Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Deteksjon av Endotoxin i Nano-formuleringer bruker Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analyser

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

Deteksjon av endotoxins i utvikling nanomaterialer representerer en av de store utfordringene innen nanomedicine. Her presenterer vi en studie som beskriver rammeverket består av tre ulike LAL formater å beregne potensiell endotoxin forurensning i nanopartikler.

Abstract

Når finnes i legemidler, en Gram-negative bakteriell cellevegg komponenten endotoxin (også kalt lipopolysakkarid) kan forårsake betennelser, feber, hypo- eller høyt blodtrykk, og, i ekstreme tilfeller kan føre til vev og organ skade som kan bli fatal. Beløpene i endotoxin i legemidler, derfor er strengt regulert. Blant metodene tilgjengelig for endotoxin gjenkjenning og kvantifisering, er Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analysen vanlig over hele verden. Mens farmasøytiske produkter kan påvirke LAL analysen, representerer nano-formuleringer en spesiell utfordring på grunn av sin kompleksitet. Formålet med utredningen er å gi en praktisk guide til forskere uerfaren i estimering endotoxins foretatt nanomaterialer og hydrogenion-formulert narkotika. Praktiske anbefalinger for tre LAL formater, inkludert turbiditet, kromogent og gel-blodpropp analyser diskuteres her. Disse analyser kan brukes til å fastslå endotoxin forurensning i nanoteknologi-baserte legemidler og vaksiner adjuvans.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En endotoxin er en av Gram-negative bakteriell cellevegg1,2. Det kan aktivere immunceller i svært lav (hører) konsentrasjoner1,2. Proinflammatory meglere (cytokiner, leukotrienes, eicosanoids, etc.) produsert av cellene som svar på en endotoxin er ansvarlig for feber, hypotensjon, hypertensjon og mer alvorlige helseproblemer, inkludert flere organsvikt 1 , 2 , 3. alvorlighetsgraden av immun-mediert bivirkninger utløst av endotoxin avhenger av sin styrke etter endotoxin sammensetning og struktur og målt i internasjonale endotoxin enheter (IUs eller EUs)3. Antall disse enheter per kilo kroppsvekt brukes til å angi en terskel pyrogenic dose endotoxin. Denne dosen er 5 EU/kg for legemidler administreres via alle ruter men intratekal ruten. Narkotika dosert per kvadratmeter av kroppsdeler, intraokulært væsker, radiopharmaceuticals og produkter administreres via intratekal ruten har en annen terskelen pyrogenic dose, som er 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (hvor V er den volumet av produktet beregnet på administrasjon), og 0,2 EU/kg, henholdsvis4. Mer informasjon om terskelen pyrogenic dosen for ulike legemidler og enheter tilbys og diskutert annetsteds4,5,6.

Dyr varierer mye i deres følsomhet for endotoxin-medierte reaksjoner. Mennesker og ikke-menneskelige primater kaniner er blant artene mest følsomme endotoxins3. For å unngå endotoxin-mediert bivirkninger hos pasienter og hindre feil konklusjoner av prekliniske toksisitet og effekt studier, er det viktig å nøyaktig oppdage og kvantifisere endotoxins i både kliniske og pre-klinisk klasse formuleringer. Flere tilgjengelige metoder kan oppnå denne oppgaven. En av dem er Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analysen, som er vanlig brukt verden over skjermen biomedisinsk produkter potensielle endotoxin forurensning også å oppdage bakterieinfeksjoner7,8,9. Den lysate er forberedt fra amoebocytes, cellene presenterer i blodet av hestesko krabbe Limulus Polyfemos bosatt i den østlige bredden av kontinentet i Nord-Amerika7. Interessant, det er noen forskjellige arter av hestesko krabbe (Tachypleus gigas og Tachypleus tridentatus) i Asia10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) brukes i flere asiatiske land for påvisning av endotoxin ligner på hvordan LAL brukes i andre cuntries10. Lysates (LAL og TAL) inneholder en gruppe proteiner som ved aktivering konferere protease aktivitet. En av disse proteinene, den såkalte faktoren C aktiveres ved kontakt med endotoxin. Aktivert faktor C kløyver faktor B, som også blir en protease og innstiftet en pro-clotting enzym å produsere en clotting enzym. Resultatet av denne kjeden av reaksjoner er dannelsen av en gel, en økning i prøven turbiditet og, i nærvær av et kromogent substrat utseendet på et farget produkt, som tjener som grunnlag for gel-blodpropp og turbiditet kromogent analyser, henholdsvis. Mens det er ingen obligatorisk LAL format, US Food and Drug Administration (FDA) forklarer i veiledning for basert bransje dokumentet, at i tilfelle uoverensstemmelser i testresultater mellom ulike LAL formater, vedtaket er gjort på gel-blodpropp analysen5 .

Mange brukte laboratoriekjemikaler (f.eks., EDTA) og kjente stoffet produkter (f.eks penicillin) forstyrre LAL søk11. Forstyrrelser identifiseres ved å vurdere utvinning av endotoxin standard piggete i en kjent konsentrasjon i en løsning som inneholder test materialet. Hvis spisspotensial er mindre enn 50% eller mer enn 200%, så resultatet av LAL analysen er gitt test materialet ugyldig på grunn av hemming eller ekstrautstyr, henholdsvis4. Nanoteknologi prosesseringsoperasjoner er ofte kompliserte og forstyrre LAL gjennom en rekke mekanismer12,13,14. Mange tilnærminger har blitt beskrevet for å overvinne forstyrrelser: eksempel rekonstituering i bestemte buffere og tensider, protein inaktivering av oppvarming, ødeleggelse av lipid-baserte hul materialer ved oppvarming og supplere prøven med overflødig divalent kasjoner5,12,13,14,15. Alternative metoder for situasjoner der LAL forstyrrelser ikke kan overvinne har også blitt beskrevet: ELISA, en HEK-TLR4 reporter celle linje analysen og massespektrometri16,17,18, 19.

Her, er eksperimentelle prosedyrer for å gjennomføre gel-blodpropp og turbiditet kromogent LAL analyser beskrevet. Disse analyser er også tilgjengelig på Nanoteknologi karakterisering Lab (NCL) nettsted20 i protokoller STE1.2 (turbiditet LAL), STE1.3 (gel-blodpropp LAL) og STE1.4 (kromogent LAL). Det anbefales å gjennomføre minst to forskjellige formater som betegner samme nano-utformingen. Når resultatene av turbiditet og kromogent LAL uenig, anses gel-blodpropp resultatene5. Når resultatene fra to LAL formater uenig, gjennomført ekstra studier bruker enten monocytt Aktivisering (MAT) eller kanin pyrogen testen (RPT) for å bekrefte LAL funnene er21. Det er viktig å merke seg at hver metode brukt for endotoxin påvisning og pyrogenicity vurdering har fordeler og begrensninger21,22,23,24. Erkjennelsen begrensninger av prosedyren for å karakterisere gitt nanoteknologi formulering er avgjørende for å få vitenskapelig begrunnelse for bruk av prosedyren optimalt for at nano-formulering.

I denne studien ble pegylert liposomal doksorubicin brukt som modell hydrogenion formulering. Denne formuleringen er godkjent av den amerikanske FDA i 1995 og brukt til behandling av kreft pasienter verden over25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse av hydrogenion prøver

  1. Forberede studie eksemplet i LAL klasse vann.
  2. Hvis prøven pH er utenfor 6-8, justere pH ved hjelp pyrogen-fri natriumhydroksid eller saltsyre.
  3. Bruke LAL klasse vann forberede flere fortynninger av studien prøven. Kontroller at høyeste fortynning ikke overstiger maksimal gyldig fortynning (MVD). Se drøftingen for detaljer om MVD estimering.

2. forberedelse av reagenser felles mellom LAL formater

  1. Fortynne konsentrert natriumhydroksid lager med pyrogen-gratis LAL reagens vann for å forberede en fungerende løsning i en konsentrasjon av 0,1 N.
  2. Fortynne konsentrert saltsyre lager med pyrogen-gratis LAL reagens vann og forberede en fungerende løsning på en siste konsentrasjon av 0,1 N.
  3. Utarbeidelse av kontroll Standard Endotoxin (CSE)
    1. Rekonstituer CSE ifølge analysesertifikatet leveres av produsenten.
      Merk: Se drøftingen for viktige notater om informasjonen i sertifikatet. Se Tabellen for materiale for detaljer om katalognummer og anvendelse av en gitt CSE formulering i ulike LAL formater.
  4. Utarbeidelse av LAL reagens
    1. Rekonstituer LAL reagensen ifølge analysesertifikatet leveres av produsenten.
      Merk: Se drøftingen for viktige detaljer om LAL forberedelse av reagenser. Se Tabellen for materiale for detaljer om katalognummer og anvendelse av en gitt LAL reagens formulering annet LAL format.

3. turbiditet LAL analysen

  1. Forberedelse av kalibrering
    1. Bruke 900 µL LAL klasse vann og 100 µL av CSE, forberede så mange mellomliggende fortynninger som kreves for å aktivere utarbeidelse av en kalibrering standard med en konsentrasjon varierer fra 0,001 til 1 EU/mL.
    2. Først merke rør og Legg 900 μL av LAL-grade vann i hver retning. Tilsett 100 μL av 10 EU/mL solutionn å forberede kalibrering standard med konsentrasjonen av 1EU/mL.
    3. Gjenta føljetong 10 ganger fortynning beskrevet ovenfor for å forberede tre lavere kalibrering standarder. Kontroller at fire kalibrering standarder mellom 0,001 1 EU/mL er utarbeidet.
  2. Utarbeidelse av kvalitet kontrollene
    1. Forberede en 0,05 EU/mL kvalitetskontroll ved å kombinere 50 µL av 1 EU/mL CSE løsningen med 950 µL av LAL-grade vann.
      Merk: Se drøftingen for detaljer vedrørende kontroll forberedelse.
  3. Utarbeidelse av hemming/ekstrautstyret (IEC) kontroller
    1. Forberede IEC med konsentrasjon av 0,05 EU/mL ved å kombinere 25 µL av 1 EU/mL CSE løsningen og 475 µL av testen nanomaterial på en gitt fortynning.
      Merk: Se drøftingen for mer informasjon.
  4. Eksperimentelle prosedyren
    1. For at maskinen skal varme opp ved å slå den på ca 30 min på forhånd. Oppsett oppdagelsen bølgelengden til 660 nm som dette er hensiktsmessig for turbiditet LAL.
    2. Logg på ved å skrive inn brukernavn og passord.
    3. Åpne programvaren (Tabell for materiale) ved å klikke på ikonet på en dataskjerm.
    4. Velg samle inn data på programvare Hjem-skjermen. Angi test ID og data informasjon om inn i tilsvarende plass i kategorien Generelt på Hjem-skjermen.
    5. Klikk kategorien maskinvare Velg instrument fra en rullegardinmeny.
    6. Oppsett oppdagelsen bølgelengden til 660 nm som dette er passende for turbiditet LAL ved å velge metoden LAL turbiditet.
    7. Kontroller at et serienummer, system-ID og seriell portinformasjon vises på skjermen. Klikk på OK. Klikk OK en gang til for å bekrefte.
    8. Angi prøve-ID i samme rekkefølge prøven er testet. Bruk standardknappene til å angi negativ kontroll, standard kurve og test prøver.
    9. Forberede doble rør for hver prøve og legge til 200 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) av negativ kontroll (vann), kalibrering standarder, kvalitetskontroll, IEC og test nanopartikler i forhåndsinnstilte merket BILLEDRØR.
    10. Legge til 50 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) av LAL reagensen i første test hetteglass, vortex det kort, og sett inn i test spor i instrumentet karusellen. Hvis 1:1 ratio, er volumet av LAL reagensen 100 µL.
    11. Gjenta denne fremgangsmåten beskrevet ovenfor for andre prøver. Prosessen prøver en om gangen.
      Merk: Se drøftingen for mer informasjon.

4. kromogent LAL

  1. Utarbeidelse av kalibrering standarder
    1. Bruke 900 µL LAL klasse vann og 100 µL av CSE, forberede så mange mellomliggende fortynninger som kreves for å aktivere utarbeidelse av en kalibrering standard med en konsentrasjon av 1 EU/mL.
    2. Bruke 900 µL LAL-grade vann og 100 µL av 1 EU/mL kalibrering standard, forberede andre kalibrering standard på en konsentrasjon av 0,1 EU/mL.
    3. Gjenta føljetong 10 ganger fortynning beskrevet ovenfor for å forberede to lavere kalibrering standarder. Kontroller at fire kalibrering standarder mellom 0,001 1 EU/mL er utarbeidet.
  2. Utarbeidelse av kvalitetskontroll.
    1. Forberede en 0,05 EU/mL kvalitetskontroll ved å kombinere 50 µL av 1 EU/mL CSE løsningen med 950 µL av LAL-grade vann.
      Merk: Se drøftingen for detaljer vedrørende kontroll forberedelse.
  3. Utarbeidelse av hemming/ekstrautstyret (IEC) kontroller
    1. Forberede 0,05 EU/mL ved å kombinere 25 μL 1 EU/mL CSE løsningen med 475 μL test nanomaterial.
      Merk: Se drøftingen for mer informasjon.
  4. Eksperimentelle prosedyren
    1. For at maskinen skal varme opp ved å slå den på ca 30 min på forhånd. Oppsett oppdagelsen bølgelengden til 405 nm som dette er hensiktsmessig for turbiditet LAL.
    2. Åpne programvaren ved å klikke på ikonet på en dataskjerm. Logg på ved å skrive inn brukernavn og passord.
    3. Velg samle inn data på programvare Hjem-skjermen. Angi test ID og data informasjon i tilsvarende plass i kategorien Generelt på Hjem-skjermen.
    4. Klikk kategorien maskinvare Velg instrument fra en rullegardinmeny. Velg instrumentet.
    5. Kontroller at et serienummer, system-ID og seriell portinformasjon vises på skjermen. Klikk på OK. Klikk OK en gang til for å bekrefte.
    6. Angi prøve-ID i samme rekkefølge prøven er testet. Bruk standardknappene til å angi negativ kontroll, standard kurve og test prøver.
    7. Forberede doble rør for hver prøve og legge til 200 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) av negativ kontroll (vann), kalibrering standarder, kvalitetskontroll, IEC og test nanopartikler i forhåndsinnstilte merket BILLEDRØR.
    8. Legge til 50 µL (test forholdet 4:1) eller 100 µL (test forholdet 1:1) av LAL reagensen i første test hetteglass, vortex det kort, og sett inn i test spor i instrumentet karusellen. Hvis 1:1 ratio, er volumet av LAL reagensen 100 µL.
    9. Gjenta denne fremgangsmåten beskrevet ovenfor for andre prøver. Prosessen prøver en om gangen.

5. gel-Clot LAL

Merk: Denne analysen identifiserer tilstedeværelsen av endotoxins i utvalget basert på visuell observasjon og oppdagelsen av en blodpropp i reaksjon røret. Eksperimentell trinnene er beskrevet nedenfor. Bruk en benk ark til posten resultater. Denne benken ark er ikke obligatorisk, og andre måter å registrere analyseresultatene er også akseptable. Et eksempel på slike en benk ark tilbys i supplerende materiale for bekvemmeligheten av en leser. Lambda (l) er følsomheten av gel-blodpropp analysen og 0,03 EU/mL.

  1. Etiketten så mange reaksjon rør som nødvendig for å imøtekomme antall analysert test prøver. Se benk arket for detaljer om antall gjentak brukes i trinn 1, trinn 2 og trinn 3 i analysen.
  2. Aliquot 100 μL vann, kontroller eller test vareprøve per rør.
  3. Forberede CSE slik at den endelige konsentrasjonen tilsvarer 4λ.
  4. Kombinere 100 μL av standard nevnt ovenfor med 100 μL av vann eller test prøve å oppnå den endelige konsentrasjonen av CSE av 2λ. Gjenta tre ganger lambda og halv-lambda og kvart lambda.
  5. Kontroller at temperaturen i vannbad er 37 ° C.
  6. Tilsett 100 μL av lysate per reagensglasset, vortex kort og montere med alle rør i vannbad 1t.
  7. Invertere røret med en jevn bevegelse.
  8. Registrere resultatene ved hjelp av "+" (fast blodpropp) eller "-" (ingen blodpropp eller løse blodpropp) på benken ark.
  9. Fortsette med analyse etter USP BET 854; bruke benk arket som støtte materiale

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Eksempel data generert etter testing denne formuleringen i LAL analyser er vist i tabell 1. Pegylert liposomal doksorubicin forstyrret kromogent LAL på fortynning 5. Men ble denne innblandingen overveldet av større fortynninger. Spisspotensial ble mellom 50 og 200% når denne formuleringen ble testet på fortynninger 50 og 500 turbiditet og kromogent LAL, samt på fortynning 5 i turbiditet LAL. Når den justeres ved fortynningsfaktoren, var resultatene samsvar mellom fortynninger i begge analyser. Videre var resultatene samsvar mellom tre analysen formater.

Testprøven Turbiditet LAL, EU/mg (spike utvinning, %) Kromogent LAL, EU/mg, (spike utvinning, %) Gel-blodpropp LAL, EU/mg (test gyldig, ja eller nei)
Pegylert liposomal doksorubicin (se tabell for materiale)
Fortynning 5 0,01 (141) interferens < 0,75 (Y)
Fortynning 50 < 0.025 (187) 0.029 (82) < 1.5 (Y) *
Fortynning 500 < 0,25 (182) < 0,25 (86) < 3 (Y) **

Tabell 1: gjenkjenning av endotoxin i pegylert liposomal doksorubicin bruker LAL søk. Pegylert liposomal doksorubicin ble testet med turbiditet, kromogent og gel-blodpropp LAL søk. Eksempel forstyrrelser ble beregnet ved hjelp av IECs. Spisspotensial vises i parentes. Verdier mellom 50 og 200% anses akseptabelt ifølge USP BET 85 standarden for endotoxin gjenkjenning4. * og ** testresultatene i dette eksemplet ble oppnådd på fortynninger 100 og 200, henholdsvis. Gel-blodpropp analysen fortynninger er forskjellige fra de som brukes i kromogent og turbiditet LAL fordi følsomhet og maksimal gyldig fortynning av denne analysen er lavere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Informasjonen i denne protokollen har blitt beskrevet før15,26 og bruker flere lovpålagte dokumenter publisert av US Food, Drug Administration (oss FDA eller FDA) og USA farmakopé (USP)4 , 5 , 6 , 27, og er også tilgjengelig på NCL nettsted20 i protokoller STE1.2 (turbiditet LAL), STE1.3 (gel-blodpropp LAL) og STE1.4 (kromogent LAL).

Test-nanomaterialer tilberedes i LAL reagens vann eller steril, pyrogen-fri PBS. PH i studien prøven er viktig fordi lav (< 6) og høy (> 8) pH vil forstyrre den optimale ytelsen til lysate. Hvis pH i test-hydrogenion utenfor 6-8, kan det justeres ved hjelp av pyrogen-fri natriumhydroksid eller saltsyre. Når slike justering utføres, er det viktig å unngå eksempel forurensning fra microelectrode. Derfor for å utføre denne prosedyren, er en liten aliquot av prøven fjernet i en separat rør og brukes til å måle pH.

Når prøven er utarbeidet i PBS eller en annen buffer, er tom bufferen også inkludert i denne testen. Konsentrasjonen av hver nanomaterial er case-spesifikk. Testen brukes til å estimere mengden av forurensende endotoxin per mg av aktive farmasøytiske ingrediens (API). Imidlertid avhengig av nano-formulering, konsentrasjonen kan også estimeres i mg av total formulering eller totale element (f.eks., gull, sølv eller jern for gull, sølv og jernoksid nanopartikler, henholdsvis). Prøven er testet fra lager bruke flere fortynninger ikke overstiger MVD. Alle fortynninger av test-nanopartikler tilberedes med LAL-grade vann.

Tre parametere brukes til å beregne MVD. De er endotoxin grensen (EL), prøve konsentrasjonen og analysen følsomhet (λ)4. Bruk følgende formel til å beregne endotoxin grensen (EL): EL = km, der K er en terskel pyrogen dose (f.eks., 5 EU/kg som beskrevet i innføring) og M er maksimal dose av testen nanomaterial beregnet på administrasjon per kilo vekt i en time4. Som beskrevet ovenfor estimering av EL for nanomaterialer brukes som radiopharmaceutical eller medisinsk enhet er avhengig av en terskel pyrogenic dose eller formel, som er forskjellig fra 5/M. Disse detaljene er nevnt i innledningen og kan revideres ytterligere i USP og oss FDA retningslinjer4,5,6. Anbefalte endotoxin grensen for ophthalmica løsninger og intraokulært enheter finnes i oss FDA retningslinjen for disse produktene6. Når en dyremodell (f.eks., musen) ble brukt til å etablere dosen av nanoformulation, denne informasjonen brukes til å beregne den såkalte menneskelige tilsvarende dosen (HED). HED beregnes ved å dele dyr dosen en konverteringsfaktor som er spesifikke for hver dyrearter. Omregningsfaktoren er for eksempel 12.3, 6.2 og 3.1 for musen, rotta og kaninen, henholdsvis27. Forandringen fremgangsmåten og begrunnelsen for å bruke det er beskrevet i detalj i de amerikanske FDA retningslinje27. Cancer therapeutics er ofte dosert per overflaten kroppens område i mg/m2. En kan følger USP retningslinjen vil beregne EL for narkotika dosert i milligram per kvadratmeter eller konvertere denne dose for mg/kg. Dose på mg/m2 kan justeres til dose på mg/kg med en artsspesifikke konverteringsfaktor27. For et voksent menneske er det 37 og angitte Km å referere til de masse konstant27. Km-faktor har enheter av kg/m2; Det er lik kroppsvekten i kilogram (kg) delt areal i kvadratmeter (m2)27. For eksempel tilsvarer en menneskelig dose eller HED av 74 mg/m2 2 mg/kg eller 74/37. For å avgjøre MVD, bruk følgende formel som er også tilgjengelig fra USP BET 85 standard: MVD = (EL x prøve konsentrasjon) / λ)4. I en hypotetisk situasjon, en hydrogenion eksempel konsentrasjonen er 10 mg/mL og sin maksimale dosen musen er 615 mg/kg. I dette tilfellet HED er 615/12.3 = 50 mg/kg; EL for alle ruter unntatt intratekal er 0,1 EU/mg (5 EU/kg/50 mg/kg) og MVD er 1000 ((0,1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 EU/mL).

Ofte, når man trenger å evaluere endotoxin forurensning i en forskning klasse nanomaterial, er dose informasjon ikke tilgjengelig. Det er noen harmoniske prosedyre å beregne MVD og EL for disse materialene. Dette kasusstudiet utfører testen direkte fra lager (vanligvis konsentrasjonen av denne løsningen er 1 mg/mL) og flere fortynninger, vanligvis 5-, 50-, 500- og 5000-folde. Når dosen, inntaksmetoden, prøve konsentrasjonen og infusjonen tid for gitt test nanomaterial endringen, endres også EL og MVD. Derfor må man vurdere informasjonen og utføre estimering av EL- og MVD i forbindelse med andre parametere knyttet til beløpet, tid, beregnet rute for administrasjon og konsentrasjon av gitt formulering.

Det er viktig å merke seg at katalogen antall og produktspesifikasjoner (f.eks., styrke, beløp per medisinglass) søkemotoren er forskjellige for ulike LAL formater. CSE brukes i turbiditet LAL kan også brukes i en gel-blodpropp LAL. CSE for et kromogent LAL er imidlertid spesifikt for denne analysen format. Instruksjonene nedenfor er generelle og gjelder for CSE brukes i alle analysen formater. CSE er en E. coli lipopolysakkarid (LPS) leveres som en lyofiliserte pulveret. Denne standarden er sertifisert av produsenten mot en referanse Standard Endotoxin (RSE) med en kjent styrke. Innholdet i ampullen inneholder CSE bør rekonstitueres med ~3.2 - 5.0 mL pyrogen gratis LAL reagens vann. I tillegg til forskjellen mellom CSE brukes for forskjellige analysen formater, er volumet av rekonstituering også gjelder for hver mye av denne standarden. Derfor må man Beregn lager CSE løsningen for hver masse standard siste konsentrasjonen. Beregningen utføres basert på styrken av standarden og beløpet på hvert hetteglass. Analysesertifikatet spesifikke for hver masse endotoxin standard inneholder informasjon om styrke og beløp per medisinglass. Man må strengt vortex standard for 30-60 sekunder, både under rekonstituering og under bruk. Det anbefales også å utføre rekonstituering med 5-10 min settling ganger og over 30-60 min tidsramme å sikre at alle lyofiliserte materiale går i løsningen. Equilibrate lager CSE til romtemperatur før i analysen. Etter rekonstituering, CSE lager kan oppbevares i kjøleskap for lagring og er stabil i fire uker.

Lik CSE, LAL reagensen er også spesifikke for hvert format. Instruksjonene nedenfor er generelle og gjelder for alle LAL analysen formater. LAL reagensen er gitt som en lyofiliserte pulveret. Produsentens anbefalingene følges for å gjeninnføre hvert hetteglass. LAL klasse vann eller bufferen hemme beta-glucans kan brukes. Bufferen hemme beta-glucans er foretrukket i dette tilfellet-studien fordi det tillater eksklusive forstyrrelser fra beta-glucans. Denne falske positive forstyrrelser er svært vanlig i nanomaterialer fordi celluloseacetat filtre brukes vanligvis under nanomaterial syntese og tjene som en kilde til Glukan forurensning15. De fleste ampuller krever rekonstituering til et siste volum 5 ml. Basert på over 10 år forfatternes erfaring med denne analysen, det har blitt lagt merke til at inkludering av denne bufferen bremser ned reaksjonen og kreve øke maksimal utbruddet tiden i instrument for å tillate laveste kalibrator på en konsentrasjon av 0,001 EU/mL å utvikle.

For å sikre nøyaktig fortynning under utarbeidelsen av standarder, er det anbefalt å bruke 10 ganger fortynning trinnene. Seriell 10 ganger fortynninger tilberedes av skyter 100 µL av aksjen eller en standard med høyere konsentrasjon i 900 µL av pyrogen-fritt vann. Siden konsentrasjonen av CSE aksjen er vanligvis høy (~ 1000 EU/mL), utarbeidelse av mellomliggende fortynninger med konsentrasjoner 100 og 10 EU/mL er anbefalt før du tilbereder analysen kalibrator med en konsentrasjon av 1 EU/mL. To forhold mellom prøven og lysate er beskrevet i denne protokollen. Selv om begge prosenter brukte, er kurven linearitet akseptabel, men ikke ideelt når 4:1-forhold og bufferen hemme beta-glucans (se Tabell for materiale) brukes.

De samme reglene gjelder som beskrevet ovenfor vedrørende kalibrering standard utarbeidelse også utarbeidelse av kvalitetskontroll (QC). Disse kontrollene brukes til å bekrefte at analysen fungerer riktig. Det er utarbeidet av skyter kjent mengden CSE i vannet pyrogen-fri. Konsentrasjonen av QC er vanligvis valgt midt i analysen området. Turbiditet LAL analysen er 0,001 til 1 EU/mL. Derfor brukes en QC i en konsentrasjon av 0,05 EU/mL. Andre konsentrasjonene innen analysen kan også brukes i utarbeidelsen av kvalitetskontrollen.

Kontrollen for hemming ekstrautstyr (IEC) er også kjent som positive produktet kontroll (PPC). Det er utarbeidet av skyter en kjent konsentrasjon av CSE i prøven. Konsentrasjonen av IEC (PPC) er vanligvis valgt midt i analysen området. Turbiditet LAL analysen er 0,001 til 1 EU/mL. Derfor brukes grensene i en konsentrasjon av 0,05 EU/mL. For å forberede denne IEC må kombinere 50 µL av 1 EU/mL CSE løsningen med 950 µL av test-hydrogenion. Grensene er klargjort for hver fortynning av en test-nanomaterial. For eksempel hvis en nano-formulering er testet på tre fortynninger (1:50, 1:500 og 1:5, 000), må man forberede tre IECs, ett for hver av disse fortynninger. Andre konsentrasjonene innen analysen kan også brukes til å forberede IEC prøven. Denne kontrollen brukes til å forstå gyldigheten av testresultatene for gitt nano-utformingen. Ifølge USP er test-resultatene gyldige hvis spisspotensial av IEC (PPC) er mellom 50 og 200%4. Spike utvinning mindre enn 50% betyr at test-nanomaterial hemmer endotoxin gjenkjenning og derfor prøven resultere undervurderer endotoxin forurensning og er ugyldig. Spisspotensial over 200% foreslår at test-materialet forbedrer analysen resultatet eller inneholder også høy forurensende endotoxin. Ved ekstrautstyr er analysen resultatet også unøyaktig. Eksempler på slike forstyrrelser og noen måter for å overvinne dem har vært beskrevet tidligere12,15.

Når du utfører turbiditet og kromogent analyser, anbefales det å bruke en repeater pipette legge LAL reagensen til alle prøvene. Gjennomsnittlig instrument operasjonstiden er 7200 sekunder. Reaksjonen kan imidlertid være raskere eller langsommere med visse masse av lysate. I tilfeller når reaksjonen er treg, må en endre innstillingen instrument til 9600s eller lengre. Denne endringen vil tillate laveste kalibrator å utvikle.

Pegylert liposomal doksorubicin er en utforming som inneholder en aktiv farmasøytiske ingrediens (API) i en konsentrasjon av 2 mg/mL. Den brukes i klinikken som en dose av 50 mg/m2. Slik konverterer denne dose mg/kg området, deles av faktor 3727. Dosen av pegylert liposomal doksorubicin i mg/kg, derfor er 1.35. For å beregne EL, 5 (terskelen pyrogen dosen i EU/kg) deles 1.35 (dosen av Doxil i mg/kg) og få 3.7 EU/mg4. Dette tallet betyr at pegylert liposomal doksorubicin på dose 1.35 mg/kg kan trygt gis per time hvis endotoxin i utformingen ikke overstiger 3.7 EU/mg, hvor mg refererer til API.

Deretter Bruk denne informasjonen til å beregne MVD for LAL analyser. Følsomheten (lambda) turbiditet, kromogent og gel-blodpropp analyser presentert i denne studien er 0.001, 0,001 og 0,03 EU/mL, henholdsvis. MVD er derfor 7,407 for turbiditet og kromogent analyser ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 EU/mL), og 247 for gel-blodpropp analysen ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 EU/mL).

Doksorubicin har et bredt absorbansen spekter som overlapper med analysen bølgelengden til kromogent LAL28,29. Videre, de fleste liposome formuleringer er grumset og vises melaktig. Dette iboende turbiditet er svært vanlig årsaken til forstyrrelser av liposomer med turbiditet analysen. I tilfelle av pegylert liposomal doksorubicin, ble forstyrrelser på grunn av turbiditet overveldet av fortynning fem som gjenspeiles av spike utvinning verdiene mellom 50 og 200% (tabell 1). Men på den samme fortynning doksorubicin var konsentrasjon fortsatt høy nok til å forstyrre den kromogent LAL (tabell 1). To påfølgende fortynninger (50 og 500) hjalp for å overvinne pegylert liposomal doksorubicin innblanding kromogent LAL. Siden gel-blodpropp analysen er uavhengig av turbiditet og prøvefarge, og endotoxin i utformingen er innen gel-blodpropp, pegylert liposomal doksorubicin ikke forstyrre gel-blodpropp analysen på alle testede fortynninger. I dette tilfellet studien, ble flere fortynninger av pegylert liposomal doksorubicin brukt for disse analyser. Fortynninger 5, 50 og 500 for turbiditet og kromogent samt 50, 100 og 200 for gel-blodpropp analysen ble valgt fordi de er innenfor MVD. MVD av gel-blodpropp analysen er lavere enn turbiditet og kromogent LALs fordi sensitiviteten av denne analysen er også lavere. Hvis utformingen forstyrret LAL på fortynning 500 turbiditet og kromogent analyser, kan analysen på høyere fortynninger (f.eks 5000, 6000, 7000 eller 7,407) utføres. Siden nivået av endotoxin på fortynning 50 i gel-blodpropp analysen var under EL, ble analyse av denne formelen på lavere fortynninger ikke utført. Men i andre tilfeller testing kan videreføres til fortynninger 20, 10, 5 eller 2 å identifisere laveste ikke forstyrre fortynning og forstår om endotoxin i utformingen er under EL.

Det er viktig å nevne at for gel-blodpropp analysen er det viktig å slå av funksjonen vann sirkulasjon i vannbad for varigheten av denne analysen eller bruke et vannbad uten slike valg fordi vannstrømmen skader blodpropp og kan påvirke nøyaktigheten av g El-blodpropp LAL analysen. Det er ikke alltid mulig å overvinne hydrogenion innblanding LAL analyser ved å øke utvalget fortynninger. Strategier og noen metoder for å overvinne ulike typer forstyrrelser og eksempler på nanopartikler ofte representerer et problem for LAL analyser har vært diskutert av andre grupper og oss andre steder12,13,14 ,15,30,31. Analyse presentert i dette manuskriptet er basert på en modell formulering. Erfaringer med andre nanoformulations kan være forskjellig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Studien ble støttet av føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, kontrakt HHSN261200800001E. Innholdet i denne publikasjonen reflekterer ikke nødvendigvis synspunkter eller politikken av Department of Health and Human Services, eller nevner av varenavn, kommersielle produkter, eller organisasjoner endossering av den amerikanske regjeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36, (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11, (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4, (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. Bacterial Endotoxins Test. (2011).
  5. FDA, U. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. (2012).
  6. FDA, U. Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44, (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19, (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409, (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220, (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5, (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9, (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. NCL. NCL assay cascade. Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015).
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4, (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9, (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33, (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160, (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31, (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9, (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11, (9-10), 1157-1175 (2017).
Deteksjon av Endotoxin i Nano-formuleringer bruker Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter