analyse av analysen prøvene med natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese er også presentert.

Abstract

Proteaser er intensivt studerte enzymer på grunn av deres viktige roller i flere biologiske banene levende organismer og patogenesen; Derfor er de stoffet mål. Vi har utviklet en magnetisk-agarose-perle-baserte analysen plattform for etterforskningen av proteolytisk aktivitet, som er basert på bruk av rekombinant fusion protein underlag. For å demonstrere bruk av denne analysen systemet, presenteres en protokoll på eksempel på humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) protease. Introdusert analysen plattformen kan brukes effektivt i biokjemiske karakterisering av proteaser, inkludert enzym aktivitet målinger i mutagenese, kinetic, hemming eller spesifisitet studier, og det kan være egnet for høy gjennomstrømming substrat screening eller kan tilpasses andre proteolytiske enzymer.

I denne analysen system, anvendt substrater inneholder N-terminal hexahistidine (hans6) og maltose bindende protein (MBP) koder, cleavage nettsteder for tobakk etse virus (TEV) og HIV-1 proteaser og en C-terminalen fluorescerende protein. Substrater effektivt kan produseres i Escherichia coli celler og renset lett med nikkel (Ni) - chelate - belagt perler. Under analysen fører proteolytisk spalting av perle-vedlagt underlag til utgivelsen av fluorescerende cleavage fragmenter, som kan måles ved fluorimetry. I tillegg kan cleavage reaksjoner analyseres av natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side). En protokoll for i-gel-renaturation analysen komponenter er også beskrevet som delvis renaturation fluorescerende proteiner gjør gjenkjenningen basert på molekylvekt og fluorescens.

Introduction

Proteolytiske enzymer tilhører de mest intenst undersøkt enzym gruppene på grunn av deres betydning i metabolske veier og industrielle applikasjoner, samt. Deres sentrale rolle i sykdommer, regulering av blodpropp, kreft, og hjerte og nevrodegenerative sykdommer gjør proteaser fremtredende mål innen medisiner. Derfor, detaljert karakterisering av underlaget spesifisitet og hemmer profilere protease (PR) rundt er avgjørende og utføres fortrinnsvis av rask, kostnadseffektiv og robust biokjemiske analyser1,2, 3.

I dag, det store flertallet av i vitro protease analyser brukes i feltet i stoffet funnet for sammensatte profilering er homogen, fluorescerende peptid-baserte og høy gjennomstrømming screening (HTS)-kompatible plattformer4. Videre merket peptider er ikke bare egnet for biblioteket screening, men de tilbyr også gode verktøy for fastsettelse av enzymet kinetic parametere for de valgte underlag. I andre tilfeller der merking av underlaget ikke er mulig, kan separasjonsbaserte analyser gi en mulig løsning for å vurdere kinetic egenskapene proteolytisk reaksjoner3.

Vanligvis i vitro protease analyser er basert på bruk av to typer substrat: korte peptider eller hele proteiner. I de tilfellene der i spalting av kort peptid sekvenser gjenspeiler egenskapene cleavage tilstrekkelig, følgende standard fremgangsmåter gjelder: (i) å undersøke standard protein underlag som oksidert insulin B-kjeden, (ii) testing kommersielt tilgjengelige underlag av andre proteaser, (iii) screening syntetiske og fluorescently merket peptid biblioteker av kombinasjon kjemi, eller (iv) med genetiske metoder, for eksempel biologisk vise teknologier5, 6. Konvensjonelle klassifiseringen, andre roman plattformer er også tilgjengelig for substrat generasjon (f.eks dannelsen av proteom-avledet peptid biblioteker7 eller spesielle undergrupper av genetiske metoder, som rekombinant fusjon protein-basert underlag8,9,10,11,12).

Alle de ovennevnte substrat typer og analyser har sine egne fordeler og begrensninger, og utviklingen av analysen formater kombinere og/eller forbedre fordelene av kjente plattformene er fortsatt etterspurt. Her beskriver vi en protokoll for en separasjonsbaserte fluorescerende protease analysen, som utnytter rekombinant underlag. Disse fusion proteinene består av6 og MBP tags smeltet sammen til en kontroll cleavage nettsted TEV PR, som er etterfulgt av underlaget sekvensen av interesse som er direkte koblet til en C-terminalen fluorescerende protein (FP) (figur 1A). Kloning av en DNA sekvens koding for en kløv område av interesse i 'kloning kassetten' kan utføres av en enkelt ligatur reaksjon i uttrykket plasmider, som har vært linearized tidligere av begrensning endonucleases.

Figure 1
Figur 1: Prinsippet om fluorescerende protease analysen. (A) den skjematisk fremstilling av en fluorescerende substrat og dens spalting av humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) protease vises. Pilen viser cleavage posisjon innenfor matrise/kapsid cleavage området sekvensen HIV-1 protease (VSQNY * PIVQ). (B) den selvlysende fargen underlag kan brukes å analysere enzymreaksjoner av Ni-NTA magnetisk-perle-baserte analysen og polyakrylamid gel geleelektroforese, også, som vises i Arbeidsflytdiagrammet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Selv om proteolytisk analyser med lignende rekombinante proteiner underlag som inneholder en affinitet kode, et proteolytisk cleavage nettsted og en fluorescerende protein-ha allerede blitt beskrevet8,9,10, systemet presenteres her har til hensikt å integrere og forbedre fordelene av disse metodene. En viktig forskjell er at fusion protein substrater i denne analysen plattformen er utstyrt med MBP å forbedre protein løselighet13 og inneholde en kontroll cleavage nettsted for TEV PRs. Videre inneholde substrater ny generasjon fluorescerende proteiner, som er svært stabil og har en monomerisk form for å hindre substrat aggregering. Foruten tidligere publiserte anvendelse av mTurquoise2 - og mApple-smeltet skjemaer14vise her vi også resultatet gitt ved bruk av en rekombinant substrat som inneholder en monomerisk forbedret gule fluorescerende protein (mEYFP) fluorescerende tag. Herved vi viser kompatibiliteten til systemet med andre fluorescerende proteiner og representerer noen generelle typer resultater som kan oppnås med protease analysen.

Rekombinant fusion proteiner er uttrykt i E. coli BL21(DE3) celler og brukes som underlag for analysen i en nikkel-nitrilotriacetic syre (Ni-NTA)-belagt magnetiske agarose-perle-tilknyttet skjema. C-terminalen cleavage produktene er frigjort fra perle overflaten i nedbryting på spalting av protease rundt. Etter separasjon av nedbryting (inneholder enzymet og cleavage produktene) fra de magnetiske perlene, kan fluorescensen bli målt for å fastsette egenskapene spalting av enzymet. I motsetning til metodene beskrevet tidligere er i systemet presenteres her, mengden substrat og C-terminalen cleavage produkter unikt kvantifisert basert på en detaljert substrat kalibreringsprosedyren. Analysen systemet kan støttes av en SDS side analyse av analysen prøver; en etterfølgende fluorescerende i-gel visualisering kan brukes umiddelbart etter geleelektroforese eller i-gel-renaturation av nondenatured og denaturert fluorescerende komponentene, henholdsvis14.

Fleksibilitet og struktur av 'kloning kassetten' tillate en tid - og kostnadseffektiv innsetting av en rekke ulike sekvenser i Konstruer og dermed fremmer generering av underlaget biblioteker. Siden alle analysen er og HTS-automatiseringskompatibelt, kan systemet være spesielt attraktivt for, for eksempel protease spesifisitet mål og mutagenese studier, eller det kan også effektivt benyttes for industriell protease hemmer screening og/eller antiviral stoffet utvikling, også.

Enzym kinetic parametere (kkatten, K-m) kan bestemmes av utviklet separasjonsbaserte analysen; Det kan derfor være egnet til å utføre enkelte enzym kinetic målinger, som tid-kurset, substrat-avhengige og hemming studiene. Dette beviser at rekombinant fusion protein substrater gir gode alternativer for ofte benyttet syntetiske oligopeptide underlag, og på grunn av deres høye likhet med polyprotein substrater, de representerer den naturlig forekommende enzym-underlaget interaksjoner mer nøyaktig.

Protocol

1. generasjon substrat-koding uttrykk plasmider

  1. Linearize pDest-hans6- MBP-FP uttrykk plasmider av PacI og NheI begrensning endonucleases. For generering av pDest-hans6- MBP-FP, kan du se Bozóki et al.14.
    1. Legge til 1,500-2,000 µg av pDest-hans6- MBP-FP uttrykk plasmider, 2 µL hver av PacI og NheI begrensning endonucleases, 10 µL 10 x-bufferen (se Tabell for materiale), og nuclease-fritt vann (NFW) til 100 µL i et microcentrifuge rør.
    2. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 1 time.
  2. Legge til 20 µL av 6 x DNA lilla lasting fargestoff til reaksjonsblandingen og Skill cleavage produktene med geleelektroforese, med 1% agarose gel. Bruke en 1 kB DNA stige som standard.
  3. Skyll gel i 15 min i 20 mL TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM eddiksyre, 1 mM EDTA, pH 8.5) inneholder 20 µL SYBR grønne løsning og avgiftsdirektoratet av lineær plasmider av agarose gel, bruke et kraftig verktøy.
    Merk: Mens belyst gel av en mørk-lesing blå transilluminator (DRBT), lineær pDest-hans6- MBP-FP plasmider vises som en diskret og lyse bånd rundt 7-8 kB.
  4. Rense linearisert uttrykk plasmider fra gel stykket ved hjelp av en gel utvinning utstyr i henhold til produsentens instruksjoner.
  5. Sett inn substrat sekvensen i lineær pDest-hans6- MBP-FP uttrykk plasmider.
    1. Anneal fremover (FWD) og omvendt (REV) E. coli codon-optimalisert oligonucleotide primerne koding for substrat sekvensen av interesse.
      Merk: Glødet primerne blir flankert av sammenhengende endene tilsvarer PacI og NheI begrensning endonuclease cleavage områder (figur 2).
      1. Mix 150 ng av lineær uttrykk plasmider med 200 ng FWD og 200 ng av REV oligonucleotide primere i en 0,2 mL polymerasekjedereaksjons (PCR) rør og juster volumet til 17 µL ved å legge til NFW.
      2. Inkuber blandingen på 65 ° C i 2 minutter, og deretter på 4 ° C i minst 2 minutter.
    2. Utføre innsetting glødet primerne linearisert plasmider hemorroider.
      1. Legge til 2 µL av T4 ligase buffer (10 x) og 1 µL av T4 ligase blandingen inneholder linearisert plasmider og glødet primerne.
      2. Inkuber ligation blandingen ved 16 ° C i 16 h.

Figure 2
Figur 2 : Oligonucleotide primere koding for en proteolytisk cleavage området sekvens. Forover og bakover grunning kode i VSQNY * PIVQ cleavage området sekvens av HIV-1 PR. Etter annealing utfyllende oligonucleotide primere, inneholder kort double-strandet DNA klissete ender, tilsvarende som i PacI og NheI begrensning endonucleases. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Transformere 100 µL BL21(DE3) kompetent celler av 5 µL av hemorroider blanding og spre cellene i lysogeny kjøttkraft (LB) agar plater som inneholder ampicillin.
    Merk: Fluorescerende proteiner vil være i samme åpent lesing rammen med N-terminal fusion kodene etter en vellykket ligation. Noen dager etter transformasjon, viser koloniene (inneholder uttrykk plasmider koding for innsatte cleavage stedet av interesse) synlig fluorescens med eller selv uten å bruke en DRBT.
  2. Forberede glyserol lager fra avbildet koloniene.
    1. Vask en diskret koloni i en 50 mL sentrifuge rør som inneholder 5 µL av LB medium som inneholder ampicillin (i en siste konsentrasjon 100 µg/ml).
    2. Inkuber det ved 37 ° C i 8 timer mens kontinuerlig riste på 220 rpm; deretter høste celler med sentrifugering 1000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    3. Forsiktig suspendere cellene i 1 mL av 80% glyserol løsning (utvannet med destillert vann) og legge til 500 µL av 10 mM MgCl2 løsning suspensjon.
    4. Overføre suspensjon slik frysing og lagre aksjer på-70 ° C.
  3. Kontrollere rekkefølgen på den genererte plasmider ved DNA sekvensering.
    1. Legge til 10 µL av glyserol aksjer (forberedt i trinn 1.7) 5 mL av LB medium som inneholder 100 µg/mL ampicillin i et 50 mL sentrifuge rør.
    2. Inkuber suspensjon på 37 ° C 16 h mens kontinuerlig riste på 220 rpm; deretter høste celler med sentrifugering 2000 x g i 10 min på 4 ° C.
    3. Isolere uttrykk plasmider fra cellen pellet av en plasmider miniprep kit (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens instruksjoner, og bruk den renset plasmider for DNA sekvensering.
      Merk: For sekvensering, 5'-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3 "(fremover) og 5-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3" (bakover) oligonucleotide primere kan brukes.

2. uttrykk for fluorescerende substrater

  1. Forberede av startkulturer.
    1. Legge til 10 µL av glyserol aksjer (forberedt i trinn 1.7) 5 mL av LB medium som inneholder 100 µg/mL ampicillin i et 50 mL sentrifuge rør.
    2. Inkuber suspensjon på 37 ° C i 15 timer mens kontinuerlig riste på 220 rpm.
  2. Overføre bakteriell kultur (5 mL) til 50 mL av fersk LB medium som inneholder 100 µg/mL ampicillin i en 500 mL steril Erlenmeyer kolbe.
  3. Vokse cellene på 37 ° C til en absorbansen av 0,6 0,8 på en 600 nm bølgelengde, mens kontinuerlig riste på 220 rpm.
    Merk: Hvis en tetracycline behandling brukes på trinn 2.5, det anbefales ikke å vokse cellene til en absorbansen på mer enn 0,6 på 600 nm.
  4. Legge til isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mM endelige konsentrasjonen å indusere protein uttrykk.
  5. Hvis en tetracycline behandling ikke brukes, ruge kultur for 3t på 37 ° C mens kontinuerlig riste på 220 rpm og fortsette protokollen trinn 2.6. Hvis en tetracycline behandling brukes, Fortsett protokollen med trinn 2.5.1-2.5.3.
    Merk: Noen FPs produsert av E. coli celler kan ha lengre modning tid (se tidligere arbeid)16,17; i disse tilfellene kan protein oversettelsen være valgfritt arrestert av tetracycline behandling, for å øke fluorescerende avkastningen av substratløsningen.
    1. Inkuber celle suspensjon for 2t på 37 ° C mens kontinuerlig riste på 220 rpm; deretter legge til en tetracycline løsning (i en siste konsentrasjon av 200 µg/mL).
    2. Inkuber cellekultur etter modning da fluorescerende protein valgfrihet ved 37 ° C, mens kontinuerlig riste på 220 rpm.
  6. Overføre 2 x 25 mL kulturen å rengjøre 50 mL sentrifuge rør og høste celler med sentrifugering 4000 x g i 15 min på 4 ° C.
  7. Forkaste nedbryting og lagre bakteriell celle pellets ved-70 ° C i minst 1 time.
    Merk: Celler som inneholder uttrykt fluorescerende substrater Vis synlige fluorescens med eller selv uten å bruke en DRBT.

3. celle avbrudd

  1. Plasser den frosne celle pellet på is og la det tine i 15 min.
  2. Legge til 2 mL lyseringsbuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 10 mM imidazole 0,05% mellom 20, pH 8) i pellet og suspendere cellene.
  3. Legge til 10 µL av ferskt tilberedte phenylmethanesulfonyl-fluor (PMSF) protease hemmer løsning (8.7 mg/mL, oppløst i etanol) suspensjon.
  4. Legg 2 mg av lysozyme, 20 enheter av DNase til suspensjon og stoppe den.
  5. Inkuber suspensjon på is 15 min og vortex det noen ganger.
  6. Overføre 2 x 1 mL av suspensjon til 1,5 mL microcentrifuge rør og sonicate suspensjon for 3 min, i runder av 10 s sonication og 5 s av hvile.
  7. Sentrifuge rørene på 10.000 x g for 20 min ved romtemperatur; deretter fjerne fluorescerende nedbryting (ryddet bakterielle celler lysate) nøye fra hver rør og overføre den til nye microcentrifuge rør.
    Merk: Lysates med fluorescerende underlaget Vis synlige fluorescens med eller selv uten å bruke en DRBT og kan lagres på 4 ° C 2 uker. Må ikke fryses det. Ryddet lysates kan benyttes for eksempel forberedelse i protease analysen (se avsnitt 4.1) eller også kan brukes til substratet rensing (se trinn 4.5.1).

4. Ni-NTA magnetisk-perle-baserte protease analysen

Merk: På grunn av fleksibiliteten til analysen plattformen, det kan være optimalisert til mange forskjellige typer studier. Denne grunn og på grunn av forskjellen i aktivitet frekvensen av enzymer valgfrihet, noen av parameterne analysen (der det er merket) ikke kan eksplisitt beskrives men må optimaliseres til personlige mål og eksperimentell design. Som en veiledning, er parametere av enkelte typer studier merket på bestemt trinnene.

  1. Eksempel forberedelse
    1. Generasjon av underlaget tilknyttet magnetiske perler
      1. Plass en lukket 2 mL lav-protein-binding (se Tabell for materiale) microcentrifuge rør som inneholder ny eller resirkulert (se avsnitt 4.7) Ni-NTA magnetiske agarose perler i en magnetiske partikler konsentrator (MPC).
        Merk: Hvor mye brukt perle suspensjon er angis basert på eksperimentell design. Vi brukte 1 mL av magnetiske perle løsning (5%, v/v) på hvert eksperiment.
      2. Perlene kan feste til veggen og/eller i lokket på microcentrifuge røret; derfor slå MPC opp-ned i alle retninger å sørge for at alle perler er samlet.
      3. Fjern nedbryting og kaste den.
      4. Vask perler av lyseringsbuffer.
        1. Legge til 1,8 mL lyseringsbuffer perler og fjerne lukket røret fra MPC.
        2. Avbryte perlene røret ved risting og/eller snu rør opp-ned til prøven er helt homogen.
        3. Sett røret tilbake til MPC og slå det opp-ned å samle perler.
        4. Åpne røret og kast nedbryting.
      5. Legge til 1.0-1.8 mL de ryddet lysate (forberedt i trinn 3.7) perler og fjerne røret fra MPC.
      6. Slå lukket røret opp-ned til perlene er helt homogen og roter sakte røret et rotator ved romtemperatur for 30 min.
      7. Plasser den i MPC og fjerne ryddet cellen lysate fra perler og lokket.
        Merk: Cellen lysate kan forkastet eller lagret for videre bruk (se notatet etter trinn 3.7).
      8. Legge til 1% mellom 20 (pH 7) til underlaget tilknyttet magnetiske perler (SAMBs).
        Merk: SAMBs vise synlig fluorescens med eller selv uten å bruke en DRBT.
    2. Vask av SAMBs
      1. Sett røret med SAMB suspensjon i MPC og kast nedbryting.
      2. Vask SAMBs 3 x med hver buffer: i) 1,8 mL 1% mellom 20 (pH 7); II) 1,8 mL vaske bufferen (50 mM NaH2PO4300 mM NaCl 5 mM imidazole, 0,05% mellom 20, pH 7); III) 1,8 mL cleavage bufferen (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,05% mellom 20, pH 7).
        Merk: Vask fremgangsmåten, kan du se trinn 4.1.1.4. Kløv bufferen kan endres etter eksperimentelle behov, men det anbefales å sjekk manualen til Ni-NTA magnetiske perler å finne kompatibiliteten.
    3. Tilberedning av SAMB lager
      1. Legge til en cleavage buffer vasket SAMBs opprette en SAMB lagerløsning.
        Merk: Etter at bufferen, ikke riste eller slå røret opp-ned. Volumet av cleavage bufferen avhenger av individuelle eksperimentell design og må beregnes basert på antall magnetiske perler (se trinn 4.1.1.1) og volumene skal brukes i trinn 4.1.4.2. 2 mL rør, brukt volumet er opptil 1900 µL (se tabell 1). Anbefalte magnetiske perle tettheten av SAMB lager løsningen er 2% - 10% (v/v).
        Studere type Volum til spalting bufferen (µL)
        S-avhengige målinger (figur 4) 1600
        Tid-retters målinger (figur 5A) 1600
        Hemming studie (Fig 5B) 1900
        pH avhengighet study (Fig 6) 1400

        Tabell 1: Antall cleavage bufferen å forberede SAMB lager løsningen i ulike målinger.
      2. Fjern lukket røret fra MPC. Bruke SAMB lager løsningen umiddelbart eller lagre den på 4 ° C i opptil 24 timer.
    4. Generasjon av analysen eksemplene bruker SAMB lager løsningen
      Merk: Detaljene i denne delen av analysen er sterkt avhengig av den enkelte eksperimentell designen (eksempel typer er vist i tabell 2).
      Eksempel type Notater
      Reaksjon utvalg (R) -brukes for å vurdere cleavage egenskaper
      -inneholder både enzymet og underlaget cleavage buffer
      Substrat tom utvalg (B) -brukes for å vurdere spontan substrat dissosiasjon (se trinn 4.6.2)
      -inneholder bare underlaget cleavage buffer
      Substrat kontroll prøven (C) -for detemining substrat konsentrasjon (se trinn 4.6.3)
      -inneholder bare underlaget i elueringsbufferen

      Tabell 2: Eksempel typer Ni-NTA magnetisk-perle-baserte protease analysen.
      1. Forberede 2 mL av lav-protein-bindende microcentrifuge rør analysen prøver.
        Merk: Andre lav protein bindende plast varer kan også brukes. Bruke runde eller flat bunn rør for å sikre fri bevegelighet av SAMBs. Se anbefalte antallet rør i tabell 3.
        Studere type R B C
        S-avhengige målinger (figur 4) 5 5 2
        Tid-retters målinger (figur 5A) 6 6 2
        Hemming studie (Fig 5B) 7 7 1
        pH avhengighet study (Fig 6) 5 5 1

        Tabell 3: Antall nødvendige 2 mL microcentrifuge rør for hver eksempel i demonstrert studiene.
      2. Suspendere SAMB lager løsningen til homogenitet og overføre mengden substrat som skal analyseres i reaksjoner umiddelbart inn prøven hetteglass. Anbefalte volumet er 25-300 µL, men det er i henhold til individuelle eksperimentell design (Tabell 4).
        Merk: Se hvis alle SAMBs har blitt målt i bunnen av rør. SAMBs kan holde seg til veggen av røret, som kan forvrenge analyseresultatene. Hvis ulike volumer måles fortløpende, starter aliquoting med høyeste volumet og prøv å minimere endre av Pipetter eller pipette-spisser.
        Studere type R B C
        S-avhengige målinger (figur 4) 25-50-100-150-250 25-50-100-150-250 25
        Tid-retters målinger (figur 5A) 25 25 25
        Hemming studie (Fig 5B) 120 120 120
        pH avhengighet study (Fig 6) 100 100 100

        Tabell 4: Antall SAMB løsningen målt i prøven hetteglass av hver eksempel i demonstrert studiene.
      3. Plasser prøven rør som inneholder aliquoted SAMB suspensjon i MPC og litt flytte MPC frem og tilbake.
      4. Nøye fjerne nedbryting fra SAMBs og kaste den.
      5. Fjerne rørene fra MPC og legge den beregnede mengden reaksjon buffer (spalting eller elueringsrør buffer [100 mM EDTA, 0,05% mellom 20, pH 7]) nøye til SAMBs.
        Merk: Beregne buffer volumet i henhold til individuelle eksperimentell design (tabell 5). For 2 mL rør er anbefalte endelige volumet reaksjonsblandingen (volumet av reaksjon bufferen skal legges i dette trinnet + volumet av løsningen skal legges i trinn 4.2.3) 50-150 µL. Sørg for at alle SAMBs er vasket i lagt til bufferen. Elueringsbufferen brukes cleavage buffer i tilfeller av underlaget kontroll (C) prøver. For en hemming studie anbefales inhibitor valgfrihet legges på dette trinnet.
        Studere type Volumet av reaksjon bufferen (µL)
        S-avhengige målinger (figur 4) 68 µL cleavage buffer
        Tid-retters målinger (figur 5A) 68 µL cleavage buffer
        Hemming studie (Fig 5B) 67.3 µL cleavage buffer + 0.7 µL hemmer lager løsning *
        pH avhengighet study (Fig 6) 69,5 µL cleavage buffer **

        Tabell 5: volumet av reaksjon buffer i demonstrert studiene. * Amprenavir ble løst i dimethyl sulfoxide; amprenavir lager løsninger (fra 1 nM til 1 µM konsentrasjoner) ble brukt for hemmende studier (se figur 5B). ** PH i anvendt cleavage bufferen varierte fra pH 6.0 8.5.
      6. Lukk lokkene på rørene. Nå er prøvene klar for analysen.
        Merk: Prøvene kan lagres på 4 ° C i opptil 24 timer, men lagring gjelder bare hvis SAMB lager løsningen ble brukt umiddelbart etter utarbeidelse (se trinn 4.1.3.2).
  2. Initiering av proteolytisk reaksjonene
    1. Forberede proteolytisk enzym løsningen behovene eksperimentelle.
      Merk: Det anbefales å bruke en cleavage buffer å oppløse og/eller fortynne enzymet. Protokoller for rensing av HIV-1-14 og TEV PRs18 har vært publisert tidligere.
    2. Angi thermoshaker omrøring hastigheten (600 rpm) og inkubasjon temperatur (tabell 6).
      Studere type Inkubasjon temperatur (° C)
      S-avhengige målinger (figur 4) 37
      Tid-retters målinger (figur 5A) 37
      Hemming studie (Fig 5B) 37
      pH avhengighet study (Fig 6) 30

      Tabell 6: inkubasjon temperaturer brukt i ulike studier typer. HIV-1 PR anbefales 37 ° C for mens 30 ° C anbefales for TEV PR.
    3. Legg enzymet løsningen til reaksjon prøvene for initialisering proteolytisk reaksjoner.
      Merk: Substrat tom (B) og C prøver, legge til spalting buffer (enzym buffer) og elueringsrør buffer, henholdsvis. Volumet er skal beregnes i henhold til individuelle eksperimentelle behovene (Tabell 7). For 2 mL rør er anbefalte endelige volumet reaksjonsblandingen (volumet av reaksjon bufferen la til i trinn 4.1.4.5 + volumet av løsningen skal legges i dette trinnet) 50-150 µL.
      Studere type Volumet av enzymet løsning/enzym buffer/elueringsbufferen (µL)
      S-avhengige målinger (figur 4) 2
      Tid-retters målinger (figur 5A) 2
      Hemming studie (Fig 5B) 2
      pH avhengighet study (Fig 6) 0,5

      Tabell 7: Volum av enzymet løsning/enzym buffer/elueringsbufferen lagt under initialisering av analysen prøvene i demonstrert studiene.
    4. Rør opp perler nøye ved å forsiktig flytte rør, og plassere rør umiddelbart i den allerede risting thermoshaker.
      Merk: Manuell eksempel avslutning (se avsnitt 4.3) tar mer tid enn oppstart; Derfor anbefales en registrert forsinkelse på minst 2 min mellom reaksjonene innvielser.
    5. Inkuber prøvene i henhold til eksperimentell design (tabell 8).
      Studere type Inkubasjon ganger (min)
      S-avhengige målinger (figur 4A) 7
      S-avhengige målinger (figur 4B) 120
      Tid-retters målinger (figur 5A) 0-2.5-5-10-15-20
      Hemming studie (Fig 5B) 10
      pH avhengighet study (Fig 6) 60

      Tabell 8: Inkubasjon ganger på analysen prøvene i ulike målinger.
  3. TerminGarderobepleieløsningen av proteolytisk reaksjoner
    1. Ta prøven ut av shaker, 30 s før slutten av inkubasjon og spinne den umiddelbart.
    2. Sett røret på MPC, la det stå i 15 s, og litt flytte MPC frem og tilbake.
    3. Åpne lokket og overføre nedbryting nøye til en plate eller en ny tube.
      Merk: Ikke berør konsentrert perler med spissen av pipette. Samlet nedbryting av C prøver og R prøver med en høy grad av cleavage kan vise synlig fluorescens med eller selv uten hjelp av en DRBT.
  4. Fluorescerende oppdagelsen
    1. Overføre 2 x 30 µL av atskilt prøve supernatants til en svart halv-området microplate.
    2. Måle fluorescens bruke riktige eksitasjon og utslipp filtre.
      Merk: Måle den grunnleggende fluorescensen cleavage buffer og elueringsbufferen, også. Filteret kombinasjoner måtte velges basert på målt fluorescerende protein (tabell 9).
      Fluorescerende protein Eksitasjon filtre (nm) Utslipp filtre (nm)
      mTurqiouse2 355/40 460/25
      mEYFP 544/15 590/10
      mApple 544/15 590/10

      Tabell 9: Eksitasjon og utslipp filtre brukes til å oppdage ulike fluorescerende proteiner.
  5. Kalibrering
    Merk: For å generere kalibrering kurver i trinn 4.6.1, fluorescens intensitetsverdiene for cleavage - eller elueringsrør-buffer-løst renset underlag i ulike konsentrasjoner må måles.
    1. Rense fluorescerende substrater.
      Merk: For rensing, SAMBs substrat tom (B) prøvene etter protease analysen kan samles inn eller en ny SAMB suspensjon kan også tilberedes (se pkt. 4.1.1 og 4.1.2).
      1. Plassere et rør med SAMBs suspendert i 1 mL av cleavage buffer (2% - 10%, v/v) å MPC og samle de magnetiske perlene ved å slå MPC opp-ned i alle retninger.
      2. Åpne røret og fjern cleavage bufferen, både fra røret og lokket.
      3. Fjern røret fra MPC og legge til 400-600 µL av elueringsbufferen i SAMBs.
      4. Sakte rotere lukket røret med en rotator ved romtemperatur for 5 min.
      5. Sett røret på MPC og samle perler ved å slå MPC opp-ned.
      6. Fjern nedbryting inneholder renset intakt fluorescerende underlaget (eluate) og overføre den til en ny lav-protein-bindende microcentrifuge tube.
        Merk: Eluate viser tydelig fluorescens med eller selv uten å bruke en DRBT.
    2. Utføre parallelle buffer exchange ved hjelp av to 0,5 mL 10K ultrafiltrasjon enheter.
      1. Mål halve mengden forberedt eluate (200-300 µL) i hver ultrafiltrasjon enhet.
      2. Etter på hvert sentrifugering trinn, fortynne den konsentrerte eluate i først og andre ultrafiltrasjon enhetene etter elueringsrør buffer og cleavage buffer, henholdsvis.
      3. Etter oppgangen, justere konsentrert prøvene løst i de ulike bufferne til samme volum, mellom 120-200 µL.
        Merk: Nå proteininnholdet i spalting buffer-løst underlaget er identisk elueringsrør buffer-løst underlaget; Derfor er det ikke nødvendig å bestemme protein innhold av den sistnevnte på trinn 4.5.3, hvis metoden som brukes for å måle protein konsentrasjon gjør med EDTA.
    3. Bestemme proteininnhold av substrater oppløst i elueringsrørets eller cleavage bufferen ved å måle absorbansen på 280 nm.
      Merk: Andre metoder (f.eks Bradford eller bicinchoninic syre (BCA) analyser) kan også brukes til å måle protein konsentrasjon, men eventuell interferens med EDTA (finnes i elueringsbufferen) eller absorbansen av fluorescerende underlaget må vurdert. Første proteininnholdet i substratløsningen brukes i trinn 4.5.4 bør være mellom 0,4-2,0 mg/mL for å generere en kalibrering kurven i et passende utvalg. Se Tabell 10 for utryddelse koeffisienter.
      Substrat Molekylvekt
      (Da)      		 Utryddelse koeffisient
      (M-1 cm-1, på 280 nm målt i vann)
      Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 72101.7 96845
      Hans6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 72042.7 95355
      Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP 72367.1 94325
      Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple 72145.9 105200

      10: molekylvekt og utryddelse koeffisientene av ulike rekombinant fluorescerende fusion protein underlag.
    4. Forberede en todelt føljetong fortynning i minst åtte trinn, både fra den elueringsrør - og cleavage-buffer-løst substrat løsningene, bruker elueringsrør eller cleavage buffer for uttynnet, henholdsvis.
    5. Overføring 30 µL av hvert fortynning punkt til en svart halv-området microplate.
    6. Mål fluorescens med en fluorimeter, bruke innstillingen brukt i trinn 4.4.2.
      Merk: Måle den grunnleggende fluorescensen cleavage og elueringsbufferen.
  6. Evaluering av analysen
    1. Tegne inn kalibrering kurvene.
      1. Beregn konsentrasjonen (i mM) renset substrat løsninger (brukt i trinn 4.5.4), basert på protein innhold i trinn 4.5.3.
      2. Korrigere relative fluorescens intensitetsverdiene (RFU) punktene føljetong fortynning av grunnleggende RFU verdiene til anvendt fortynning bufferen (cleavage bufferen eller elueringsbufferen).
      3. Plot korrigert RFU verdiene mot molar konsentrasjonen av cleavage - eller elueringsrør-buffer-løst renset substrater og utføre en lineær regresjon (force skjæringspunktet til null).
        Merk: En høy R2 verdi (˃0.97) angir en god lineær sammenheng mellom fluorescensen og konsentrasjonen av fluorescerende protein. I dette tilfellet kan stigningstallet til regresjonslinjen brukes til å vurdere konsentrasjonen av analysen undersøkt området i trinn 4.6.2 og 4.6.3. Eksperimentell feil og data poengsystem kan påvirke pålitelighet i kalibreringen; Dermed kan en grafisk evaluering utføres ved hjelp av zoome inn grafer (som vist på Figur 3), for å sjekke om R2 og slope-verdier er påvirket av dataene.
    2. Beregn mengden av C-terminalen fluorescerende cleavage produkt i reaksjon utvalgene.
      1. Korrigere RFU verdiene for hvert R utvalg av RFU verdiene til tilsvarende B prøven.
      2. Beregne cleavage produktet konsentrasjonen (i mM) i reaksjon prøvene ved den korrigerte RFU verdier av skråningen av cleavage-buffer-baserte kalibreringen kurven (se trinn 4.6.1.3).
    3. Beregne anvendt substrat konsentrasjonen i reaksjon utvalgene.
      1. Korrigere RFU verdiene av C utvalget med RFU verdien av grunnleggende elueringsbufferen.
      2. Beregn konsentrasjonen av eluted underlaget (i mM) i supernatants av C prøven ved å dele sine korrigert RFU verdier av skråningen av elueringsrør-buffer-baserte kalibreringen kurven (se trinn 4.6.1.3).
      3. Bestemme substrat konsentrasjonen (i mM) SAMB lager løsningen for å opprette analysen prøvene i trinn 4.1.4.2, basert på følgende ligning:
        Equation 1
        Her er cSAMB molar konsentrasjonen av SAMB lager løsningen forberedt på inndeling 4.1.3; cC er molar konsentrasjonen av eluted underlaget i C utvalget beregnet på trinn 4.6.3.3; Vr er volumet av reaksjonsblandingen opprettet av reaksjon bufferen i trinn 4.1.4.5 og enzym bufferen i trinn 4.2.3.; VSAMB er volumet av SAMB lager løsningen i C utvalget (trinn 4.1.4.2).
      4. Beregne molar konsentrasjonen av underlagene i hvert R utvalg basert på molar konsentrasjonen av SAMB lager løsningen (i mM) ifølge volumet (i µL) målt i hver reaksjon eksempel rør på trinn 4.1.4.2.
    4. Utfør databehandling.
      Merk: Dataanalyse, avhenger av målet med forsøket. Videoen viser et eksempel på behandling av en substrat-avhengige kinetic studie på HIV-1 PR med sin6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat. De første hastighet beregnes fra antall C-terminalen cleavage fragmenter og plottes mot anvendt substrat konsentrasjonen. Kinetisk parameterne bestemmes av en Michaelis-Menten lineær regresjonsanalyse.
  7. Resirkulering av magnetiske perler
    Merk: Etter utfører analysen, magnetiske agarose perlene kan samles og resirkulert.
    1. Samle brukt magnetiske perler med MPC og forkaste nedbryting.
      1. Vask perler med 1,8 mL følgende bufferne, i angitt rekkefølge: gjenfødelse buffer A (0,05% mellom 20, 0,5 M NaOH), gjenfødelse buffer B (0,05% mellom 20), gjenfødelse buffer C (0,05% mellom 20, 100 mM EDTA, pH 8), gjenfødelse buffer B, gjenfødelse buffer D ( 0,05% mellom 20, 100 mM NiSO4, pH 8), gjenfødelse buffer B, og regenerering buffer E (0,5% mellom 20, 30% etanol, pH 7).
        Merk: Vask fremgangsmåten, kan du se trinn 4.1.1.4.
    2. Lagre resirkulert perlene i gjenfødelse buffer E på 4 ° C.

5. side analyse

  1. Eksempel forberedelse
    Merk: Etter at Ni-NTA magnetisk-perle-baserte analysen, analysen supernatants kan analyseres av siden. I dette tilfellet hoppe over trinn 5.1.1 og 5.1.2. Det er imidlertid også mulig å analysere renset fluorescerende underlag løsningen og/eller deres cleavage fragmenter etter-løsning fordøyelsen med protease rundt. I dette tilfellet fortsette protokollen trinn 5.1.1.
    1. Forberede renset fluorescerende substratløsningen etter trinn 4.5.1.
    2. Utføre i-løsning fordøyelsen.
      1. Utveksle elueringsbufferen med cleavage buffer i 0,5 mL 10K ultrafiltrasjon enhet og aliquot prøvene å bli fordøyd i 1,5 mL microcentrifuge rør.
        Merk: For siden analyse, vi aliquoted 68 µL av hver substrat, men antall utvalg rør og volumet av substratløsningen skal aliquoted kan optimaliseres i henhold til individuelle eksperimentell design.
      2. Legg enzymet løsningen i prøvene.
        Merk: For siden analyse, brukte vi 2 µL av HIV-1 PR, forberedt som beskrevet av Bozóki et al.14, men volumet kan optimaliseres i henhold til individuelle eksperimentell design. Det anbefales å bruke cleavage buffer til å oppløse og/eller fortynne enzymet.
      3. Inkuber prøvene i henhold til eksperimentell design.
        Merk: For siden analyse, vi ruges reaksjonsblandingen for 45 min på 37 ° C, men inkubasjon tid og temperatur må angis i henhold til eksperimentell design.
      4. Avslutte reaksjonen grepet 5.1.3.
    3. Forberede prøven siden.
      Merk: Fluorescerende substrat-inneholder eksemplene kan være forberedt på siden av en nondenaturing eller en denaturing metode. For bruk av nondenaturing eller denaturing, følger du trinn 5.1.3.1 eller 5.1.3.2, henholdsvis.
      1. Utarbeide et nondenatured utvalg: Bland 30 µL av utvalget med 6 µL av 6 x nondenaturing eksempel lasting buffer (300 mM Tris, 20% glyserol, 0,05% bromophenol blå, pH 6.8).
      2. Forberede en denaturert prøve: Bland 30 µL av utvalget med 6 µL av 6 x denaturing eksempel lasting buffer (300 mM Tris, 20% glyserol, 0,05% bromophenol blå, 12% SDS, 100 mM β-mercaptoethanol, pH 6.8), og varme prøvene ved 95 ° C i 10 min.
  2. SDS-side analyse
    Merk: Alternativt, hvis bare nondenatured (forberedt i trinn 5.1.3.1) prøver er å bli analysert, en innfødt side kan også utføres. I dette tilfellet hopp over delen 5.3.
    1. Forberede en SDS-polyakrylamid gel (bruk 14% skille og 4% stabling gel) og fyll tanken med geleelektroforese buffer (2,5 mM Tris, 19,2 mM glysin, 0,01% SDS).
    2. Legge til prøvene (forberedt i trinn 5.1.3.1 eller 5.1.3.2) fordelt av en polyakrylamid gel og utføre geleelektroforese på 120 V spenning.
    3. Fjern gel kassetten fra modulen kjører og plasser gel i en vask tank.
      Merk: Nondenatured prøver vises allerede i gel, selv med det blotte øye eller med et DRBT.
  3. I-gel renaturation og oppdagelsen av fluorescerende proteiner
    Merk: For å oppdage fluorescerende proteiner i denaturert prøver (forberedt i trinn 5.1.3.2) på DRBT, SDS må vaskes fra gel, til delvis renature proteiner.
    1. Legge til ~ 100 mL destillert vann gel og skyll gel minst i 30 min.
      Merk: For å forbedre SDS fjerning, erstatte vannet hvert 10 min, eller skyll opptil 60 min.
    2. Visualisere fluorescerende proteiner ved hjelp av en DRBT, eller UV bildebehandling.
  4. Konvensjonelle Coomassie farging av gel
    1. Stain gel med Coomassie briljant blå farge å visualisere nonfluorescent proteiner.

Representative Results

Figur 1A viser skjematisk strukturen av en representant fluorescerende rekombinante proteiner substrat som kan behandles av HIV-1 PR på bestemte kuttesetet området sekvensen. Figur 1B representerer substrat produksjon og mulige programmer i protease analyser, inkludert Ni-NTA magnetisk-perle-baserte analysen og/eller siden.

For å få pålitelige data av fluorimetry, er en kalibreringsprosedyren nødvendig, for å bestemme antall fluorescerende underlag og cleavage produkter. For dette, fluorescens intensitetsverdien til de forskjellige underlag i forskjellige buffer forhold må måles og må være koblet til konsentrasjonene i fjellkjeden assayed konsentrasjon (Figur 3). Slope-verdier av kalibrering kurver kan brukes for å bestemme beløpene av underlag og cleavage produkter i analysen prøver. Av kalibrering kurvene er uavhengige av cleavage området sekvensene inn substrater (Tabell 11), og kan potensielt brukes til en rekke underlag smeltet til samme type fluorescerende protein. Zoome inn diagrammer vises for alle lineære regresjoner, forstørre lavere konsentrasjon områdene samt (Figur 3). Det er viktig å merke seg at kalibreringen må utføres nøye fordi det kreves en riktig fordeling av datapunkter for en pålitelig kalibrering. Derfor er todelt føljetong fortynning brukt for å forberede prøvene kalibrering fordi R2 verdien angir en god sammenheng mellom konsentrasjonen av fluorescerende protein og fluorescens bare hvis et tilstrekkelig antall datapunkt har blitt brukt til å dekke hele konsentrasjon området. Videre kan eksperimentell feil sterkt påvirke nøyaktigheten av kalibreringen; dermed kanskje en grafisk evaluering regresjon linjer må også.

En rekke enzymatisk målinger kan utføres av protease analysen, inkludert en undersøkelse av effekten av underlaget konsentrasjonen på reaksjon hastighet (figur 4A). Av lineær regresjon, kan dataene brukes til å bestemme enzym kinetic parametere (f.eks v-max og K-m). En utilstrekkelig perle suspensjon og spredning og en upassende reaksjon avslutning kan forårsake suboptimal resultater (figur 4B), som ikke er egnet for beregning av pålitelig enzym kinetic verdier.

En avhengighet av produktet formasjonen tid kan bestemmes av analysen (figur 5A) (som under optimalisering av parameterne cleavage reaksjon). Enzym aktivitet i nærvær av en inhibitor kan også være undersøkt (figur 5B) for fastsettelse av aktiv enzym konsentrasjonen og hemmende konstant. Ved hjelp av samme metode, kan effekten av andre hemmere også bli vist av analysen.

Protease analysen er nyttig når undersøker virkningene av pH på enzym aktivitet, også. Figur 6A representerer avhengigheten av enzym aktivitet på pH ved eksempel TEV PR, som har en bred optimal pH (pH 6-9). Hvis pH avhengigheten av enzym aktivitet er studert (eller enzymer har en surt pH optimal må måles), er det nødvendig å vurdere at affinitet binding av rekombinant underlag til perlene kan begrenses ved litt surt pH. En forhøyet dissosiasjon av underlagene fra perler (figur 6B) kan forårsake en forvrengning av analyseresultatene. Vurderer spontan substrat dissosiasjon fra perler, må verdiene til reaksjon prøver rettes av B prøver.

Figur 7 viser at nondenatured fluorescerende proteinene kan differensieres i gel basert på fargene, blå lys transillumination (figur 7A). Hvis fastsettelsen av molekylvekt av underlag/Kløv er nødvendig, kan denaturing forhold også brukes for eksempel forberedelse, fordi fluorescerende proteiner kan være delvis rehabilitert i gel, og kan oppdages av UV-lys (Figur 7B) eller Coomassie flekker (figur 7C). Hvis R prøvene blir analysert, er bare C-terminalen cleavage produktene synlig (figur 7C), mens N-terminal cleavage fragmenter og uncleaved substrater forbli knyttet til perler. Noen ganger proteiner kan delvis denaturert til tross for nondenaturing betingelser (figur 7C), og mens nondenatured proteiner er mer rikelig, denaturert skjemaer er også synlig i utvalget. Dette fenomenet påvirker ikke gjenkjenning av proteolytisk spalting, men må vurderes når det gjelder kvantitativt densitometry av nondenatured prøver.

Selv om den detaljerte beskrivelsen vises bare for en 2 mL-t-baserte analysen, kan analysen tilpasses for en 96-brønns plate-systemet (Figur 8), som har allerede blitt testet med suksess i vårt laboratorium (vises ikke). 96-brønns plate-tilpasset formatet er fullt kompatibel med fluorimetric og electrophoretic analyser, også, innhentet data kan også bli vurdert basert på beskrevet i dette dokumentet.

Figure 3
Figur 3 : Kalibrering kurver. Representant substrat kalibrering kurver er demonstrert med eksempel på to rekombinant underlag smeltet til ulike C-terminalen fluorescerende koder: (A og B) hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 og (C og D ) Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoome inn tallene vises også til å representere den lineære regresjonen datapunkt i 0-0.005 mM substrat konsentrasjon område. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 4
Figur 4 : Bestemmelse av enzymet kinetic parametere. Substrat-avhengige kinetic målinger ble utført av HIV-1 PR (på en siste aktive konsentrasjon av 41.2 nM). Initial hastighet verdiene ble plottet mot underlaget konsentrasjonen og en Michaelis-Menten lineær regresjonsanalyse ble utført. Feilfeltene representerer SD (n = 2). (A) A representant optimal resultatet blir vist med eksempel på hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple fusion protein substrat. (B) en representant suboptimal resultatet vises også for hans6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 underlaget, der innstillingen for riktig substrat var problematisk på grunn av en utilstrekkelig homogenisering SAMB lager løsningen , mens relativt høy feil ble forårsaket av uriktig reaksjon oppsigelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Tid-kurs og hemmende. (A) Hans 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP rekombinant fusion protein substrat (i en siste konsentrasjon av 0.00326 mM) var kløyvde av HIV-1 PR (på en siste aktive konsentrasjon av 41.2 nM), og utgivelsen av fluorescerende PIVQ-mEYFP proteolytisk fragmenter ble målt utføre en tid-retters analyse. Målingene ble utført på fem ulike tidspunkt. Feilfeltene representerer SD (n = 2). (B) hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP ble brukt som substrat (på 0.0015 mM) til å fastslå den hemmende effekten av amprenavir på aktiviteten i HIV-1 PR (på en totale konsentrasjonen av 163.8 nM). Ved plotting data, halv maksimal inhibitoriske konsentrasjon (IC50) kunne vurderes og aktiv enzym konsentrasjonen (en siste aktive konsentrasjon av 41.2 nM) av anvendt HIV-1 PR kan også beregnes basert på hemming kurven. Feilfeltene representerer SD (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Studere avhengighet av enzym aktivitet og spontan substrat dissosiasjon på pH (A) i hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (i 0.033 mM) ble brukt til å måle enzymaktiviteten av TEV PR (på en siste totale konsentrasjonen av 91.42 nM) cleavage buffer satt til en annen pH, mellom rekke 6.5 8.5. Feilfeltene representerer SD (n = 2). De plottede dataene har vært publisert tidligere14. (B) basert på relative fluorescerende intensitetsverdiene substrat tom prøvene, spontane dissosiasjon av hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (0.033 mM) fra de magnetiske perlene ble studert ved hjelp av cleavage buffer med en annen pH, mellom 6.0 8.5. De plottede dataene har vært publisert tidligere14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Oppdage proteiner i gel av ulike metoder. (A) Uncleaved og HIV-1 PR-fordøyd fusion protein underlag etter nondenaturing eksempel forberedelse var visualisert ved blå lys transillumination etter SDS-side. Kløv reaksjonen ble utført av-løsning fordøyelse. (B) umiddelbart etter siden bare nondenatured proteiner ble oppdaget i gel av UV lys, etter fjerning av SDS, tidligere denaturert fluorescerende proteiner ble delvis rehabilitert og sporbar. Prøvene ble utarbeidet fra supernatants til Ni-NTA magnetisk-perle-baserte analysen. (C) Coomassie flekker kan også brukes til proteinet oppdagelsen, etter i-gel-renaturation. SDS-dag i gel-kan føre den delvis denaturering av innfødte protein, men innebygd eksempler nondenatured skjemaene er mer rikelig. Prøvene ble utarbeidet fra supernatants til Ni-NTA magnetisk-perle-baserte analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 8
Figur 8 : 96-brønns plate-baserte tilpasning av analysen plattformen. (A) analysen kan utføres ikke bare i 2 mL rør men i brønnene av en 96-brønns plate, også. Her viser vi skjematisk representasjon for anvendelse av analysen å studere spesifisitet av en fiktiv protease ved hjelp av en rekke fluorescerende underlag, som kan inneholde vill-type (wt) eller mutert (mut-1 til mut-4) cleavage området sekvenser. For håndtering av magnetiske perler, er en 96-brønns kompatibel magnetiske partikler konsentrator (MPC) i forsøkene. Alle angitte volumene er knyttet til en enkelt brønn. Hvis du vil sammenligne cleavage effektiviteten av de forskjellige underlag, kan substrat konvertering vurderes fra ønsket substratet-tom-korrigert RFU verdier reaksjon prøvene, vurderer substrat-tom-korrigert RFU verdiene for den tilknyttede substrat kontroll prøver som 100. (B) etter at fluorimetry, de separerte supernatants til analysen prøver kan også analyseres ved siden og fluorescerende protein komponentene kan analyseres direkte eller etter-gel renaturation ved nondenaturing og denaturing Forberedelse, henholdsvis. Tre forskjellige analysen eksempel typer er også illustrert i hver figur: C = substrat kontroll, B = substrat tom og R = reaksjon. Substrat kontroll prøvene er i elueringsbufferen, mens underlaget tom reaksjon prøvene er cleavage buffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Buffer Fluorescerende protein CV % med bakker (%)
Elueringsrør mTurquoise2 6.04
Kløv 9.11
Elueringsrør mApple 10.92
Kløv 12.68

Tabell 11: koeffisient av varians (CV %) verdier av underlaget kalibrering kurvene. For å teste om fluorescens av rekombinant protein underlagene er avhengig av webområdet innsatte cleavage, ble kalibreringer utført av rekke mApple - og mTurquoise2-smeltet underlag (seks varianter for hver, som inneholder forskjellige cleavage område sekvenser av HIV-1 protease), både i elueringsrør og cleavage buffere. Vi fant at CV % verdier av bakkene er under 15% i alle tilfeller, som innebærer at en enkelt substrat kalibrering kan benyttes for vurdering av ulike målinger utført av underlaget varianter som inneholder den samme fluorescerende koden.

Discussion

Intensiv industri og akademiske undersøkelser av proteolytiske enzymer og det konstante behovet for rask og rimelig HTS-kompatible protease analysen plattformer derfor har vi utviklet en magnetisk-perle-baserte fluorescerende protease analysen. Analysen er basert på bruk av rekombinant fusion proteiner som kan være romanen alternativer til mye benyttet syntetiske peptid substrater.

I formatet utviklet analysen er fusion protein substrater immobilisert til overflaten av Ni-chelate-belagt magnetiske agarose perler. Substrat vedlegget er levert av N-terminalen sin6 affinitet tag fusion protein, som er direkte smeltet en MBP merke for å forenkle den folding og forbedre vannløselighet substrat13. MBP etterfølges av cleavage områder av TEV PR og en protease rundt. Den tidligere kan tjene som en kontroll cleavage nettsted i analysen, mens sistnevnte kan behandles av protease undersøkes. Området Kløv er utskiftbare; en kort dsDNA sekvens koding for spalting området rundt kan settes inn i den fleksible 'kloning kassetten"med uttrykk plasmider av hemorroider. Rekombinant fusion proteiner inneholder en svært stabile, monomerisk fluorescerende protein kode ved C-terminalen, som gjør at endepunktet påvisning av enzymet befridde, fluorescerende C-terminalen cleavage produkter utgitt på proteolytisk cleavage ( Figur 1A). Renset fluorescerende intakt substrater løst i ulike buffere brukes også for kalibrering for å vurdere molar konsentrasjonen av underlag og cleavage produkter. Dessuten, etter fluorimetry, kan analysen komponentene analyseres av SDS-side, også. Både native (nondenatured) og denaturert fluorescerende proteiner kan visualiseres i gel, umiddelbart etter geleelektroforese eller senere i-gel renaturation, henholdsvis. Denne ekstra prosedyre i kombinasjon med en konvensjonell Coomassie briljant blå flekker-kan brukes effektivt for verifikasjon av analyseresultatene (figur 1B).

Analyse-prosedyre består av enkle, lett-å-utføre trinnene i et lavt volum-format som kan tilpasses fullstendig til en høy gjennomstrømming automatisk miljø. Men anses uavhengig fra utfører analysen manuelt eller med en automatisering system, følgende deler av analysen avgjørende og trenger spesiell oppmerksomhet mens du utfører prosedyren. i) homogenitet av magnetiske perle løsningen. En homogen magnetiske perle løsning må brukes hele analysen, både i rensing og vaske trinnene. Spesielt avhengig pålitelighet protease analyser sterkt av riktig aliquoting substrat tilknyttet magnetiske perle (SAMB) lager løsninger. For å øke effektiviteten av suspensjon og spredning, anbefales det å sette bead konsentrasjon mellom 2% og 10% (v/v). Under eksempel forberedelse, bruk av buffere supplert med ikke-ionisert vaskemiddel (som Triton X-100 eller mellom 20) opp til 2% kan også redusere overholdelse av magnetiske perler av plast overflater. Overholdelse av perler til veggene av prøven ampuller kan unngås hvis perle suspensjoner brukes nøye på bunnen av ampullene i stedet for onto veggene av prøven rør. Homogenitet av magnetiske perler under enzymatiske reaksjonen er også kritisk og kan sikres av kontinuerlig risting prøvene på 600 rpm under inkubasjon. Perler er skikkelig spredt i avrundet eller flat bunn plast varer, mens bruk av V-bunn ampuller ikke anbefales. En suboptimal resultatet skyldes uriktig perle homogenisering er representert i figur 4B. II) opphør av reaksjon prøver.  En annen fordel av metoden er at den enzymatiske reaksjonen kan bli avsluttet uten bruk av varmebehandling rødsprit eller noen potensielt forstyrrende midler15. Avslutningen kan utføres ved å skille de magnetiske perlene fra reaksjonsblandingen, ved hjelp av en konvensjonell magnetiske partikler konsentrator. Mens bufferen som fjernet reaksjon inneholder aktive enzymet og genererte C-terminalen fluorescerende cleavage produktene, forbli uncleaved substrater knyttet til perler. På grunn av tilstedeværelsen av aktiv enzym i reaksjon bufferen må separasjon prosedyren utføres nøye for pålitelig endepunktet gjenkjenning. Før du plasserer eksempel ampullene i presisjonstørking, anbefales det å bruke et kort spin sentrifugering. Etter å plassere rør i presisjonstørking, gi minst 15 s perler inn. Svak bevegelse av separatoren frem og tilbake kan lette innsamling av perler. Vurder at, under en manuelt utført separasjon, oppsigelse vanligvis tar mer tid enn initiering av reaksjonene. Derfor anbefales en ca 2 min registrert forsinkelse mellom innvielser hvis inkubasjon samtidig må brukes på alle prøvene.

Prinsippet om beskrevet proteolytisk analysen er relativt enkelt. men er allsidigheten av systemet garantert av fleksibel og stabil substrat strukturen. Individuelle optimalisering av analysen kan være begrenset av kompatibiliteten til affinitet perler med de anvendt, reagenser og tilsetningsstoffer. Med produsentens protokollen fant vi også at affinitet binding av underlag til Ni-NTA perle overflaten vesentlig svekker på pH ≤ 6,515. Derfor er det anbefalt å bruke substrat tom prøver parallelt reaksjon prøvene, og frekvensen av spontane substrat dissosiasjon må vurderes under evaluering av resultatene.

I de tilfellene hvor magnetisk-perle-baserte analyser ikke kan utføres på grunn av bruk av perle-kompatibel komponenter eller en lav pH, kan i-løsning fordøyelsen av renset rekombinant substrater også brukes. I disse tilfellene reaksjon blandinger kan bli analysert ved geleelektroforese og proteiner kan visualiseres i gel basert på beskrevet protokollen. Undersøke proteolytiske, kan i-løsning fordøyelsen og i-gel påvisning av proteiner også være alternative verktøy av fluorimetry. En nyhet av designet underlaget er anvendelsen av en i-gel renaturation trinn etter denaturing SDS-side. Mens opprinnelig (nondenatured) fluorescerende proteiner beholde sine fluorescens under geleelektroforese, er egenskapen fluorescerende avskaffet på rødsprit (figur 7B). Imidlertid kan fluorescens denaturert proteiner delvis utvinnes av fjerningen av SDS fra gel. Dermed muliggjør en separasjon av reaksjon komponenter denaturing betingelser ikke bare den fluorescens-baserte men molekylær-vekt-baserte identifikasjon. En annen fordel med fluorescerende i-gel deteksjon forhold til analyse av en Coomassie-farget gel er at (opprinnelig eller rehabilitert) fluorescerende proteinene kan lett identifiseres i gel basert på deres fluorescens (se figur 7). Dette kan være viktig hvis cleavage reaksjoner utføres i prøver som inneholder nonfluorescent forurensninger eller proteiner svært ligner molekylvekt av hverandre.

Protease analyser med tilsvarende designet underlag er allerede publisert tidligere8,9,10, og selv om cleavage stedet av interesse i disse tilfellene var også plassert mellom en affinitet-kode og fluorescerende protein, analysen systemet presentert her ikke bare gjentar beskrevet ideer men kombinerer de forskjellige fordelene de tidligere plattformene og også fullføres dem med ytterligere forbedringer: i) bruken av en MBP fusion partner, ii) det tilstedeværelsen av en TEV PR kontroll cleavage nettsted, iii) bruk av nylig foretatt monomerisk FPs og iv) anvendelsen av en unik substrat kalibreringsprosedyren. Analysen selv var spesielt designet for å være nyttig for enzym spesifisitet og kinetisk studier i et trygt, tid - og kostnadseffektiv måte, uten behov for dyre instrumentering. Metoden er rettet til å være egnet og rimelig verktøy for både industri og akademisk forskningsformål. På grunn av fleksibiliteten til 'kloning kassetten' av uttrykket plasmider, kan systemet være egnet for rask og rimelig generasjon av rekombinant substrat biblioteker. Her beskrives analysen er en mulig verktøy for gjennomføring av underlaget spesifisitet, enzymet mutagenese, og hemming studier, og også gi et verktøy for å utføre enzym kinetics. Analysen plattform (bakteriell celle avbrudd til fastsettelse av parameterne kinetic) kan tilpasses en HTS - og automatisering-basert miljø og, muligens kan brukes i industrielle protease hemmer screening og/eller antiviral stoffet utvikling. I tillegg er tilpasningen av analysen for konkurrerende proteolyse også i fremtiden omfanget av vårt laboratorium. I slike en konkurransedyktig analysen, to forskjellige underlag-hver som inneholder en annen cleavage område smeltet en annen C-terminalen fluorescerende tag-er brukes samtidig i samme cleavage reaksjon for å undersøke preferanse for de studerte enzymet for gitt mål sekvensene. Videre er bruk av en 96-brønns plate-tilpasset analysen form (Figur 8) også å være optimalisert for mutasjon screening ved hjelp av en rekke underlag med endrede cleavage området sekvenser ved cystein proteaser.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet var støttes delvis av GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "PHARMPROT sammen" prosjekt og også finansiert av høyere utdanning institusjonelle Excellence studiet av departementet for Human kapasiteter i Ungarn, innenfor rammen av den Bioteknologi tematiske programmet for universitetet av Debrecen. Forfatterne er takknemlig for medlemmer av laboratoriet av Retroviral biokjemi for sine vitenskapelige hjelp under analysen utvikling og også for deres tålmodighet under filmingen analysen (spesielt til Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz og Vanda Toldi, som vises i bakgrunnen av videoen). Forfatterne vil også si spesiell takk til Gedeon Richter Plc., spesielt til Dr. Zoltán Urbányi for å la Beáta Bozóki arbeid i avdeling for biokjemi og molekylærbiologi som gjest forsker. Forfatterne også gjerne utvide sin takknemlighet György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi og Zoltán Király fra Multimedia og E-læring teknisk midten av universitetet av Debrecen for profesjonell hjelp i lyd og video produksjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10K Amicon tubes Merck-Millipore UFC501096
2-Mercaptoethanol (β-ME) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  M6250
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 Bio-Rad 1610148
Acetic acid  Merck 100063
Agarose SERVA 11404.04
Alpha Imager HP gel documentation system ProteinSimple
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  A3678
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  A9518
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge Beckman Coulter 392185
Black half-area plates Greiner bio-One 675086
Bromophenol blue Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  B0126
CutSmart buffer (10x) New England Biolabs B7204S For plasmid linearization (step 1.1.1)
Dark Reader transilluminator Clare Chemical Research DR-45M
DNase I  New England Biolabs M0303L
Dynamag-2 magnetic particle concentrator Thermo Fischer Scientific 12321D
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells  Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) C600003
Ethanol Merc-Millipore 100983
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  798681
Gel Loading Dye, Purple (6X) New England Biolabs B7024S
Glycerol Merck 356350
Glycine Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  G7126
High-Speed Plasmid Mini Kit GeneAid PD300
Imidazole Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  56750
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) AM9464
Jouan CR 412 centrifuge Jouan CR412
Labinco LD-76 Rotator  Labinco 7600
Luria-Bertani (LB) broth Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  L3022
Lysozyme  Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  L6876
Magnesium chloride Scharlau MA0036
MERCK eurolab ultrasonic bath MERCK USR54H
Millifuge Eppendorf spin centrifuge Millipore CT10
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell Bio-Rad
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  T9281
NanoDrop 2000 Thermo Fischer Scientific
NheI-HF restriction endonuclease New England Biolabs R3131L
Nickel(II) sulfate (NiSO4) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  656895
Ni-NTA magnetic agarose beads  Qiagen 36113
Orbital shaker Biosan OS-20
PacI restriction endonuclease New England Biolabs R0547L
PageBlue Protein Staining Solution  Thermo Fischer Scientific 24620
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  P7626
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes  Eppendorf 22431102
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
Snijders Press-to-Mix shaker  Gemini 34524
Sodium-acetate trihydrate Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S7670
Sodium-chloride Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S9888
Sodium-hydroxide  Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S5881
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain Thermo Fischer Scientific S7563
T4 DNA ligase Promega M180A
Thermo shaker Biosan TS-100 with SC-24 accessory block
Tris Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  T1503
Tween 20 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  P2287
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter Wallac Oy, Turku, Finland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meldal, M. Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition. Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).
  2. Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).
  3. Zhang, G. Protease assays. The Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda, MD. (2012).
  4. Woelcke, J., Hassiepen, U. Fluorescence-based biochemical assay formats. A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. Chen, T. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2010).
  5. Richardson, P. L. The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development. Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).
  6. Diamond, S. L. Methods for mapping protease specificity. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).
  7. Schilling, O., Overall, C. M. Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites. Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).
  8. Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates. Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).
  9. Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).
  10. Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate. Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).
  11. Branchini, B. R., et al. Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).
  12. Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases. Microbial Cell Factories. 13 (1), 44 (2014).
  13. Fox, J. D., Waugh, D. S. Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).
  14. Bozóki, B., et al. A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening. Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).
  15. Mótyán, J. A., Miczi, M., Bozóki, B., Tözsér, J. Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates. Data in Brief. 18, 203-208 (2018).
  16. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15, 47-51 (2018).
  17. Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains. PLoS One. 8, e75991 (2013).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).

Tags

Biokjemi problemet 143 rekombinant fusion protein substrat protease analysen Ni-NTA magnetiske agarose perler fluorescerende protein i-gel renaturation humant immunsviktvirus type 1 protease
Bruk av rekombinant Fusion proteiner i en fluorescerende Protease analysen plattform og deres i-gel-Renaturation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bozóki, B., Mótyán,… More

Bozóki, B., Mótyán, J. A., Miczi, M., Gazda, L. D., Tőzsér, J. Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation. J. Vis. Exp. (143), e58824, doi:10.3791/58824 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter