Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

Detectie van endotoxines in technisch vervaardigde nanomaterialen vertegenwoordigt een van de grote uitdagingen op het gebied van de nanogeneeskunde. Hier, presenteren we een case-studie die het kader bestaat uit drie verschillende LAL formaten beschrijft te schatten van potentiële endotoxine besmetting in nanodeeltjes.

Abstract

Indien aanwezig in farmaceutische producten, een gramnegatieve celwand component endotoxinen (vaak ook genoemd lipopolysaccharide) kan leiden tot ontsteking, koorts, hypo- of hypertensie, en, in extreme gevallen, kan leiden tot weefsel- en orgaanbanken schade die kan fataal geworden. De bedragen van endotoxinen in farmaceutische producten, zijn daarom streng gereglementeerd. Onder de beschikbare methoden voor endotoxine detectie en kwantificering, is de bepaling Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) gebruikte wereldwijd. Terwijl een farmaceutisch product met de LAL-test interfereren kan, vormen nano-formuleringen een bijzondere uitdaging vanwege hun complexiteit. Het doel van deze paper is om een praktische gids voor onderzoekers onervaren bij het schatten van endotoxines in technisch vervaardigde nanomaterialen en nanoparticle geformuleerde drugs. Praktische aanbevelingen voor het uitvoeren van drie LAL formaten met inbegrip van de troebelheid, chromogenic en gel-clot vitrotests worden hierin besproken. Deze tests kunnen worden gebruikt om te bepalen van endotoxine besmetting in nanotechnologie gebaseerde geneesmiddelen, vaccins en hulpstoffen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een Endotoxine is een bouwsteen van de gram-negatieve bacteriële celwand1,2. Het kan activeren de immuuncellen bij zeer lage (picogram) concentraties1,2. De proinflammatoire bemiddelaars (cytokines leukotriënen, eicosanoïden, etc.) geproduceerd door de cellen in reactie op een endotoxine zijn verantwoordelijk voor koorts, hypotensie, hypertensie en meer ernstige gezondheidsproblemen met inbegrip van meerdere orgaanfalen 1 , 2 , 3. de ernst van de immuun-gemedieerde bijwerkingen veroorzaakt door het Endotoxine is afhankelijk van de sterkte bepaald door de endotoxine samenstelling en structuur en gemeten in internationale endotoxine eenheden (IUs of EUs)3. Het nummer van deze eenheden per kilogram lichaamsgewicht wordt gebruikt om een drempel pyrogene dosis van endotoxinen. Deze dosis is dat 5 EU/kg voor geneesmiddelen toegediend via alle routes maar de intrathecale weg. Drugs toegediend per vierkante meter lichaamsoppervlak, intraoculaire vloeistoffen, radiofarmaceutica en producten door de overheid gereguleerde via de route van de intrathecale hebben een verschillende drempel pyrogene dosis, oftewel 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (waar V is de volume van het product dat bestemd is voor beheerdoeleinden), en 0.2 EU/kg, respectievelijk4. Meer details over de drempel pyrogene dosis voor verschillende geneesmiddelen en apparaten worden geleverd en elders besproken4,5,6.

Dieren verschillen sterk in hun gevoeligheid voor endotoxine-gemedieerde reacties. Mens, niet-menselijke primaten en konijnen behoren tot de meest gevoelige endotoxines3soorten. Om te vermijden endotoxine-gemedieerde bijwerkingen bij patiënten en voorkomen dat onjuiste conclusies van preklinische toxiciteit en werkzaamheid studies, is het essentieel om nauwkeurig detecteren en kwantificeren van endotoxines in beide formuleringen van de klinische en preklinische rang. Deze taak kunnen worden bereikt door verschillende beschikbare methoden. Een van hen is de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay, waarmee vaak wereldwijd scherm biomedische producten voor de potentiële endotoxine verontreiniging alsmede over het detecteren van bacteriële infecties7,8,9. De lysate wordt bereid uit amoebocytes, de cellen in het bloed van horseshoe krabben Limulus polyphemus presenteren die woonachtig zijn in de oostelijke oever van het continent van Noord-Amerika7. Interessant, er zijn een paar verschillende soorten van horseshoe krabben (Tachypleus gigas en Tachypleus tridentatus) in Asia10. Het Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) wordt gebruikt in verscheidene Aziatische landen voor de detectie van endotoxinen vergelijkbaar met hoe de LAL wordt gebruikt in andere cuntries10. De lysates (LAL en TAL) bevatten een groep eiwitten die na activatie protease-activiteit verlenen. Één van deze eiwitten, de zogenaamde Factor C wordt geactiveerd bij contact met endotoxine. Geactiveerd Factor C cleaves Factor B, die op zijn beurt ook een protease wordt en een pro-stolling enzym te produceren een bloedstolling enzym cleaves. Het resultaat van deze keten van reacties is de vorming van een gel, een toename van de troebelheid van het monster en, in de aanwezigheid van een chromogenic substraat, het uiterlijk van een gekleurd product, die dienen als basis voor gel-clot, troebelheid en chromogenic testen respectievelijk. Terwijl er geen verplichte LAL notatie, is de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) wordt uitgelegd in het richtsnoer voor de industrie document, dat in geval van discrepantie in de testresultaten tussen verschillende LAL formaten, de beslissing is gemaakt op basis van de gel-clot assay5 .

Veel gebruikte laboratorium chemische stoffen (bijv., EDTA) en bekende drug producten (bijvoorbeeld penicilline) met LAL interfereren testen11. De storing wordt meestal aangeduid met de beoordeling van het herstel van het endotoxine standaard verrijkt met een bekende concentratie in een oplossing die met het testmateriaal. Als het herstel van de spike is minder dan 50% of meer dan 200%, dan het resultaat van de LAL assay voor is het gegeven testmateriaal ongeldig zijn wegens de remming of verbetering, respectievelijk4. Nanotechnologie gebaseerde formuleringen zijn vaak complex en interfereren met de LAL via allerlei mechanismen12,13,14. Vele benaderingen zijn beschreven om te overwinnen de interferentie: monster reconstitutie in specifieke buffers en oppervlakteactieve stoffen, eiwit geïnactiveerd door Verwarming, vernietiging van lipide gebaseerde holle materialen door verwarming en tot aanvulling van het monster met overmaat divalente kationen5,12,13,14,15. Alternatieve methoden voor situaties wanneer LAL interferentie niet overwonnen kan worden zijn ook beschreven: ELISA, een HEK-TLR4 verslaggever cel lijn assay en massaspectrometrie16,17,18, 19.

Hierin, worden experimentele procedures voor het uitvoeren van de gel-clot, troebelheid en chromogenic LAL testen beschreven. Deze tests zijn ook beschikbaar op de nanotechnologie karakterisering Lab (NCL) website20 in protocollen STE1.2 (troebelheid LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) en STE1.4 (chromogenic LAL). Het wordt aanbevolen om ten minste twee verschillende formaten dezelfde nano-formulering karakteriseren. Wanneer de resultaten van de turbiditeit en chromogenic LAL oneens zijn, zijn de resultaten van de gel-clot5beschouwd. Wanneer de resultaten van twee LAL formaten oneens, aanvullende studies met ofwel monocyt activering test (MAT) of konijn pyrogeen (RPT) om te controleren of de LAL bevindingen zijn uitgevoerd21. Het is belangrijk op te merken dat elke methode voor de detectie van endotoxinen gebruikt en pyrogene beoordeling voordelen en beperkingen21,22,23,24 heeft. Herkennen van beperkingen van de procedure die is gebruikt voor het karakteriseren van de formulering van een bepaalde nanotechnologie is essentieel voor het verkrijgen van wetenschappelijke rechtvaardiging voor het gebruik van de procedure die optimaal is voor die nano-formulering.

In deze studie, werd gepegyleerde Liposomale Doxorubicine gebruikt als een model nanoparticle formulering. Deze formulering is in 1995 goedgekeurd door de US FDA en gebruikt voor de behandeling van kanker patiënten wereldwijd25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. bereiding van Nanoparticle monsters

  1. Voorbereiding van het monster studie in LAL rang water.
  2. Als de pH van de steekproef buiten het bereik van 6-8 is, breng de pH met behulp van natriumhydroxide pyrogeen-vrije of zoutzuur.
  3. Met behulp van LAL rang water Maak verschillende verdunningen van het monster studie. Zorg ervoor dat de hoogste verdunning maximale geldige verdunning (MVD) niet overschrijdt. Raadpleeg de sectie discussie voor meer informatie over MVD schatting.

2. voorbereiding van reagentia gemeenschappelijk tussen LAL formaten

  1. Verdunnen van de geconcentreerde natriumhydroxide-voorraad met behulp van pyrogeen-vrije LAL reagens water te bereiden een werkende oplossing bij een concentratie van 0,1 N.
  2. Verdunnen van geconcentreerd zoutzuur voorraad met behulp van pyrogeen-vrije LAL reagens water en bereiden een werkoplossing in een eindconcentratie van 0,1 N.
  3. Voorbereiding van het besturingselement standaard endotoxine (CSE)
    1. Het reconstrueren van de CSE volgens het certificaat van analyse door de fabrikant geleverd.
      Opmerking: Raadpleeg de sectie discussie voor belangrijke opmerkingen met betrekking tot de informatie in het certificaat. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor de details met betrekking tot catalogusnummer en toepassing van een bepaalde CSE formulering in verschillende LAL formaten.
  4. Bereiding van het reagens LAL
    1. Reconstrueren de LAL reagens volgens het certificaat van analyse die door de fabrikant.
      Opmerking: Raadpleeg de sectie discussie voor belangrijke informatie over LAL reagens voorbereiding. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor de details met betrekking tot catalogusnummer en toepassing van een bepaalde LAL reagens formulering in andere LAL indeling.

3. troebelheid LAL Assay

  1. Opstelling van de normen van de kalibratie
    1. Met behulp van 900 µL van LAL rang water en 100 µL van CSE, maak zo veel tussenliggende verdunningen zo nodig om de voorbereiding van een ijkstandaard met een concentratiebereik van 0.001 tot 1 EU/mL.
    2. Eerste label buizen en 900 μL van LAL-grade water toe te voegen in elke buis. Dan Voeg 100 μl van 10 EU/mL solutionn ter voorbereiding van de ijkstandaard met concentratie van 1EU/mL.
    3. Herhaal de seriële 10-fold verdunning zoals hierboven beschreven te bereiden drie lagere normen van de kalibratie. Controleer of dat vier kalibratie standaarden variërend van 0.001 tot 1 EU/mL zijn opgesteld.
  2. Voorbereiding van de kwaliteitscontroles
    1. Bereiden een 0,05 EU/mL kwaliteitscontrole door het combineren van 50 µL van de 1 EU/mL CSE-oplossing met 950 µL LAL-grade water.
      Opmerking: Raadpleeg de sectie discussie voor details met betrekking tot de voorbereiding van de controle.
  3. Voorbereiding van de remming/toebehoren (IEC) controles
    1. Bereiden IEC met concentratie 0,05 EU/ml door 25 µL van de 1 EU/mL CSE-oplossing en 475 µL van het nanomateriaal test bij een bepaalde verdunning te combineren.
      Opmerking: Raadpleeg de sectie discussie voor meer informatie.
  4. Experimentele procedure
    1. Het toestaan van het instrument om op te warmen door draaien op ongeveer 30 min vooraf. Set-up de golflengte van de detectie tot 660 nm als dit is geschikt voor de troebelheid LAL.
    2. Melden door de gebruikersnaam en wachtwoord te typen.
    3. Open de software (Tabel van materialen) door te klikken op het bijbehorende pictogram op een computerscherm.
    4. Selecteer gegevens verzamelen op het huisscherm van software. Voer de test-ID en gegevens de gegevens van de groep in de desbetreffende ruimte op het tabblad Algemeen op het huisscherm.
    5. Klik op het tabblad Hardware . Kies het type instrument uit een dropdownmenu.
    6. Set-up de golflengte van de detectie tot 660 nm als dit is geschikt voor de troebelheid LAL door kiezen de LAL troebelheid methode.
    7. Controleer of een serienummer, de systeem-ID en de seriële poortinformatie op het scherm weergegeven. Klik op OK. Klik nogmaals op OK om te bevestigen.
    8. Voer de monster-ID in dezelfde volgorde als die het monster wordt getest. Gebruik standaardknoppen voor de negatieve controle, de standaard curve en test samples.
    9. Dubbele buizen voorbereiden op elk monster en voeg 200 µL (test ratio 4:1) of 100 µL (test verhouding 1:1) negatieve controle (water), kalibratie standaarden, kwaliteitscontrole, IEC en test nanodeeltjes in vooraf gelabelde glazen buizen.
    10. 50 µL (test ratio 4:1) of 100 µL (test verhouding 1:1) LAL reagens toevoegen aan de eerste test injectieflacon, vortex het kort en invoegen in test-sleuf in de carrousel instrument. Als de verhouding van 1:1 wordt gebruikt, is het volume van het reagens LAL 100 µL.
    11. Herhaal de procedure die hierboven wordt beschreven voor andere monsters. Proces monsters één filter tegelijk.
      Opmerking: Raadpleeg de sectie discussie voor meer details.

4. chromogenic LAL

  1. Voorbereiding van kalibratie standaarden
    1. Met behulp van 900 µL van LAL rang water en 100 µL van CSE, maak zo veel tussenliggende verdunningen zo nodig om de voorbereiding van een ijkstandaard met een concentratie van 1 EU/mL.
    2. Met behulp van 900 µL LAL-grade water en 100 µL van de 1 EU/mL ijkstandaard, bereiden een tweede ijkstandaard bij een concentratie van 0,1 EU/mL.
    3. Herhaal de seriële 10-fold verdunning zoals hierboven beschreven te bereiden twee lagere normen van de kalibratie. Controleer of dat vier kalibratie standaarden variërend van 0.001 tot 1 EU/mL zijn opgesteld.
  2. Voorbereiding van kwaliteitscontroles.
    1. Bereiden een 0,05 EU/mL kwaliteitscontrole door het combineren van 50 µL van de 1 EU/mL CSE-oplossing met 950 µL LAL-grade water.
      Opmerking: Raadpleeg de sectie discussie voor details met betrekking tot de voorbereiding van de controle.
  3. Voorbereiding van de remming/toebehoren (IEC) controles
    1. 0,05 EU/mL voor te bereiden door het combineren van 25 μL van de 1 EU/mL CSE-oplossing met 475 μL van test nanomateriaal.
      Opmerking: Raadpleeg de sectie discussie voor meer informatie.
  4. Experimentele procedure
    1. Het toestaan van het instrument om op te warmen door draaien op ongeveer 30 min vooraf. Set-up de golflengte van de detectie tot 405 nm als dit is geschikt voor de troebelheid LAL.
    2. Open de software door te klikken op het bijbehorende pictogram op een computerscherm. Melden door de gebruikersnaam en wachtwoord te typen.
    3. Selecteer gegevens verzamelen op het huisscherm van software. Test-ID en gegevens groepsinformatie aangaan met bijbehorende ruimte op het tabblad Algemeen op het huisscherm.
    4. Klik op het tabblad Hardware . Kies het type instrument uit een dropdownmenu. Het instrument kiezen.
    5. Controleer of een serienummer, de systeem-ID en de seriële poortinformatie op het scherm weergegeven. Klik op OK. Klik nogmaals op OK om te bevestigen.
    6. Voer de monster-ID in dezelfde volgorde als die het monster wordt getest. Gebruik van standaardknoppen om negatieve controle, standaard curve en test monsters.
    7. Dubbele buizen voorbereiden op elk monster en voeg 200 µL (test ratio 4:1) of 100 µL (test verhouding 1:1) negatieve controle (water), kalibratie standaarden, kwaliteitscontrole, IEC en test nanodeeltjes in vooraf gelabelde glazen buizen.
    8. 50 µL (test ratio 4:1) of 100 µL (test verhouding 1:1) LAL reagens toevoegen aan de eerste test injectieflacon, vortex het kort en invoegen in test-sleuf in de carrousel instrument. Als de verhouding van 1:1 wordt gebruikt, is het volume van het reagens LAL 100 µL.
    9. Herhaal de procedure die hierboven wordt beschreven voor andere monsters. Proces monsters één filter tegelijk.

5. gel-Clot LAL

Opmerking: Deze test identificeert de aanwezigheid van endotoxines in het monster gebaseerd op de visuele waarneming en detectie van een klonter in de reactiebuis. De experimentele stappen worden hieronder beschreven. Gebruik een bankje blad wilt opnemen van de resultaten. Dit blad van de Bank is niet verplicht, en andere manieren voor het opnemen van de test-resultaten zijn ook aanvaardbaar. Een voorbeeld van dergelijke een blad van de Bank wordt geleverd in aanvullende materialen voor het gemak van een lezer. Lambda (l) is de gevoeligheid van de gel-clot-assay en 0.03 EU/mL.

  1. Label zoveel reactie buizen zo nodig aangepast aan het aantal geanalyseerde monsters. Verwijzen naar het blad van de Bank voor meer informatie over het aantal replicatieonderzoeken gebruikt in stap 1, stap 2 en 3 van de bepaling.
  2. Aliquot 100 μl van water, besturingselementen of test sample per buis.
  3. Bereiden CSE zodanig dat de eindconcentratie gelijk aan 4λ is.
  4. Combineren van 100 μl van de standaard met 100 μl van water of test monster te bereiken de uiteindelijke concentratie van CSE van 2λ hierboven vermeld. Herhaal drie keer tot lambda en half-lambda en een kwart lambda.
  5. Zorg ervoor dat de temperatuur in het waterbad 37 ° C.
  6. Voeg 100 μl van lysate per reageerbuis, vortex kort en plaats het rek met alle de buizen in het waterbad gedurende 1 uur.
  7. Omkeren van de buis met een vloeiende beweging.
  8. Handmatig recordresultaten met "+" (stevige clot) of "-" (geen clot of losse clot) op het blad van de Bank.
  9. Doorgaan met de analyse uit volgens de USP inzet 854; het blad van de bench gebruiken als ondersteunend materiaal

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het voorbeeld van gegevens die zijn gegenereerd na het testen van deze formulering in LAL assays wordt weergegeven in tabel 1. Gepegyleerde Liposomale Doxorubicine bemoeid met chromogenic LAL bij verdunning 5. Echter, deze bemoeienis werd overwonnen door grotere verdunningen. Spike herstel was tussen 50 en 200% wanneer deze formulering werd getest in de verdunningen 50 en 500 in turbiditeit en chromogenic LAL, evenals bij verdunning 5 in turbiditeit LAL. Wanneer aangepast door de verdunningsfactor, waren de resultaten consistent tussen verdunningen in beide testen. Bovendien, de resultaten waren consistent tussen de drie assay-indelingen.

Monster Troebelheid LAL, EU/mg (spike herstel, %) Chromogenic LAL, EU/mg, (spike herstel, %) Gel-clot LAL, EU/mg (test geldig, ja of Nee)
Gepegyleerde Liposomale Doxorubicine (Zie de tabel van materialen)
Verdunning 5 0,01 (141) interferentie < 0,75 (Y)
Verdunning 50 < 0,025 (187) 0.029 (82) < 1.5 (Y) *
Verdunning 500 < 0,25 (182) < 0,25 (86) < 3 (Y) **

Tabel 1: detectie van endotoxinen in gepegyleerde Liposomale Doxorubicine met behulp van LAL testen. Gepegyleerde Liposomale Doxorubicine werd getest met behulp van de turbiditeit, chromogenic en gel-clot LAL testen. Monster inmenging was geschat aan de hand van de ICES. Spike herstel wordt tussen haakjes weergegeven. Waarden tussen 50 en 200% worden beschouwd als aanvaardbaar volgens de USP inzet 85 standaard voor endotoxine detectie4. * en ** de testresultaten van dit monster werden verkregen in verdunningen 100 en 200, respectievelijk. De gel-clot assay verdunningen verschillen van die welke worden gebruikt in chromogenic en troebelheid LAL omdat gevoeligheid en maximale geldige verdunning van deze test lager zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De informatie in dit protocol is beschreven voor15,26 en vertrouwt op verschillende regelgevende documenten gepubliceerd door de Amerikaanse Food en Drug Administration (US FDA of FDA), Amerikaanse Farmacopee (USP)4 , 5 , 6 , 27, en is tevens beschikbaar op de website NCL20 in protocollen STE1.2 (troebelheid LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) en STE1.4 (chromogenic LAL).

Test-nanomaterialen worden bereid in LAL reagens water of steriele, pyrogeen-gratis PBS. De pH van de monster studie is belangrijk omdat lage (< 6) en hoog (> 8) pH met de optimale prestaties van de lysate interfereren zal. Als de pH van de test-nanoparticle buiten het bereik van 6-8 is, kan het worden aangepast met behulp van natriumhydroxide pyrogeen-vrije of zoutzuur. Wanneer dergelijke aanpassing wordt uitgevoerd, is het onontbeerlijk om verontreiniging van de steekproef van micro-elektrode te voorkomen. Dus, voor het uitvoeren van deze procedure, is een kleine hoeveelheid van het monster in een aparte buis verwijderd en gebruikt voor het meten van de pH.

Wanneer het monster wordt voorbereid in PBS of een andere buffer, wordt de lege buffer is ook opgenomen in deze test. De concentratie van elke nanomateriaal is geval-specifiek. De test wordt gebruikt om te schatten hoeveel besmetten Endotoxinen per milligram de actieve farmaceutische ingrediënten (API). Echter, afhankelijk van het type van nano-formulering, de concentratie kan ook worden geschat in mg van de totale formulering of het totale element (bv., goud, zilver of ijzer voor goud, zilver en ijzeroxide nanodeeltjes, respectievelijk). Het monster wordt getest uit de voorraad die met behulp van verschillende verdunningen niet meer dan de MVD. Alle verdunningen van het test-nanodeeltjes zijn opgesteld op basis van LAL-grade water.

Drie parameters worden gebruikt voor het berekenen van de MVD. Zij zijn de endotoxine limiet (EL), de concentratie van het monster en de assay gevoeligheid (λ)4. Gebruik de volgende formule voor het berekenen van endotoxinen limiet (EL): EL = K/M, waar K een drempel pyrogeen dosis is (bv., 5 EU/kg zoals besproken in de inleiding) en M is de maximale dosis van de test nanomateriaal bestemd voor de administratie per kilogram lichaam gewicht in een één uur4. Zoals hierboven is besproken, de schatting van EL voor nanomaterialen gebruikt als radiofarmaceuticum of als medisch hulpmiddel is gebaseerd op een drempel pyrogene dosis of formule, die verschilt van 5/M. Deze gegevens zijn vermeld in de inleiding en kunnen worden herzien in de USP en US FDA richtlijnen4,5,6. De aanbevolen endotoxine limiet voor oogheelkundige oplossingen en intraoculaire apparaten vindt u in de US FDA richtsnoer voor deze producten6. Wanneer een dierlijk model (bv., muis) werd gebruikt om de dosis van nanoformulation, deze informatie wordt gebruikt om te schatten van de zogenaamde menselijke equivalente dosis (HED). De HED is berekend door de dierlijke dosis door een conversiefactor, die specifiek is voor elke diersoort. Bijvoorbeeld, is de omrekeningsfactor 12.3, 6.2 en 3.1 voor de muis, de rat en het konijn, respectievelijk27. De omzettingsprocedure en de motivering voor het gebruik ervan worden beschreven in detail in de US FDA richtsnoer27. Therapeutiek van kanker zijn vaak gedoseerd per oppervlakte lichaamszone uitgedrukt in mg/m2. Een kan volgen de USP richtsnoer voor het berekenen van EL voor drugs gedoseerd in milligram per vierkante meter of deze dosis omzetten in mg/kg bereik. De dosis in mg/m2 kan worden aangepast aan de dosis in mg/kg met een soortspecifieke conversiefactor27. Voor een volwassen mens is het 37 en aangegeven als K,m om te verwijzen naar de massa constante27. De km-factor heeft eenheden van kg/m2; het is gelijk aan het lichaamsgewicht in kilogram (kg) gedeeld door de oppervlakte in vierkante meters (m2),27. Bijvoorbeeld, een humane dosis of HED 74 mg/m2 komt overeen met 2 mg/kg of 74/37. Om te bepalen MVD, gebruik de volgende formule, die ook beschikbaar via de standaard USP inzet 85 is: MVD = (EL x monster concentratie) / λ)4. In een hypothetische scenario, een nanoparticle monster concentratie is 10 mg/mL en de maximale dosis in de muis is 615 mg/kg. In dit geval is de HED 615/12,3 = 50 mg/kg; EL voor alle routes behalve intrathecale is 0.1 EU/mg (5 EU/kg/50 mg/kg) en MVD is 1.000 ((0.1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 EU/mL).

Vaak, wanneer men evalueren endotoxine besmetting in een onderzoek rang nanomateriaal moet, is de dosis-informatie niet beschikbaar. Er is geen geharmoniseerde procedure voor hoe te schatten van het MVD en EL voor deze materialen. Deze case studie Hiermee voert u de test direct uit voorraad (meestal de concentratie van deze oplossing is 1 mg/mL) en bij verschillende verdunningen, meestal 5, 50, 500- en 5000-plooien. Als de dosering, de wijze van toediening, de concentratie van het monster en de infusie tijd voor de gegeven test nanomateriaal verandering, de EL en MVD ook gewijzigd. Daarom moet de informatie evalueren en schatting van EL en MVD uitvoeren in het kader van andere parameters die betrekking hebben op het bedrag, de tijd, beoogde vorm van toediening en concentratie van de gegeven formulering.

Het is belangrijk op te merken dat het catalogusnummer en de productspecificaties (bv., potentie, bedraagt per flacon) van de CSE zijn verschillend voor verschillende LAL formaten. Het CSE in turbiditeit die Lal kan ook worden gebruikt in een gel-clot LAL gebruikt. Het CSE voor een chromogenic LAL is echter specifiek voor deze bepaling-indeling. De onderstaande instructies zijn algemene en van toepassing op het CSE in alle assay formaten gebruikt. Het CSE is een E. coli lipopolysaccharide (LPS) geleverd als een gelyofiliseerd poeder. Deze standaard is gecertificeerd door de fabrikant tegen een referentie standaard endotoxinen (RSE) met een bekende werkzaamheid. De inhoud van de flacon met CSE moeten opnieuw worden samengesteld met ~3.2 - 5,0 mL van het pyrogeen-vrije LAL reagens water. Naast het verschil tussen CSE gebruikt voor de bepaling van de verschillende formaten, is de hoeveelheid reconstitutie ook specifiek voor elke partij deze standaard. Daarom heeft men voor de berekening van de uiteindelijke concentratie van de stockoplossing van de CSE voor elke partij van de standaard. De berekening wordt uitgevoerd op basis van de sterkte van de standaard en het bedrag dat is opgenomen in elk flesje. Het certificaat van analyse specifiek voor elke partij endotoxine standaard bevat informatie over de potentie en het bedrag per flacon. Men moet strikt vortex de norm voor 30-60 seconden, zowel tijdens de reconstructie en tijdens het gebruik. Het is ook aanbevolen om het herstel met behulp van 5-10 min afwikkeling keer uitvoeren en over een 30-60 min tijd frame om ervoor te zorgen dat alle materiaal gelyofiliseerd gaat in oplossing. Equilibreer voordat u in de test, de voorraad CSE tot kamertemperatuur. Na de reconstitutie, de CSE voorraad kan worden gekoeld voor opslag en is stabiel gedurende vier weken.

Gelijkaardig aan het CSE, de LAL reagens is ook specifiek voor elk formaat. De onderstaande instructies zijn algemene en van toepassing op alle LAL assay formaten. De LAL reagens wordt geleverd als een gelyofiliseerd poeder. Aanbevelingen van de fabrikant worden gevolgd om te reconstrueren elke flacon. LAL rang water of buffer remming van de bèta-glucanen in het dieet kan worden gebruikt. De buffer remming van de bèta-glucanen in het dieet bij voorkeur wordt in deze case-studie omdat hierdoor de inmenging uitsluiten voor beta-glucanen in het dieet. Deze vals-positieve inmenging is heel gebruikelijk in nanomaterialen omdat cellulose-acetaat filters meestal tijdens nanomateriaal synthese gebruikt worden en als een bron van glucan besmetting15 fungeren. De meeste flesjes vergt reconstitutie tot een eindvolume van 5 mL. Gebaseerd op meer dan 10 jaar de auteurs ervaring met deze test, het is opgevallen dat de opneming van deze buffer de reactie vertraagt en steeds meer maximale intreden in de instrumentele instellingen vereisen kan waarmee de laagst kalibrator op een concentratie van 0,001 EU/mL te ontwikkelen.

Om ervoor te zorgen nauwkeurige verdunning tijdens de opstelling van normen, is het aanbevolen 10-fold verdunning stappen uit te voeren. Seriële 10-fold verdunningen kunnen bereid worden door blancobepalingen 100 µL van de voorraad of een standaard met een hogere concentratie in 900 µL van het pyrogeen-gratis water. Omdat de concentratie van de CSE-voorraad meestal is hoog (~ 1.000 EU/mL), voorbereiding van de tussentijdse verdunningen met concentraties 100 en 10 EU/mL wordt aanbevolen voor de voorbereiding van de kalibrator van de test met een concentratie van 1 EU/mL. Twee verhoudingen tussen het monster en lysate worden beschreven in dit protocol. Hoewel beide ratio's meestal gebruikt zijn, is de kromme lineariteit aanvaardbaar, maar niet ideaal wanneer de verhouding 4:1 en de buffer remming van de bèta-glucanen (Zie de Tabel van materialen) worden gebruikt.

Dezelfde regels zoals hierboven beschreven met betrekking tot de kalibratie standaard voorbereiding ook van toepassing op de voorbereiding van de kwaliteitscontrole (QC). Deze besturingselementen worden gebruikt om te verifiëren dat de test correct functioneert. Het wordt bereid door de bekende hoeveelheid CSE in het water pyrogeen-gratis stekelige. De concentratie van QC wordt meestal gekozen in het midden van het bereik van de bepaling. Het bereik van de troebelheid LAL-test is 0.001 tot 1 EU/mL. Daarom wordt een QC bij een concentratie van 0,05 EU/mL gebruikt. Andere concentraties binnen het bereik van de test kunnen ook worden gebruikt bij de voorbereiding van de controle op de kwaliteit.

De remming verbetering controle (IEC) is ook bekend als positieve productcontrole (PPC). Het wordt bereid door stekelige een bekende concentratie van CSE in het monster. De concentratie van IEC (PPC) wordt meestal gekozen in het midden van het bereik van de bepaling. Het bereik van de troebelheid LAL-test is 0.001 tot 1 EU/mL. Daarom is de IEC bij een concentratie van 0,05 EU/mL gebruikt. Ter voorbereiding van deze IEC moet combineren 50 µL van de 1 EU/mL CSE-oplossing met 950 µL van test-nanoparticle. De IEC is voorbereid op elke verdunning van een test-nanomateriaal. Bijvoorbeeld, als een nano-formulering is getest bij drie verdunningen (1:50, 1:500 en 1:5, 000), heeft een te bereiden drie ICES, één voor elk van deze verdunningen. Andere concentraties binnen het bereik van de test kunnen ook worden gebruikt ter voorbereiding van het IEC-monster. Deze knop wordt gebruikt om te begrijpen van de geldigheid van de testresultaten voor de gegeven nano-formulering. Volgens de USP zijn de test-resultaten geldig indien het herstel van de piek van IEC (PPC) tussen de 50 en 200%4 is. Spike herstel, minder dan 50% betekent dat de test-nanomateriaal endotoxine detectie en dus de test remt leiden tot onderschat endotoxine besmetting en is ongeldig. Spike herstel meer dan 200% suggereert dat het testmateriaal het resultaat van de test verbetert of een te hoog niveau van de besmettende endotoxine bevat. In het geval van verhoging is het resultaat van de test ook onjuist. Voorbeelden van dergelijke storingen en enkele manieren voor het overwinnen van hen geweest beschreven eerdere12,15.

Bij het uitvoeren van de turbiditeit en chromogenic testen, is het aanbevolen om het gebruik van een repeater Pipet toe te voegen van het reagens LAL aan alle monsters. De gemiddelde instrument bewerkingstijd is 7200 seconden. De reactie kan echter sneller of langzamer met bepaalde veel de lysate. In gevallen wanneer de reactie traag is, wellicht een de instrumentele instellingen wijzigen om 9600s of langer. Deze wijziging zal toestaan de laagst kalibrator te ontwikkelen.

Gepegyleerde Liposomale Doxorubicine is een formulering die een actief farmaceutisch ingrediënt (API) met een concentratie van 2 mg/mL bevatten. Het wordt gebruikt in de kliniek als een dosis van 50 mg/m2. Als u wilt deze dosis omzetten in mg/kg bereik, wordt het gedeeld door factor 3727. De dosis van de liposomale Doxorubicine gepegyleerde in mg/kg, daarom 1.35. Als u wilt berekenen EL, 5 (de drempel pyrogeen dosis in EU/kg) wordt gedeeld door 1.35 (de dosis van het Doxil in mg/kg) en 3.7 EU/mg4te verkrijgen. Dit getal betekent dat de liposomale Doxorubicine gepegyleerde bij de dosis van 1,35 mg/kg kan worden veilig beheerd per één uur als endotoxinen in de formulering 3.7 EU/mg, waarbij mg verwijst naar de API niet overschrijdt.

Deze informatie vervolgens gebruiken voor het berekenen van het MVD voor LAL testen. De gevoeligheid (lambda) van de troebelheid, chromogenic en de gel-clot vitrotests gepresenteerd in deze studie is 0,001, 0,001 en 0.03 EU/mL, respectievelijk. MVD daarom 7,407 voor turbiditeit en chromogenic testen ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 EU/mL), en 247 voor de gel-clot assay ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 EU/mL).

Doxorubicine heeft een brede absorptie-spectrum dat wordt overlapt door assay golflengte van de chromogenic LAL28,29. Bovendien, de meeste liposoom formuleringen zijn troebel en verschijnen melkachtig. Dit inherente troebelheid is de veel voorkomende reden voor de inmenging van liposomen met troebelheid test. In het geval van gepegyleerde Liposomale Doxorubicine, werd de storing als gevolg van de troebelheid overwonnen door verdunning vijf blijkens de spike herstel waarden tussen 50 en 200% (tabel 1). Op de dezelfde verdunning Doxorubicine, was echter de concentratie nog hoog genoeg te bemoeien met de chromogenic LAL (tabel 1). Twee opeenvolgende verdunningen (50 en 500) bijgedragen tot het overwinnen van gepegyleerde Liposomale Doxorubicine interferentie met chromogenic LAL. Aangezien de gel-clot-bepaling onafhankelijk van de turbiditeit en voorbeeldkleur is, en het niveau van endotoxinen in de formulering binnen het bereik van de gel-clot is, de gepegyleerde Liposomale Doxorubicine niet bemoeien met de gel-clot-bepaling op alle geteste verdunningen. In deze case studie, werden verschillende verdunningen van gepegyleerde Liposomale Doxorubicine gebruikt voor deze tests. De verdunningen 5, 50 en 500 voor turbiditeit en chromogenic evenals 50, 100 en 200 voor de gel-clot-assay werden gekozen omdat ze binnen de MVD. De MVD van de gel-clot-bepaling is lager dan dat van de turbiditeit en chromogenic LALs omdat de gevoeligheid van deze test ook lager is. Als de formulering bemoeid met de LAL bij verdunning 500 in turbiditeit en chromogenic testen, kan de analyse op hogere verdunningen (b.v., 5000, 6000, 7000 of 7,407) worden uitgevoerd. Aangezien het niveau van endotoxinen verkregen bij verdunning 50 in de gel-clot-bepaling onder de EL was, werd de analyse van deze formulering in lagere verdunningen niet uitgevoerd. Echter, in andere gevallen, het testen kan worden voortgezet op verdunningen 20, 10, 5 of 2 te identificeren van de laagste niet bemoeien verdunning en begrijpen of het niveau van endotoxinen in de formulering hieronder de EL is.

Het is belangrijk te vermelden dat voor de gel-clot-assay het essentieel is de functie van de omloop water in het waterbad uitschakelen voor de duur van deze bepaling of een waterbad zonder deze optie gebruiken omdat waterstroom de klonter schaadt en invloed kan zijn op de nauwkeurigheid van de g El-clot LAL assay. Het is niet altijd mogelijk om te overwinnen nanoparticle interferentie met LAL testen door het verhogen van de monster-verdunningen. Strategieën en aantal benaderingen voor het overwinnen van verschillende soorten inmenging en voorbeelden van nanodeeltjes meestal vertegenwoordigen een probleem voor LAL testen zijn elders besproken door de andere fracties en ons12,13,14 ,15,30,31. De analyse in dit manuscript is gebaseerd op de formulering van een model. De ervaring met andere nanoformulations kan afwijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De studie werd ondersteund door federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder contract HHSN261200800001E. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Department of Health and Human Services, noch vermeldt van handelsnamen, commerciële producten, of organisaties impliceren goedkeuring door de Amerikaanse overheid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36, (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11, (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4, (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. Bacterial Endotoxins Test. (2011).
  5. FDA, U. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. (2012).
  6. FDA, U. Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44, (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19, (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409, (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220, (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5, (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9, (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. NCL. NCL assay cascade. Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015).
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4, (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9, (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33, (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160, (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31, (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9, (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11, (9-10), 1157-1175 (2017).
Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter