Summary
工程纳米材料中内毒素的检测是纳米医学领域面临的重大挑战之一。在这里, 我们提出了一个案例研究, 描述了由三种不同的 lal 格式组成的框架, 以估计纳米颗粒中潜在的内毒素污染。
Abstract
当存在于医药产品中时, 革兰氏阴性细菌细胞壁成分内毒素 (通常也称为脂多糖) 可引起炎症、发热、低血压或高血压, 在极端情况下, 可导致组织和器官损伤, 从而可能导致组织和器官损伤。变得致命。因此, 对药品中的内毒素含量进行了严格的监管。在可用于内毒素检测和定量的方法中, 利穆鲁斯·阿米巴细胞裂解液 (lal) 法在全球范围内得到了广泛的应用。虽然任何药品都会干扰 lal 检测, 但由于其复杂性, 纳米配方是一个特殊的挑战。本文的目的是为在估算工程纳米材料和纳米颗粒配方药物中的内毒素方面经验不足的研究人员提供实用的指导。在此, 讨论了执行三种 lal 格式的实用建议, 包括浊度、显色性和凝胶凝块检测。这些检测可用于测定纳米技术药物产品、疫苗和佐剂中的内毒素污染。
Introduction
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁 1,2的一个组成部分。它可以在非常低的 (皮图) 浓度 1,2激活免疫细胞。细胞对内毒素产生的促炎介质 (细胞因子、白三烯、eicooid等) 导致发烧、低血压、高血压和更严重的健康问题, 包括多器官衰竭1,2,3. 内毒素引发的免疫介导的副作用的严重程度取决于其效力, 这些副作用由内毒素组成和结构决定, 并以国际内毒素单位 (iu 或 eu)3进行测量。每公斤体重单位的数量被用来设定一个阈值的热原剂量内毒素。对于通过除鞘内路线以外的所有途径给药的药物产品, 这一剂量为5欧元/千克。每平方米的药物体表面、眼内液体、放射性药物和通过鞘内途径施用的产品具有不同的阈值热原剂量, 即 100 EU/mL、0.2 euml、175 欧元 (其中 v 是用于管理的产品的体积), 分别为 0.2 eu/kg.关于各种药物产品和设备的阈值热原剂量的更多细节, 在其他地方提供和讨论。
动物对内毒素介导的反应的敏感性差别很大。人类、非人类灵长类动物和兔子是对内毒素3最敏感的物种之一.为了避免患者内毒素介导的副作用, 并防止临床前毒性和疗效研究的不准确结论, 必须准确地检测和量化临床和临床前等级配方中的内毒素。目前有几种可用的方法可以完成这项任务。其中之一是利穆鲁斯阿米巴细胞裂解液 (lal) 检测, 它在全球范围内常用用于筛选生物医学产品的潜在内毒素污染, 以及检测细菌感染7,8,9。裂解液是由存在于北美大陆东岸的马蹄蟹血液中的肌细胞组成的, 这种细胞存在于马蹄形细胞中。有趣的是, 在亚洲有几个不同种类的马蹄蟹 (马蹄形蟹和三头肌) 。在几个亚洲国家, 细胞裂解液 (tal) 被用来检测内毒素, 类似于其他国家使用 lal 的方式.裂解物 (lal 和 tal) 含有一组蛋白质, 在激活时产生蛋白酶活性。其中一种蛋白质, 所谓的因子 c 在与内毒素接触时被激活。活化因子 c 裂解因子 b, 进而成为蛋白酶, 并裂解促进凝血酶产生凝血酶。这种反应链的结果是形成了凝胶, 增加了样品的浊度, 并且在有显色底物的情况下, 出现了有色产品, 作为凝胶凝块、浊度和显色检测的基础,分别。虽然没有强制性的 lal 格式, 美国食品药品监督管理局 (fda) 在行业文件的指导意见中解释说, 如果不同的 lal 格式之间的测试结果不一致, 决定是根据凝胶凝块检测5.
许多常用的实验室化学品 (如edta) 和已知的药物产品 (如青霉素) 会干扰 lal 检测11。这种干扰通常是通过评估在已知浓度下刺入含有测试材料的溶液中的内毒素标准的回收情况来识别的。如果穗恢复小于50% 或大于 200%, 则给定测试材料的 lal 检测结果是无效的, 原因是抑制或增强, 分别为 4。基于纳米技术的配方通常是复杂的, 并通过各种机制12,13,14干扰 lal。已经描述了许多克服干扰的方法: 样品在特定的缓冲液和表面活性剂中的重组, 蛋白质通过加热失活, 通过加热和补充样品过量来破坏以脂质为基础的空心材料二价阳离子5,12,13,14,15。还介绍了 lal 干扰无法克服的情况下的替代方法: elisa、hek-tlr4 报告细胞系检测和16、17、18、 19岁
本文介绍了进行凝胶凝块、浊度和显色性 lal 检测的实验过程。这些检测也可在纳米技术表征实验室 (ncl) 网站20上获得, 协议为 ste1.2 (浊度 lal)、ste3 (凝胶-凝体 lal) 和 ste1.4 (显色性 lal)。建议至少采用两种不同的格式来表征相同的纳米配方。当浊度和色原性 lal 的结果不一致时, 凝胶凝块的结果被认为是5。当两种 lal 格式的结果不一致时, 使用单核细胞活化试验 (mat) 或兔热原测试 (rpt) 来验证 lal 的结果进行了21项额外的研究。需要注意的是, 用于内毒素检测和热原性评估的每一种方法都有优点和局限性 21、22、23、24.认识到用于表征特定纳米技术配方的程序的局限性对于获得科学的理由来证明该程序的使用是最佳的, 该纳米制剂。
本研究采用聚乙二醇化脂质体多沙比星作为纳米颗粒的模型制剂。这种制剂于1995年获得美国 fda 的批准, 用于治疗全世界25 例癌症患者。
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Protocol
1. 纳米粒子样品的制备
- 在 lal 级水中准备研究样本。
- 如果样品 ph 值在6-8 范围之外, 请使用无热原氧化钠或盐酸调整 ph 值。
- 使用 lal 级的水制备了几个稀释的研究样本。确保最高稀释量不超过最大有效稀释 (mvd)。有关 mvd 估计的详细信息, 请参阅讨论部分。
2. lal 格式之间常用试剂的制备
- 使用无热剂 lal 试剂水稀释浓缩氢氧化钠库存, 制备浓度为 0.1 n 的工作溶液。
- 使用无热素的 lal 试剂水稀释浓缩的盐酸库存, 并在最终浓度为 0.1 n 的情况下制备工作溶液。
- 控制标准内毒素 (cse) 的制备
- 根据制造商提供的分析证书重新编制 cse。
注: 有关证书中提供的信息的重要说明, 请参阅讨论部分。有关不同 lal 格式的特定 cse 配方的目录号和应用的详细信息, 请参阅材料表。
- 根据制造商提供的分析证书重新编制 cse。
- lal 试剂的制备
- 根据制造商提供的分析证书重新制造 lal 试剂。
注: 有关 lal 试剂制备的重要详细信息, 请参阅讨论部分。有关不同 lal 格式的特定 lal 试剂配方的目录号和应用的详细信息, 请参阅材料表。
- 根据制造商提供的分析证书重新制造 lal 试剂。
3. 浊度测定
- 校准标准的准备
- 使用900μl 的 lal 级水和100μl 的 cse, 准备尽可能多的中间稀释剂, 以能够准备一个校准标准的浓度范围为0.001 至 1 eu/ml。
- 首先贴标签管, 并在每个管中加入900μl 的 lal 级水。然后加入100μml 溶液, 制备浓度为1euml 的校准标准。
- 按照上述步骤重复连续10倍稀释, 以准备三个较低的校准标准。验证是否制定了四项校准标准, 从0.001 到 1 euml 不等。
- 质量控制的准备
- 将 1个 euml cse 溶液的50μl 与950μl 的 lal 级水结合, 准备0.05 的 euml 质量控制。
注: 有关控制准备的详细信息, 请参阅讨论部分。
- 将 1个 euml cse 溶液的50μl 与950μl 的 lal 级水结合, 准备0.05 的 euml 质量控制。
- 改进 (iec) 控制的准备
- 在一定的稀释下, 将 1个 euml cse 溶液的25μl 和测试纳米材料的475μl 结合起来, 以 0.05 eumml 浓度制备 iec。
注: 有关其他详细信息, 请参阅讨论部分。
- 在一定的稀释下, 将 1个 euml cse 溶液的25μl 和测试纳米材料的475μl 结合起来, 以 0.05 eumml 浓度制备 iec。
- 实验程序
- 提前约30分钟打开仪器, 让其预热。将检测波长设置为 660 nm, 因为这适用于浊度 lal。
- 通过键入用户名和密码登录。
- 通过单击计算机屏幕上的相应图标打开软件 (材料表)。
- 选择 "收集软件主屏幕上的数据" 。在主屏幕上的"常规" 选项卡中的相应空间中输入测试 id 和数据组信息。
- 单击 "硬件" 选项卡. 从下拉菜单中选择仪器类型。
- 通过选择 lal 浊度法, 将检测波长设置为 660 nm, 因为这适用于浊度 lal。
- 验证屏幕上是否显示序列号、系统 id 和串行端口信息。单击"确定"。再次单击"确定"进行确认。
- 输入样品 id 的顺序与测试示例的顺序相同。使用默认按钮输入负控件、标准曲线和测试示例。
- 为每个样品准备重复的管, 并将负控制 (水)、校准标准、质量控制、iec 和测试纳米颗粒的 200μl (测试比 42:1) 或 100μl (测试比率 1:1) 添加到预先标记的玻璃管中。
- 在首次测试小瓶中加入 50μl (测试比 42:1) 或 100μl (测试比 12:1), 将其短暂旋转, 并插入仪器传送带中的测试槽中。如果使用1:1 的比率, 则 lal 试剂的体积为100μl。
- 对其他示例重复上述过程。一次处理一个样本。
注: 有关详细信息, 请参阅讨论部分。
4. 变色 lal
- 校准标准的准备
- 使用900μl 的 lal 级水和100μl 的 cse, 准备尽可能多的中间稀释, 以使准备校准标准的浓度为 1 euml。
- 使用 900μl lal 级的水和100μl 的 1 euml 校准标准, 准备第二个校准标准, 浓度为 0.1 eumml。
- 按照上述步骤重复串行10倍稀释, 以准备两个较低的校准标准。验证是否制定了四项校准标准, 从0.001 到 1 euml 不等。
- 质量控制的准备。
- 将 1个 euml cse 溶液的50μl 与950μl 的 lal 级水结合, 准备0.05 的 euml 质量控制。
注: 有关控制准备的详细信息, 请参阅讨论部分。
- 将 1个 euml cse 溶液的50μl 与950μl 的 lal 级水结合, 准备0.05 的 euml 质量控制。
- 改进 (iec) 控制的准备
- 将 1个 euml cse 溶液的25μl 与475μl 的纳米材料结合, 制备 0.05 euml。
注: 有关其他详细信息, 请参阅讨论部分。
- 将 1个 euml cse 溶液的25μl 与475μl 的纳米材料结合, 制备 0.05 euml。
- 实验程序
- 提前约30分钟打开仪器, 让其预热。将检测波长设置为 405 nm, 因为这适用于浊度 lal。
- 点击计算机屏幕上的相应图标打开软件。通过键入用户名和密码登录。
- 选择 "收集软件主屏幕上的数据" 。在主屏幕上的"常规" 选项卡中, 将测试 id 和数据组信息输入相应的空间。
- 单击 "硬件" 选项卡. 从下拉菜单中选择仪器类型。选择仪器。
- 验证屏幕上是否显示序列号、系统 id 和串行端口信息。单击"确定"。再次单击"确定"进行确认。
- 输入样品 id 的顺序与测试示例的顺序相同。使用默认按钮输入负控件、标准曲线和测试示例。
- 为每个样品准备重复的管, 并将负控制 (水)、校准标准、质量控制、iec 和测试纳米颗粒的 200μl (测试比 42:1) 或 100μl (测试比率 1:1) 添加到预先标记的玻璃管中。
- 在首次测试小瓶中加入 50μl (测试比 42:1) 或 100μl (测试比 12:1), 将其短暂旋转, 并插入仪器传送带中的测试槽中。如果使用1:1 的比率, 则 lal 试剂的体积为100μl。
- 对其他示例重复上述过程。一次处理一个样本。
5. 凝胶-凝胶 lal
注: 本分析方法根据对反应管中凝块的目视观察和检测, 确定样品中是否存在内毒素。实验步骤如下所述。使用工作台记录结果。此工作台表不是强制性的, 记录检测结果的其他方法也是可以接受的。为了方便读者, 补充材料中提供了这种工作台的一个例子。lambda (l) 是凝胶凝块测定的灵敏度, 为 0.03 eul。
- 根据需要标记尽可能多的反应管, 以适应分析测试样品的数量。有关检测的第1步、第2步和第3步中使用的复制数量的详细信息, 请参阅工作表。
- 每管的水、控制或测试样品为100μl。
- 准备 cse, 使最终浓度等于4。
- 将上述标准的100μl 与100μl 的水或测试样品混合, 以达到 2 cse 的最终浓度。再重复三次, 实现兰姆达和半兰布达和四分之一 lambda。
- 确保水浴中的温度为37°c。
- 在每个试管中加入100μl 的裂解液, 短暂的涡流, 并将所有试管的机架放入水浴中1小时。
- 以平滑的运动反转管。
- 手动记录结果使用 "+" (牢固的凝块) 或 "-" (无血块或松散的血块) 在板凳上。
- 根据 usp bet 85 4进行分析; 使用工作台板作为支撑材料
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Representative Results
表 1显示了在 lal 检测中测试此配方后生成的数据示例。聚乙二醇脂质体多索比星在稀释5时干扰显色性 lal。然而, 这种干扰是通过更大的稀释克服的。当这种配方在浊度和显色性 lal 的稀释50和500中进行稀释测试时, 以及在浊度 lal 中的稀释5时, 尖刺回收率在50% 至200% 之间。当通过稀释因子进行调整时, 两个检测中的稀释结果是一致的。此外, 三种检测方法的结果是一致的。
| 测试样本 | 浊度 lal, eu/mg (穗恢复,%) | 变色性 lal, eu/mg, (穗恢复,%) | 凝胶凝胶-拉尔, eu/mg (测试有效, 是或否) |
| 聚乙二醇脂质体剂量素 (见材料表) | |||
| 稀释5 | 0.01 (141) | 干扰 | < 0.75 (y) |
| 稀释50 | < 0.025 (187) | 0.029 (82) | < 1.5 (y) * |
| 稀释500 | < 0.25 (182) | < 0.25 (86) | < 3 (y) * * |
表 1: 使用 lal 检测聚乙二醇化脂质体阿霉素中的内毒素.采用浊度、显色性和凝胶-凝胶-凝胶-凝胶-lal 检测。样品干扰是使用 iec 估计的。尖刺恢复显示在括号中。根据 usp bet 85 内毒素检测标准4, 50% 至200% 之间的值被认为是可以接受的。* 和 * * 该样品的测试结果分别在稀释100和200处获得。凝胶凝块测定稀释剂与色相和浊度 lal 的稀释不同, 因为该测定的灵敏度和最大有效稀释量较低。
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Discussion
本议定书中提供的信息在15、26之前就已经描述过, 并依赖于美国食品药品监督管理局 (fda 或 fda) 和美国药典 (usp)公布的若干监管文件4,5,6,27, 也可在 ncl 网站20协议ste2 (浊度 lal), ste3 (凝胶-凝胶 lal) 和 ste1.4 (显色性 lal)。
测试纳米材料是在 lal 试剂水中或无菌、无热原酶 pbs 中制备的。研究样品的 ph 值很重要, 因为低 (< 6) 和高 (> 8) ph 值会干扰裂解液的最佳性能。如果测试纳米颗粒的 ph 值超出6-8 范围, 则可使用无热原氧化钠或盐酸进行调整。当进行这种调整时, 避免微电极污染样品是至关重要的。因此, 为了执行此过程, 将样品的一个小的脂肪去掉到一个单独的管子中, 用于测量 ph 值。
在 pbs 或其他缓冲区中制备样本时, 空白缓冲区也包括在此测试中。每个纳米材料的浓度是特定于病例的。该测试用于估计活性药物成分 (api) 每毫克的污染内毒素的量。然而, 根据纳米制剂的类型, 浓度也可以估计为总配方或总元素的毫克 (例如, 金、银和氧化铁纳米颗粒)。样品使用不超过 mvd 的几种稀释方法从库存中进行测试。测试纳米颗粒的所有稀释都是用 lale 级水制备的。
计算 mvd 时使用了三个参数。它们是内毒素极限 (el)、样品浓度和测定灵敏度 ()4。使用以下公式计算内毒素极限 (el): el = k/2, 其中 k 是阈值热原剂量 (如导言中所述, 为 5 euskg), m 是用于每公斤身体给药的纳米材料试验的最大剂量重量在一个小时4。如上所述, 对用作放射性药物或医疗器械的纳米材料的 el 的估计依赖于与 m 不同的阈值热原剂量或配方。这些细节在导言中提到, 可以在 usp 和美国 fda 的准则4、5、6 中进一步审查。推荐的内毒素限制眼科溶液和眼内设备提供了美国 fda 指南为这些产品6。当动物模型 (如小鼠) 被用来确定纳米配方的剂量时, 这一信息被用来估计所谓的人类等效剂量 (hed)。hed 是通过将动物剂量除以每个动物物种特有的换算系数来计算的。例如, 小鼠、大鼠和兔子的转化率分别为12.3、6.2 和 3.1.美国 fda 指南27详细介绍了转换程序和使用它的理由。癌症治疗通常是剂量的每个表面的身体面积表示为 mg m 2。你可以按照 usp 的指导原则来计算 el 的药物剂量每平方米毫克或转换为 mg/kg 范围。使用特定物种的换算系数 27 , 可以根据 mg kg 的剂量调整。对于一个成年人来说, 它是 37, 并表示为 km 指的是质量常数27。公里系数有 kg/2 的单位;它等于以公斤为单位的体重 (公斤) 除以表面积 (米 2)27。例如, 人的剂量或 hed为74 mg/2, 相当于 2 mg kg 或 74/37。要确定 mvd, 请使用以下公式, 该公式也可从 usp bet 85 标准: mvd = (el x 样品浓度)) 4。在假设的情况下, 纳米颗粒样品浓度为 10 mgml, 其在小鼠体内的最大剂量为 615 mg/kg。在这种情况下, hed 为 615/12.3 = 50 mg/kg;除鞘内外, 所有路线的 el 为 0.1 eu/mg (5 eugsgsg/kg), mvd 为 1, 000 (0.1 euml x10 mg/mL)/0.001 eu/ml)。
通常情况下, 当需要评估研究级纳米材料中的内毒素污染时, 剂量信息是不可用的。对于如何估计这些材料的 mvd 和 el, 没有统一的程序。本案例研究直接从库存 (通常此溶液的浓度为 1 mgml) 和几次稀释, 通常为 5-、50、500和 5, 000倍进行测试。当给定的纳米材料的剂量、给药途径、样品浓度和输液时间发生变化时, el 和 mvd 也会发生变化。因此, 必须在与特定制剂的数量、时间、预期管理途径和浓度有关的其他参数的范围内评估 el 和 mvd 的信息并进行估计。
需要注意的是, cse 的产品目录号和产品规格 (例如, 效力、每个小瓶的数量) 对于不同的 lal 格式是不同的。在浊度 lal 中使用的 cse 也可以用于凝胶凝块 lal。然而, 用于显色性 lal 的 cse 是这种检测格式所特有的。下面提供的说明是通用的, 适用于所有检测格式中使用的 cse。cse 是一种大肠杆菌脂多糖 (lps), 作为冻干粉提供。本标准由制造商根据标准内毒素 (rse) 认证, 具有已知的效力。含有 cse 的小瓶中含有 ~ 3.2-5.0 ml 的无热性 lal 试剂水进行重组。除了用于不同检测格式的 cse 之间的差异外, 重组的体积也是这一标准的每一批都特有的。因此, 必须计算出每批标准的股票 cse 溶液的最终浓度。计算是根据标准的效力和每个小瓶中包含的量进行的。针对每批内毒素标准的分析证书包含有关每瓶的效力和数量的信息。无论是在重组过程中还是在使用过程中, 人们都必须严格地对标准进行 3 0-6 0秒的漩涡。还建议使用5-10 的沉降时间和超过30-60 的时间框架进行重组, 以确保所有冻干材料进入溶液。在使用前, 将 cse 库存平衡到室温。重组后, cse 库存可冷藏储存, 稳定四周。
与 cse 类似, lal 试剂也是针对每种格式的特定。下面提供的说明是通用的, 适用于所有 lal 检测格式。lal 试剂是作为冻干粉提供的。制造商的建议被遵循, 以重建每个小瓶。可以使用 lal 级的水或抑制β-葡聚糖的缓冲液。在本例中, 缓冲抑制β-葡聚糖是首选, 因为它允许排除β-葡聚糖的干扰。这种假阳性干扰在纳米材料中非常常见, 因为纤维素醋酸酯过滤器在纳米材料合成过程中经常使用, 并作为葡聚糖污染的来源.大多数小瓶将需要重建到最后的容量5毫升。根据作者在这一检测方面10多年的经验, 人们注意到, 这种缓冲液的加入会减慢反应速度, 并且可能需要增加仪器设置中的最大起始时间, 以便在浓度为 0.001 euml 开发。
为确保在标准制定过程中的准确稀释, 建议使用10倍稀释步骤。可通过将100μl 的库存或浓度较高的标准刺入900μl 的无热水来制备系列10倍稀释。由于 cse 库存的浓度通常很高 (~ 1, 000 eu/ml), 因此建议在制备浓度为 1 eu/ml 的测定校准器之前制备浓度为100和 10 eu/ml 的中间稀释剂。该协议描述了测试样品与裂解液之间的两个比率。尽管这两种比率都是常用的, 但当使用4:1 比和缓冲液抑制β-葡聚糖 (见材料表) 时, 曲线线性度是可以接受的, 但并不理想。
上述关于校准标准准备的规则也适用于质量控制 (qc) 的准备工作。这些控制用于验证检测是否正常工作。它是通过将已知的 cse 量刺入无热原水中而制备的。qc 的浓度通常选择在检测范围的中间。浊度 lal 测定的范围为0.001 至 1 eu/ml。因此, 使用浓度为 0.05 euml 的 qc。检测范围内的其他浓度也可用于质量控制的制备。
抑制增强控制 (iec) 也被称为阳性产品控制 (ppc)。它是通过将已知的 cse 浓度刺入测试样品来制备的。iec (ppc) 的浓度通常选择在检测范围的中间。浊度 lal 测定的范围为0.001 至 1 eu/ml。因此, 使用浓度为 0.05 euml 的 iec。为了制备这种 iec, 需要将 1个 euml cse 溶液的50μl 与950μl 的测试纳米粒子结合起来。iec 是为测试纳米材料的每次稀释而准备的。例如, 如果在三个稀释剂 (1:50、1: 500 和 1:5000) 下测试了纳米制剂, 则必须为这些稀释液中的每一种制备三个 iec。检测范围内的其他浓度也可用于制备 iec 样品。该控制用于了解给定纳米配方的测试结果的有效性。根据 usp, 如果 iec (ppc) 的峰值恢复在50% 到 200% 4 之间, 测试结果是有效的.尖刺回收率低于 50%, 这意味着测试纳米材料抑制内毒素检测, 因此, 测试结果低估了内毒素污染, 是无效的。穗回收率超过 200%, 表明测试材料增强了检测结果或含有过高的污染内毒素水平。在增强的情况下, 检测结果也是不准确的。这种干扰的例子和一些克服它们的方法已经描述了前面 12,15。
在执行浊度和色原性检测时, 建议使用中继器移液器将 lal 试剂添加到所有样品中。仪器平均运行时间为7200秒。然而, 反应可以更快或更慢与某些地段的裂解液。在这种情况下, 当反应缓慢时, 可能需要将仪器设置更改为9600s 或更长时间。此更改将允许开发最低的校准器。
聚乙二醇脂质体多沙比星是一种含有活性药物成分 (api) 的制剂, 浓度为 2 mg/ml。在临床上使用, 剂量为 50 mg/2.要将此剂量转换为 mg/kg 范围, 它除以因子 3727。因此, 聚乙二醇化脂质体的剂量为1.35。为了计算 el, 5 (以 eu/kg 为单位的阈值热原剂量) 除以 1.35 (以 mg/2 为多克的剂量), 并获得 3.7 eumg4。这一数字意味着, 如果制剂中的内毒素不超过 3.7 eumg/mg, 其中 mg 指的是原料药, 则每小时可安全地施用剂量为 1.35 mg/kg 的聚乙二醇化脂质体 doxorubicin。
接下来, 使用此信息计算 lal 检测的 mvd。本研究中提出的浊度、显色剂和凝胶-凝块检测的灵敏度分别为0.001、0.001 和 0.001 eu/ml。因此, mvd 在浊度和显色性检测中为 7 407 (5 eu/2 kx 2 mg/mL)/0.001 EU/kg), 在凝胶夹层检测中为 247 (5 eu/kg x 2 mg/mL)/0.03 EU/kg)。
多索比星具有广泛的吸收光谱, 与色原 lal 28,29 的分析波长重叠。此外, 大多数脂质体配方都是浑浊的, 显得乳白色。这种固有的浊度是脂质体干扰浊度的常见原因。在聚乙二醇脂质体的情况下, 通过稀释5克服了浊度引起的干扰, 尖峰恢复值在50% 到200% 之间就证明了这一点 (表 1)。然而, 在相同的稀释剂量多索霉素浓度仍然足够高, 足以干扰色素性 lal (表 1)。随后的两次稀释 (50 和 500) 有助于克服聚乙二醇化脂质体对色素性 lal 的干扰。由于凝胶凝块法与浊度和样品颜色无关, 且配方中的内毒素水平在凝胶凝块范围内, 因此在所有测试稀释液中, 聚乙二醇脂质体多索比星都不干扰凝胶凝块测定。在本案例研究中, 对聚乙二醇脂质体多索比星进行了多次稀释。选择了浊度和显色性的稀释5、50和500以及凝胶凝块测定的50、100和200稀释剂, 因为它们在 mvd 中。凝胶凝块试验的 mvd 低于浊度和显色性 lals, 因为该检测的灵敏度也较低。如果配方在浊度和显色性稀释500处干扰了 lal, 则可以在较高的稀释 (例如 5 , 000、6, 000、7, 000 或 7 407) 下进行分析。由于凝胶凝块测定稀释50时获得的内毒素水平低于 el, 因此在较低稀释时没有对该制剂进行分析。然而, 在其他情况下, 可以继续在稀释 20, 10, 5 或 2, 以确定最低的不干扰稀释, 并了解配方中的内毒素水平是否低于 el。
重要的是要提到, 对于凝胶凝块检测, 在这种检测期间关闭水浴中的水循环功能或在没有这种选择的情况下使用水浴是至关重要的, 因为水流会破坏凝块, 并可能影响 g 的准确性l-血块拉尔分析。通过增加样品稀释, 并不总是能够克服纳米颗粒对 lal 检测的干扰。其他团体和我们在其他地方讨论了克服各种干扰的策略和一些方法, 以及通常代表lal 检测问题的纳米粒子的例子 ,15,30,31。本手稿中的分析是基于模型的制定。与其他纳米配方的经验可能不同。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家癌症研究所联邦基金的支持, 该研究的合同是 HHSN261200800001E。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策, 提及商品名称、商业产品或组织也不一定意味着美国政府的认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Turbidity LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
| Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
| Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
| Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
| Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
| Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
| Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
| Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
| Vortex | any brand | Any brand can be used | |
| Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
| Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |
References
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