Summary
조작된 nanomaterials에 독의 검출 nanomedicine 분야에서 대상 과제 중 하나를 나타냅니다. 여기, 우리는 나노 입자에서 잠재적인 내 오염 추정 세 가지 다른 랄 형식으로 구성 된 프레임 워크를 설명 하는 사례 연구를 제시.
Abstract
제약 제품에 존재 하는 경우 (종종 라고도 lipopolysaccharide) 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 내 염증, 발열, 저자 또는 고혈압, 발생할 수 있습니다. 그리고, 극단적인 경우에 수 있습니다. 조직 및 장기 손상으로 이어질 수 있습니다. 치명적 된다. 따라서, 제약 제품에도의 양은 엄격 하 게 통제 된다. 도 탐지 및 정량화에 대 한 사용할 수 있는 방법, 중 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 주로 세계적으로 사용 됩니다. 어떤 제약 제품 랄 분석 결과 방해할 수 있습니다, 하는 동안 나노-공식 그들의 복잡으로 인해 특정 도전을 나타냅니다. 이 문서의 목적은 연구 설계 나노 소재 및 나노 공식화 약물 독 추정에 미숙한 실용적인 가이드를 제공 하. 여기, 탁도, 발을 포함 한 세 랄 포맷 응고 젤 분석 실험을 수행 하기 위한 실질적인 권장 사항은 설명 합니다. 이 분석 실험 나노기술 기반 약물 제품, 백신, 그리고 adjuvants 내 오염 확인을 사용할 수 있습니다.
Introduction
내 그람 음성 세균 세포 벽1,2의 빌딩 블록 이다. 그것은 매우에 면역 세포를 활성화할 수 있습니다 (picogram) 농도1,2낮은. 셀 한도에 대 한 응답에 의해 생성 된 proinflammatory 중재자 (cytokines, leukotrienes, eicosanoids, 등) 발열, 저 혈압, 고혈압, 그리고 여러 기관 실패를 포함 하 여 더 심각한 건강 문제에 대 한 책임은 1 , 2 , 3. 면역 중재 측면-효과도 의해 실행의 심각도 내 구성과 구조에 의해 결정 고도 국제 단위 (IUs 또는 EUs)3에서 측정 된 힘에 따라 달라 집니다. 이러한 단위 몸 무게의 킬로그램 당 수는 내 화성 복용량을 임계값을 설정 하는 데 사용 됩니다. 이 복용량은 EU/5kg 약 제품에 대 한 관리 를 통해 intrathecal 경로 하지만 모든 노선. 몸 표면, 안구 내부 체액, 방사성 의약품, 및 intrathecal 경로 관리 를 통해 제품의 평방 미터 당 약을 복용 하는 약 있다 다른 임계값 화성 복용량은 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (V가는 볼륨 관리를 위한 제품의), 그리고 0.2 EU/kg, 각각4. 다양 한 약품 및 장치에 대 한 임계값 화성 복용량에 대 한 자세한 내용은 제공 되 고 다른4,,56논의.
동물도 중재 반응에 그들의 감도에서 넓게 변화 한다. 인간, 비 인간 영장류, 그리고 토끼 독3가장 매우 민감한 종족 중입니다. 환자에도 중재 부작용을 피하기 위해 고의 전 임상 독성 및 효능 연구의 부정확 한 결론을 방지, 정확 하 게 감지 하 고 두 임상 및 전 임상 등급 정립에서 독을 계량 필수적 이다. 현재 사용할 수 있는 여러 가지 방법을이 작업을 달성할 수 있다. 그들 중 하나는 일반적으로 화면 생물 의학 제품에 잠재적인 내 오염 뿐만 아니라 세균 감염7,,89감지로 세계 전반 사용 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 이다. 셀 말굽 게 Limulus polyphemus 의 혈액에 존재 하는 lysate amoebocytes에서 준비 북미7대륙의 동쪽 해 안에 거주. 흥미롭게도, 말굽 게의 몇 가지 다른 종이 있다 (Tachypleus gigas 및 Tachypleus tridentatus) 아시아10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (탈)도 다른 cuntries10에 랄을 사용 하는 방법을 유사한의 검출에 대 한 여러 아시아 국가에서 사용 됩니다. (랄 및 탈) lysates 포함 단백질 활성화 시 부여 하는 프로 테아 제 활동의 그룹. 이러한 단백질, 소위 요소 C 중 하나 내와 접촉 시 활성화 됩니다. 활성화 인자 C 앞 요소 B는 또한 차례 차례로 되는 효소 응고 효소를 생산 하는 프로 응고 효소를 앞. 반응의이 체인의 결과 젤, 샘플 탁도 하 고, 비 기질, 젤 응고, 탁도, 그리고 비 분석 실험을 위한 기초 역할을, 착 색된 제품의 외관의 존재 증가의 형성 각각. 산업 문서, 다른 랄 포맷 간의 테스트 결과에 주문서, 결정은 한다 젤 응고 분석 결과5 기반은 필수 랄 형식이, 미국 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)에 대 한 지침에 설명 합니다. .
일반적으로 사용 되는 많은 실험실 화학 물질 (예., EDTA) 및 제품 (예: 페니실린) 방해 랄 알려진된 마약 분석 실험11. 방해는 일반적으로 테스트 자료를 포함 하는 솔루션으로 알려진된 농도에 아군도 표준의 복구를 평가 하 여 식별 됩니다. 스파이크 복구 50% 미만 또는 200% 이상에 대 한 분석 결과 LAL의 결과 다음 경우 주어진된 시험 체 억제 또는 향상, 각각4유효 하지 않습니다. 나노기술 기반 정립은 종종 복잡 하 고 메커니즘12,,1314의 다양 한 통해 랄을 방해. 많은 접근 방해를 극복 하기 위해 설명 되었습니다: 난방, 난방 및 과잉을 가진 샘플을 보완 하 여 지질 기반 투명 재료의 파괴에 의해 단백질 비활성화 특정 버퍼에 계면 활성 제, 샘플 재구성 divalent 양이온5,12,13,,1415. LAL 방해를 극복할 수 없을 때 상황에 대 한 대체 방법을 또한 설명 되었습니다: ELISA, HEK TLR4 기자 셀 라인 분석 결과, 및 질량 분석16,,1718, 19.
여기, 젤 응고, 탁도, 및 비 랄 분석 실험 수행에 대 한 실험 절차에 설명 되어 있습니다. 이 분석 실험 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고 랄)에 나노기술 특성화 연구소 (NCL) 웹사이트20 에서 사용할 수 있습니다 및 STE1.4 (비 랄). 같은 나노 제제의 특성을 두 개 이상 다른 포맷을 수행 하는 것이 좋습니다. 탁도 및 비 랄의 결과 동의 하지 않을 때 젤 응고 결과5를간주 됩니다. 두 랄 형식의 결과 동의 하는 경우21랄 확인 monocyte 활성화 테스트 (매트) 또는 토끼 pyrogen 테스트 (RPT)을 사용 하 여 연구 결과 추가 실시. 각 방법도 검색에 사용 되 고 pyrogenicity 평가 장점과 한계21,,2223,24에 중요 하다. 주어진된 나노기술 정립 하는 데 사용 하는 프로시저의 한계를 인식 그 나노 제제에 대 한 최적의 절차의 사용에 대 한 과학적 정당성을 얻기 위해 필수적 이다.
이 연구에서는 PEGylated 자주 독 소 루비 모델 나노 배합으로 사용 되었다. 이 1995 년에 미국 FDA에 의해 승인 하 고 암 환자 전세계25치료를 위해 사용.
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Protocol
1입니다. 나노 샘플의 준비
- 준비 랄에 연구 샘플 학년 물.
- 샘플 pH 범위를 6-8 인 경우에, pyrogen 무료 수산화 나트륨 또는 염 산을 사용 하 여 pH를 조정 합니다.
- 랄을 사용 하 여 학년 물 연구 샘플의 여러 희석을 준비 합니다. 높은 희석은 최대 유효 희석 (MVD)를 초과 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. MVD 추정에 대 한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오.
2. 랄 형식 사이 시 약 일반의 준비
- LAL 시 약 물 pyrogen 무료를 사용 하 여 0.1 n.의 농도에서 작업 솔루션을 준비 하는 집중된 수산화 나트륨 재고 희석
- LAL 시 약 물 pyrogen 무료를 사용 하 여 집중된 염 산 주식을 희석 하 고 0.1 n.의 최종 농도에 작업 솔루션을 준비
- 제어 표준도 (CSE)의 준비
- 제조업체에서 제공 하는 분석의 인증서에 따라 CSE reconstitute
참고: 인증서에 제공 하는 정보에 관한 중요 사항에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오. 카탈로그 번호 및 다른 랄 형태로 특정된 CSE 공식의 응용 프로그램에 대 한 세부 사항에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
- 제조업체에서 제공 하는 분석의 인증서에 따라 CSE reconstitute
- LAL 시 약의 준비
- LAL 시 약 제조업체에서 제공 하는 분석의 인증서에 따라 reconstitute
참고: LAL 시 약 준비에 관한 중요 한 세부 사항에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오. 카탈로그 번호 및 다른 랄 형태로 주어진된 LAL 시 약 배합의 응용 프로그램에 대 한 세부 사항에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
- LAL 시 약 제조업체에서 제공 하는 분석의 인증서에 따라 reconstitute
3. 탁 랄 분석 결과
- 교정 표준의 준비
- Using 랄 학년 물 900 µ L, CSE의 100 µ L, 많은 중간 희석 교정 0.001에서 1 EU/mL의 농도 범위와 표준의 준비를 활성화 하는 데 필요한 준비.
- 첫 번째 튜브 라벨 고 각 관으로 랄 급 물 900 μ를 추가 합니다. 1EU/mL의 농도 함께 교정 표준 준비 10 EU/mL solutionn의 100 μ를 추가 합니다.
- 3 더 낮은 교정 표준 준비 위에서 설명한 대로 직렬 10 희석을 반복 합니다. 1 EU/mL 0.001에서 배열 하는 4 개의 교정 표준 준비 된 확인 합니다.
- 품질 컨트롤의 준비
- 1 EU/mL CSE 솔루션의 50 µ L 랄 급 물 950 µ L 결합 하 여 0.05 EU/mL 품질 관리를 준비 합니다.
참고: 컨트롤 준비에 관한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오.
- 1 EU/mL CSE 솔루션의 50 µ L 랄 급 물 950 µ L 결합 하 여 0.05 EU/mL 품질 관리를 준비 합니다.
- 금지/향상 (IEC) 컨트롤의 준비
- 1 EU/mL CSE 솔루션의 25 µ L의 주어진된 희석에 테스트 접한 475 µ L를 결합 하 여 0.05 EU/mL의 농도와 IEC를 준비 합니다.
참고: 추가 정보에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오.
- 1 EU/mL CSE 솔루션의 25 µ L의 주어진된 희석에 테스트 접한 475 µ L를 결합 하 여 0.05 EU/mL의 농도와 IEC를 준비 합니다.
- 실험 절차
- 약 30 분 사전에 설정 하 여 워밍업 악기를 허용 합니다. 설정 검출 파장 660 nm이 탁도 랄에 대 한 적절 한입니다.
- 사용자 이름 및 암호를 입력 하 여 로그인.
- 컴퓨터 화면에 해당 아이콘을 클릭 하 여 소프트웨어 (테이블의 재료)를 엽니다.
- 소프트웨어 홈 화면에 데이터 수집 을 선택 합니다. 일반 탭에서 해당 공간으로 홈 화면에 테스트 ID와 데이터 그룹 정보를 입력 합니다.
- 하드웨어 탭을 클릭 하 여 드롭다운 메뉴에서 악기 종류를 선택 합니다.
- 설정 검출 파장 660 nm이 적합 chosing에 의해 탁 랄 랄 탁도 방법.
- 일련 번호, 시스템 ID 및 직렬 포트 정보는 화면에 표시를 확인 합니다. 확인을 클릭 합니다. 확인 한번 더 확인을 클릭 합니다.
- 샘플 테스트는 동일한 순서에 샘플 ID를 입력 합니다. 기본 단추를 사용 하 여 부정적인 제어, 표준 곡선 및 테스트 샘플 입력.
- 각 샘플에 대 한 중복 튜브를 준비 하 고 미리 레이블이 유리 튜브로 200 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 부정적인 제어 (물), 교정 표준, 품질 관리, IEC 및 테스트 나노 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다.
- 첫 번째 테스트 유리병, 그것을 짧게, 그리고 테스트에 삽입 슬롯 악기 회전 목마에 소용돌이를 50 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 LAL 시 약의 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다. 1:1 비율을 사용 하는 경우 LAL 시 약의 볼륨은 100 µ L입니다.
- 다른 샘플에 대 한 위에서 설명한 절차를 반복 합니다. 프로세스는 한 번에 하나씩 샘플링합니다.
참고: 자세한 내용은 토론 섹션을 참조 하십시오.
4. 비 랄
- 교정 표준의 준비
- Using 랄 학년 물 900 µ L, CSE의 100 µ L, 많은 중간 희석 1 EU/mL의 농도와 교정 표준의 준비를 활성화 하는 데 필요한 준비.
- Using 900 µ L 랄 급 물과 표준 1 EU/mL 교정의 100 µ L, 0.1 EU/mL의 농도에서 두 번째 교정 표준 준비.
- 두 더 낮은 교정 표준 준비 위에서 설명한 대로 직렬 10 희석을 반복 합니다. 1 EU/mL 0.001에서 배열 하는 4 개의 교정 표준 준비 된 확인 합니다.
- 품질 컨트롤의 준비입니다.
- 1 EU/mL CSE 솔루션의 50 µ L 랄 급 물 950 µ L 결합 하 여 0.05 EU/mL 품질 관리를 준비 합니다.
참고: 컨트롤 준비에 관한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오.
- 1 EU/mL CSE 솔루션의 50 µ L 랄 급 물 950 µ L 결합 하 여 0.05 EU/mL 품질 관리를 준비 합니다.
- 금지/향상 (IEC) 컨트롤의 준비
- 1 EU/mL CSE 솔루션의 25 μ 테스트 접한의 475 μ와 결합 하 여 0.05 EU/mL를 준비 합니다.
참고: 추가 정보에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오.
- 1 EU/mL CSE 솔루션의 25 μ 테스트 접한의 475 μ와 결합 하 여 0.05 EU/mL를 준비 합니다.
- 실험 절차
- 약 30 분 사전에 설정 하 여 워밍업 악기를 허용 합니다. 설정 검출 파장 405 nm이 탁도 랄에 대 한 적절 한입니다.
- 컴퓨터 화면에 해당 아이콘을 클릭 하 여 소프트웨어를 엽니다. 사용자 이름 및 암호를 입력 하 여 로그인.
- 소프트웨어 홈 화면에 데이터 수집 을 선택 합니다. 일반 탭에서 해당 공간으로 홈 화면에 테스트 ID와 데이터 그룹 정보를 입력 합니다.
- 하드웨어 탭을 클릭 하 여 드롭다운 메뉴에서 악기 종류를 선택 합니다. 악기를 선택 하십시오.
- 일련 번호, 시스템 ID 및 직렬 포트 정보는 화면에 표시를 확인 합니다. 확인을 클릭 합니다. 확인 한번 더 확인을 클릭 합니다.
- 샘플 테스트는 동일한 순서에 샘플 ID를 입력 합니다. 기본 단추 부정적인 제어 입력을 사용 하 여 표준 곡선 및 테스트 샘플.
- 각 샘플에 대 한 중복 튜브를 준비 하 고 미리 레이블이 유리 튜브로 200 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 부정적인 제어 (물), 교정 표준, 품질 관리, IEC 및 테스트 나노 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다.
- 첫 번째 테스트 유리병, 그것을 짧게, 그리고 테스트에 삽입 슬롯 악기 회전 목마에 소용돌이를 50 µ L (테스트 비율 4:1) 또는 LAL 시 약의 100 µ L (테스트 비율 1:1)를 추가 합니다. 1:1 비율을 사용 하는 경우 LAL 시 약의 볼륨은 100 µ L입니다.
- 다른 샘플에 대 한 위에서 설명한 절차를 반복 합니다. 프로세스는 한 번에 하나씩 샘플링합니다.
5. 젤-응고 랄
참고:이 분석 결과 시각적 관찰 및 반응 관에 응고의 검출에 따라 샘플에서 독의 존재를 식별 합니다. 아래 실험 단계를 설명 합니다. 벤치 시트를 사용 하 여 결과 기록. 이 벤치 시트는 필수, 그리고 시험 결과 기록 하는 다른 방법을 받아들일 수 있습니다. 같은 벤치 시트의 예로 독자의 편의 위해 보충 자료 제공 됩니다. 람다 (l) 젤 응고 시험의 감도 이며 0.03 EU/mL입니다.
- 분석 된 테스트 샘플의 수를 수용 하는 데 필요한 많은 반응 튜브 라벨. 1 단계, 2 단계 분석 결과의 3 단계에서 사용 하는 복제의 수에 대 한 자세한 내용은 벤치 시트를 참조 하십시오.
- 튜브 당 물, 컨트롤 또는 테스트 샘플의 aliquot 100 μ.
- 최종 농도 4λ는 CSE를 준비 합니다.
- 2λ의 CSE의 최종 농도 달성 하기 위해 물 또는 테스트 샘플의 100 μ와 위에서 언급 한 기준의 100 μ를 결합 한다. 람다와 반 람다 및 1/4 람다 3 번 이상 반복 합니다.
- 물 목욕에서 온도 37 ° c.
- 추가 테스트 튜브, 소용돌이 짧게 당 lysate의 100 μ 고 모든 튜브 랙 1 h 물 목욕 합니다.
- 부드러운 모션으로 튜브를 반전.
- "+" (상사 병)를 사용 하 여 수동으로 레코드 결과 또는 "-" (응고 또는 느슨한 응고) 벤치 시트에.
- USP 내기 854에 따라 분석 하십시오; 벤치 시트를 사용 하 여 자료를 지원
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Representative Results
LAL 분석 실험에서이 테스트 한 후 생성 된 데이터의 예는 표 1에 표시 됩니다. PEGylated 자주 독 소 루비 5 희석에서 비 랄와 방해. 그러나,이 간섭 큰 희석에 의해 극복 됐다. 50과 200% 사이 스파이크 복구 때이 희석 탁 랄에에서 5에서 뿐만 아니라 희석 50 및 탁도 및 비 랄, 500에서 테스트 되었습니다. 희석 비율 조정, 결과 두 분석 실험에 희석 사이 일관 했다. 또한, 결과 세 가지 분석 결과 형식 사이 일관 했다.
| 테스트 샘플 | 탁도 랄, EU/mg (스파이크 복구, %) | 비 랄, EU/mg (스파이크 복구, %) | 젤-응고 LAL, EU/mg (유효한, 예 또는 아니요 테스트) |
| PEGylated 자주 독 소 루비 (재료의 표 참조) | |||
| 희석 5 | 0.01 (141) | 간섭 | < 0.75 (Y) |
| 희석 50 | < 0.025 (187) | 0.029 (82) | < 1.5 (Y) * |
| 희석 500 | < 0.25 (182) | < 0.25 (86) | < 3 (Y) * * |
표 1: PEGylated 자주 독 소 루비 랄을 사용 하 여 분석 실험에 감지. 자주 독 소 루비 탁, 비 젤-응고 랄을 사용 하 여 테스트를 했다 PEGylated 분석 실험. 샘플 간섭 IECs를 사용 하 여 추정 되었다. 스파이크 복구 괄호에 표시 됩니다. 50과 200% 사이의 값으로 간주 됩니다 USP 내기 85에 따르면 허용도 감지4에 대 한 표준. * 고 * *이 샘플의 테스트 결과 각각 100과 200, 희석에 가져온. 젤 병 분석 결과 희석 다르다 발에 사용 되 고 탁 랄 감도 최대 유효 희석이 분석이 결과의 더 낮은 때문에.
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Discussion
이 프로토콜에서 제공 하는 정보15,26 전에 설명 하고있다 고는 미국 식품 의약품 안전 청은 미국 식약청 (FDA) 및 미국 약전 (USP)4 에 의해 게시 된 여러 규제 문서 , 5 , 6 , 27, 그리고 또한 NCL 웹사이트20 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고 랄)에 사용할 수 및 STE1.4 (비 랄).
테스트-나노 LAL 시 약 물 또는 살 균, pyrogen 무료 PBS에서 준비 된다. 연구 샘플의 산도 낮은 (< 6)와 높은 (> 8) pH는 lysate의 최적의 성능을 방해 합니다 때문에 중요 하다. 테스트-나노의 pH 범위를 6-8 인 경우에, 그것은 수산화 나트륨 pyrogen 무료 또는 염 산을 사용 하 여 조정할 수 있습니다. 이러한 조정을 수행 하면 microelectrode에서 샘플 오염을 피하기 위하여 생명 이다. 따라서이 절차를 수행 하려면 샘플의 작은 약 수는 별도 관으로 제거와 pH를 측정 하는 데 사용.
샘플 PBS 또는 다른 버퍼에서 준비 되었을 때 빈 버퍼 또한이 테스트에 포함 되어 있습니다. 각 접한의 농도 경우 다릅니다. 테스트는 활성 제약 성분 (API)의 밀리 그램 당 내 오염의 양을 추정 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 나노 배합의 종류에 따라 농도 또한 예상할 수 있는 총 공식 또는 총 요소의 mg에 (예., 골드, 실버 또는 골드, 실버, 및 산화 철 나노 입자, 각각 철). 샘플에서 MVD를 초과 하지 않는 여러 희석을 사용 하 여 재고에서 테스트 됩니다. 테스트-나노 입자의 모든 희석 랄 등급 물을 사용 하 여 준비가 되어 있습니다.
세 개의 매개 변수는 MVD를 계산 하는 데 사용 됩니다. 그들은 내 제한 (엘), 샘플 농도 분석 결과 감도 (λ)4입니다. 다음 수식을 사용 하 여도 (엘)를 계산: 엘 = K/M, 여기서 K는 임계값 pyrogen 복용량 (예. 5, EU/kg는 소개에서 언급 했 듯이)이 고 M은 바디의 킬로그램 당 관리를 위한 테스트 접한의 최대 복용량 무게는 한 시간4. 위에서 설명 했 듯이, radiopharmaceutical 또는 의료 기기를 사용 하는 나노 재료에 대 한 엘의 추정 임계값 화성 복용량 의존 또는 수식, 있는 다른 5/M. 이러한 세부 정보는 소개에서 언급 하 고 USP 및 미국 FDA 가이드라인4,,56에 더 검토 될 수 있습니다. 안과 솔루션 안구 내부 장치에 대 한 권장된도 제한6이러한 제품 대 한 미국 FDA 지침에 제공 됩니다. 때 동물 모델 (예., 마우스)는 nanoformulation의 복용량을 설정 하는 데,이 정보는 소위 인간의 등가 선 량 (HED) 추정. HED는 각 동물 종에 특정 변환 계수로 동물 복용량을 분할 하 여 계산 됩니다. 예를 들어, 변환 계수 12.3, 6.2, 마우스, 쥐, 토끼, 각각273.1입니다. 변환 절차와 그것을 사용 하기 위한 근거 미국 FDA 지침27에서 자세히 설명 합니다. 암 치료는 종종 mg/m2에서 표현 하는 표면 본문 영역 당 약을 복용. 하나 하나 평방 미터 당 밀리 그램에서 약을 복용 하는 약물에 대 한 엘을 계산 하는 USP 지침을 따라 하거나 mg/kg 범위가이 복용량을 변환할 수 있습니다. Mg/m2 에 복용량27종의 변환 인수 사용 하 여 mg/kg의 복용량을 조정할 수 있습니다. 성인 인간, 그것은 37 Km 질량 상수27를 참조로 표시 된. Km 요소는 k g/m2의 단위 그것은 평방 미터 (m2)27에 표면적으로 나눈 킬로그램 (kg)에 몸 무게와 같습니다. 예를 들어 인간의 복용량 또는 HED 74 m g/m2 의 2 mg/kg 또는 74/37에 해당합니다. MVD를 결정 하려면 다음 수식을 사용 합니다, USP 내기 85 표준에서 사용할 수 있는: MVD (샘플 농도 x 엘) = / λ)4. 가상 시나리오에서 나노 샘플 농도 10mg/mL 이며 마우스에 그것의 최대 복용량은 615 mg/kg 이다. 이 경우에 HED은 615/12.3 = 50 mg/kg; Intrathecal 제외 하 고 모든 경로 대 한 엘은 0.1 EU/mg (5 EU/kg/50 mg/kg) MVD는 1000 ((0.1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 EU/mL).
종종, 하나 연구 학년 접한에 걸쳐 오염 평가 하는 경우, 복용량 정보 불가능 합니다. 이러한 자료에 대 한 MVD 및 엘을 예측 하는 방법에 대 한 아무 조화 절차가입니다. 이 사례 연구 재고에서 직접 테스트를 수행 합니다 (일반적으로이 용액의 농도 1 mg/mL)에서 여러 희석, 일반적으로 5-, 50-, 500-5000-주름. 복용량, 관리의 경로, 샘플 농도 주입 주어진된 테스트 접한 변화에 대 한 시간, MVD 고 엘도 변경. 따라서, 하나는 정보를 평가 하 고 엘와 MVD의 추정 금액, 관리의 시간, 원하는 경로 및 주어진된 정립의 농도에 관련 된 다른 매개 변수의 맥락에서 수행 하고있다.
주의 하는 것이 중요 하다 카탈로그 번호 및 제품 사양 (예., 힘, 유리병 당 금액)는 CSE의 다른 랄 형식에 대 한 다르다. CSE 탁에 젤 응고 랄 랄을 사용하실 수 있습니다 사용. 그러나, 비 랄에 대 한 CSE이 분석 결과 형식입니다. 아래에 제공 된 지침 일반적인 있으며 모든 시험 형식에 사용 되는 CSE에 적용. CSE는 동결 건조 된 분말으로 공급 하는 대장균 lipopolysaccharide (LPS) 이다. 이 표준은 알려진된 힘으로 제조 업체에 대 한 참조 표준도 (RSE) 의해 인증 됩니다. ~3.2-LAL 시 약 물 pyrogen 무료 5.0 mL CSE를 포함 하는 유리병의 내용은 재구성 된다 한다. CSE 다른 분석 결과 형식에 대 한 사용의 차이, 함께 재구성의 볼륨이이 표준의 각 많은 특정 이기도 합니다. 따라서, 하나는 많이 각 표준에 대 한 재고 CSE 솔루션의 최종 농도 계산 했다. 계산 각 유리병에 포함 된 양과 표준의 힘에 따라 수행 됩니다. 각 많이 표준에 대 한 구체적인 분석의 인증서 유리병 당 양과 효능에 대 한 정보가 들어 있습니다. 하나는 엄격 하 게 소용돌이 표준 30-60 초에 대 한 재구성 하는 동안 및 사용 중. 그것은 또한 안정화 시간 5-10 분을 사용 하 여 재구성을 수행 하는 것이 좋습니다 하 고 30-60 분 이상의 시간 프레임을 모두 동결 건조 된 재료 확인을 솔루션으로 들어간다. 분석 결과 사용 하기 전에 실내 온도에 주식 CSE를 equilibrate. 재구성, 후 CSE 사진 저장용 냉장 수 이며 4 주에 대 한 안정적입니다.
CSE와 마찬가지로, LAL 시 약은 또한 각 형식에 대 한 특정. 아래에 제공 된 지침은 일반적인 있으며 모든 랄 분석 결과 형식에 적용. LAL 시 약 동결 건조 된 분말으로 제공 됩니다. 제조업체의 권장 사항은 각 유리병을 다시 구성할 뒤에 됩니다. LAL 학년 물 또는 beta glucans 억제 버퍼를 사용할 수 있습니다. Beta glucans 억제 버퍼 beta glucans에서 방해를 제외 수 있기 때문에이 사례 연구에서 선호 된다. 셀 루 로스 아세테이트 필터 접한 합성 하는 동안 일반적으로 사용 되는 글 루 칸 오염15의 근원으로 봉사 하기 때문에이 긍정 간섭 나노에서 매우 일반적입니다. 대부분 병 5 mL의 최종 볼륨을 재구성을 해야 합니다. 10 년 이상이 분석 결과와 저자의 경험을 바탕으로, 그것은 발견 되었습니다이 버퍼의 포함 반응 속도가 느려집니다 및에서 최저 교정기 있도록 악기 설정에서 최대 발병 시간을 증가 해야 한 개발을 0.001 EU/mL의 농도입니다.
표준의 준비 하는 동안 정확한 희석을 보장 하기 위해, 10 희석 단계를 사용 하는 것이 좋습니다. 직렬 10 희석 식이나 pyrogen 무료 물 900 µ L로 높은 농도와 표준의 사용률이 100 µ L에 의해 준비 될 수 있다. 때문에 CSE의 농도 일반적으로 높은 (~ 1000 EU/mL), 준비의 중간 희석 농도가 100, 10 EU/mL 1 EU/mL의 농도 분석 결과 교정기를 준비 하기 전에 것이 좋습니다. 두 비율 테스트 샘플 사이 고 lysate이 프로토콜에서 설명 합니다. 비록 두 비율 일반적으로 사용 하 고, 곡선의 선형성은 허용 하지만 좋지 않은 4:1 비율 및 베타-glucans ( 재료의 표참조)을 억제 하는 버퍼를 사용 하는 경우.
동일한 규칙 교정 표준 준비에 대해 위에서 설명한 대로 또한 적용할 품질 컨트롤 (QC)의 준비. 이러한 컨트롤은 분석 결과 제대로 작동 하는지 확인 하는 데 사용 됩니다. 급상승 pyrogen 무료 물에 CSE의 알려진된 금액에 의해 준비 된다. QC의 농도 분석 결과 범위 중간에 일반적으로 선택 됩니다. 탁도 랄 분석 결과의 범위는 0.001 ~ 1 EU/mL입니다. 따라서, QC 0.05 EU/mL의 농도에서 사용 됩니다. 다른 농도 분석 결과 범위 내에서 품질 관리의 준비에 사용할 수 있습니다.
저해 향상 제어 (IEC) 긍정적인 제품 컨트롤 (PPC)도 알려져 있다. 그것은 테스트 샘플에 CSE의 알려진된 농도가 급상승에 의해 준비 된다. IEC (PPC)의 농도 분석 결과 범위 중간에 일반적으로 선택 됩니다. 탁도 랄 분석 결과의 범위는 0.001 ~ 1 EU/mL입니다. 따라서, IEC 0.05 EU/mL의 농도에서 사용 됩니다. 이 IEC 준비 하나는 테스트-나노의 950 µ L 50 µ L 1 EU/mL CSE 솔루션의 결합 해야 합니다. IEC의 테스트 접한 각 희석에 대 한 준비가 되어 있습니다. 예를 들어 나노 제제 3 희석 (1시 50분, 1: 500, 1:5, 000)에서 테스트 하는 경우 하나의 각이 희석 3 IECs 준비 하고있다. 시험 범위 내에서 다른 농도 또한 IEC 샘플 준비를 사용할 수 있습니다. 이 컨트롤은 주어진된 나노 제제에 대 한 테스트 결과의 타당성을 이해 하는 데 사용 됩니다. USP에 따라 테스트 결과 IEC (PPC)의 스파이크 복구는 50 ~ 2004하는 경우에 유효 합니다. 스파이크 50% 미만 복구 수단 테스트 접한 억제도 검색 및, 따라서, 테스트 underestimates 내 오염 결과 고 올바르지 않습니다. 스파이크 복구 200% 이상 제안 테스트 자료 분석 결과 향상 또는 오염도의 너무 높은 수준을 포함 합니다. 향상, 경우 시험 결과 정확 하지 않다 또한. 이러한 방해 하 고 그들을 극복 하기 위한 몇 가지 방법의 예제 설명된 이전12,15되었습니다.
탁도 및 비 분석 실험을 수행할 때 리피터 피 펫을 사용 하 여 모든 샘플에 LAL 시 약을 추가 하는 것이 좋습니다. 평균 악기 작업 시간은 7200 초입니다. 그러나, 빠르거나 느린 특정 많은 lysate의 반응 수 있습니다. 경우, 반응이 느린 때 9600s 이상 악기 설정을 변경 해야 할 수 있습니다 하나. 이 변경 개발 하는 가장 낮은 교정기를 허용할 것 이다.
PEGylated 자주 독 소 루비 2 mg/mL의 농도에서 활성 제약 성분 (API)를 포함 하는 공식 이다. 50 mg/m2의 복용량으로 서 병원에서 사용 됩니다. 이 복용량 mg/kg 범위를 변환 하려면 그것 요소 3727로 나눕니다. PEGylated 자주 독 소 루비 mg/kg에서의 복용량은 따라서 1.35입니다. 엘을 계산 하려면 5 (EU/kg에서 임계값 pyrogen 복용량) 1.35 (mg/kg에 Doxil의 복용량)로 분할 되 고 3.7 EU/mg4를 얻을. 이 번호는 PEGylated 자주 독 소 루비 1.35 mg/kg의 복용량에 안전 하 게 관리할 수 단일 시간 정립에도 3.7 EU/mg, mg api 참조를 초과 하지 않는 경우를 의미 합니다.
다음,이 정보를 사용 하 여 랄 분석 실험에 대 한 MVD 계산 하. 탁도, 비와이 연구에서 제시 하는 젤-응고 분석 실험의 감도 (람다) 이며 0.001, 0.001 0.03 EU/mL, 각각. 따라서, MVD는 탁도 및 비 분석 실험에 대 한 7,407 ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 EU/mL), 그리고 젤 응고 분석 결과 ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 EU/mL)에 대 한 247.
독 소 루비는 넓은 흡 광도 스펙트럼 분석 결과 파장의 비 랄28,29겹치는 있습니다. 또한, 대부분 liposome 정립은 탁 하 고 밀키 나타납니다. 이 고유의 탁 탁도 분석 결과와 리의 간섭에 대 한 매우 일반적인 이유입니다. PEGylated 자주 독 소 루비, 경우는 탁으로 인 한 간섭 5 50과 200% (표 1) 사이의 값을 복구 스파이크에 의해 입증으로 희석에 의해 극복 됐다. 그러나, 동일한 희석 독 소 루비에 농도 비 랄 (표 1) 방해에 충분히 높은 했다. (50와 500) 2 개의 연속적인 희석 비 랄 PEGylated 자주 독 소 루비 방해를 극복 하기 위해 도움이. 젤 응고 분석 결과 탁도 및 견본 색의 독립적인 정립에도 수준이 젤 응고 범위 때문에, PEGylated 자주 독 소 루비 않았다 방해 하지 젤 응고 분석 결과 모든 테스트 희석. 이 사례 연구에서 PEGylated 자주 독 소 루비의 여러 희석이 분석이 실험을 위해 사용 되었다. 젤 병 분석 결과 대 한 희석 5, 50 및 500 탁도 및 비로 50, 100 그리고 200는 MVD 내 때문에 선택 되었다. 젤 병 분석 결과의 MVD는이 분석 결과의 감도 또한 더 낮은 때문에 탁도 및 비 LALs 보다 낮습니다. 정립 희석 500에서 랄 탁도 및 비 분석 실험에 방해, 높은 희석 (예를 들어, 5000, 6000, 7000, 7,407)에서 분석 수행 수 있습니다. 아래는 엘 젤 응고 분석 결과에 희석 50에서 얻은 내 수준 이었기 낮은 희석에이 배합의 분석은 수행 되지 않습니다. 그러나, 다른 경우에는 테스트 계속 될 수 있었다 희석 20, 10, 5 또는 최저 아니 식별 하는 2 희석을 방해 하 고 EL 아래 정립에도의 수준 인지 이해.
젤 응고 분석 결과 대 한 그것은 필수이 분석 결과의 동안 물 욕조에 물 순환 기능을 해제 하거나 물 흐름 손해는 응고 g의 정확도 영향을 미칠 수 있기 때문에 이러한 옵션 없이 물 목욕을 사용 하는 언급 하는 것이 중요 하다 엘-응고 랄의 시험 그것은 항상 가능한 샘플 희석을 증가 시켜 나노 랄 분석 방해를 극복 하입니다. 전략과 랄 분석 되었습니다 문제를 일반적으로 대표 하는 나노 입자의 예제와 다양 한 종류의 장애를 극복 하기 위한 몇 가지 방법을 논의 다른 그룹 및 우리가 다른12,13,14 ,15,,3031. 이 원고에 제시 하는 분석 모델 수립을 기반으로 합니다. 다른 nanoformulations의 경험과 다를 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
연구는 국립 암 연구소에서 연방 기금에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회, HHSN261200800001E 계약. 이 발행물의 콘텐츠 뷰 또는 정책의는 부의 보건 및 인적 서비스, 반드시 반영 하지 않습니다도 무역 이름, 상용 제품의 언급지 않습니다 또는 조직 미국 정부에 의해 승인을 의미 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
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