Summary
Bu iletişim kuralı tek, enfekte-mesane idrar yolu enfeksiyonu fare modeli gelen epitel hücreleri izole basit bir yöntem açıklanır.
Abstract
Bu makalede, deneysel olarak üriner sistem enfekte olmuş bir fare tek tek hücre içi bakteriyel toplumdan izole etmek için kullanılan bir yordam anahat. Protokol genel olarak üç bölüme ayrılabilir: enfeksiyon, mesane epitel hücre hasat ve bireysel enfekte epitel hücreleri izole etmek için ağız micropipetting. İzole epitel hücre canlı bakteri hücreleri içerir ve neredeyse aşağı akım tek hücreli analiz için ideal hale ekstraselüler bakteri kirletici ücretsizdir. Bir tek hücre içi bakteriyel topluluk elde etmek için enfeksiyon başından itibaren geçen süre 8 h hakkında olduğunu. Bu iletişim kuralı dağıtmak ucuz ve yaygın olarak kullanılan malzemeler kullanır ve biz tahmin o da o enfekte hücreleri nadir olsa bile hücre karışımları tek enfekte hücreleri izole etmek için diğer enfeksiyon modellerinde kullanılabilir. Ancak, ağız micropipetting bir potansiyel risk nedeniyle, bu yordam için son derece bulaşıcı ajanlar önerilir.
Introduction
İdrar yolu enfeksiyonları (UTIs) en sık görülen bakteriyel enfeksiyonlar biridir. Kadınların yaklaşık 40-%50 en az bir idrar yolu enfeksiyonu (iye) onların ömür boyu1sırasında deneyim bekleniyor. İYE ana ajanlarından biri uropathogenic E. coli (UPEC), hangi hesapların komplikasyonsuz UTIs2üzerinden % 70 için. Ayrıca, yaklaşık dörtte birini bir iye olanlar sık sık aynı zorlanma, uygun antibiyotik tedavisi3rağmen neden bir tekrarlayan enfeksiyon olacaktır. İYE yüksek insidansı yılda ABD4den fazla 2 milyar dolar maliyet sağlık sistemleri üzerinde önemli bir yük temsil eder. Ayrıca, UTIs tedavisinde antibiyotik kullanımı da önemli halk sağlığı endişe5olan yükselen antibiyotik direnci oranları için açar.
Bu nedenle, büyük bir çaba tarafından UPEC idrar yolu, aynı zamanda tekrarlayan enfeksiyonlar6,7,8neden yeteneğini bozar mekanizmaları anlama içine yerleştirildi. Özellikle, bir fare modeli enfeksiyonu iye8' e katkıda bakteriyel ve ana bilgisayar özellikleri incelemek için kullanılan. Bu fare modeli insan hastalardan izole değiştirilmemiş klinik suşları için geçerli olmanın avantajı vardır. Bu model ayrıca bakteriyel yolları iye, kurulması Type 1 pilus9 ve demir Alım sistemleri gibi10için önemli potansiyel olarak druggable keşfi neden olmuştur.
İYE erken olaylarda eğitim bu başarıları ile karşılaştırıldığında, bilgi tekrarlayan iye yatan mekanizmaları hala11bulunmuyor. UPEC antibiyotik tedavisi evades ve tekrarlayan enfeksiyonlar neden olan mesane mesane içindeki epitel hücreleri hücre içi bakteri toplulukları (IBCs) oluşturarak bir hipotezdir. IBCs enfeksiyon fare modelleri hem insan iye hastalar12,13de tespit edilmiştir. IBCs huzurunda Pediatrik iye hastaların İdrar numuneleri yineleme14,15daha yüksek oranları ile ilişkilendirilmiş. Ancak, IBCs izole edip onları içinde bakteri eğitim nedeniyle onların nadir teknik olarak zor olduğu kanıtlanmıştır; Bu virüslü bir fare mesane genellikle sadece 10-100 IBCs16vardır tahmin edilmektedir. Ayrıca, mesane epitel hücreleri nispeten büyüktür (50-120 µm)17yapım o floresan dağıtmak için zorlu, destekli cep (FACS) sıralama verilen bu tipik FACS püskürtme uçlarını çapları 70 µm veya 100 µm ile tasarlanmıştır. Böylece, hücreleri mesane epitelyal hücreler olarak büyüklüğünde kez filtrasyon FACS akışkanlar tıkanmasını önlemek için önce tarafından kaldırılır.
Laboratuarımızın son zamanlarda genel ve ekonomik bir yöntem karışımları mesane18alıntı epitel hücreleri gibi nadir enfekte hücreleri izole etmek için nitelendirdi. IBCs etkili bir şekilde ayırmak için geleneksel ağız pipetting kullanılır. Ağız micropipetting uzun Embriyolardan tek hücreleri ve aşağı akım analizi19,20,21,22,23, için embriyo için kullanılan bir tekniktir 24 , 25. (içinde mililitre) sıvı geniş hacimli geleneksel ağız pipetting kez neden olmuştur laboratuvar ile ilgili kaza ve teknik haklı olarak çok geleneksel Embriyoloji dışında araştırma topluluğu tarafından shunned ve tek hücre uygulamaları. Tek hücre yorum bu tekniği19,20, hangi büyük bir arabellek sağlayarak riski azaltmak bizim Protokolü esinlenerek (> 2 mL) hava araştırmacı ve sıvı birime göre örnek arasında transfer (< 1 ΜL). Bu yöntem ayrıca ayrıntılı denetimini o ağzını yararlanır micropipetting sağlar, hangi transfer çözüm ve yüksek saflıkta izole hücre çevresindeki düşük son ses için çevirir. Ucuz malzeme teknik kullanır (< 50$) ve böylece tüm Labs'de uygulamak için uygun olmalıdır.
Bu görsel iletişim kuralı bu teknik çoğaltmak isteyen diğer araştırmacılar yardımcı olmak için bir başvuru sağlayan bizim IBC yalıtım teknik anlatılmaktadır. Araştırmacı micropipetting için bir açık ve erişilebilir görüntüleme sahne ile canlı görüntüleme sırasında tek tek epitel hücreleri ve floresan bakteri görselleştirmek için kullanılan bir floresan diseksiyon mikroskop (veya benzer bir donanım) erişiminiz olmalıdır (rağmen diğer eşdeğer araç modelleri de kullanılabilir Malzemeler tablo için kullanılan, mikroskop ayrıntılarını görmek). Bu iletişim kuralı iye bir fare modelinde IBCs üzerinde durulacak iken benzer yöntemleri hücre süspansiyonlar enfeksiyon diğer modellerinde enfekte hücreleri izole etmek için uygulanabilir olmalıdır.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan işleme ile ilgili bilim, teknoloji ve araştırma, Singapur için kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Singapur genom Enstitüsü ve biyolojik kaynak merkezi ajansı tarafından onaylanmıştır.
1. fare enfeksiyon
-
Cam kılcal hazırlanması
- Bir açık alev kaynağı (Bunsen brülör veya alkol yazıcı) ışık.
- Her iki ucu sıkıca pinching tarafından bir cam iki elle kapiller basılı tutun, sonra tüp ortasında eşit ısı cam yumuşak gider kadar. Kılcal yavaşça bile bardak Isıtma yardım etmek için kendi ekseni boyunca ileri geri döndürün.
- Cam kılcal ısı kaynağından çıkarın ve hemen eller, kavrama tüp her iki ucundaki koruyarak ayır. Çekti kılcal ideal son uzunluğu 3-5 cm tek mesane epitel hücreleri izole için uygun bir iç çapı emin olmak için unpulled bir kılcal daha uzun olur.
Uyarı: Tüp hala bir süre için son derece sıcak kalır, çok sonraki adıma devam etmeden önce soğumasını birkaç dakika için bir ısı güvenli yüzeyinde kılcal bir kenara koyun. - Kontrol edin cam kılcal ortasına haline gelmiştir görmek için dar (şekil 1A) ve tüp iç hala kısmıdır (şekil 1B) içi boş. IBCs yalıtımı için 200-400 µm delik boyutunu kullanılabilir.
- Tek elle çektiğine kılcal bir ucunu almak. Diğer elinizle forseps Per ve kendi dar noktada kapiller çekti cam almak için kullanabilirsiniz. Forseps ezme olmadan kılcal sıkıca kavrama için yeterli güçle wielded emin olun.
- Hızlı bir kıvırma hareketi forseps tutan el tarafından çekti kılcal bir ağız micropipetting kılcal oluşturmak için dar noktada ek bileşeni için kullanın.
Not: Cam kırıkları yeterli koruma kullanılan sürece parmak forseps yerine de kabul edilebilir, kullanmaktır. - Adımları 1.1.2-1.1.6 tekrar en az 4 x daha yeterli yedek micropipetting kılcal damarlar üretmek ve IBC yalıtım için çap aralığı sağlamak. Birden fazla enfeksiyon grup beklenen 5 ek micropipetting kılcal her ek enfeksiyon grubu için hazırlar.
Uyarı: Açık alev kapatmayı unutmayın. - Çekti kılcal bir 100 mm Petri kabına yerleştirin ve yemek için kılcal sterilize etmek 30 dk için UV ışınlarına maruz.
- UV sterilizasyon sonra Petri kabına kapağını değiştirmek ve petri kabına ile kılcal damarlar, oda sıcaklığında saklayın.
-
Kateter enfeksiyonu önce hazırlanması
- Üriner kateter Hung ve ark.8 ve Conover vd.26 ' en az bir gün önce enfeksiyon açıklandığı gibi enfeksiyon için hazır olun.
-
Floresan uropathogenic E. coli kültür hazırlanması
- Seçili fluorophore ifade uropathogenic bakteriyel büyümek zorlanma göre kurulan iletişim kuralları.
Not: Zorlanma ve fluorophore seçimleri büyük ölçüde mikroskop ve bireysel laboratuarlarında suşları bağlıdır. Bu örnekte, ilk gelen bir hastada tekrarlayan sistit klinik bir izole UTI89 türetilmiş bir tür kullanın. Bu zorlanma, SLC-638, plazmid (kuruluşlarıdır-77) vsfGFP-9 ve sefaloridin direnç18ifade eden bir taşır. SLC-638 LB suyu 50 µg/mL sefaloridin ile desteklenmiş 37 ° C'de büyüyor. - Bir Luria Bertani (LB) üzerinde çizgi zorlanma SLC-638-agar plaka 50 µg/mL sefaloridin ile desteklenmiştir. 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya.
- (İsteğe bağlı) Plaka floresan işaretleri ifade bir koloni seçmeden önce onaylamak için diseksiyon mikroskop görüntüleyin.
- Bir bakteri aşılama döngü kullanarak, seçili koloni bir 125 mL konik şişesi 50 µg/mL sefaloridin ile desteklenmiş LB suyu 10 mL ile aktarın. Şişeye statik olarak 37 ° C'de 24 h için kuluçkaya.
- Alt Kültür Kültür 10 µL balonun alarak ve 10 mL LB suyu sulandrarak bu şişeyi bakterilerden 50 µg/mL sefaloridin içinde bir taze 125 mL şişe (1: 1000 seyreltme) ile takıma. Bu ikinci şişeyi statik olarak 37 ° C'de başka bir 24 h için kuluçkaya.
- Spin aşağı bakteri kültürü için 5000 x g de 5 min ve 4 ° c
- Süpernatant dikkatle boşaltmak ve OD600 0,5 soğuk PBS bakteriyel Pelet resuspend.
Not: Kültür Kültür değişebilir, genellikle statik kültürünün 1 mL yaklaşık 4-5 mL OD600 verir = 0.5 bakteri kültürü. Bakteriyel inoculum her zorlanma aşağıdaki gibi hesaplanabilir için gerekli toplam hacmi: 50 µL her fare için gereklidir ve 50 µL iğne kafa doldurmak için gereklidir. Ek bir 10-%20 (en az 50 µL) inoculum şırınga ölü hacim için hesap için önerilir. - Hung vd.8' de açıklandığı gibi enfeksiyon titresi belirlemek için kalan bakteri karışımı kullanın.
Not: Bu adım 4 ° C'de bakteriyel karışımı depolayarak birkaç saatliğine gecikebilir
- Seçili fluorophore ifade uropathogenic bakteriyel büyümek zorlanma göre kurulan iletişim kuralları.
-
İdrar yolu enfeksiyonu fare modeli
- Fareler her zorlanma florasan E. coli bölümünde 1,3 kültürlü için bir deney grubu ile8tarafından Hung vd., açıklandığı gibi bulaştırmak.
Not: Ayrıca Conover ve ark.26 görsel yardım için bkz:. - Bakteri aşılama zaman fare veya kafes için unutmayın.
- Enfeksiyonlar tüm deney grubu için yineleyin.
Not: Enfeksiyon kateter tekrar aynı gruptaki tüm fareler için kullanılabilir. - Adımları yineleyin 1.4.1-1.4.3 her deney grubu için planlanan, taze kateter ve yeni yağlama jel her grup için hazırlanan sağlanması.
Not: Deneyler ile çok sayıda hayvan için iyisi hayvanlar beş kişilik gruplara ayırmak ve her grup öyle ki enfeksiyonları şaşırtıcı yaklaşık 30 dk 1 h ayrı enfekte. Bu aşağıdaki adımları (Bölüm 2 ve 3) için yeterli zaman sağlar.
- Fareler her zorlanma florasan E. coli bölümünde 1,3 kültürlü için bir deney grubu ile8tarafından Hung vd., açıklandığı gibi bulaştırmak.
2. mesane epitel hücre hücre süspansiyon elde etmek için hasat
-
Hasat ve fare sidiktorbası ters çevirme
- Üç 50 mL konik tüpler cerrahi ekipman sterilizasyon için % 70 etanol 45 mL dolu hazırlayın.
- 2.1.1. adımda hazırlanan tüpler ikiye makas ve forseps her bir çift koyun. İki çift forseps (bir tercihen daha dar ve mesane inversiyon için yuvarlak bir uç ile) üçüncü tüpün içine yerleştirin.
Not: İlk tüp araçlarında dış bölge üzerinde kullanılacak, mesane hasat ikinci araçlarında kullanılacak olan ve son tüp Arzum forseps iki çift mesane inversiyon kullanılan. - 6 h enfeksiyon sonrası, kurumun kurulmuş IACUC protokolleri göre virüslü fareleri ötenazi.
Not: Bizim IACUC Protokolü ötenazi üzerinden fare (isoflurane) anestezi altında çalışırken servikal yerinden çıkması için çağırır. - Hayvanlar düz sırtlarını yatıyordu ve % 70 etanol ile dolu bir sprey şişesinde onların karın bölgesi sterilize etmek için kullanın.
- Bir çift forseps ve Cerrahi makas (2.1.2. adımda hazırlanan) ilk tüp kullanarak, yapmak yaklaşık 1 cm yukarıda üretral deride küçük bir enine kesi açılıyor. Fareyi bir V-şekilli kesim tüm boyunca anterior karın zarını içeriğini gösterir fare oluşturma, üst ekstremite doğru çapraz olarak kesi genişletin. Bu işlem sırasında fare (Şekil 2A, B) bağırsak makas kesmeyin emin olun.
- (Adım 2.1.2 hazır) araçları ikinci seti geçin. Makas bıçakları veya forseps milleri kullanarak, yavaşça fare pelvik bölge yakınındaki yağ yastıkları üzerinde aşağı doğru itin.
Not: Bu adım dışarı doğru çıkıntı mesane neden olur ve hasat için görünürlük sağlar. - Tepe, maruz mesane forseps (Şekil 2C) bir çift ile kavrama.
- Bir tutuş ve mesane tepe üzerinde Forseps ile tutmak, kesme ve mesane (idrar ve üreter uzağa kesme) hayvan kalanından ücretsiz Cerrahi makas kullanarak. Değil serbest bırakmak henüz mesane tutan forseps.
- Dar yuvarlak forseps üzerinden üçüncü konik makas geçiş (adımından 2.1.2) tüp, nerede sadece önceki adımda (Şekil 2D) kesilmiş mesane açılış yuvarlak forseps bir şaft ucu yerleştirin. Güvenli bir şekilde mesane açılış içine eklenen yuvarlak forseps ucuyla mesane apeks sürükleyici forseps çifti serbest bırakmak ve ikinci konik tüp için geri.
- Forseps üçüncü tüp ikinci çifti kullanarak, yavaşça mesane "ilk dış sonuna yuvarlak forseps (Şekil 2D, ok 1) uzak mesane ağız çekerek ve çevresinde ve diğer ucu üzerinden rehberlik", tersyüz yuvarlak forseps (Şekil 2D, ok 2).
Not: Eylem bir çorap bir ayak kaldırma ve diğer üzerinde çekerek sebep olabilir.- İnversiyon işlemi sırasında neredeyse tamamen kapalı forseps ilk yuvarlak çifti korumak. Bu yuvarlak forseps, ilk boşluğundan mesane koparmak için hareket yeterli özgürlüğü sağlar ama aynı zamanda ilk yuvarlak forseps daha yakın ikinci mili getiriyor ve mesane kolayca transfer edilecek sağlar. Son bu adımı mesane ters ve forseps (Şekil 2E) ilk çifti ikinci milinin ucunda bitmeli sonucudur.
- Forseps ikinci çifti kullanarak, yavaşça ters mesane forseps ucu kapalı soğuk PBS 1 mL coax.
Not: (İsteğe bağlı) Tersine, tüm genel frekans ve IBCs, dağıtımı varsa gözlemlemek için virüslü mesane görüntülerini almaya söylemenin tam zamanı.
- Adımları 2.1.1-2.1.10 her mesane (için en fazla beş hayvan) deneysel grubunda yineleyin.
-
Mesane epitel hücre kazıma
- İki kullanarak forseps çiftlerini temiz, yavaşça (iç epitelyal hücre katmanı olan) ters mesane dışına kazıyorum. Çevredeki PBS gelirleri kazıma olarak cloudier görünür ve epitel hücreleri PBS çözüm içine salınır.
- (İsteğe bağlı) Görsel olarak mesane kazıma hücreleri diseksiyon mikroskop kullanarak çözümde yayımladı onaylayın. Şekil 3 A, B). PBS bulutlu çıplak gözle görünür ve alıntı bireysel mesane epitel hücreleri 10 x büyütme oranında görülebilir.
- Adımları 2.2.1-2.2.2 her hasat mesane adım 2.1 için yineleyin.
3. hücre içi bakteriyel topluluk (IBC) yalıtım: ağız Pipetting IBCs
Not: Tüm yöntemleri bu bölümde açıklanan bir kurumsal risk değerlendirmesi uğramıştır. Ağız pipetting aktarıldığı çözüm sindirim doğasında risk taşır. Bu riski büyük ölçüde, bu iletişimi kullanan nanoliter birimleri tarafından hafifletilmiş ve protokol ödeme tüm kullanıcılar için önlem dikkate alın ve uygulama notları listelenen burada ve tartışma öneririz.
-
Sonra hücreleri ağız micropipetting aparatı (şekil 3C) ayarla PBS, içine kazınmış.
- Aspiratör tüp lastik takılır (beyaz bitiş) çekti cam kapiller (unpulled son) kalın ucunu bağlayın.
- Dar sonuna 1 mL pipet ucu açık (kırmızı) öbür tarafında sıkı bir uyum sağlanması aspiratör tüp yerleştirin.
- 2 bir pipet 1 mL pipet ucu açık, daha geniş ucunu alıyorum mL dar sonuna yerleştirin, daha sıkı bir olduğunu kontrol ettikten uygun.
Not: Ortaya çıkan Kur araştırmacı sonundan daha geniş, açık kılcal tüp cihazları diğer ucundaki dar sonundan bir nazik emiş gücü oluşturmak için alıyorum pipet ağzını pipet için sağlar. - 100 mm Petri kabına taze deiyonize su içeren kullanarak son ağız micropipetting aparatı sınayın. Hafif bir emme eylemi alıyorum pipet (kamışla bir içki yudumlarken için benzer) açık ucundaki kılcal sıvı düzeyini artırmak ama aspiratör tüpüne taşmasına deiyonize su neden olmaz. Bir yandan Petri kabına konumunu ayarlamak için diğer taraftan kullanırken kılcal tüp kontrol etmek için kullanın.
Not: Bir tek IBC ağız-pipetting için gerekli emiş gücünü araştırmacılar arasında değişir. Ancak, bu tekniği çalışırken her araştırmacı ve hiçbir sıvı kılcal akıyor, yavaş yavaş artış ile zayıf bir emme başlatmak önerilir. İçmek için pipet üzerinde emme daha büyük bir güç için gerek yoktur. Kılcal sıvı kadar adım 3.1.4 içinde belgili tanımlık sınav sırasında toplayıp ortaya çıkmazsa, kılcal veya alıyorum tüp tıkandı ve değiştirilmesi gerekir mümkündür. Daha fazla emme kullanarak ağız pipetting aparatı içinde kontrol tüm yeni araştırmacılar ilk pratik su sterilize önerilir. Ayrıca, ağız pipetting cihaz tarafından alınan birim kontrolünü araştırmacı dil kullanımı yoluyla olduğuna dikkat edin. Dil ince uygulanan emiş gücü ayarlama, aynı zamanda bir acil durum durdurma hareket. - Başarılı sıvı alımını gerçekleştirmek sonra alıyorum pipet açık ucunu hafifçe esen kılcal sınırdışı becerisini test. Hava kabarcığı yok IBCs, 3.5. adımı önlemek için sıvı kovma sürecinde oluşturulur emin olun.
Not: Olarak emme ile pozitif basınç santrifüj tüpüne IBC kovmak için araştırmacı tarafından uygulanan gücünü araştırmacılar arasında değişir. Bu araştırmacılar bu iletişim kuralı için yeni için pratik 3.1 bir kaç gün önce adım gerçek enfeksiyon için tavsiye edilir. Steril su ağız micropipette cihazları kullanarak gıda boyası (görüş için) birkaç damla ile karıştırılarak küçük hacimli aktarma pratik pratik ağız micropipetting için bir öneri olduğunu.
- Diseksiyon mikroskop altında alıntı hücre süspansiyon yerleştirin ve IBCs büyük floresan toplamları (şekil 3A, B) tanımlar. İdeal büyütme 20-40 x aralığıdır. Cam kapiller ince sonu PBS taze bir tüp 1 için içine daldırma kılcal eylem yoluyla istenmeyen ses alımını azaltmak için s.
- Mikroskop baktığımızda, IBC ilgi tanımlamak ve yavaş yavaş açık sonuna doğru IBC kılcal tüp getirin. Cam kapiller ince sonu uzak iki veya daha fazla hücre aspirasyon önlemek için veya hücre dışında daha büyük toplamları kırmak için her IBC yakınındaki ilave hücreleri süpürme için kullanın.
- Mikroskop bakarken, bir çok küçük emiş gücü kadar sonu IBC cam kılcal damar yönlendirecek ağız micropipetting aparatı (alıyorum pipet) uygulayın.
- IBC kadar seçmek sonra bir boş 1,5 mL santrifüj tüpü kılcal hareket ve damlacığı ve IBC santrifüj tüpüne (şekil 3D) çıkarmak için hafif bir pozitif basınç uygulayın.
- Birçok IBCs sonraki mesane için devam etmeden önce geçerli mesane üzerinden gerektiğinde adımları 3,3 3,6 yinelemek. Alıyorum Pipetler ve kılcal sık tükürük birikmesini önlemek için değiştirin.
Uyarı: Bulaşıcı (veya klinik) bakteri suşları ile çalışırken, sürekli kılcal çözümde düzeyini izlemeniz. Aspiratör tüp içine kılcal kenarından pipetted taşma olmak sıvı düzeyini izin vermeyin. Bu durum ortaya çıkarsa, hemen bir farklı aspiratör tüp geçiş ve yukarı önceki atmak. - 3.2-3.6 Bütün hasat mesane veya biyolojik örnekler yeterli sayıda deney grubu için toplayana kadar adımları yineleyin.
- (İsteğe bağlı) Adım 3,6 ve 3,7 bütün deneysel grupları (veya fare) euthanized ve yeterli biyolojik örnekleri her gruptan hasat kadar yineleyin.
Representative Results
Ayrı--dan onay (şekil 3D) toplama tüp diseksiyon mikroskop ile tek bir izole IBC varlığı, izole IBC saflığı confocal mikroskobu tarafından onaylanabilir. Şekil 4' teAgösterildiği gibi izole hücreler E. coli ve uroplakin için leke ve IBCs (50-120 µm)17için beklenen boyutu vardır. Ayrıca, E. coli boyama çevresindeki sıvı içinde mevcut değil. Bizim verilere dayanarak, bu teknik ile izole hücreler fazla % 90 IBCs18' dir. Yalıtım sonra koloni oluşturan birim (CFU) numaralandırma (şekil 4B) veya genomik eşdeğerleri () için nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) üzerinden varlığı ve bireysel IBC bakteri hücreleri canlılığı onaylanabilir Şekil 4 C). şekil 4C de gösterir aynı protokolü ile izole bulaşmamış epitel hücreleri ölçülebilir miktarda bakteri var mı. Bu verilere dayanarak, bir tek IBC CFUs aralığı 102-103 idrar yolu enfeksiyonu, fare modeli olduğunu tahmin ediyoruz. Tek IBC yalıtım ana amaçlarından biri de RNA sıralama gibi aşağı akım analizleri gerçekleştirmektir. Bizim izolasyon yöntemi analiz için IBCs içinde bakterilerden RNA almak mümkün olduğunu doğrulamak için biz nicel ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) miktar (16S, cyoB ve frdA) üç genlerin için gerçekleştirilen bir tek tek izole ve havuza alınan IBCs (şekil 4D) aralığı. Şekil 4 ' te gösterilen tüm veri-adapte-Duraiswamy vd.18izniyle. Bizim IBC yalıtım Protokolü'nün bir genel bakış şematik Duraiswamy vd18yeniden şekil 5' de görülebilir.
Resim 1 : El çekti kılcal korumak dar açıklıklar. (A)örnekleri el çekti kılcal tüpler karşıtlık siyah bir arka plan üzerinde görüntülenir. Top, unpulled bir kılcal, yeterli bir ölçüde çekilmemiş bir kılcal alttan tek mesane epitel hücre hasat için kullanılabilir bir kılcal ve çok ince (ve böylece iki parçaya ayrılmış) çekildi bir kılcal gösterilir. 15 cm cetvel alt ölçek için görüntünün yer alıyor. Kullanılabilir kılcal yapışma için tahmini noktası şekil üzerinde kırmızı okla gösterilir. (B) resim çekti kılcal (alt) içi boş iç çapını teyit diseksiyon mikroskop ile çekilen. Unpulled bir kılcal yukarıda iki kapiller göreli boyut farkı göstermek için yer alıyor. Ölçek çubuğu 4.0 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Mesane epitel hücreleri hasat için fare diseksiyon. (Fare peritoneal kavite ve mesane ortaya çıkarmak içinA) görüntüsünü bir fare ile beyaz çizgiler insizyon açısı ve tahmini konumunu belirtmek için eklendi. (B) maruz görüntüsünü fare peritoneal kavite sonrası insizyon. (C) maruz görüntüsünü mesane (kırmızı ok) arasından yağ yastıkları çıkıntılı. (D) fare mesane görüntüsünü hareket yönünü gösteren oklarla Lümen içine eklenen forseps ucu ile mesane ters çevirmek gerekli. Mesane önce biraz dışa doğru o zaman etrafında ve kapalı forseps ilk şaftlı çekilir. 1 ve 2 numaralı beyaz oklarla gösterilen her iki eylem için hareket yönleri şunlardır. (E) ters mesane forseps ikinci mili eklenen son konumunu gösteren bir resim. Forseps milleri her iki panelleri D ve E Kırmızı oklar ve metin ile etiketlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Mesane hücreleri IBC hasat. (A) bir virüs bulaşmış ve ters mesane hücre kazıma önce soğuk PBS çözümde. (B) mikroskop altında görülen mesane hücreleri gösteren bir resim çizdim. IBCs (bkz: Kırmızı oklar) her iki görüntüleri büyük yeşil flüoresan toplamları olarak tespit edilebilir. (C) tamamlanan görüntüsünü ağız micropipetting aparatı. Alıyorum pipet, pipet ucu, aspiratör tüp ve çekti kılcal tüp ile numaralandırılmış oklar sağ tarafta belirtildiği şekilde tanımlanır. (D) tek bir görüntüsünü (kırmızı özetlenen) 1,5 mL toplama tüp içinde IBC izole. (Belirtildiği gibi) ölçek çubukları panelleri A, B ve d beyaz çizgiler gösterilir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Hasat IBCs saf ve aşağı akım analizi için kullanılabilir. Bu rakam, Duraiswamy ve ark18izni ile değiştirildi. Anti-uroplakin ve anti -E.coli antikorlar ile lekeli iki izole GFP pozitif hücre(a)görüntüler. İlk hücre (IBC 1) bireysel salgılarını (düşük-büyütme) görüntülerini solda, ve bir yüksek-büyütme Birleştirilen görüntüyü sağ tarafta. İkinci hücre (IBC 2) birleştirilmiş ve bireysel kanalları yüksek büyütme gösterilir. Belirtilen ölçek Barlar şunlardır. DNA'ile 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) lekeli ve mavi kanalda temsil. Anti -E. coli floresein isothiocyanate (FITC) Birleşik ve yeşil kanalda temsil ikincil bir antikor ile lekeli. Anti-uroplakin tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) Birleşik ve kırmızı kanalı temsil ikincil bir antikor ile lekeli. (B) bakteriyel CFUs izole IBCs üzerinden. IBCs hemen işlenir veya %0,1 Triton-X 10 veya 30 dk. havuza alınmış CFU kez bireysel IBCs için izole--dan n inkübe = 3 ayrı deneyler gösterilir. Sınırı algılama = 0.7 günlük10 CFUs/IBC. Kırmızı noktalar algılama limitte çizilen kendisi için hiçbir kolonileri ele geçirildi örnekleri gösteriyor. Tüm IBC içeren örnekleri farklı olmamasını (p > 0,05, Mann-Whitney testi); bulaşmamış epitel hücreleri IBC (10 dakika) verilerden (p < 0,001, Mann-Whitney testi) önemli ölçüde farklıdır. Bireysel IBCs ve bulaşmamış epitel hücreleri bakteri (C) qPCR miktar %0.1 10 dk kuluçka sonra Triton-X (*, p < 0,0001, Mann-Whitney testi, n = 4). Sınırı algılama 1,18 günlük10 bakteriyel genom eşdeğerleri/IBC =. Kırmızı noktalar onların kendisi için hiçbir kolonileri titering panelinde ayrı ayrı izole ve havuza alınan IBCs değişen sayıda 16S rRNA, cyoB ve frdA Gen B. (D) miktar üzerinde kurtarılan örnekleri gösteriyor (n = 1 deney; her noktası 3 teknik çoğaltır ortalamasını gösterir). NC = hiçbir DNA negatif kontrol. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Bir şematik ve onun ilişkili fotoğrafları IBCs yalıtım ağız micropipetting üzerinden temsil eden enfekte fareler sidiktorbası. Bu rakam Duraiswamy vd18yeniden oluşturulur. (A) A hasat tüm mesane; (B) bir ters tüm mesane IBCs ifade GFP açığa; (C) süspansiyon bitişik arabellekte; bireysel IBCs gösteren bir alıntı mesane kenarına bir close-up (D) tek bir tüpün içine pipetted IBC izole. B panelinde Kırmızı oklar GFP pozitif IBCs mesane luminal yüzeyinde örnekleri gösterir. C panelinde kırmızı noktalı çizgi ("BL" belirtilir); ters mesane sağ kenarlığını gösterir C panelinde Kırmızı oklar mesane yüzeyden alıntı belirgin bireysel GFP pozitif epitel hücreleri gösterir. Beyaz noktalı çizgi D panelinde beyaz bir okla gösterilen bir izole IBC içeren bir micropipetted alt-microliter damlacık gösterir. Ölçek çubukları 2 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Biz anlatmıştık Protokolü iye bir fare modeli tek IBCs yalıtım sağlar. Bu iletişim kuralı için CFU kültür tarafından doğrulanabilir uygun hücre içi bakteri içeren IBCs izole ediyor. Bırakmak için protokol sonuçlarında az kirlenme ile IBCs ekstrasellüler bakteriler, bakteri hücre içi her iki bakteri karakterizasyonu daha fazla ve bir IBC (şekil 4C) hücreden ev sahibi. Ayrıca tek bir IBC bakterilerden qPCR (şekil 4C), gibi aşağı akım uygulamalarda kullanılabilir bizim teknik işlem IBCs tüp bebek diğer analizler için kullanılabilir düşündüren gösteriyoruz. 5 IBCs az üzerinden hasat bakteri havuzu tarafından biz daha fazla qRT-PCR çözümlemesi üç bakteriyel genler, yeteneğimizi kaliteli RNA--dan bizim izole IBCs (şekil 4D) bakterilerde hasat edilebilir düşündüren göstermektedir. Birlikte, biz göstermiştir veri genom çapında RNA (RNA sıralama gibi) tek IBCs çözümlemesini bu yalıtım tekniği kullanarak mümkün olabilir gösterir.
İşte o zaman siyah 6 farelerin UTI8927tarafından enfekte sidiktorbası IBC numaraları zirve çünkü bu protokol için biz 6 h zaman noktasında odaklanmıştır. Ayrıca, biz de UTI89 türü 1 pilus ifadesinde düzeyini geliştirmek için bir statik bakteriyel kültür sistemi kullandık. Tip 1 pilus ifadesi ekleyin ve mesane epitel hücreleri28bulaştırmak için E. coli için önemlidir. Ancak, bu ifade sıkıca düzenlenmiş29 ve çevre ipuçları30alter bilinmektedir. Bir tutarlı enfeksiyon fenotip ve IBCs yeterli sayıda korumak için daha önce çalışan E. coli test edilirken (Hung vd.8' den biraz değiştirilmiş) bir 2 x 24 h statik bakteri kültürü ve 6 h enfeksiyon zaman noktası kullanmanızı öneririz NU14 ve UTI8928,29gibi suşları. Ancak, bu değişkenler diğer iye suşları veya IBCs ideal dizi her enfeksiyondan elde etmek için diğer fareler suşları ayarlanması gerekir mümkündür.
Hung ve ark.8 iletişim kuralı yalnızca dişi fareler kullanırken, idrar yolu enfeksiyonu erkek farelerde kurmak için kurulan diğer protokoller bildirilen31olmuştur. Bu modelde, sistit erkek farelerde Ayrıca IBC yolu takip ettim. Erkek ve dişi farelerde mesane boyutunda benzer olduğu için biz bizim IBC yalıtım Protokolü virüslü erkek fareler üzerinde de kullanılabilir tahmin.
Bu protokol için kullanılan nispeten basit bir teknoloji aynı zamanda çoğu laboratuvarlarda dağıtılabilir sağlar. Bu protokol için anahtar adımlar ilgi hücre türü seçmek için microcapillaries oluşturmak için cam kılcal çekerek biridir. Bu adım için oluşturulan microcapillaries çaplarda esneklik sağlar ve böylece yöntem-ebilmek var olmak erişmek için birden çok farklı hedef hücre tipleri. Ancak, doğal varyasyon bu kılcal oluştururken nedeniyle, son çapı kullanışlı bir aralık içinde olduğundan emin olmak için özen göstermelidir. Kılcal çok dar ise, onlar ilgi hücre kadar almak başarısız, ama onlar çok geniş yapılması durumunda, birden fazla hücreyi tek bir hamleyle seçilmiş olabilir. Ayrıca, microcapillaries oluşturmaya çalışan araştırmacı bu tür olayların oluşmasını önlemek için dikkat çekmek yüzden kapiller çekme işlemi sırasında açık alev kullanımını yanıklar ve ateş, doğal bir riski taşımaktadır. Değişkenlik yanı sıra açık yangın riski azaltmak için bu kılcal yapımında araştırmacı yapmak ilgili geleneksel bir micropipette makinesi, Elektrofizyolojik deneyler (örneğin, PC-100, Narishige grubu) için kullanılanlar gibi çekerek kullanımı. Bu makineler yaptıkça yerçekimi veya Robotik platformlar kılcal çekmek için kullanın, onlar enfeksiyon modeli ihtiyaçlarını karşılamak için uygun olabilir. Ancak, mevcut makinalar çekerek micropipette çok çeşitli bireysel araştırmacı bu iletişim kuralı ile kullanmak için uygun son kılcal damar çapı belirlemek için bazı deneme yanılma yoluyla gitmek gerekir anlamına gelecektir.
Sunulan protokolü bir floresan etiketi ifade bakteri IBC görsel olarak tanımlamak için kullanır. Böylece, bu teknik araştırmacıların genetik olarak bulaşıcı organizma değiştirme yeteneği tarafından sınırlıdır. Özellikle UPEC için IBC oluşturmayan suşları CFT073 ve NU14 gibi başarıyla GFP ifade plazmid32,33,34ile dönüşmüşlerdir; Bunlar bu nedenle aynı protokol kullanılabilir olmalıdır. Fare mesane (70 mm2)35, bireysel epitel hücreleri (50-120 µm)17uzunluğu ve IBCs bir tek mesane16sıklığı alanına bağlı, bir muhafazakar için IBCs insidansı hakkında tahmindir 1 1.000 hücreleri (veya % 0.1). Bu tahmin nadir olaylar hedeflemek için hücre izolasyon protokolü yardımcı programını vitrinde. Hücre seçimini bizim iletişim kuralı aracılığıyla duyarlığını ve çekilebilir kapiller çapları çok çeşitli öneririm bu protokolü hücre içi bakteri enfeksiyonu içinde vivo ve tüp bebek diğer modellerinden yalıtmak için kullanılabilir. Nitekim, biz başarıyla virüslü kültürlü mesane epitel hücreleri (veri gösterilmez) ayırmak için bu tekniği kullanmıştır.
Bir-in teknik adımları protokolündeki zorlu daha kazıma için epitel hücreleri göstermek için mesane ters çevirme. Ayrıca mesane kazıma için edebilir üzerinde bir kesi yapmak mümkün olduğunu bulduk. Ancak nedeniyle açık; kesme işlemi sırasında mesane epitel hücrelerine zarar azaltmaya bakım alınmalıdır ideal olarak bir tek kesim mesane açık edebilir için kullanılması gereken. Ayrıca, kesme işlemi sırasında hücreler veya mesane doku yanlışlıkla kaybedilmesini önlemek için soğuk PBS içinde yapılmalıdır.
IBCs bu iletişim kuralı, ağız pipetting hücre ile birlikte transfer çözüm son hacim sınırlama yanı sıra, hücre seçimi işlemi üzerinde daha fazla denetim sağlar. Daha iyi denetim ve araştırmacıların ağız çözüm büyük ayrılık da en üst düzeye çıkarır araştırmacı, Emanet nanoliter microliter Aralık içinde transfer birimleri olduğu gibi. Buna ek olarak, bizim modern micropipette ile bu transfer daha fazla çevresindeki sıvı ve potansiyel olarak kirlenme ekstraselüler luminal bakteri ile önde gelen IBC, hücrelerle eğilimindedir bir deneyimdir. Ağız pipetting daha yüksek bir performans üzerinde tek diğer hücre izolasyon yöntemleri sağlar bizim bulgu da diğer labs22,23,24tarafından bildirilmiştir. Tek hücre izolasyon bir yana, ağız pipetting bile tek hücre çoğalmasıyla nöronlar25daha fazla belgili tanımlık yarar ve eğitimli bir araştırmacı tekniği ile elde edebilirsiniz dakika kontrol gösterir, kullanılmıştır. Ancak, birincil önemi güvenliğidir ve kullanılan patojenler bağlı olarak alınabilir potansiyel ek önlemler öneririz: (i) araştırmacı ve örneğin bir alıyorum kullanarak biyolojik malzeme arasında hava tampon uzantısı ek bir engel olarak davranmaya alıyorum pipet içine Pamuk yün gibi fiziksel bir filtre ekleme pipet ile bir daha büyük birim (örneğin, 5 mL) veya (II).
Nereye bir risk değerlendirmesi ağız pipetting hala çok riskli olduğunu sonuca götürecek durumlarda, piyasada bulunan robot kurulumları (örneğin, nanoinjections için) için daha güvenli bir yöntem sağlamak için bizim tekniği diğer bölümleri birleştirilebilir karışık nüfus üzerinden enfekte hücreleri izole. Bu robot bir micromanipulator kullanarak bizim deneyim IBC yalıtım olarak mesane epitel hücre boyutu büyük intra deneysel varyasyon kullanıcı için zorlu yapar ağız pipetting için karşılaştırıldığında azalma oranını göstermiştir belirtilmelidir bir robot kol kuvvet tek IBCs almak için gerekli belirlemek için. Yine de, bu son derece bulaşıcı hastalık ile çalışma için uygun, costlier rağmen bir seçenek kalır.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Ulusal Araştırma Vakfı, Başbakan'ın Office, Singapur, onun NMG araştırma bursu programı kapsamında tarafından desteklenmiştir (NMK ödül yok. NRF-RF2010-10); Singapur Sağlık Bakanlığı'nın Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (NMRC/CIRG/1358/2013); ve Singapur genom Enstitüsü (GIS) / bilim, teknoloji ve araştırma Ajansı (A * STAR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL eppendorf tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| 100% ethanol | For Alcohol Burner | ||
| 15 mL conical tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| 1 mL Tuberculin Syringe | BD Biosciences | 302100 | |
| 3% Bacterial Agar | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| 70% ethanol | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Aesculap anatomic forceps | Braun/Kruuse | BD222R | For initial dissection of mouse (skin, fascia) |
| Alcohol Burner | Wheaton | 237070 | |
| Aspirating pipette | BD Biosciences | 357558 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Bacterial loops | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424 | Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes |
| Conical flasks | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Digital camera for microscope | Olympus | DP71 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
| Glass Capillaries | Kimax | 6148K07 | |
| Iris Scissors STR SS 110MM | Braun | BC110R | |
| Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Kanamycin Sulfate | Calbiochem | 420311 | For static bacterial culture and OD measurement |
| LB broth (Miller) | Thermo/Gibco | 10855021 | For static bacterial culture and OD measurement |
| Light source unit for microscope | Olympus | LG-PS2 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
| Lubricant | KY | Any similar commercial medical lubricant will suffice | |
| Macro fluorescence microscope | Olympus | MVX10 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
| Micropipette + micropipette tips | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| PBS 1x | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Pipette controller + Pipettes | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Polyethylene Tubing | BD Intramedic | 427401 | |
| Precision Glide needle 30 G | BD Biosciences | 305107 | Possibly under new catalogue number (305106) |
| Splinter forceps curved | Braun | BD312R | |
| Spray bottle (for ethanol) | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Square cuvettes | Elkay | 127-1010-400 | For static bacterial culture and OD measurement |
| Sterilgard III Advance Safety Cabinet | Baker | SG403 | Any biosafety cabinet with a UV irridiator |
| Sterilin 90mm Standard Petri Dish | Thermo | 101VR20 | Any sterile petri dish |
| Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm | Braun | OK366R | Recommended for harvesting of bladder |
| Surgical Scissors STR S/B 105MM | Braun | BC320R | |
| Tabletop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals |
| WPA C08000 cell density meter | Biowave (Biochrom) | 80-3000-45 | For static bacterial culture and OD measurement |
References
- Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).
- Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).
- Foxman, B., Barlow, R., D'Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs. Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).
- Zowawi, H. M., et al. The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology. Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).
- Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections. Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).
- Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract. Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).
- Hung, C. -S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).
- Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science Translational Medicine. , (2011).
- Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. PLoS Pathogens. , (2009).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).
- Hunstad, D. A., Justice, S. S. Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli. Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Medicine. , (2007).
- Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
- Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
- Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection. Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).
- Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal). International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).
- Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir. Infection and Immunity. , (2018).
- Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).
- Tang, F., et al. Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres. PLoS One. , (2011).
- Wells, J. M., Melton, D. A. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development. 127, 1563-1572 (2000).
- Guo, H., et al. Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing. Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).
- Zhao, R., et al. The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
- Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2017).
- Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), 52892 (2015).
- Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
- Mulvey, M. A., et al. Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli. Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).
- Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).
- Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media. Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).
- Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).
- Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
- Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli. Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).
- Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073. Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).
- Jost, S. P. Postnatal growth of the mouse bladder. Journal of Anatomy. 143, 39-43 (1985).
