Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

एकल-कोशिकीय जीवाणु समुदायों का अलगाव जो अनुप्रवाह एकल कोशिका विश्लेषण के लिए मूत्र पथ के संक्रमण के म्यूरिन मॉडल से उत्पन्न होता है ।

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/58829
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1,3
1Infectious Diseases Group, Genome Institute of Singapore, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, National University of Singapore, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Summary

इस प्रोटोकॉल में मूत्र पथ के संक्रमण के एक म्यूरिन मॉडल से एकल, संक्रमित मूत्राशय उपकला कोशिकाओं अलग करने की एक सरल विधि का वर्णन है ।

Abstract

इस लेख में, हम एक प्रक्रिया है कि मूत्र पथ में प्रयोगात्मक संक्रमित किया गया है एक चूहे से व्यक्तिगत intracellular जीवाणु समुदायों को अलग करने के लिए इस्तेमाल की रूपरेखा । प्रोटोकॉल मोटे तौर पर तीन वर्गों में विभाजित किया जा सकता है: संक्रमण, मूत्राशय उपकला कोशिका संचयन, और मुंह micropipetting व्यक्तिगत संक्रमित उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए । पृथक उपकला कोशिका में व्यवहार्य जीवाणु कोशिकाएँ होती हैं और यह बाह्य-कोशिका विश्लेषण के लिए आदर्श बनाते हुए, extracellular बैक्टीरिया को दूषित करने से लगभग मुक्त होती है । संक्रमण की शुरुआत से एक एकल intracellular जीवाणु समुदाय प्राप्त करने के लिए लिया गया समय के बारे में 8 ज है । इस प्रोटोकॉल को तैनात करने और व्यापक रूप से उपलब्ध सामग्री का उपयोग करता है सस्ती है, और हम आशा है कि यह भी अंय संक्रमण मॉडल में उपयोग किया जा सकता है कोशिका मिश्रण से एकल संक्रमित कोशिकाओं को अलग भले ही उन संक्रमित कोशिकाओं दुर्लभ हैं । हालांकि, मुंह micropipetting में एक संभावित जोखिम के कारण, इस प्रक्रिया अत्यधिक संक्रामक एजेंटों के लिए अनुशंसित नहीं है ।

Introduction

मूत्र पथ के संक्रमण (यूटिस) सबसे आम जीवाणु संक्रमण में से एक हैं । एक अनुमान के अनुसार महिलाओं के 40-50% अपने जीवनकाल1के दौरान एक मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) का अनुभव होने की उंमीद कर रहे हैं । यूटीआई के मुख्य एजेंटों में से एक यूरोपैजेनिक ई. कोलाई (यूपीईसी) है, जो ७०% से अधिक सीधी ऊटिस2के लिए खाता है । इसके अलावा, जो एक यूटीआई है की लगभग एक चौथाई आवर्तक संक्रमण होगा, अक्सर एक ही तनाव के कारण, उचित एंटीबायोटिक उपचार के बावजूद3। यूटीआई की उच्च घटना हेल्थकेयर सिस्टम पर भारी बोझ का प्रतिनिधित्व करती है, जिसकी लागत यूएस4में $२,०००,०००,००० से अधिक है । इसके अलावा, एंटीबायोटिक्स का उपयोग करने के लिए उतीस भी बढ़ती एंटीबायोटिक प्रतिरोध दरों की ओर जाता है, जो एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय है5।

इसलिए, एक बड़े प्रयास के तंत्र को समझने में रखा गया है जिसके द्वारा यूपीसी मूत्र पथ को संक्रमित करता है, साथ ही साथ उसके आवर्तक संक्रमण के कारण की क्षमता6,7,8। विशेष रूप से, संक्रमण के एक माउस मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है बैक्टीरियल और मेजबान विशेषताओं है कि यूटीआई8में योगदान की जांच । इस माउस मॉडल को मानव रोगियों से अलग असंशोधित नैदानिक उपभेदों के लिए लागू होने का लाभ है । इस मॉडल ने यूटीआई की स्थापना के लिए संभावित druggable जीवाणु मार्ग की खोज को भी प्रेरित किया है, जैसे कि 1 पिल्स9 और आयरन अधिग्रहण सिस्टम10।

यूटीआई में प्रारंभिक घटनाओं के अध्ययन में इन सफलताओं की तुलना में, आवर्तक यूटीआई अंतर्निहित तंत्र का ज्ञान अभी भी11कमी है । एक परिकल्पना यह है कि उपेक एंटीबायोटिक चिकित्सा evades और मूत्राशय उपकला कोशिकाओं के भीतर intracellular जीवाणु समुदायों (IBCs) के गठन से मूत्राशय में आवर्तक संक्रमण का कारण बनता है । आईबीसी को संक्रमण के म्यूरिन मॉडलों में और मानव यूटीआई रोगियों में12,13दोनों की पहचान की गई है । बाल रोग यूटीआई रोगियों से मूत्र के नमूनों में आईबीसी की उपस्थिति14,15की पुनरावृत्ति की उच्च दरों के साथ संबद्ध किया गया है । हालांकि, IBCs अलग करना और उनके भीतर बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए तकनीकी रूप से उनकी दुर्लभ वस्तु के कारण चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है; यह अनुमान है कि एक संक्रमित म्यूरीन ब्लैडर आमतौर पर केवल 10-100 IBCs16है । इसके अलावा, मूत्राशय उपकला कोशिकाओं अपेक्षाकृत बड़े (50-120 μm)17, यह प्रतिदीप्ति सहायता सेल छंटाई (facs) कि ठेठ facs नलिका ७० μm या १०० μm के व्यास के साथ डिजाइन किए है दिया तैनात करने के लिए चुनौतीपूर्ण बना रही है । इस प्रकार, मूत्राशय उपकला कोशिकाओं के रूप में बड़े के रूप में कोशिकाओं अक्सर छानने का पहलू से पहले से हटा रहे है fluidics कॉलेस्ट्रॉल से बचने के लिए ।

हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में एक सामांय और किफायती विधि के मिश्रण से दुर्लभ संक्रमित कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस तरह के स्क्रैप के उपकला कोशिकाओं18मूत्राशय के रूप में वर्णित है । IBCs को प्रभावी ढंग से अलग करने के लिए, हम पारंपरिक मुंह पिख्ता इस्तेमाल किया । मुंह micropipetting एक तकनीक है कि लंबे समय तक एकल कोशिकाओं और भ्रूण के लिए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए माइक्रोनिपुलेशन के लिए इस्तेमाल कियागया है19,20,21,22,23, 24 , 25. पारंपरिक मुंह बड़ी तरल मात्रा (milliliters में) के pipetting अक्सर प्रयोगशाला से संबंधित दुर्घटनाओं का कारण रहा है, और तकनीक सही पारंपरिक भ्रूणविज्ञान के बाहर अनुसंधान समुदाय के बहुत से त्याग दिया गया है और एकल सेल अनुप्रयोगों । हमारे प्रोटोकॉल इस तकनीक के एकल सेल संस्करण से प्रेरित है19,20, जो शोधकर्ता और नमूने के बीच हवा के एक बड़े बफर (> 2 एमएल) प्रदान करने के तरल की मात्रा की तुलना में स्थानांतरित (< 1 μL) । इस विधि भी ठीक नियंत्रण का लाभ लेता है कि मुंह micropipetting प्रदान करता है, जो आसपास के समाधान हस्तांतरित और अलग कोशिकाओं की उच्च शुद्धता के एक कम अंतिम मात्रा में अनुवाद । तकनीक सस्ती सामग्री (< $50) का उपयोग करता है, और इस प्रकार सभी प्रयोगशालाओं में लागू करने के लिए व्यवहार्य होना चाहिए ।

इस दृश्य प्रोटोकॉल हमारे IBC अलगाव तकनीक का वर्णन, एक संदर्भ प्रदान करने के लिए अंय इस तकनीक को दोहराने की मांग शोधकर्ताओं की सहायता । शोधकर्ता एक फ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप (या इसी तरह के उपकरण) है कि व्यक्तिगत उपकला कोशिकाओं और लाइव इमेजिंग के दौरान फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए उपयोग की आवश्यकता होगी, micropipetting के लिए एक खुला और सुलभ इमेजिंग मंच के साथ (उपयोग माइक्रोस्कोप के विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें, हालांकि अन्य समकक्ष साधन मॉडल भी इस्तेमाल किया जा सकता है). हालांकि यह प्रोटोकॉल यूटीआई के म्यूरिन मॉडल में IBCs पर ध्यान केंद्रित करेगा, इसी तरह के तरीकों को संक्रमण के अन्य मॉडलों में सेल निलंबन से संक्रमित कोशिकाओं को अलग करने के लिए लागू किया जाना चाहिए ।

Protocol

सभी विधियों पशु हैंडलिंग के बारे में यहां वर्णित है संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) सिंगापुर के जीनोम संस्थान और विज्ञान, प्रौद्योगिकी और अनुसंधान, सिंगापुर के लिए एजेंसी के जैविक संसाधन केंद्र द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. माउस संक्रमण

  1. ग्लास केशिकाओं की तैयारी
    1. प्रकाश एक खुला लौ स्रोत (Bunsen बर्नर या शराब बर्नर).
    2. दोनों सिरों को मजबूती से चुटकी लेते हुए एक गिलास केशिका को पकड़ो, फिर बीच में ट्यूब को समान रूप से गर्म करें जब तक कि कांच नरम न हो जाए । केशिका धीरे आगे और पीछे अपनी धुरी के साथ घुमाएं को भी गिलास के हीटिंग में सहायता ।
    3. गर्मी स्रोत से कांच केशिका निकालें और तुरंत हाथ खींचने के अलावा, जबकि ट्यूब के दोनों सिरों पर पकड़ बनाए रखने । खींचा केशिका के आदर्श अंतिम लंबाई 3-5 सेमी लंबे समय तक एक unpulled केशिका एक मूत्राशय उपकला कोशिकाओं अलग के लिए एक उपयुक्त आंतरिक व्यास सुनिश्चित करने के लिए है ।
      चेतावनी: टयूबिंग अभी भी समय की अवधि के लिए बेहद गर्म रहता है, तो एक गर्मी सुरक्षित सतह पर एक तरफ केशिका अलग सेट अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले शांत करने के लिए कुछ मिनट के लिए ।
    4. देखो अगर कांच केशिका के बीच संकीर्ण हो गया है देखने के लिए (चित्रा 1ए) और है कि ट्यूब के इंटीरियर अभी भी खोखला है (चित्रा 1बी) । IBCs के अलगाव के लिए, 200-400 μm के एक बोर आकार प्रयोग करने योग्य है ।
    5. एक हाथ के साथ खींचा केशिका के एक छोर उठाओ । दूसरे हाथ से संदंश की एक जोड़ी पकड़ो, और इसका इस्तेमाल करने के लिए अपने संकीर्ण बिंदु पर खींचा कांच केशिका उठाओ । सुनिश्चित करें कि यह संदंश पर्याप्त बल के साथ यह कुचल के बिना केशिका दृढ़ता पकड़ करने के लिए wielded हैं ।
    6. हाथ से एक तेजी से घुमा गति का उपयोग करने के लिए संकीर्ण बिंदु पर खींचा केशिका तस्वीर के लिए एक मुंह micropipetting केशिका बनाने के लिए ।
      नोट: उंगलियों के बजाय संदंश का उपयोग भी स्वीकार्य है, जब तक कांच shards से पर्याप्त सुरक्षा का उपयोग किया जाता है ।
    7. दोहराएं कदम 1.1.2-1.1.6 कम से अधिक 4x पर्याप्त अतिरिक्त micropipetting केशिकाओं का उत्पादन करने के लिए और IBC अलगाव के लिए व्यास की एक सीमा प्रदान करते हैं । यदि एक से अधिक संक्रमण समूह प्रत्याशित है, तो प्रत्येक अतिरिक्त संक्रमण समूह के लिए 5 अतिरिक्त सूक्ष्मपिख्ता केशिकाओं को तैयार करें ।
      चेतावनी: खुली लौ बंद करना न भूलें ।
    8. एक १०० मिमी पेट्री डिश में खींचा केशिकाओं प्लेस और 30 मिनट के लिए यूवी विकिरण को पकवान बेनकाब केशिकाओं ।
    9. यूवी नसबंदी के बाद पेट्री डिश पर ढक्कन बदलें और कमरे के तापमान पर केशिकाओं के साथ पेट्री डिश की दुकान ।
  2. संक्रमण से पहले कैटर्स की तैयारी
    1. संक्रमण के लिए मूत्र कैटर्स तैयार के रूप में त्रिशंकु एट अल.8 में वर्णित है और conover एट अल.26 संक्रमण से एक दिन पहले ।
  3. फ्लोरोसेंट यूरोपैथोजेनिक ई. कोलाई संस्कृति की तैयारी
    1. स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार चयनित फ्लोरिफोर-urपैथोजेनिक जीवाणु तनाव को विकसित करना ।
      नोट: तनाव और फ्लोरे के विकल्प मुख्यतः माइक्रोस्कोप और व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं में उपलब्ध उपभेदों पर निर्भर करते हैं । इस उदाहरण में, हम UTI89, जो एक नैदानिक आवर्तक cystitis के साथ एक मरीज से मूल रूप से अलग है से व्युत्पंन तनाव का उपयोग करें । इस विकृति, एसएलसी-६३८, एक प्लाज्मिड (pslc-७७) है कि दोनों vsfgfp-9 और कनमीसिन प्रतिरोध18व्यक्त किया जाता है । एसएलसी-६३८, ५० μg/एमएल kanamycin के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर पौंड शोरबाट में उगाया जाता है ।
    2. स्ट्रीक विकृति SLC-६३८ पर एक लूरिया बेरतानी (LB)-आगर प्लेट ५० μg/mL kanamycin के साथ पूरक । थाली ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात में सेते ।
    3. वैकल्पिक एक कॉलोनी का चयन करने से पहले फ्लोरोसेंट मार्कर की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए विदारक माइक्रोस्कोप पर थाली देखें ।
    4. एक जीवाणु टीका लूप का उपयोग कर, चयनित कॉलोनी एक १२५ मिलीलीटर शंकु कुप्पी करने के लिए ५० μg/मिलीलीटर kanamycin के साथ पौंड शोरबाट पूरक के 10 मिलीलीटर के साथ स्थानांतरण । 24 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी स्टैटिकली सेते ।
    5. कुप्पी से संस्कृति के 10 μl लेने के द्वारा इस कुप्पी से बैक्टीरिया उपसंस्कृति और यह एक ताजा १२५ मिलीलीटर फ्लास्क (एक 1:1000 कमजोर पड़ने) में ५० μg/मिलीलीटर कनमीसिन के साथ पूरक पौंड शोरबा के 10 मिलीलीटर में कमजोर । इस दूसरी कुप्पी स्टैटिकली एक और 24 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेटे ।
    6. ५,००० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए बैक्टीरियल संस्कृति नीचे स्पिन ।
    7. Supernatant Decant और कोल्ड पीबीएस में बैक्टीरियल गोली resuspend ०.५ के आयुध डिपो६०० पर ।
      नोट: हालांकि यह संस्कृति से संस्कृति के लिए भिंन हो सकते हैं, आमतौर पर स्थैतिक संस्कृति के 1 मिलीलीटर के बारे में 4-5 मिलीलीटर के आयुध डिपो६०० = ०.५ बैक्टीरियल संस्कृति देता है । प्रत्येक विकृति के लिए आवश्यक बैक्टीरियल संरोप की कुल मात्रा निम्नानुसार गणना की जा सकती है: ५० μl प्रत्येक माउस के लिए आवश्यक है और सुई सिर को भरने के लिए ५० μl की जरूरत है । एक अतिरिक्त 10-20% (संरोप के ५० μl की ंयूनतम) सिरिंज में मृत मात्रा के लिए खाते की सिफारिश की है ।
    8. शेष बैक्टीरियल मिश्रण का उपयोग करने के लिए लटका एट अल.8में वर्णित के रूप में संक्रमण अनुमापांक निर्धारित करते हैं ।
      नोट: इस चरण में 4 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु मिश्रण को संग्रहित कर कुछ घंटों के लिए विलंबित किया जा सकता है ।
  4. मूत्र पथ के संक्रमण का म्यूरिन मॉडल
    1. त्रिशंकु एट अल.8द्वारा वर्णित के रूप में चूहों को संक्रमित, फ्लोरोसेंट ई. कोलाई के प्रत्येक तनाव के लिए एक प्रायोगिक समूह के साथ १.३ खंड में ।
      नोट: इसके अलावा दृश्य सहायता के लिए Conover एट अल.26 देखें ।
    2. माउस या पिंजरे के लिए जीवाणु टीका का समय नोट करें ।
    3. पूरे प्रायोगिक समूह के लिए संक्रमण दोहराएं ।
      नोट: संक्रमण कैथेटर एक ही समूह में सभी चूहों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है ।
    4. दोहराएं कदम 1.4.1-1.4.3 प्रत्येक प्रायोगिक के लिए योजना बनाई समूह, सुनिश्चित करना है कि एक ताजा कैथेटर और नई स्नेहक जेल हर समूह के लिए तैयार है ।
      नोट: जानवरों की एक बड़ी संख्या के साथ प्रयोगों के लिए, यह सबसे अच्छा है पांच के समूहों में जानवरों के विभाजन और चौंका देने वाला संक्रमण ऐसी है कि प्रत्येक समूह के बारे में 30 मिनट के लिए 1 एच के अलावा संक्रमित है । यह निंन चरणों के लिए पर्याप्त समय प्रदान करेगा (अनुभाग 2 और 3) ।

2. मूत्राशय उपकला कोशिका संचयन एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए

  1. कटाई और प्रतिकर्तन म्यूरिन मूत्राशय
    1. स्टरलाइज़िंग सर्जिकल उपकरणों के लिए ७०% इथेनॉल के ४५ मिलीलीटर से भरा ३ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों तैयार ।
    2. चरण 2.1.1 में तैयार ट्यूबों के दो में, कैंची की एक जोड़ी और एक संदंश की एक जोड़ी जगह । दो जोड़े संदंश (एक अधिमानतः संकीर्ण और एक गोल टिप के साथ, मूत्राशय के उलटा के लिए) तीसरे ट्यूब में रखें ।
      नोट: पहले ट्यूब में उपकरण बाहरी क्षेत्र पर इस्तेमाल किया जाएगा, दूसरे में उपकरण मूत्राशय की कटाई में इस्तेमाल किया जाएगा, और पिछले ट्यूब में संदंश के दो जोड़े मूत्राशय उलटा में इस्तेमाल किया जाएगा ।
    3. 6 एच पोस्ट संक्रमण में, संस्थान की स्थापना की IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार संक्रमित चूहों को euthanize ।
      नोट: हमारे IACUC प्रोटोकॉल गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से इच्छामृत्यु के लिए कॉल करते हुए माउस anस्थेसिया (isoflurane) के तहत किया जाता है ।
    4. अपनी पीठ पर फ्लैट जानवरों को रखना और उनके उदर क्षेत्र करने के लिए ७०% इथेनॉल के साथ भरा एक स्प्रे बोतल का उपयोग करें ।
    5. पहले ट्यूब (2.1.2 कदम में तैयार) से संदंश और शल्य कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, मूत्रमार्ग खोलने के ऊपर 1 सेमी के बारे में त्वचा पर एक छोटे से अनुप्रस्थ चीरा बनाते हैं । माउस के ऊपरी अंगों की ओर तिरछे चीरा का विस्तार, एक वी के आकार का निर्माण माउस है कि peritoneum की सामग्री को उजागर करता है की पूरी पूर्वकाल के साथ । सुनिश्चित करें कि इस प्रक्रिया के दौरान, कैंची माउस की आंतों के माध्यम से कटौती नहीं है (चित्रा 2ए, बी).
    6. उपकरण के दूसरे सेट करने के लिए स्विच (2.1.2 कदम में तैयार) । कैंची या forceps के शाफ्ट के ब्लेड का प्रयोग, धीरे माउस के श्रोणि क्षेत्र के पास वसा पैड पर नीचे धक्का ।
      नोट: इस कदम के कारण मूत्राशय जावक बहर और फसल कटाई के लिए दृश्यता सुनिश्चित करता है ।
    7. शीर्ष पर उजागर मूत्राशय पकड़ संदंश की एक जोड़ी के साथ (चित्रा 2सी) ।
    8. एक फर्म पकड़ forceps के साथ मूत्राशय शीर्ष पर रखते हुए, कट और पशु के आराम से मूत्राशय मुक्त (मूत्रमार्ग और मूत्रल काटने) शल्य कैंची का उपयोग कर । अभी तक मूत्राशय पकड़े संदंश जारी मत करो ।
    9. कैंची से तीसरे शंकु ट्यूब से संकीर्ण गोल संदंश को स्विचन (2.1.2 कदम से), मूत्राशय के उद्घाटन में जहां यह सिर्फ पिछले कदम में कटौती की गई थी में गोल संदंश के एक शाफ्ट के टिप डालने (चित्रा 2डी) । सुरक्षित रूप से मूत्राशय के उद्घाटन में डाला गोल संदंश की नोक के साथ, मूत्राशय के शीर्ष मनोरंजक संदंश की जोड़ी जारी है और यह दूसरा शंकु ट्यूब करने के लिए वापस ।
    10. तीसरी ट्यूब से संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग करना, धीरे मूत्राशय "अंदर बाहर बारी", पहले गोल संदंश से दूर मूत्राशय के मुंह के बाहर अंत खींच (चित्रा 2डी, 1 तीर) और यह मार्गदर्शक के आसपास और के अंय टिप पर गोलाकार संदंश (चित्र 2D, तीर 2) ।
      नोट: कार्रवाई एक पैर से एक जुर्राब को हटाने और इसे दूसरे पर खींच करने की कोशिश की जा सकती है ।
      1. उलटा प्रक्रिया के दौरान, लगभग पूरी तरह से बंद संदंश के पहले गोल जोड़ी बनाए रखने के । यह आंदोलन की पर्याप्त स्वतंत्रता के लिए गोल संदंश के पहले शाफ्ट से मूत्राशय खींच प्रदान करता है, लेकिन यह भी पहले के करीब गोल संदंश के दूसरे शाफ्ट लाता है और मूत्राशय के लिए अनुमति देता है आसानी से स्थानांतरित किया जाएगा । इस कदम का अंतिम परिणाम यह है कि मूत्राशय के अंत और संदंश की पहली जोड़ी के दूसरे शाफ्ट की नोक पर उल्टा किया जा रहा होना चाहिए (चित्रा 2ई) ।
      2. संदंश की दूसरी जोड़ी का प्रयोग, धीरे ठंडा pbs के 1 मिलीलीटर में संदंश की नोक से उल्टे मूत्राशय मनाना ।
        नोट: वैकल्पिक यह उपयुक्त समय के लिए पूरे औंधा, संक्रमित मूत्राशय की छवियों को लेने के लिए सामांय आवृत्ति और IBCs, यदि कोई हो वितरण का निरीक्षण है ।
    11. (पांच पशुओं की एक अधिकतम करने के लिए) प्रयोगात्मक समूह में प्रत्येक मूत्राशय के लिए 2.1.10 चरणों को दोहराएं ।
  2. मूत्राशय उपकला सेल scraping
    1. Forceps के दो साफ जोड़े का उपयोग, धीरे उल्टे मूत्राशय के बाहर परिमार्जन (जो आंतरिक उपकला कोशिका परत है) । आसपास के PBS खुर आय और उपकला कोशिकाओं PBS समाधान में जारी कर रहे है के रूप में cloudier प्रकट करना चाहिए ।
    2. वैकल्पिक नेत्रहीन पुष्टि करते है कि मूत्राशय scraping एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर समाधान में कोशिकाओं को जारी किया है । चित्रा 3 A, B). PBS नग्न आंखों के लिए बादल दिखाई देते हैं, और स्क्रैप व्यक्तिगत मूत्राशय उपकला कोशिकाओं 10x आवर्धन में देखा जा सकता है चाहिए ।
    3. चरण २.१ से प्रत्येक काटा मूत्राशय के लिए 2.2.1-2.2.2 कदम दोहराएं ।

3. Intracellular बैक्टीरियल समुदाय (IBC) अलगाव: Ibc के मुंह पिख्ता

नोट: इस खंड में वर्णित सभी विधियों में संस्थागत जोखिम मूल्यांकन आया है । मुंह का पिख्ता विलयन के अंतर्निहित जोखिम को वहन करता है जिसे हस्तांतरित किया जा रहा है । इस जोखिम को मुख्यतः नैनोलिटर वॉल्यूम्स द्वारा कम किया जाता है जो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है, और हम अनुशंसा करते हैं कि प्रोटोकॉल के सभी उपयोगकर्ता यहाँ और चर्चा में सूचीबद्ध एहतियाती और अभ्यास नोट्स पर ध्यान दें.

  1. कोशिकाओं को पीबीएस में स्क्रैप किया गया है के बाद, मुंह micropipetting उपकरण (चित्रा 3सी) की स्थापना की ।
    1. खींच ग्लास केशिका (unpulled अंत) के रबर प्लग (सफेद अंत) में चूषित्र ट्यूब के मोटा अंत डालें ।
    2. एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप के संकीर्ण अंत में अंय खुले (लाल) चूषित्र ट्यूब के अंत में डालें, यह सुनिश्चित करना है कि वहां एक तंग फिट है ।
    3. एक 2 मिलीलीटर में पिपेट के संकीर्ण अंत संमिलित करें खुला, 1 मिलीलीटर पिपेट टिप के व्यापक अंत में, फिर से सुनिश्चित करना है कि वहां एक तंग फिट है ।
      नोट: जिसके परिणामस्वरूप सेटअप उपकरण के दूसरे छोर पर केशिका ट्यूब के संकीर्ण अंत से एक कोमल चूषण बल बनाने के लिए aspirating पिपेट के व्यापक, खुले अंत से पिपेट करने के लिए शोधकर्ता की अनुमति देता है ।
    4. ताजा विआयनीकृत पानी युक्त एक १०० मिमी पेट्री डिश का उपयोग कर अंतिम मुंह micropipetting उपकरण का परीक्षण । Aspirating पिपेट के खुले अंत पर एक मामूली चूषण कार्रवाई (एक भूसे के माध्यम से एक पेय पर सिप्पी के समान) केशिका में तरल के स्तर में वृद्धि करनी चाहिए, लेकिन कारण नहीं विआयनीकृत पानी के लिए aspirating ट्यूब में अतिप्रवाह । एक हाथ का उपयोग केशिका ट्यूब को नियंत्रित करने के लिए, जबकि दूसरे हाथ का उपयोग पेट्री डिश की स्थिति को समायोजित करने के लिए ।
      नोट: मुंह के लिए आवश्यक चूषण की शक्ति-एक IBC को पिख्ता शोधकर्ताओं के बीच भिंन होगा । हालांकि, यह अनुशंसा की जाती है कि प्रत्येक शोधकर्ता इस तकनीक का प्रयास एक कमजोर चूषण के साथ शुरू और धीरे से यह वृद्धि अगर कोई तरल ऊपर केशिका बह रहा है । वहां पीने के लिए एक भूसे पर चूसने से अधिक एक बल के लिए कोई ज़रूरत नहीं है । यदि केशिका चरण 3.1.4 में परीक्षण के दौरान तरल उठा जा करने के लिए प्रकट नहीं होता है, यह संभव है कि या तो केशिका या aspirating ट्यूब अधिधारित है और जगह की जरूरत है । यह आगे की सिफारिश की है कि सभी नए शोधकर्ताओं पहले मुंह में सक्शन को नियंत्रित करने का अभ्यास नियंत्रण निष्फल पानी का उपयोग उपकरण । इसके अतिरिक्त, ध्यान दें कि मुंह पाइपकरण उपकरण द्वारा लिया मात्रा का नियंत्रण है शोधकर्ता जीभ के उपयोग के माध्यम से है । जीभ पतले चूषण लागू की ताकत को समायोजित कर सकते हैं, साथ ही साथ एक आपातकालीन बंद के रूप में कार्य ।
    5. तरल की सफल तेज प्राप्त करने के बाद, यह धीरे से aspirating पिपेट के खुले अंत में उड़ाने से केशिका से निष्कासित करने की क्षमता का परीक्षण । सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले कदम ३.५ के दौरान IBCs के संदूषण को रोकने के लिए तरल को खदेड़ने की प्रक्रिया में बनाए जाते हैं ।
      नोट: चूषण के साथ के रूप में, सकारात्मक दबाव की ताकत के लिए शोधकर्ता द्वारा लागू करने के लिए अपकेंद्रक ट्यूब में IBC निष्कासित शोधकर्ताओं के बीच भिंन होगा । यह शोधकर्ताओं के लिए नए इस प्रोटोकॉल के लिए सिफारिश की है कदम ३.१ वास्तविक संक्रमण से पहले कुछ दिनों के अभ्यास के लिए । मुंह micropipetting अभ्यास के लिए एक सुझाव खाद्य डाई की कुछ बूंदें (दृश्यता के लिए) मुंह micropipetting उपकरण का उपयोग कर के साथ मिश्रित निष्फल पानी की छोटी मात्रा में स्थानांतरित करने का अभ्यास है ।
  2. स्क्रैप्ड सेल निलंबन को विदारक माइक्रोस्कोप के तहत रखें और IBCs की पहचान बड़े फ्लोरोसेंट समुच्चय (चित्रा 3A, B) के रूप में करें । आवर्धन की आदर्श सीमा 20-40x है । केशिका कार्रवाई के माध्यम से अवांछित मात्रा के ऊपर की ओर कम करने के लिए 1 एस के लिए PBS के एक ताजा ट्यूब में कांच केशिका के ठीक अंत डुबकी ।
  3. माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख रहे हैं, ब्याज की IBC की पहचान और धीरे से IBC की ओर केशिका ट्यूब के खुले अंत लाने के लिए । दो या अधिक कोशिकाओं की आकांक्षा को रोकने के लिए, या कोशिकाओं के बड़े समुच्चय को तोड़ने के लिए प्रत्येक IBC के पास अतिरिक्त कोशिकाओं को दूर स्वीप करने के लिए कांच केशिका के ठीक अंत का प्रयोग करें ।
  4. जबकि खुर्दबीन के माध्यम से देख रहे हैं, दूर छोर पर एक बहुत छोटे चूषण बल लागू (पिपेट) मुंह micropipetting उपकरण के कांच केशिका में IBC मार्गदर्शन करने के लिए ।
  5. IBC को चुनने के बाद, केशिका को खाली १.५ मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर ले जाएं और छोटी बूंद और IBC को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (चित्र 3D) में निष्कासित करने के लिए थोड़ा सा सकारात्मक दबाव लागू करें ।
  6. दोहराएं चरण 3.3-3.6 पर के रूप में कई IBCs की जरूरत है वर्तमान मूत्राशय से, अगले मूत्राशय के लिए आगे बढ़ने से पहले । लार के निर्माण को रोकने के लिए अक्सर पिपेट और केशिकाओं aspirating बदलें ।
    चेतावनी: बैक्टीरिया के संक्रामक (या नैदानिक) उपभेदों के साथ काम करते हैं, लगातार केशिका में समाधान के स्तर की निगरानी । केशिका के किनारे से द्रव के स्तर को प्रतिचयक नली में न जाने दें । यदि ऐसा होता है, तुरंत एक अलग चूषित्र ट्यूब पर स्विच, और पिछले सेट को छोड़ दें ।
  7. सभी काटा गया bladders पर चरण 3.2-3.6 दोहराएं, या जब तक कि प्रयोगात्मक समूह के लिए जैविक नमूनों की पर्याप्त संख्या एकत्र किया गया है ।
  8. वैकल्पिक दोहराएं चरण ३.६ और ३.७ जब तक सभी प्रायोगिक समूहों (या चूहों) किया गया है और पर्याप्त जैविक नमूनों को प्रत्येक समूह से काटा गया है ।

Representative Results

पुष्टि के अलावा (चित्रा 3डी) विदारक माइक्रोस्कोपी द्वारा संग्रह ट्यूब में एक एकल अलग ibc की उपस्थिति की, अलग आईबीईसी की शुद्धता भी पुष्टि की जा सकती है । चित्रा 4एमें दिखाया गया के रूप में, अलग कोशिकाओं ई. कोलाई और uroplakin दोनों के लिए दाग चाहिए, और ibcs के लिए अपेक्षित आकार (50-120 μm)17। इसके अलावा, ई. कोलाई धुंधला आसपास के तरल में मौजूद नहीं है । हमारे डेटा के आधार पर, इस तकनीक के साथ अलग कोशिकाओं के ९०% से अधिक IBCs18हैं । अलगाव के बाद, व्यक्ति ibc में बैक्टीरिया की कोशिकाओं की उपस्थिति और व्यवहार्यता की पुष्टि कॉलोनी बनाने इकाई (cfu) गणना (चित्रा 4ख) या मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qpcr) जीनोमिक समकक्ष के माध्यम से किया जा सकता है ( चित्रा 4 ग). चित्र 4ग यह भी दर्शाता है कि असंक्रमित उपकला कोशिकाओं को एक ही प्रोटोकॉल के साथ अलग बैक्टीरिया की मात्रा quantifiable नहीं है । इन आंकड़ों के आधार पर हमारा अनुमान है कि एक ही आईसीसी में CFUs की रेंज मूत्र पथ के संक्रमण के म्यूरिन मॉडल में 102-103 है । एकल IBC अलगाव के मुख्य लक्ष्यों में से एक ऐसे RNA अनुक्रमण के रूप में डाउनस्ट्रीम विश्लेषण प्रदर्शन है । यह सत्यापित करने के लिए कि हमारे अलगाव विधि आईबीसी में बैक्टीरिया से rna विश्लेषण के लिए प्राप्त करने में सक्षम है, हम मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया प्रदर्शन (qrt-पीसीआर) तीन जीन (16s, cyob, और frda) के परिमाणन के लिए एक अलग-अलग और परित ibcs की रेंज (चित्रा 4डी) । चित्रा 4 में दर्शाए गए सभी आंकड़ों को दुरईस्वामी एट अल.18की अनुमति से अनुकूलित किया गया है । हमारे IBC अलगाव प्रोटोकॉल का एक सिंहावलोकन योजनाबद्ध चित्रा 5में देखा जा सकता है, जो Duraiswamy एट अल.18से reproduced है ।

Figure 1
चित्रा 1 : हाथ से खींचा केशिकाओं संकीर्ण खुले बनाए रखने । (क) हाथ से खींचे केशिका ट्यूबों के नमूने इसके विपरीत काली पृष्ठभूमि पर प्रदर्शित किए जाते हैं । नीचे से ऊपर, एक unpulled केशिका, एक केशिका कि एक पर्याप्त हद तक नहीं खींचा, एक केशिका कि एकल मूत्राशय उपकला कोशिका संचयन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और एक केशिका कि बहुत पतली खींच लिया गया था (और इस प्रकार दो टुकड़ों में अलग) दिखाए जाते हैं । एक 15 सेमी शासक पैमाने के लिए छवि के तल पर रखा गया है । प्रयोग करने योग्य केशिका को तड़कने के लिए अनुमानित बिंदु लाल तीर द्वारा चित्र पर दर्शाया गया है । (ख) एक खींच केशिका (नीचे) के खोखले आंतरिक व्यास की पुष्टि एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ लिया छवि । एक unpulled केशिका ऊपर तैनात करने के लिए दो capillaries के सापेक्ष आकार अंतर प्रदर्शित है । स्केल बार = ४.० mm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : फसल मूत्राशय उपकला कोशिकाओं के लिए माउस के विच्छेदन । (क) सफेद रेखाओं के साथ एक माउस की एक छवि के लिए अनुमानित स्थान और चीरों के कोण को इंगित करने के लिए जोड़ा गया है murine पेरिटोनेयल गुहा और मूत्राशय को बेनकाब । (ख) उजागर माउस पेरिटोनियल गुहा के बाद चीरा की एक छवि । (ग) उजागर मूत्राशय की एक छवि (लाल तीर) वसा पैड के बीच से फैला हुआ । (घ) लूमेन में सम्मिलित किए गए टिकिया की नोक के साथ म्यूरीन ब्लैडर की एक छवि, जो मूत्राशय को पलटने के लिए आवश्यक गति की दिशा इंगित करने के लिए तीरों के साथ है. मूत्राशय पहले थोड़ा बाहर खींच लिया है, तो चारों ओर और बंद forceps के पहले शाफ्ट । दोनों कार्यों के लिए प्रस्ताव के निर्देश के रूप में सफेद तीर 1 और 2 गिने द्वारा संकेत कर रहे हैं । (ङ) प्रतिलोमित मूत्राशय की अंतिम स्थिति को दर्शाने वाली एक प्रतिबिंब जो प्रतिरूपी के दूसरे शाफ्ट पर प्रविष्ट होता है । संदंश के शाफ्ट लाल तीर और पाठ के साथ दोनों पैनलों डी और ई में लेबल रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : आईडीसी मूत्राशय कोशिकाओं से संचयन । (क) सेल स्क्रैप से पहले कोल्ड पीबीएस सॉल्यूशन में संक्रमित और उल्टे मूत्राशय । (ख) एक सूक्ष्मदर्शी के नीचे देखा के रूप में स्क्रैप मूत्राशय कोशिकाओं दिखा छवि । IBCs दोनों छवियों में बड़ी हरी फ्लोरोसेंट समुच्चय के रूप में पहचाना जा सकता है (लाल तीर देखें) । (ग) पूरा मुंह माइक्रोपाइटिंग उपकरण की एक छवि । पिपेट, पिपेट टिप, aspirating ट्यूब, और खींचा केशिका ट्यूब की पहचान की है गिने तीर के रूप में सही पर संकेत दिया । (घ) एक एकल अलग आईसीसी की एक छवि के भीतर एक १.५ मिलीलीटर संग्रह ट्यूब (लाल रंग में रेखांकित) । स्केल पट्टियां (जैसा कि दर्शाया गया है) पैनलों A, B, और D में सफेद रेखाओं द्वारा प्रदर्शित की जाती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : फसल IBCs शुद्ध कर रहे है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस आंकड़े को दुरईस्वामी एट अल18की अनुमति से संशोधित किया गया है । (क) दो अलग-थलग जीएफपी पॉजिटिव सेलों की छवियां जो एंटी-यूरोलाकिन और एंटी-ई -कोलाई एंटीबॉडी से सना हुआ था । प्रथम कक्ष (IBC 1) में बाईं ओर व्यक्तिगत चैनल (कम-आवर्धन पर) की छवियाँ हैं, और एक उच्च-आवर्धन मर्ज की गई छवि दाईं ओर है. दूसरी सेल (IBC 2) में उच्च आवर्धन में मर्ज और व्यक्तिगत चैनल दिखाया गया है । स्केल पट्टियां संकेत के रूप में हैं । डीएनए 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) और नीले चैनल में प्रतिनिधित्व के साथ दाग है । विरोधीई. कोलाई एक द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ दाग है फ्लोरेसेइन isothiocyanate (fitc) के लिए संयुग्मित और ग्रीन चैनल में प्रतिनिधित्व किया । एंटी-यूरोपिलकिन टेट्रामेथाइरोडैमीन आइसोथायोसिनेट (TRITC) के लिए एक माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित के साथ दाग है और लाल चैनल में प्रतिनिधित्व किया । (ख) आइसोलेटेड आईबीसी से बैक्टीरियल cfus । IBCs तुरंत संसाधित किए गए थे, या 10 या 30 मिनट के लिए ०.१% Triton-X में इनसेबटेड । अलग आईबीसी के Pooled CFU गिनती n = 3 अलग प्रयोगों से दिखाया जाता है । पहचान की सीमा = ०.७ लॉग10 cfus/ लाल डॉट्स का पता लगाने की सीमा पर प्लॉट किए गए नमूने जिनसे कोई कालोनियां बरामद नहीं हुई । सभी IBC-युक्त नमूने काफी अलग नहीं हैं (पी > ०.०५, मान-whitney परीक्षण); असंक्रमित उपकला कोशिकाओं IBC (10 मिनट) डेटा (पी < ०.००१, मान-whitney परीक्षण) से काफी अलग हैं । (ग) ०.१% ट्रिटन-एक्स (*, पी < ०.०००१, मान-व्हिटनी टेस्ट, एन = 4) में 10 मिनट की ऊष्मायन के बाद वैयक्तिक आईबीसी और असंक्रमित उपकला कोशिकाओं पर बैक्टीरिया का qpcr परिमाणन । पता लगाने की सीमा = १.१८ लॉग10 बैक्टीरियल जीनोम समकक्ष/ लाल डॉट्स नमूनों का संकेत देते हैं जिसके लिए पैनल बी में टिटरिंग पर कोई कालोनियां बरामद नहीं की गई । (घ) व्यक्तिगत रूप से पृथक और परित आईबीसी (एन = 1 प्रयोग) की भिन्न संख्याओं के लिए 16S Rrna, cyob और frda जीन का परिमाणन; प्रत्येक बिंदु 3 तकनीकी replicates का माध्य इंगित करता है) । नेकां = कोई डीएनए नकारात्मक नियंत्रण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : एक योजनाबद्ध और इसके जुड़े चित्र संक्रमित चूहों bladders से मुंह micropipetting के माध्यम से IBCs के अलगाव का प्रतिनिधित्व । यह आंकड़ा ड्राईस्वामी एट अल.18से रिप्रोडक्शन किया गया है । (क) एक काटा हुआ संपूर्ण मूत्राशय; (ख) एक औंधा पूरा मूत्राशय आईबीसी व्यक्त करते हुए जीएफपी को उजागर करता है; (ग) आसन्न बफर में निलंबन में वैयक्तिक आईबीसी को दर्शाने वाला एक खुरपेड ब्लैडर के किनारे का बंद होना; (घ) एक एकल पृथक आईबीईसी को एक नली में रखा जाता है । पैनल बी में लाल तीर मूत्राशय की लुमिनल सतह पर जीएफपी पॉजिटिव आईबीसी के उदाहरणों को दर्शाते हैं । पैनल C में लाल बिंदीदार रेखा उल्टे मूत्राशय की दाईं बॉर्डर को इंगित करती है ("BL" के रूप में दर्शाई गई); पैनल सी में लाल तीर स्पष्ट व्यक्तिगत GFP-सकारात्मक उपकला कोशिकाओं है कि बंद मूत्राशय की सतह scraped है संकेत मिलता है । पैनल डी में सफ़ेद बिंदीदार रेखा एक सूक्ष्मपेटित उप-माइक्रोलीटर छोटी बूंद को दर्शाती है, जिसमें एक अलग आईडीसी होता है, जो सफेद तीर द्वारा दर्शाया जाता है । स्केल सलाखों = 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हमने जिस प्रोटोकॉल का वर्णन किया है वह यूटीआई के म्यूरिन मॉडल से सिंगल आईबीसी के पृथक्करण की अनुमति देता है । यह प्रोटोकॉल ibcs को व्यवहार्य intracellular बैक्टीरिया से युक्त करता है, जिसे cfu के लिए संवर्धन द्वारा सत्यापित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल IBCs से intracellular बैक्टीरिया में परिणाम extracellular बैक्टीरिया द्वारा थोड़ा संदूषण के साथ, दोनों बैक्टीरिया और एक IBCS से मेजबान सेल के आगे लक्षण वर्णन के लिए अनुमति (चित्रा 4सी) । हम यह भी बताते है कि एक एकल ibc से बैक्टीरिया ऐसे qpcr (चित्रा 4सी) के रूप में अनुप्रवाह अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, सुझाव है कि हमारी तकनीक के लिए इन विट्रो विश्लेषण में अंय के लिए ibc प्रक्रिया इस्तेमाल किया जा सकता है । 5 IBCs के रूप में कुछ के रूप में से काटा बैक्टीरिया pooling द्वारा, हम आगे तीन बैक्टीरियल जीन पर qRT-पीसीआर विश्लेषण करने के लिए हमारी क्षमता का प्रदर्शन, सुझाव है कि अच्छी गुणवत्ता आरएनए हमारे अलग आईबीसी में बैक्टीरिया से काटा जा सकता है (चित्रा 4डी). संयुक्त, डेटा हमने दिखाया है कि प्रदर्शन जीनोम चौड़ा आरएनए विश्लेषण (जैसे RNA अनुक्रमण के रूप में) एकल IBCs पर इस अलगाव तकनीक का उपयोग संभव हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम 6 एच समय बिंदु पर ध्यान केंद्रित किया है क्योंकि है कि जब काले 6 UTI89 द्वारा संक्रमित चूहों के मूत्राशय में ibc संख्या पीक। इसके अलावा, हम भी एक स्थैतिक बैक्टीरियल संस्कृति प्रणाली का इस्तेमाल किया है प्रकार के स्तर को बढ़ाने के लिए 1 UTI89 में पिल्स अभिव्यक्ति । प्रकार की अभिव्यक्ति 1 पिलस ई. कोलाई के लिए महत्वपूर्ण है करने के लिए संलग्न करने के लिए और संक्रमित मूत्राशय उपकला कोशिकाओं28। हालांकि, इस अभिव्यक्ति कसकर विनियमित है29 और पर्यावरण cues इसे बदलने के लिए जाना जाता है30। आदेश में एक सुसंगत संक्रमण phenotype और IBCs की पर्याप्त संख्या बनाए रखने के लिए, हम एक 2 x 24 h स्थैतिक बैक्टीरियल संस्कृति का उपयोग करने की सिफारिश (थोड़ा त्रिशंकु एट अल.8से संशोधित) और 6 एच संक्रमण समय बिंदु जब पहले परीक्षण ई. कोलाई के साथ काम इस तरह के NU14 और UTI8928,29के रूप में उपभेदों । हालांकि, यह संभव है कि इन चर अंय यूटीआई उपभेदों में या अंय चूहों उपभेदों में समायोजित करने के लिए प्रत्येक संक्रमण से IBCs की आदर्श संख्या प्राप्त करने की आवश्यकता होगी ।

जबकि त्रिशंकु एट अल.8 से प्रोटोकॉल केवल मादा चूहों का उपयोग करता है, पुरुष चूहों में मूत्र पथ के संक्रमण की स्थापना के लिए अंय स्थापित प्रोटोकॉल31रिपोर्ट किया गया है । इस मॉडल में, पुरुष चूहों में cystitis भी IBC मार्ग का पालन किया । के रूप में पुरुष और मादा चूहों के मूत्राशय आकार में समान हैं, हमें आशा है कि हमारे ibc अलगाव प्रोटोकॉल संक्रमित पुरुष चूहों पर के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त अपेक्षाकृत सरल प्रौद्योगिकी भी यह सुनिश्चित करती है कि इसे अधिकांश प्रयोगशालाओं में तैनात किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में शामिल प्रमुख कदमों में से एक है कांच की केशिकाओं को खींचना जिसमें रूचि के कोशिका प्रकार का चयन करने के लिए माइक्रोकेशिकाओं का निर्माण करना है । यह कदम microcapillaries के व्यास में लचीलापन के लिए अनुमति देता है बनाया है, और इस तरह की विधि एकाधिक विभिंन लक्ष्य सेल प्रकार के लिए बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, इन capillaries बनाने में निहित भिन्नता के कारण, देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि अंतिम व्यास एक उपयोगी रेंज में है लिया जाना चाहिए । यदि केशिकाओं बहुत संकीर्ण हैं, वे ब्याज की सेल लेने में विफल है, लेकिन अगर वे बहुत व्यापक बना रहे हैं, एक ही प्रयास में एकाधिक कोशिकाओं का चयन किया जा सकता है । इसके अलावा, केशिका खींचने की प्रक्रिया के दौरान एक खुली लौ का उपयोग जलता है और आग का एक अंतर्निहित जोखिम वहन करती है, तो शोधकर्ता microcapillaries बनाने का प्रयास करने के लिए ऐसी घटनाओं होने से रोकने के लिए ध्यान रखना चाहिए । परिवर्तनशीलता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खुले आग इन capillaries बनाने में शामिल जोखिम को कम करने के लिए, शोधकर्ता ऐसे electroशरीरक्रियात्मक प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में एक पारंपरिक माइक्रोपिपेट पुलिंग मशीन, का उपयोग कर सकता है (जैसे, पीसी-१००, नारीशिगे समूह) । के रूप में इन मशीनों या तो गुरुत्वाकर्षण या रोबोट प्लेटफार्मों के उपयोग के लिए capillaries खींच कर, वे संक्रमण मॉडल की जरूरतों को पूरा करने के लिए सिलवाया जा सकता है । हालांकि, micropipette पुलिंग उपलब्ध मशीनों की विस्तृत श्रृंखला का मतलब होगा कि व्यक्तिगत शोधकर्ता के लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि के माध्यम से जाने के लिए इस प्रोटोकॉल के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त अंतिम केशिका व्यास निर्धारित करने की आवश्यकता होगी ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल नेत्रहीन IBC की पहचान करने के लिए एक फ्लोरोसेंट टैग व्यक्त बैक्टीरिया का उपयोग करता है । इस प्रकार, इस तकनीक के शोधकर्ताओं द्वारा सीमित करने के लिए आनुवंशिक रूप से संक्रामक जीव को संशोधित करने की क्षमता है । विशेष रूप से उपेक के लिए, ibc-बनाने उपभेदों जैसे CFT073 और NU14 सफलतापूर्वक gfp के साथ बदल दिया गया है-plasmids३२,३३,३४व्यक्त; इसलिए ये एक ही प्रोटोकॉल में प्रयोग करने योग्य होना चाहिए । माउस मूत्राशय (७० मिमी2)३५के क्षेत्र के आधार पर, व्यक्तिगत उपकला कोशिकाओं की लंबाई (50-120 μm)17, और एक एकल मूत्राशय में IBCs की आवृत्ति16, ibcs की घटनाओं के लिए एक रूढ़िवादी अनुमान के बारे में है 1 में १,००० कक्ष (या ०.१%) । यह अनुमान दुर्लभ घटनाओं को लक्षित करने के लिए हमारे सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल की उपयोगिता को प्रदर्शित करते हैं । हमारे प्रोटोकॉल के माध्यम से सेल चयन की परिशुद्धता और केशिका व्यास कि खींचा जा सकता है की एक विस्तृत श्रृंखला का सुझाव है कि इस प्रोटोकॉल को विवो में अंय से intracellular बैक्टीरिया को अलग और संक्रमण के विट्रो मॉडलों में इस्तेमाल किया जा सकता है । वास्तव में, हम सफलतापूर्वक इस तकनीक का इस्तेमाल किया है संक्रमित सुसंस्कृत मूत्राशय उपकला कोशिकाओं को अलग (नहीं दिखाया डेटा) ।

प्रोटोकॉल में अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण चरणों में से एक मूत्राशय के व्युत्क्षण के लिए scraping उपकला कोशिकाओं को बेनकाब है । हमने पाया है कि यह भी मूत्राशय पर एक चीरा बनाने के लिए यह splay बाहर scraping के लिए संभव है । तथापि, इसे काटने की प्रक्रिया के दौरान मूत्राशय की उपकला कोशिकाओं को होने वाले नुकसान को कम करने के लिए उचित सावधानी बरती जानी चाहिए; आदर्श रूप से एक एकल कटौती मूत्राशय खुला splay करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, कटौती ठंडे PBS में किया जाना चाहिए, प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं या मूत्राशय के ऊतकों की आकस्मिक हानि को रोकने के लिए ।

इस प्रोटोकॉल में IBCs के मुंह का पिख्ता सेल चयन प्रक्रिया पर अधिक नियंत्रण प्रदान करता है, साथ ही सेल के साथ स्थानांतरित समाधान की अंतिम मात्रा को सीमित । ठीक नियंत्रण और शोधकर्ताओं के मुंह से समाधान की बड़ी जुदाई भी शोधकर्ता की सुरक्षा अधिकतम, के रूप में स्थानांतरित खंड microliter रेंज के लिए नैनोलिटर के भीतर हैं । इसके विपरीत, आधुनिक micropipette के साथ हमारे अनुभव यह है कि यह IBC के साथ अधिक आसपास के तरल और कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए जाता है, संभवतः extracellular ल्यूमिनल बैक्टीरिया के साथ संदूषण के लिए अग्रणी । हमारी खोज है कि मुंह pipetting अंय एकल सेल अलगाव विधियों पर एक उच्च प्रदर्शन प्रदान करता है भी अंय22,23,24लैब्स द्वारा सूचित किया गया है । एकल कोशिका अलगाव के अलावा, मुंह पिख्ता भी न्यूरॉन्स25, जो आगे उपयोगिता और मिनट के नियंत्रण को दर्शाता है कि एक प्रशिक्षित शोधकर्ता तकनीक के साथ प्राप्त कर सकते हैं के लिए एकल सेल इलेक्ट्रोपोरेशन में इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, सुरक्षा प्राथमिक महत्व की है, और हम संभावित अतिरिक्त उपाय है कि इस्तेमाल किया जा रहा रोगजनकों के आधार पर लिया जा सकता है सुझाव: (i) शोधकर्ता और जैविक सामग्री के बीच हवा बफर का विस्तार, उदाहरण के लिए एक aspirating का उपयोग करके एक बड़ी मात्रा के साथ पिपेट (जैसे, 5 मिलीलीटर), या (ii) एक अतिरिक्त बाधा के रूप में कार्य करने के लिए aspirating पिपेट में कपास ऊन के रूप में एक भौतिक फिल्टर जोड़ने.

मामलों में जहां एक जोखिम मूल्यांकन निष्कर्ष है कि मुंह pipetting अभी भी बहुत जोखिम भरा है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोबोट setups (जैसे nanoinjections के लिए इस्तेमाल उन लोगों के रूप में) हमारी तकनीक के अंय वर्गों के साथ संयुक्त किया जा सकता है के लिए एक सुरक्षित विधि प्रदान करने के लिए सुराग मिश्रित आबादी से संक्रमित कोशिकाओं को अलग । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक रोबोट माइक्रोनिप्लेटर का उपयोग कर के साथ हमारे अनुभव IBC अलगाव की कमी की दर का प्रदर्शन किया है मुंह की तुलना में पिख्ता, मूत्राशय उपकला कोशिका आकार में बड़े अंतर-प्रयोगात्मक भिन्नता के रूप में यह उपयोगकर्ता के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है एकल IBCs लेने के लिए आवश्यक बल निर्धारित करने के लिए एक रोबोट बांह की. फिर भी, यह एक व्यवहार्य, हालांकि महंगा है, रोग के अत्यधिक संक्रामक एजेंटों के साथ काम करने वालों के लिए विकल्प रहता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अनुसंधान को राष्ट्रीय अनुसंधान प्रतिष्ठान, प्रधानमंत्री कार्यालय, सिंगापुर द्वारा अपनी एनआरएफ अनुसंधान अध्येतावृत्ति योजना (एनआरएफ अवार्ड सं) के अंतर्गत समर्थन दिया गया था । NRF-RF2010-10); सिंगापुर स्वास्थ्य मंत्रालय की राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएमआरसी/सीआईडीजी/1358/2013); और जीनोम इंस्टीट्यूट ऑफ सिंगापुर (जीआईएस)/विज्ञान, प्रौद्योगिकी, और अनुसंधान के लिए एजेंसी (ए * स्टार) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL eppendorf tube For static bacterial culture and OD measurement
100% ethanol For Alcohol Burner
15 mL conical tube For static bacterial culture and OD measurement
1 mL Tuberculin Syringe BD Biosciences  302100
3% Bacterial Agar For static bacterial culture and OD measurement
70% ethanol For static bacterial culture and OD measurement
Aesculap anatomic forceps Braun/Kruuse BD222R For initial dissection of mouse (skin, fascia)
Alcohol Burner Wheaton 237070
Aspirating pipette BD Biosciences  357558
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177
Bacterial loops For static bacterial culture and OD measurement
Benchtop centrifuge Eppendorf 5424 Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes
Conical flasks For static bacterial culture and OD measurement
Digital camera for microscope Olympus DP71 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Glass Capillaries Kimax 6148K07
Iris Scissors STR SS 110MM Braun BC110R
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein Animal Health 29405
Kanamycin Sulfate Calbiochem 420311 For static bacterial culture and OD measurement
LB broth (Miller) Thermo/Gibco 10855021 For static bacterial culture and OD measurement
Light source unit for microscope Olympus LG-PS2 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Lubricant  KY Any similar commercial medical lubricant will suffice
Macro fluorescence microscope Olympus MVX10 For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Micropipette + micropipette tips For static bacterial culture and OD measurement
PBS 1x For static bacterial culture and OD measurement
Pipette controller + Pipettes For static bacterial culture and OD measurement
Polyethylene Tubing BD Intramedic 427401
Precision Glide needle 30 G BD Biosciences  305107 Possibly under new catalogue number (305106)
Splinter forceps curved Braun BD312R
Spray bottle (for ethanol) For static bacterial culture and OD measurement
Square cuvettes Elkay 127-1010-400 For static bacterial culture and OD measurement
Sterilgard III Advance Safety Cabinet Baker SG403 Any biosafety cabinet with a UV irridiator
Sterilin 90mm Standard Petri Dish Thermo 101VR20 Any sterile petri dish
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm Braun OK366R Recommended for harvesting of bladder
Surgical Scissors STR S/B 105MM Braun BC320R
Tabletop Centrifuge Eppendorf 5810R Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals
WPA C08000 cell density meter Biowave (Biochrom) 80-3000-45 For static bacterial culture and OD measurement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  2. Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).
  3. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).
  4. Foxman, B., Barlow, R., D'Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs. Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).
  5. Zowawi, H. M., et al. The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology. Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).
  6. Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections. Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).
  7. Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract. Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).
  8. Hung, C. -S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).
  9. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science Translational Medicine. , (2011).
  10. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. PLoS Pathogens. , (2009).
  11. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).
  12. Hunstad, D. A., Justice, S. S. Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli. Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).
  13. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Medicine. , (2007).
  14. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  15. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  16. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection. Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).
  17. Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal). International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).
  18. Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir. Infection and Immunity. , (2018).
  19. Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).
  20. Tang, F., et al. Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres. PLoS One. , (2011).
  21. Wells, J. M., Melton, D. A. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development. 127, 1563-1572 (2000).
  22. Guo, H., et al. Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing. Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).
  23. Zhao, R., et al. The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
  24. Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).
  25. Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2017).
  26. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), 52892 (2015).
  27. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
  28. Mulvey, M. A., et al. Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli. Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).
  29. Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).
  30. Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media. Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).
  31. Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).
  32. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  33. Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli. Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).
  34. Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073. Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).
  35. Jost, S. P. Postnatal growth of the mouse bladder. Journal of Anatomy. 143, 39-43 (1985).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण १४६ मुद्दा मूत्र पथ के संक्रमण एकल कोशिका अलगाव intracellular जीवाणु समुदायों मूत्ररोग विज्ञान Escherichiaकोलाई MURINE यूटीआई
एकल-कोशिकीय जीवाणु समुदायों का अलगाव जो अनुप्रवाह एकल कोशिका विश्लेषण के लिए मूत्र पथ के संक्रमण के म्यूरिन मॉडल से उत्पन्न होता है ।
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, E., Chee, J. L. Y.,… More

Yang, E., Chee, J. L. Y., Duraiswamy, S., Chen, S., Lees, K., Chen, S. L. Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis. J. Vis. Exp. (146), e58829, doi:10.3791/58829 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter