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Bioengineering

नैनो में Endotoxin का पता लगाने-योगों Limulus Amoebocyte Lysate (लाल) परख का उपयोग

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

इंजीनियर मैटीरियल्स में endotoxins का पता लगाने nanomedicine के क्षेत्र में भव्य चुनौतियों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है । यहाँ, हम एक मामले का अध्ययन है कि नैनोकणों में संभावित endotoxin संदूषण का अनुमान करने के लिए तीन अलग लाल स्वरूपों से बना ढांचे का वर्णन प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

जब दवा उत्पादों में मौजूद, एक ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरियल कोशिका दीवार घटक endotoxin (अक्सर भी lipopolysaccharide कहा जाता है) सूजन, बुखार, hypo या उच्च रक्तचाप पैदा कर सकता है, और, चरम मामलों में, ऊतक और अंग क्षति के लिए नेतृत्व कर सकते है कि घातक हो जाते हैं । दवा उत्पादों में endotoxin की मात्रा, इसलिए, कड़ाई से विनियमित रहे हैं । endotoxin डिटेक्शन और ठहराव के लिए उपलब्ध तरीकों के बीच, Limulus Amoebocyte Lysate (लाल) परख सामांयतः दुनिया भर में इस्तेमाल किया जाता है । जबकि किसी भी दवा उत्पाद लाल परख के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, नैनो-योगों उनकी जटिलता के कारण एक विशेष चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस पेपर का उद्देश्य इंजीनियर मैटीरियल्स और nanoparticle-तैयार की गई दवाओं में endotoxins का आकलन करने में अनुभवहीन शोधकर्ताओं को प्रैक्टिकल गाइड उपलब्ध कराना है । साथ ही, turbidity, chromogenic और जेल-थक्का परख सहित तीन लाल स्वरूपों प्रदर्शन के लिए व्यावहारिक सिफारिशों पर चर्चा कर रहे हैं । इन परख नैनो में endotoxin संदूषण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है आधारित दवा उत्पादों, टीके, और adjuvants ।

Introduction

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एक endotoxin ग्राम के एक इमारत ब्लॉक नकारात्मक बैक्टीरियल सेल दीवार1,2है । यह बहुत कम (picogram) सांद्रता1,2पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं । भड़काऊ मध्यस्थों (साइटोकिंस, leukotrienes, eicosanoids, आदि) एक endotoxin के जवाब में कोशिकाओं द्वारा उत्पादित बुखार, हाइपरटेंशन, उच्च रक्तचाप, और कई अंग विफलता सहित अधिक गंभीर स्वास्थ्य समस्याओं के लिए जिम्मेदार हैं 1 , 2 , 3. endotoxin द्वारा ट्रिगर प्रतिरक्षा मध्यस्थता पक्ष प्रभाव की गंभीरता endotoxin संरचना और संरचना द्वारा निर्धारित अपनी शक्ति पर निर्भर करता है और अंतरराष्ट्रीय endotoxin इकाइयों में मापा (IUs या EUs)3. शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम इन इकाइयों की संख्या endotoxin की दहलीज pyrogenic खुराक सेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस खुराक सभी मार्गों लेकिन intrathecal मार्ग के माध्यम से प्रशासित दवा उत्पादों के लिए 5 यूरोपीय संघ/ दवाओं शरीर की सतह के प्रति वर्ग मीटर की खुराक, intraocular तरल पदार्थ, radiopharmaceuticals, और intrathecal मार्ग के माध्यम से प्रशासित उत्पादों एक अलग दहलीज pyrogenic खुराक है, जो है १०० यूरोपीय संघ/एम2, ०.२ यूरोपीय संघ/एमएल, १७५ यूरोपीय संघ/ व्यवस्थापन के लिए लक्षित उत्पाद की मात्रा), और ०.२ EU/किग्रा, क्रमशः4. विभिंन दवा उत्पादों और उपकरणों के लिए दहलीज pyrogenic खुराक के बारे में अधिक जानकारी प्रदान की और कहीं पर चर्चा कर रहे है4,5,6

जानवरों endotoxin-मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं के लिए उनकी संवेदनशीलता में व्यापक रूप से बदलती हैं । मनुष्यों, गैर-मानव रहनुमाओं, और खरगोशों endotoxins3के लिए सबसे अत्यंत संवेदनशील प्रजातियों में से हैं । रोगियों में endotoxin मध्यस्थता दुष्प्रभावों से बचने और नैदानिक विषाक्तता और प्रभावकारिता अध्ययन के गलत निष्कर्ष को रोकने के लिए, यह सही का पता लगाने और दोनों नैदानिक और पूर्व नैदानिक ग्रेड योगों में endotoxins यों तो आवश्यक है. वर्तमान में उपलब्ध कई विधियाँ इस कार्य को प्राप्त कर सकती हैं. उनमें से एक है Limulus Amoebocyte Lysate (लाल) परख, जो सामांयतः दुनिया भर में इस्तेमाल के लिए संभावित endotoxin संदूषण के लिए जैव चिकित्सा उत्पादों स्क्रीन के रूप में अच्छी तरह के रूप में जीवाणु संक्रमण का पता लगाने के लिए7,8,9। lysate amoebocytes से तैयार है, घोड़े की नाल केकड़े के रक्त में मौजूद कोशिकाओं Limulus polyphemus उत्तर अमेरिका के महाद्वीप के पूर्वी किनारे में रहने वाले7। दिलचस्प है, वहां घोड़े की नाल केकड़ों की कुछ अलग प्रजातियों (Tachypleus गीगा और Tachypleus tridentatus) एशिया में10रहे हैं । Tachypleus Amoebocyte Lysate (ताल) के लिए कई एशियाई देशों में प्रयोग किया जाता है इसी तरह endotoxin का पता लगाने के लिए कैसे लाल अंय cuntries10में प्रयोग किया जाता है । lysates (लाल और ताल) प्रोटीन का एक समूह है कि सक्रियकरण पर सक्रियता प्रदान गतिविधि शामिल हैं । इन प्रोटीन में से एक, तथाकथित कारक सी endotoxin के साथ संपर्क करने पर सक्रिय है । सक्रिय कारक सी सट फैक्टर बी, जो बारी में भी एक को चिढ़ाने के लिए हो जाता है और एक थक्के एंजाइम का उत्पादन करने के लिए एक प्रो थक्के एंजाइम सट । प्रतिक्रियाओं की इस श्रृंखला का परिणाम एक जेल के गठन, नमूना turbidity में वृद्धि और, एक chromogenic सब्सट्रेट की उपस्थिति में, एक रंगीन उत्पाद है, जो जेल के लिए एक नींव के रूप में सेवा की उपस्थिति-थक्का, turbidity, और chromogenic परख, क्रमशः. हालांकि कोई अनिवार्य लाल स्वरूप है, अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) उद्योग दस्तावेज के लिए मार्गदर्शन में बताते हैं, कि अलग लाल स्वरूपों के बीच परीक्षा परिणामों में विसंगति के मामले में, निर्णय जेल-थक्का परख 5 के आधार पर किया जाता है .

कई सामांयतः प्रयोगशाला रसायनों का इस्तेमाल किया (जैसे, EDTA) और ज्ञात दवा उत्पादों (जैसे, पेनिसिलिन) लाल परख11के साथ हस्तक्षेप । हस्तक्षेप आमतौर पर एक परीक्षण सामग्री युक्त समाधान में एक ज्ञात एकाग्रता पर नुकीला endotoxin मानक की वसूली का आकलन करके पहचाना जाता है । यदि स्पाइक वसूली से कम ५०% या २००% से अधिक है, तो दिया परीक्षण सामग्री के लिए लाल परख का परिणाम निषेध या वृद्धि के कारण अवैध है, क्रमशः4। नैनो-आधारित योगों अक्सर जटिल और तंत्र की एक किस्म के माध्यम से लाल के साथ हस्तक्षेप कर रहे हैं12,13,14. कई दृष्टिकोण के हस्तक्षेप को दूर करने के लिए वर्णित किया गया है: विशिष्ट बफ़र और सर्फेक्टेंट में नमूना पुनर्गठन, हीटिंग द्वारा प्रोटीन निष्क्रियण, लिपिड आधारित खोखले सामग्री के विनाश हीटिंग द्वारा और अतिरिक्त के साथ नमूने का सप्लीमेंट divalent cations,१२,१३,१४,१५. लाल हस्तक्षेप को दूर नहीं किया जा सकता है जब स्थितियों के लिए वैकल्पिक तरीकों भी वर्णित किया गया है: एलिसा, एक HEK-TLR4 रिपोर्टर सेल लाइन परख, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री16,17,18, 19. शी.

जेल-थक्का, turbidity, और chromogenic लाल परख के आयोजन के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाएं बताई गई हैं । इन परख नैनो लक्षण लैब (एनसीएल) वेबसाइट20 प्रोटोकॉल में भी उपलब्ध है एसटी में 1.2 (turbidity लाल), ए. ए. 1.3 (जेल-थक्का लाल) और एसटी के 1.4 (chromogenic लाल) । यह एक ही नैनो-निर्माण की विशेषताएं करने के लिए दो अलग स्वरूपों का संचालन करने के लिए सिफारिश की है । जब turbidity और chromogenic लाल असहमत के परिणाम, जेल-थक्का परिणाम5माना जाता है । जब दो लाल स्वरूपों के परिणाम असहमत हैं, अतिरिक्त अध्ययन लाल निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए या तो monocyte सक्रियण परीक्षण (चटाई) या खरगोश पायरोजेन परीक्षण (RPT) का उपयोग21आयोजित कर रहे हैं । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक विधि endotoxin डिटेक्शन और pyrogenicity असेसमेंट के लिए उपयोग किए गए लाभ और सीमाएँ21,22,23,24है । किसी दिए गए नैनो निर्माण को चिह्नित करने के लिए उपयोग की गई कार्यविधि की सीमाएं पहचानने के लिए उस नैनो-निर्माण के लिए इष्टतम प्रक्रिया के उपयोग के लिए वैज्ञानिक औचित्य प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

इस अध् ययन में PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन को मॉडल nanoparticle योगों के रूप में इस् तेमाल किया गया । यह निर्माण १९९५ में अमेरिका एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया है और कैंसर रोगियों का इलाज दुनिया भर में25के लिए इस्तेमाल किया ।

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Protocol

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1. Nanoparticle नमूनों की तैयारी

  1. लाल ग्रेड के पानी में स्टडी सैंपल तैयार करें ।
  2. यदि नमूना पीएच 6-8 रेंज के बाहर है, पायरोजेन मुक्त सोडियम हीड्राकसीड या हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग करके पीएच समायोजित करें ।
  3. लाल ग्रेड पानी का प्रयोग अध्ययन नमूना के कई कमजोर पड़ने तैयार करते हैं । सुनिश्चित करें कि उच्चतम कमजोर पड़ने अधिकतम वैध कमजोर पड़ने (MVD) से अधिक नहीं है । MVD अनुमान के बारे में विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें ।

2. लाल प्रारूपों के बीच आम एजेंट की तैयारी

  1. ०.१ एन की एकाग्रता में एक काम समाधान तैयार करने के लिए पायरोजेन मुक्त लाल एजेंट पानी का उपयोग कर केंद्रित सोडियम हीड्राकसीड शेयर पतला
  2. पतला केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड स्टॉक का उपयोग पायरोजेन-नि: शुल्क लाल एजेंट पानी और ०.१ एन के एक अंतिम एकाग्रता में एक काम समाधान तैयार
  3. नियंत्रण मानक Endotoxin (सीएसई) की तैयारी
    1. सीएसई को निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए विश्लेषण के प्रमाण पत्र के अनुसार पुनर्गठित करना ।
      नोट: प्रमाण पत्र में दी गई जानकारी के संबंध में महत्वपूर्ण नोट्स के लिए चर्चा अनुभाग देखें । सूची संख्या और विभिन्न लाल स्वरूपों में दिए गए सीएसई तैयार करने के आवेदन के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका का संदर्भ लें.
  4. लाल रिएजेंट की तैयारी
    1. निर्माता द्वारा प्रदत्त विश्लेषण प्रमाण पत्र के अनुसार लाल रिएजेंट का पुनर्गठन किया जाए ।
      नोट: लाल एजेंट तैयारी के संबंध में महत्वपूर्ण विवरणों के लिए चर्चा अनुभाग देखें । सूची संख्या और अलग लाल प्रारूप में दिए गए लाल एजेंट निर्माण के आवेदन के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका का संदर्भ लें ।

3. Turbidity लाल परख

  1. अंशांकन मानकों की तैयारी
    1. लाल ग्रेड पानी के ९०० µ एल और सीएसई के १०० µ एल का उपयोग कर, के रूप में कई मध्यवर्ती कमजोर पड़ने के रूप में तैयार करने के लिए एक अंशांकन मानक की तैयारी के साथ एक एकाग्रता सीमा के लिए ०.००१ से 1 यूरोपीय संघ/
    2. पहली लेबल ट्यूबों और प्रत्येक ट्यूब में लाल ग्रेड पानी की ९०० μL जोड़ें । फिर 1EU/एमएल की एकाग्रता के साथ अंशांकन मानक तैयार करने के लिए 10 यूरोपीय संघ/एमएल solutionn के १०० μL जोड़ें ।
    3. तीन निचले अंशांकन मानकों को तैयार करने के लिए ऊपर वर्णित के रूप में धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने को दोहराएँ । सत्यापित करें कि चार अंशांकन मानक ०.००१ से लेकर 1 EU/एमएल तैयार किया गया है ।
  2. गुणवत्ता नियंत्रण की तैयारी
    1. लाल ग्रेड के पानी के ९५० µ l के साथ 1 यूरोपीय संघ/एमएल सीएसई समाधान के ५० µ एल के संयोजन द्वारा एक ०.०५ eu/एमएल गुणवत्ता नियंत्रण तैयार करें ।
      नोट: नियंत्रण तैयारी के बारे में विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें ।
  3. निषेध/संवर्धन (आईईसी) नियंत्रण की तैयारी
    1. 1 यूरोपीय संघ/एमएल सीएसई समाधान के 25 µ एल के संयोजन से ०.०५ यूरोपीय संघ/एमएल की एकाग्रता के साथ आईईसी तैयार करें और ४७५ µ एल परीक्षण nanomaterial के एक दिया कमजोर पड़ने पर ।
      नोट: अतिरिक्त विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें ।
  4. प्रायोगिक प्रक्रिया
    1. उपकरण को अग्रिम में लगभग 30 मिनट पर यह मोड़ द्वारा गर्म करने की अनुमति दें । सेट अप का पता लगाने के लिए तरंग दैर्ध्य ६६० एनएम के रूप में यह turbidity लाल के लिए उपयुक्त है ।
    2. उपयोगकर्ता नाम और पासवर्ड लिखकर साइन इन करें ।
    3. एक कंप्यूटर स्क्रीन पर इसी आइकन पर क्लिक करके सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका) खोलें ।
    4. सॉफ़्टवेयर होम स्क्रीन पर डेटा एकत्रित करें चुनें. होम स्क्रीन पर सामांय टैब में संबंधित स्थान में परीक्षण ID और डेटा समूह जानकारी दर्ज करें ।
    5. हार्डवेयर टैब क्लिक करें । एक ड्रॉपडाउन मेनू से साधन प्रकार चुनें ।
    6. सेट अप का पता लगाने तरंग दैर्ध्य ६६० एनएम के रूप में यह लाल turbidity विधि chosing द्वारा turbidity लाल के लिए उपयुक्त है ।
    7. सत्यापित करें कि एक सीरियल नंबर, सिस्टम ID और सीरियल पोर्ट जानकारी स्क्रीन पर दिखाई देते हैं । ठीकक्लिक करें । पुष्टि करने के लिए एक और समय ठीक क्लिक करें ।
    8. नमूना आईडी एक ही क्रम में दर्ज करें नमूना परीक्षण किया है. नकारात्मक नियंत्रण, मानक वक्र और परीक्षण नमूनों को दर्ज करने के लिए डिफ़ॉल्ट बटनों का उपयोग करें ।
    9. प्रत्येक नमूने के लिए डुप्लिकेट ट्यूबों तैयार करें और जोड़ें २०० µ एल (परीक्षण अनुपात 4:1) या १०० µ एल (परीक्षण अनुपात 1:1) के नकारात्मक नियंत्रण (पानी), अंशांकन मानकों, गुणवत्ता नियंत्रण, आईईसी और परीक्षण नैनोकणों में पूर्व-लेबल ग्लास ट्यूबों.
    10. जोड़ें ५० µ एल (परीक्षण अनुपात 4:1) या १०० µ एल (टेस्ट अनुपात 1:1) लाल रिएजेंट के लिए पहले परीक्षण शीशी, भंवर यह संक्षेप में, और उपकरण हिंडोला में परीक्षण स्लॉट में डालें । 1:1 अनुपात का उपयोग किया जाता है, तो लाल एजेंट की मात्रा १०० µ एल है ।
    11. अंय नमूनों के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रिया को दोहराएँ । प्रक्रिया नमूने एक समय में एक ।
      नोट: अधिक विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें ।

4. Chromogenic लाल

  1. अंशांकन मानकों की तैयारी
    1. लाल ग्रेड पानी के ९०० µ एल का उपयोग कर और सीएसई के १०० µ एल, के रूप में कई मध्यवर्ती कमजोर पड़ने के रूप में तैयार 1 यूरोपीय संघ/एमएल की एकाग्रता के साथ एक अंशांकन मानक की तैयारी को सक्षम करने के लिए की जरूरत है ।
    2. 1 यूरोपीय संघ/एमएल अंशांकन मानक के ९०० µ एल लाल ग्रेड पानी और १०० µ एल का उपयोग करना, ०.१ यूरोपीय संघ/एमएल की एकाग्रता पर एक दूसरे अंशांकन मानक तैयार करें ।
    3. दो निचले अंशांकन मानकों को तैयार करने के लिए ऊपर वर्णित के रूप में धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने को दोहराएँ । सत्यापित करें कि चार अंशांकन मानक ०.००१ से लेकर 1 EU/एमएल तैयार किया गया है ।
  2. गुणवत्ता नियंत्रण की तैयारी ।
    1. लाल ग्रेड के पानी के ९५० µ l के साथ 1 यूरोपीय संघ/एमएल सीएसई समाधान के ५० µ एल के संयोजन द्वारा एक ०.०५ eu/एमएल गुणवत्ता नियंत्रण तैयार करें ।
      नोट: नियंत्रण तैयारी के बारे में विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें ।
  3. निषेध/संवर्धन (आईईसी) नियंत्रण की तैयारी
    1. ०.०५ परीक्षण nanomaterial के ४७५ μL के साथ 1 यूरोपीय संघ/एमएल सीएसई समाधान के 25 μL के संयोजन के द्वारा यूरोपीय संघ/एमएल तैयार करें ।
      नोट: अतिरिक्त विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें ।
  4. प्रायोगिक प्रक्रिया
    1. उपकरण को अग्रिम में लगभग 30 मिनट पर यह मोड़ द्वारा गर्म करने की अनुमति दें । सेट अप का पता लगाने के लिए तरंग दैर्ध्य ४०५ एनएम के रूप में यह turbidity लाल के लिए उपयुक्त है ।
    2. एक कंप्यूटर स्क्रीन पर इसी आइकन पर क्लिक करके सॉफ्टवेयर खोलें । उपयोगकर्ता नाम और पासवर्ड लिखकर साइन इन करें ।
    3. सॉफ़्टवेयर होम स्क्रीन पर डेटा एकत्रित करें चुनें. होम स्क्रीन पर सामान्य टैब में समान स्थान में परीक्षण ID और डेटा समूह जानकारी दर्ज करें.
    4. हार्डवेयर टैब क्लिक करें । एक ड्रॉपडाउन मेनू से साधन प्रकार चुनें । साधन चुनें ।
    5. सत्यापित करें कि एक सीरियल नंबर, सिस्टम ID और सीरियल पोर्ट जानकारी स्क्रीन पर दिखाई देते हैं । ठीकक्लिक करें । पुष्टि करने के लिए एक और समय ठीक क्लिक करें ।
    6. नमूना आईडी एक ही क्रम में दर्ज करें नमूना परीक्षण किया है. नकारात्मक नियंत्रण, मानक वक्र और परीक्षण नमूने दर्ज करने के लिए डिफ़ॉल्ट बटनों का उपयोग करें ।
    7. प्रत्येक नमूने के लिए डुप्लिकेट ट्यूबों तैयार करें और जोड़ें २०० µ एल (परीक्षण अनुपात 4:1) या १०० µ एल (परीक्षण अनुपात 1:1) के नकारात्मक नियंत्रण (पानी), अंशांकन मानकों, गुणवत्ता नियंत्रण, आईईसी और परीक्षण नैनोकणों में पूर्व-लेबल ग्लास ट्यूबों.
    8. जोड़ें ५० µ एल (परीक्षण अनुपात 4:1) या १०० µ एल (टेस्ट अनुपात 1:1) लाल रिएजेंट के लिए पहले परीक्षण शीशी, भंवर यह संक्षेप में, और उपकरण हिंडोला में परीक्षण स्लॉट में डालें । 1:1 अनुपात का उपयोग किया जाता है, तो लाल एजेंट की मात्रा १०० µ एल है ।
    9. अंय नमूनों के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रिया को दोहराएँ । प्रक्रिया नमूने एक समय में एक ।

5. जेल-थक्का लाल

नोट: यह परख दृश्य अवलोकन और प्रतिक्रिया ट्यूब में एक थक्का का पता लगाने के आधार पर नमूने में endotoxins की उपस्थिति की पहचान करता है । इसके लिए प्रयोगात्मक कदम नीचे बताए गए हैं । परिणाम रिकॉर्ड करने के लिए एक बेंच पत्रक का उपयोग करें । यह बेंच शीट अनिवार्य नहीं है, और परख परिणाम रिकॉर्डिंग के अंय तरीके भी स्वीकार्य हैं । इस तरह के एक बेंच शीट का एक उदाहरण एक पाठक की सुविधा के लिए अनुपूरक सामग्री में प्रदान की जाती है । लैंब्डा (एल) जेल की संवेदनशीलता-थक्का परख है और ०.०३ यूरोपीय संघ/एमएल है ।

  1. विश्लेषण परीक्षण नमूनों की संख्या को समायोजित करने के लिए आवश्यक के रूप में कई प्रतिक्रिया ट्यूबों के रूप में लेबल. 1 चरण, चरण 2 और परख के चरण 3 में इस्तेमाल की प्रतिकृतियों की संख्या के बारे में विवरण के लिए बेंच शीट को देखें ।
  2. Aliquot १०० पानी की μL, नियंत्रण या टेस्टी नमूना प्रति ट्यूब.
  3. सीएसई को ऐसे तैयार करें कि अंतिम एकाग्रता 4λ के बराबर हो.
  4. 2λ के सीएसई के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए पानी या परीक्षण के नमूने के १०० μL के साथ उपर्युक्त मानक के १०० μL का मिश्रण. लैंब्डा और हाफ लैंब्डा और एक चौथाई लैंब्डा हासिल करने के लिए तीन और बार दोहराएं ।
  5. सुनिश्चित करें कि पानी के स्नान में तापमान ३७ ° c है ।
  6. टेस्ट ट्यूब, भंवर संक्षेप में प्रति lysate के १०० μL जोड़ें और 1 एच के लिए पानी के स्नान में सभी ट्यूबों के साथ रैक जगह है ।
  7. एक चिकनी गति के साथ ट्यूब उलटा ।
  8. मैन्युअल रूप से "+" (फर्म थक्का) या "-" (कोई थक्का या ढीला थक्का) बेंच पत्रक पर का उपयोग कर परिणाम रिकॉर्ड.
  9. विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें खासियत बेट ८५4के अनुसार; समर्थन सामग्री के रूप में बेंच पत्रक का उपयोग करें

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Representative Results

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लाल परख में इस निर्माण का परीक्षण करने के बाद उत्पन्न डेटा का उदाहरण तालिका 1में दिखाया गया है । PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन ने chromogenic लाल के साथ दखल 5. हालांकि, इस व्यवधान को अधिक से अधिक कमजोर पड़ने से दूर किया गया । स्पाइक वसूली ५० और २००% के बीच था जब इस निर्माण turbidity और chromogenic लाल में ५० और ५०० कमजोर पड़ने पर परीक्षण किया गया था, साथ ही turbidity लाल में कमजोर पड़ने पर 5 । जब कमजोर पड़ने के कारक द्वारा समायोजित, परिणाम दोनों परख में कमजोर पड़ने के बीच लगातार थे । इसके अलावा, परिणाम तीन परख प्रारूपों के बीच संगत थे ।

परीक्षण नमूना Turbidity लाल, EU/एमजी (स्पाइक रिकवरी,%) Chromogenic लाल, यूरोपीय संघ/mg, (स्पाइक रिकवरी,%) जेल-थक्का लाल, यूरोपीय संघ/एमजी (मान्य परीक्षण, हाँ या नहीं)
PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन (सामग्री की सारणी देखें)
कमजोर पड़ने 5 ०.०१ (१४१) हस्तक्षेप < ०.७५ (वाई)
कमजोर पड़ने ५० < ०.०२५ (१८७) ०.०२९ (८२) < १.५ (Y) *
कमजोर पड़ने ५०० < ०.२५ (१८२) < ०.२५ (८६) < 3 (Y) * *

तालिका 1: PEGylated में endotoxin का पता लगाना liposomal लाल परख का उपयोग डॉक्सोरूबिसिन । PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन turbidity, chromogenic और जेल-थक्का लाल परख का उपयोग कर परीक्षण किया गया था । नमूना हस्तक्षेप IECs का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था । स्पाइक पुनर्प्राप्ति लघुकोष्ठक में दिखाया गया है । ५० और २००% के बीच मान endotoxin डिटेक्शन4के लिए खासियत बेट ८५ मानक के अनुसार स्वीकार्य माना जाता है । * और * * इस नमूने के परीक्षण के परिणाम १०० और २००, क्रमशः कमजोर पड़ने पर प्राप्त किए गए । जेल-थक्का परख कमजोर पड़ने chromogenic और turbidity लाल में इस्तेमाल किया उन लोगों से अलग है क्योंकि संवेदनशीलता और इस परख के अधिकतम वैध कमजोर पड़ने कम कर रहे हैं ।

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल में दी गई जानकारी15,26 से पहले बताई गई है और अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (अमेरिका एफडीए या एफडीए) और संयुक्त राज्य अमेरिका फार्माकोपिया (खासियत)4 द्वारा प्रकाशित कई विनियामक दस्तावेजों पर निर्भर करता है , 5 , 6 , 27, और एनसीएल की वेबसाइट पर भी उपलब्ध है20 में प्रोटोकॉल एसटी (turbidity लाल), एसटी (जेल-थक्का लाल) और (chromogenic लाल) 1.4 एसटी ।

टेस्ट-मैटीरियल्स लाल रिएजेंट पानी या बाँझ, पायरोजेन मुक्त पंजाबियों में या तो तैयार कर रहे हैं । अध्ययन के नमूने के पीएच महत्वपूर्ण है क्योंकि कम (< 6) और उच्च (> 8) पीएच lysate के इष्टतम प्रदर्शन के साथ हस्तक्षेप करेंगे । यदि परीक्षण के पीएच-nanoparticle 6-8 रेंज के बाहर है, यह पायरोजेन मुक्त सोडियम हीड्राकसीड या हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है । जब इस तरह के समायोजन किया जाता है, यह microelectrode से नमूना संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, इस कार्यविधि को निष्पादित करने के लिए, नमूना का एक छोटा aliquot एक अलग ट्यूब में निकाल दिया जाता है और पीएच को मापने के लिए उपयोग किया जाता है ।

जब नमूना पंजाब में या किसी अन्य बफ़र में तैयार किया जाता है, तो रिक्त बफ़र भी इस परीक्षण में शामिल है । प्रत्येक nanomaterial की एकाग्रता केस-विशिष्ट है । परीक्षण में सक्रिय भेषज संघटक (एपीआई) के प्रति मिलीग्राम प्रदूषित endotoxin की मात्रा का अनुमान लगाया जाता है. हालांकि, नैनो-निर्माण के प्रकार पर निर्भर करता है, एकाग्रता भी कुल निर्माण या कुल तत्व (जैसे, सोना, चांदी या सोने, चांदी के लिए लोहा, और आयरन ऑक्साइड नैनोकणों, क्रमशः) के मिलीग्राम में अनुमान लगाया जा सकता है । नमूना MVD से अधिक नहीं कई कमजोर पड़ने का उपयोग कर स्टॉक से परीक्षण किया है । परीक्षण के सभी कमजोर पड़ने-नैनोकणों लाल ग्रेड पानी का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं ।

तीन पैरामीटर MVD की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है । वे endotoxin सीमा (एल), नमूना एकाग्रता, और परख संवेदनशीलता (λ)4हैं । endotoxin सीमा (el) की गणना करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें: el = k/मी, जहां k एक थ्रेशोल्ड पायरोजेन खुराक है (जैसे, 5 EU/किग्रा के रूप में परिचय में चर्चा) और एम शरीर के प्रति किलोग्राम प्रशासन के लिए इरादा परीक्षण nanomaterial की अधिकतम खुराक है एक एक घंटे में वजन4. के रूप में ऊपर चर्चा की, मैटीरियल्स के लिए EL का आकलन radiopharmaceutical के रूप में या चिकित्सा उपकरण के रूप में इस्तेमाल एक दहलीज pyrogenic खुराक या फार्मूला है, जो 5 से अलग है पर निर्भर करता है/ इन विवरणों परिचय में उल्लेख कर रहे है और आगे की खासियत और अमेरिका एफडीए दिशानिर्देश4,5,6में समीक्षा की जा सकती है । नेत्र समाधान और intraocular उपकरणों के लिए अनुशंसित endotoxin सीमा इन उत्पादों के लिए अमेरिका एफडीए दिशानिर्देश6में प्रदान की गई है । जब एक पशु मॉडल (जैसे, माउस) nanoformulation की खुराक स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, इस जानकारी तथाकथित मानव समकक्ष खुराक (HED) का अनुमान लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. HED एक रूपांतरण कारक है, जो प्रत्येक पशु प्रजातियों के लिए विशिष्ट है द्वारा पशु खुराक विभाजित द्वारा गणना की है । उदाहरण के लिए, रूपांतरण कारक है १२.३, ६.२ और ३.१ माउस के लिए, चूहा, और खरगोश, क्रमशः27. रूपांतरण प्रक्रिया और यह प्रयोग करने के लिए तर्क अमेरिका एफडीए दिशानिर्देश27में विस्तार से वर्णित हैं । कैंसर चिकित्सकीय अक्सर सतह शरीर के प्रति खुराक की जाती है क्षेत्र में व्यक्त की मिलीग्राम/ एक या तो खासियत दिशानिर्देश का पालन कर सकते है के लिए एल की गणना के लिए मिलीग्राम प्रति वर्ग मीटर में खुराक या इस खुराक में परिवर्तित मिलीग्राम/ मिलीग्राम/एम2 में खुराक एक प्रजाति-विशिष्ट रूपांतरण कारक27का उपयोग कर मिलीग्राम/किलो में खुराक के लिए समायोजित किया जा सकता है । एक वयस्क मानव के लिए, यह ३७ है और कश्मीरएम के रूप में संकेत के लिए बड़े पैमाने पर लगातार27का उल्लेख है । किमी फैक्टर किलो की इकाइयों/ यह वर्ग मीटर (एम2)27में सतह क्षेत्र द्वारा विभाजित किलोग्राम (किग्रा) में शरीर के वजन के बराबर है । उदाहरण के लिए, एक मानव खुराक या ७४ मिलीग्राम/एम2 के HED 2 मिलीग्राम/kg या 74/37 से मेल खाती है । MVD निर्धारित करने के लिए, निम्न सूत्र का उपयोग करें, जो भी खासियत शर्त ८५ मानक से उपलब्ध है: MVD = (एल एक्स नमूना एकाग्रता)/λ)4. एक काल्पनिक परिदृश्य में, एक nanoparticle नमूना एकाग्रता है 10 मिलीग्राम/एमएल और माउस में इसकी अधिकतम खुराक है ६१५ मिलीग्राम/ इस मामले में HED 615/12.3 = 50 मिलीग्राम/kg है; EL intrathecal को छोड़कर सभी मार्गों के लिए ०.१ यूरोपीय संघ/मिलीग्राम है (5 यूरोपीय संघ/kg/50 मिलीग्राम/किग्रा) और MVD १,००० है ((०.१ eu/मिलीग्राम x 10 mg/एमएल)/0.001 eu/एमएल) ।

अक्सर, जब एक अनुसंधान ग्रेड nanomaterial में endotoxin संदूषण का मूल्यांकन करने की जरूरत है, खुराक जानकारी उपलब्ध नहीं है । कैसे इन सामग्रियों के लिए MVD और EL अनुमान लगाने के लिए कोई संगत प्रक्रिया है । इस मामले का अध्ययन सीधे स्टॉक से परीक्षण करता है (आमतौर पर इस समाधान की एकाग्रता है 1 मिलीग्राम/एमएल) और कई कमजोर पड़ने पर, आमतौर पर 5-, ५०-, ५००-और ५,००० गुना । जब खुराक, प्रशासन के मार्ग, नमूना एकाग्रता और दिए गए परीक्षण nanomaterial परिवर्तन के लिए अर्क समय, EL और MVD भी बदल जाते हैं । इसलिए, एक के लिए जानकारी का मूल्यांकन और अंय राशि, समय, प्रशासन और दिए गए निर्माण की एकाग्रता का इरादा मार्ग से संबंधित मापदंडों के संदर्भ में EL और MVD का आकलन करने के लिए है ।

यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सूची संख्या और उत्पाद विनिर्देशों (उदाहरणके लिए, शक्ति, प्रति शीशी मात्रा) सीएसई अलग लाल स्वरूपों के लिए अलग हैं । turbidity लाल में प्रयुक्त सीएसई भी एक जेल में इस्तेमाल किया जा सकता है-थक्का लाल । हालांकि, एक chromogenic लाल के लिए सीएसई इस परख प्रारूप के लिए विशिष्ट है । नीचे दिए गए निर्देश सामांय है और सभी परख स्वरूपों में इस्तेमाल सीएसई के लिए लागू । सीएसई एक ई. कोलाई lipopolysaccharide (एलपीएस) एक lyophilized पाउडर के रूप में आपूर्ति की है । यह मानक एक ज्ञात शक्ति के साथ एक संदर्भ मानक Endotoxin (्से) के खिलाफ निर्माता द्वारा प्रमाणित है । सीएसई युक्त शीशी की सामग्री के साथ पुनर्गठन किया जाना चाहिए ~ ३.२-५.० मिलीलीटर पायरोजेन-मुक्त लाल एजेंट पानी की । सीएसई के बीच अंतर के अलावा अलग परख प्रारूपों के लिए इस्तेमाल किया, पुनर्गठन की मात्रा भी इस मानक के प्रत्येक बहुत कुछ के लिए विशिष्ट है । इसलिए, एक मानक के प्रत्येक बहुत के लिए स्टॉक सीएसई समाधान के अंतिम एकाग्रता की गणना करने के लिए है । गणना मानक की शक्ति और प्रत्येक शीशी में निहित राशि के आधार पर किया जाता है । endotoxin मानक के प्रत्येक लॉट के लिए विशिष्ट विश्लेषण का प्रमाण पत्र शक्ति और प्रति शीशी राशि के बारे में जानकारी शामिल है । एक को कड़ाई से 30-60 सेकंड के लिए मानक भंवर है, दोनों पुनर्गठन के दौरान और उपयोग के दौरान । यह भी 5-10 मिनट निपटाने बार और एक 30-60 मिनट समय सीमा से अधिक का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी lyophilized सामग्री समाधान में चला जाता है पुनर्गठन करने की सिफारिश की है । परख में उपयोग करने से पहले, equilibrate स्टॉक सीएसई कमरे के तापमान के लिए । पुनर्गठन के बाद सीएसई के शेयर को स्टोरेज के लिए प्रशीतित किया जा सकता है और यह चार हफ्तों के लिए स्थिर है ।

सीएसई के समान, लाल रिएजेंट भी प्रत्येक प्रारूप के लिए विशिष्ट है । नीचे दिए गए निर्देश सामान्य हैं और सभी लाल परख प्रारूपों के लिए लागू होते हैं । लाल रिएजेंट को lyophilized पाउडर के रूप में प्रदान किया जाता है । निर्माता की सिफारिशों के बाद प्रत्येक शीशी को फिर से गठित किया जाता है. या तो लाल ग्रेड पानी या बीटा glucans बाधा बफर इस्तेमाल किया जा सकता है । बीटा-glucans बाधा बफर इस मामले में पसंद-अध्ययन है क्योंकि यह बीटा-glucans से हस्तक्षेप को छोड़कर अनुमति देता है । इस झूठी सकारात्मक हस्तक्षेप मैटीरियल्स में बहुत आम है क्योंकि फाइबर एसीटेट फिल्टर सामांयतः nanomaterial संश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया और glucan संदूषण15के एक स्रोत के रूप में सेवा कर रहे हैं । अधिकांश शीशियों 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को पुनर्गठन की आवश्यकता होगी । इस परख के साथ ' लेखकों के अनुभव के 10 से अधिक वर्षों के आधार पर, यह देखा गया है कि इस बफर के शामिल किए जाने की प्रतिक्रिया को धीमा कर देती है और साधन सेटिंग्स में अधिकतम शुरुआत समय में वृद्धि की आवश्यकता हो सकती है एक पर सबसे कम औजार की अनुमति ०.००१ यूरोपीय संघ/एमएल की एकाग्रता विकसित करने के लिए ।

मानकों की तैयारी के दौरान सटीक कमजोर पड़ने को सुनिश्चित करने के लिए, यह 10 गुना कमजोर पड़ने वाले कदमों का उपयोग करने की सिफारिश की है । सीरियल 10 गुना कमजोर पड़ने से शेयर के spiking १०० µ एल या पायरोजेन के ९०० µ एल में उच्च एकाग्रता के साथ एक मानक से मुक्त पानी तैयार किया जा सकता है । सीएसई स्टॉक की एकाग्रता के बाद से आम तौर पर उच्च है (~ १,००० यूरोपीय संघ/एमएल), १०० सांद्रता के साथ मध्यवर्ती कमजोर पड़ने की तैयारी और 10 यूरोपीय संघ/एमएल 1 यूरोपीय संघ/एमएल की एकाग्रता के साथ परख औजार तैयार करने से पहले की सिफारिश की है । इस प्रोटोकॉल में परीक्षण नमूना और lysate के बीच दो अनुपात बताए गए हैं । हालांकि दोनों अनुपात आमतौर पर उपयोग किया जाता है, वक्र रैखिकता स्वीकार्य है, लेकिन आदर्श नहीं है जब 4:1 अनुपात और बफर बाधा बीटा-glucans ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया जाता है ।

अंशांकन मानक तैयारी के बारे में उपरोक्त वर्णित समान नियम गुणवत्ता नियंत्रण (QC) की तैयारी के लिए भी लागू होते हैं । ये नियंत्रण परख ठीक से कार्य कर रहा है सत्यापित करने के लिए उपयोग किया जाता है । यह पायरोजेन-मुक्त पानी में सीएसई की ज्ञात राशि spiking द्वारा तैयार किया जाता है. QC की एकाग्रता आमतौर पर परख रेंज के बीच में चुना जाता है । turbidity लाल परख की रेंज ०.००१ है 1 यूरोपीय संघ/ इसलिए, ०.०५ यूरोपीय संघ/एमएल की एकाग्रता पर एक QC का उपयोग किया जाता है । परख रेंज के भीतर अंय सांद्रता भी गुणवत्ता नियंत्रण की तैयारी में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

निषेध वृद्धि नियंत्रण (आईईसी) भी सकारात्मक उत्पाद नियंत्रण (पीपीसी) के रूप में जाना जाता है । यह परीक्षण के नमूने में सीएसई के एक ज्ञात एकाग्रता spiking द्वारा तैयार किया जाता है । आईईसी की एकाग्रता (पीपीसी) आमतौर पर परख रेंज के बीच में चुना जाता है । turbidity लाल परख की रेंज ०.००१ है 1 यूरोपीय संघ/ इसलिए, आईईसी ०.०५ यूरोपीय संघ/एमएल की एकाग्रता पर किया जाता है । इस आईईसी एक को तैयार करने के लिए 1 यूरोपीय संघ के ५० µ एल गठबंधन की जरूरत है/एमएल सीएसई समाधान ९५० के साथ परीक्षण के µ एल-nanoparticle । आईईसी एक परीक्षण के प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए तैयार है-nanomaterial । उदाहरण के लिए, यदि एक नैनो-निर्माण तीन कमजोर पड़ने पर परीक्षण किया है (1:50, 1:500 और 1:5000), एक तीन IECs तैयार करने के लिए है, इनमें से प्रत्येक के लिए एक कमजोर पड़ने । परख रेंज के भीतर अंय सांद्रता भी आईईसी नमूना तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस नियंत्रण के लिए दिया नैनो तैयार करने के लिए परीक्षण के परिणामों की वैधता को समझने के लिए प्रयोग किया जाता है । खासियत के अनुसार, परीक्षण-परिणाम मान्य हैं यदि आईईसी (पीपीसी) की स्पाइक रिकवरी ५० और २००%4के बीच है । स्पाइक रिकवरी ५०% से कम का अर्थ है कि परीक्षण-nanomaterial endotoxin डिटेक्शन को रोकता है और इसलिए, परीक्षण परिणाम endotoxin दूषण को आंकता है और अमांय है । स्पाइक वसूली पर २००% पता चलता है कि परीक्षण सामग्री परख परिणाम को बढ़ाता है या दूषित endotoxin का एक बहुत उच्च स्तर होता है । बढोतरी के मामले में परख परिणाम भी गलत निकला है । ऐसे हस्तक्षेप के उदाहरण और उन पर काबू पाने के लिए कुछ तरीके पहले12,15बताए गए हैं.

जब turbidity और chromogenic परख प्रदर्शन, यह एक पुनरावर्तक पिपेट का उपयोग करने के लिए सभी नमूनों को लाल एजेंट जोड़ने की सिफारिश की है । औसत साधन आपरेशन समय ७२०० सेकंड है । हालांकि, प्रतिक्रिया lysate के कुछ बहुत से तेज या धीमी हो सकती है । मामलों में, जब प्रतिक्रिया धीमी है, एक 9600s या लंबे समय के लिए साधन सेटिंग्स बदलने की आवश्यकता हो सकती है । यह परिवर्तन सबसे कम औजार विकसित करने की अनुमति देगा ।

PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन 2 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता में एक सक्रिय दवा संघटक (एपीआई) युक्त एक निर्माण है । यह ५० मिलीग्राम/एम2की एक खुराक के रूप में क्लिनिक में प्रयोग किया जाता है । इस खुराक को मिलीग्राम/kg श्रेणी में कनवर्ट करने के लिए, यह फैक्टर ३७27से विभाजित है । मिलीग्राम/kg में PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन की खुराक, इसलिए, १.३५ है । EL, 5 (यूरोपीय संघ/किग्रा में दहलीज पायरोजेन खुराक) की गणना करने के लिए १.३५ (मिलीग्राम/किग्रा में Doxil की खुराक) से विभाजित है और ३.७ यूरोपीय संघ/मिलीग्राम4प्राप्त है । इस संख्या का अर्थ है कि १.३५ मिलीग्राम/kg की खुराक पर PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन सुरक्षित रूप से प्रति एक घंटे प्रशासित किया जा सकता है अगर endotoxin निर्माण में ३.७ यूरोपीय संघ/मिलीग्राम, जहां एमजी एपीआई को संदर्भित करता है से अधिक नहीं है ।

इसके बाद, लाल परख के लिए MVD की गणना करने के लिए इस जानकारी का उपयोग करें । इस अध्ययन में प्रस्तुत turbidity, chromogenic और जेल का थक्का परख की संवेदनशीलता (लैंब्डा) क्रमशः ०.००१, ०.००१ और ०.०३ EU/ इसलिए, MVD turbidity और chromogenic ((5 eu/किलो x 2 mg/एमएल)/0.001 eu/एमएल), और २४७ जेल-थक्का परख ((5 eu/किलो x 2 mg/एमएल)/0.03 eu/एमएल) के लिए ७,४०७ है ।

डॉक्सोरूबिसिन एक व्यापक अवशोषण स्पेक्ट्रम है कि chromogenic लाल28, 29की परख तरंग दैर्ध्य के साथ ओवरलैप है । इसके अलावा, सबसे liposome योगों पंकिल और दूधिया दिखाई देते हैं । इस अंतर्निहित turbidity turbidity परख के साथ liposomes के हस्तक्षेप के लिए बहुत ही आम कारण है । PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन, turbidity के कारण हस्तक्षेप के मामले में कमजोर पड़ने से पांच के रूप में ५० और २००% (तालिका 1) के बीच स्पाइक वसूली मूल्यों द्वारा सबूत के रूप में दूर था । हालांकि, एक ही कमजोर पड़ने डॉक्सोरूबिसिन एकाग्रता में अभी भी काफी उच्च chromogenic लाल (तालिका 1) के साथ हस्तक्षेप था । दो बाद के कमजोर पड़ने (५० और ५००) chromogenic लाल के साथ हस्तक्षेप डॉक्सोरूबिसिन PEGylated liposomal पर काबू पाने में मदद की । जेल थक्का परख turbidity और नमूना रंग से स्वतंत्र है, और निर्माण में endotoxin के स्तर जेल-थक्का रेंज के भीतर है के बाद से, PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन सभी परीक्षण कमजोर पड़ने पर जेल थक्का परख के साथ हस्तक्षेप नहीं किया । इस मामले के अध्ययन में, PEGylated liposomal डॉक्सोरूबिसिन के कई कमजोर पड़ने इन परख के लिए इस्तेमाल किया गया । कमजोरियां 5, ५० और ५०० turbidity और chromogenic के लिए के रूप में अच्छी तरह से ५०, १०० और जेल के लिए २००-थक्का परख क्योंकि वे MVD के भीतर है चुना गया । जेल की MVD का थक्का परख turbidity और chromogenic ललस की तुलना में कम है क्योंकि इस परख की संवेदनशीलता भी कम है. यदि निर्माण turbidity और chromogenic परख में ५०० कमजोर पड़ने पर लाल के साथ दखल, उच्च कमजोर पड़ने पर विश्लेषण (जैसे, ५,०००, ६,०००, ७,००० या ७,४०७) किया जा सकता है । जेल थक्का परख में ५० कमजोर पड़ने पर प्राप्त endotoxin के स्तर के बाद से EL नीचे था, कम कमजोर पड़ने पर इस निर्माण के विश्लेषण प्रदर्शन नहीं किया गया । हालांकि, अंय मामलों में, परीक्षण कमजोर पड़ने पर 20, 10, 5 या 2 की पहचान करने के लिए जारी रखा जा सकता है ंयूनतम हस्तक्षेप नहीं कमजोर पड़ने और समझ है कि निर्माण में endotoxin के स्तर EL ।

यह उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है कि जेल-थक्का परख यह इस परख की अवधि के लिए पानी के स्नान में पानी परिसंचरण समारोह बारी आवश्यक है या इस तरह के विकल्प के बिना एक पानी स्नान का उपयोग करें, क्योंकि पानी के प्रवाह को नुकसान का थक्का और जी की सटीकता को प्रभावित कर सकते है el-थक्का लाल परख । यह हमेशा संभव नहीं है लाल परख के साथ nanoparticle हस्तक्षेप को दूर करने के लिए नमूना कमजोर पड़ने से बढ़ रहा है । रणनीतियों और हस्तक्षेप और नैनोकणों के उदाहरण आमतौर पर लाल परख के लिए एक समस्या का प्रतिनिधित्व करने के विभिंन प्रकार पर काबू पाने के लिए कुछ दृष्टिकोण अंय समूहों और अमेरिका के द्वारा चर्चा की गई है कहीं12,13,14 ,१५,३०,३१. इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विश्लेषण एक मॉडल तैयार करने पर आधारित है । अंय nanoformulations के साथ अनुभव अलग हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

अध्ययन राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों, अनुबंध HHSN261200800001E के तहत से संघीय कोष द्वारा समर्थित किया गया । इस प्रकाशन की सामग्री जरूरी विचार या स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग की नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, न ही व्यापार के नाम का उल्लेख करता है, वाणिज्यिक उत्पादों, या अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन मतलब संगठनों ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

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References

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नैनो में Endotoxin का पता लगाने-योगों Limulus Amoebocyte Lysate (लाल) परख का उपयोग
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Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

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