Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

Deteção de endotoxinas em nanomateriais engenharia representa um dos grandes desafios no campo da nanomedicina. Aqui, apresentamos um estudo de caso que descreve a estrutura composta por três diferentes formatos LAL para estimar a contaminação potencial de endotoxinas em nanopartículas.

Abstract

Quando presentes em produtos farmacêuticos, uma parede de pilha bacteriana gram-negativos endotoxina de componente (muitas vezes também chamada lipopolissacarídeo) pode causar inflamação, febre, hipo - ou hipertensão arterial e, em casos extremos, pode levar a danos de tecidos e órgãos que podem tornar-se fatal. As quantidades de endotoxina em produtos farmacêuticos, portanto, são estritamente regulamentadas. Entre os métodos disponíveis para a detecção de endotoxinas e quantificação, o ensaio de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) é comumente usado em todo o mundo. Enquanto qualquer produto farmacêutico pode interferir com o ensaio LAL, nano-formulações representam um desafio particular devido à sua complexidade. O objetivo deste trabalho é fornecer um guia prático para pesquisadores inexperientes na estimativa de endotoxinas em nanomateriais engenharia e drogas nanopartículas-formulado. Neste documento, recomendações práticas para a realização de três formatos LAL, incluindo turbidez, cromogênico e gel-coágulo ensaios são discutidas. Estes ensaios podem ser usados para determinar a contaminação de endotoxinas em medicamentos baseados em nanotecnologia, vacinas e adjuvantes.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Uma endotoxina é um bloco de construção da parede de pilha bacteriana gram-1,2. Ele pode ativar as células do sistema imunológico em muito baixas concentrações de (picograma)1,2. Os mediadores proinflammatory (citocinas, leucotrienos, eicosanoides, etc) produzidos pelas células em resposta a uma endotoxina são responsáveis pela febre, hipotensão, hipertensão e mais graves problemas de saúde, incluindo a falência múltipla de órgãos 1 , 2 , 3. a severidade dos imune-mediada-efeitos colaterais provocados a endotoxina depende de sua potência determinada pela estrutura e composição de endotoxinas e medido em unidades de endotoxina internacional (IUs ou EUs)3. O número dessas unidades por quilograma de peso corporal é usado para definir uma dose pirogénica limiar da endotoxina. Esta dose é que 5 EU/kg para medicamentos administrados através de todas as rotas, mas a via intratecal. Drogas dosadas por metro quadrado de superfície corporal, fluidos intra-ocular, radiofármacos e produtos administrado via intratecal rota têm uma dose pirogénica limiar diferente, que é 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, EU 175/V (onde V é o volume do produto destinado a administração) e EU 0.2/kg, respectivamente4. Mais detalhes sobre a dose pirogénica limiar para vários medicamentos e dispositivos são fornecidos e discutiram em outra parte4,5,6.

Animais variam muito em sua sensibilidade para reações mediadas por endotoxinas. Os seres humanos, os primatas não-humanos e coelhos estão entre as espécies mais extremamente sensíveis a endotoxinas3. Para evitar mediada por endotoxina de efeitos colaterais em pacientes e evitar conclusões imprecisas de toxicidade pré-clínica e estudos de eficácia, é essencial para detectar com precisão e quantificar endotoxinas em ambas as formulações de grau e pré-clínicos. Vários métodos atualmente disponíveis podem realizar esta tarefa. Um deles é o ensaio de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), que é comumente usado em todo o mundo para a tela de produtos biomédicos para a potencial contaminação de Endotoxinas, bem como para detectar infecções bacterianas7,8,9. O lisado é preparado a partir amoebocytes, as células presentes no sangue de caranguejos-ferradura Limulus polyphemus residentes na costa leste do continente da América do Norte7. Curiosamente, há poucas espécies diferentes de caranguejos-ferradura (Tachypleus gigas e Tachypleus tridentatus) em Ásia10. O Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) é usado em vários países asiáticos para a detecção de endotoxina semelhante como o leite é usado em outros cuntries10. Os lysates (LAL e TAL) contêm um grupo de proteínas que, após a ativação, conferir atividade de protease. Uma destas proteínas, o chamado Factor C é ativada em caso de contacto com endotoxina. Ativado fator C cliva o fator B, que por sua vez também se torna uma protease e fende uma pro-coagulação enzimática para produzir uma enzima de coagulação. O resultado dessa cadeia de reações é a formação de um gel, um aumento na turbidez da amostra e, na presença de um substrato cromogénico, a aparência de um produto colorido, que servem como base para gel-coágulo, turbidez e ensaios cromogênico, respectivamente. Enquanto não há nenhum formato obrigatório da LAL, a Food and Drug Administration (FDA) explica na orientação para documento da indústria, que, em caso de discrepância nos resultados do teste entre diferentes formatos LAL, a decisão é feita com base no ensaio de gel-coágulo5 .

Muitos comumente utilizados produtos químicos de laboratório (ex., EDTA) e ensaios de drogas conhecida produtos (por exemplo, penicilina) interferem com LAL11. A interferência é geralmente identificada por avaliar a recuperação do padrão de endotoxina cravado em uma concentração conhecida em uma solução contendo o material de ensaio. Se a recuperação de pico é menor do que 50% ou mais de 200%, então o resultado da LAL do ensaio para o material determinado teste é inválido devido à inibição ou realce, respectivamente4. Formulações à base de nanotecnologia são muitas vezes complexas e interferem com o leite através de uma variedade de mecanismos12,13,14. Muitas abordagens têm sido descritas para superar a interferência: reconstituição de amostra em buffers específicos e surfactantes, inativação de proteínas por aquecimento, destruição de materiais ocos baseados em lipídios por aquecimento e completando a amostra com excesso cátions divalentes5,12,13,14,15. Métodos alternativos para situações em que a interferência de leite não pode ser superada também têm sido descritos: ELISA, uma célula de repórter HEK-TLR4 linha de ensaio e espectrometria de massa16,17,18, 19.

Neste documento, os procedimentos experimentais para a realização de ensaios LAL cromogênico, turbidez e gel-coágulo são descritos. Estes ensaios também estão disponíveis no site laboratório de caracterização de nanotecnologia (NCL)20 em protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.3 (gel-coágulo LAL) e STE1.4 (LAL cromogênico). Recomenda-se realizar pelo menos dois formatos diferentes para caracterizar a mesma formulação-nano. Quando resultados de turbidez e LAL cromogênica discordam, os resultados do gel-coágulo são considerados5. Quando os resultados dos dois formatos LAL discordam, adicionais de conclusões de estudos usando o teste de ativação de monócitos (esteira) ou teste de pirogênio coelho (RPT) para verificar LAL são realizados21. É importante notar que cada método utilizado para detecção de endotoxinas e avaliação pirogénicos tem vantagens e limitações21,22,23,24. Reconhecer as limitações do procedimento usado para caracterizar uma formulação de determinada nanotecnologia é essencial para obter justificação científica para a utilização do procedimento ideal para essa formulação-nano.

Neste estudo, doxorrubicina lipossomal peguilado foi usada como uma formulação de nanopartículas de modelo. Esta formulação foi aprovada pela FDA em 1995 e usada no tratamento de pacientes de câncer em todo o mundo25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. preparação das amostras de nanopartículas

  1. Prepare a amostra de estudo em LAL grau água.
  2. Se o pH da amostra está fora do intervalo de 6-8, ajuste o pH usando apirógena hidróxido de sódio ou ácido clorídrico.
  3. Usando leite água grau preparar várias diluições da amostra do estudo. Certifique-se que a maior diluição que não ultrapasse a máxima diluição válida (MVD). Consulte a seção de discussão para obter detalhes sobre a estimativa de MVD.

2. preparação dos reagentes comuns entre formatos LAL

  1. Diluir o estoque de hidróxido de sódio concentrado usando água reagente LAL livre de pirogênio para preparar uma solução de trabalho em uma concentração de 0,1 N.
  2. Diluir o estoque de ácido clorídrico concentrado usando água de reagente LAL livre de pirogênio e preparar uma solução de trabalho em uma concentração final de 0,1 N.
  3. Preparação da endotoxina padrão de controle (CSE)
    1. Reconstitua o CSE de acordo com o certificado de análise fornecida pelo fabricante.
      Nota: Consulte a seção de discussão para observações importantes sobre as informações fornecidas no certificado. Consulte a Tabela de materiais para os detalhes a respeito do número de catálogo e aplicação de uma determinada formulação de CSE em diferentes formatos LAL.
  4. Preparação do reagente LAL
    1. Reconstitua o reagente LAL de acordo com o certificado de análise fornecida pelo fabricante.
      Nota: Consulte a seção de discussão para obter detalhes importantes sobre a preparação do reagente LAL. Consulte a Tabela de materiais para os detalhes a respeito do número de catálogo e aplicação de uma determinada formulação de reagente LAL em formato diferente do leite.

3. turbidez LAL ensaio

  1. Preparação dos padrões de calibração
    1. 900 µ l de água de grau LAL e 100 µ l do CSE, prepare diluições intermediárias como muitos conforme necessário para permitir a preparação de uma calibração padrão com um intervalo de concentração de 0.001 a 1 EU/mL.
    2. Primeiro rótulo tubos e adicionar 900 μL de água LAL grau em cada tubo. Em seguida, adicione 100 μL de 10 solutionn EU/mL para preparar padrão de calibração com concentração de 1EU/mL.
    3. Repita a série 10 vezes diluição conforme descrito acima para preparar três padrões de calibração inferiores. Verificar que quatro padrões de calibração que variam de 0,001 a 1 EU/mL foram preparadas.
  2. Preparação dos controles de qualidade
    1. Prepare um controle de qualidade EU/mL 0,05 combinando-se 50 µ l da 1 solução CSE EU/mL com 950 ml de água LAL-grau.
      Nota: Consulte a seção de discussão para obter detalhes sobre a preparação de controle.
  3. Preparação de controles de inibição/Enhancement (IEC)
    1. Prepare o IEC com concentração de 0,05 EU/mL através da combinação de 25 µ l da 1 solução CSE EU/mL e 475 µ l do nanomaterial de teste em uma determinada diluição.
      Nota: Consulte a seção de discussão para obter detalhes adicionais.
  4. Procedimento experimental
    1. Permitir que o instrumento aquecer por ligá-lo aproximadamente 30 min de antecedência. Set-up o comprimento de onda de deteção de 660 nm como isto é apropriado para o turbidity da LAL.
    2. Entrar digitando o nome de usuário e senha.
    3. Abra o software (Tabela de materiais), clicando no ícone correspondente na tela do computador.
    4. Selecione a coletar dados na tela inicial do software. Digite as informações de grupo de identificação e dados de teste no espaço correspondente na aba geral na tela inicial.
    5. Clique na guia Hardware escolha o tipo de instrumento de um menu dropdown.
    6. Set-up o comprimento de onda de deteção de 660 nm como isto é apropriado para a turbidez LAL, selecionando o método de turbidez LAL.
    7. Verifique se um número de série, ID de sistema e informações de porta serial aparecem na tela. Clique Okey. Clique Okey mais uma vez para confirmar.
    8. Insira o ID de amostra na mesma ordem que a amostra é testada. Use botões padrão para inserir o controlo negativo, amostras de curva e teste padrão.
    9. Preparar tubos duplicados para cada amostra e adicionar 200 µ l (teste de proporção 4:1) ou 100 µ l (teste de proporção 1:1) de controlo negativo (água), padrões de calibração, controle de qualidade, nanopartículas IEC e teste em tubos de vidro previamente rotulado.
    10. Adicione 50 µ l (teste de proporção 4:1) ou 100 µ l (teste de proporção 1:1) de reagente LAL ao primeiro teste frasco, vórtice que brevemente e insira no teste slot no carrossel do instrumento. Se a proporção de 1:1 é usada, o volume de reagente LAL é 100 µ l.
    11. Repita o procedimento descrito acima para as outras amostras. Processo de amostras de um de cada vez.
      Nota: Consulte a seção de discussão para mais detalhes.

4. cromogênico LAL

  1. Preparação de padrões de calibração
    1. 900 µ l de água de grau LAL e 100 µ l do CSE, prepare diluições intermediárias como muitos conforme necessário para permitir a preparação de um padrão de calibração com uma concentração de 1 EU/mL.
    2. Água de LAL-série 900 µ l e 100 µ l da 1 padrão de calibração EU/mL, prepare um segundo padrão de calibração em uma concentração de 0.1 EU/mL.
    3. Repita a série 10 vezes diluição conforme descrito acima para preparar dois mais baixos padrões de calibração. Verificar que quatro padrões de calibração que variam de 0,001 a 1 EU/mL foram preparadas.
  2. Elaboração de controles de qualidade.
    1. Prepare um controle de qualidade EU/mL 0,05 combinando-se 50 µ l da 1 solução CSE EU/mL com 950 ml de água LAL-grau.
      Nota: Consulte a seção de discussão para obter detalhes sobre a preparação de controle.
  3. Preparação de controles de inibição/Enhancement (IEC)
    1. Prepare-se 0,05 EU/mL combinando 25 μL da 1 solução CSE EU/mL com 475 μL de teste nanomaterial.
      Nota: Consulte a seção de discussão para obter detalhes adicionais.
  4. Procedimento experimental
    1. Permitir que o instrumento aquecer por ligá-lo aproximadamente 30 min de antecedência. Set-up o comprimento de onda de deteção de 405 nm como isto é apropriado para o turbidity da LAL.
    2. Abra o software clicando no ícone correspondente na tela do computador. Entrar digitando o nome de usuário e senha.
    3. Selecione a coletar dados na tela inicial do software. Insira informações de grupo de identificação e dados de teste no espaço correspondente na aba geral na tela inicial.
    4. Clique na guia Hardware escolha o tipo de instrumento de um menu dropdown. Escolha o instrumento.
    5. Verifique se um número de série, ID de sistema e informações de porta serial aparecem na tela. Clique Okey. Clique Okey mais uma vez para confirmar.
    6. Insira o ID de amostra na mesma ordem que a amostra é testada. Use botões padrão para inserir o controlo negativo, amostras de curva e teste padrão.
    7. Preparar tubos duplicados para cada amostra e adicionar 200 µ l (teste de proporção 4:1) ou 100 µ l (teste de proporção 1:1) de controlo negativo (água), padrões de calibração, controle de qualidade, nanopartículas IEC e teste em tubos de vidro previamente rotulado.
    8. Adicione 50 µ l (teste de proporção 4:1) ou 100 µ l (teste de proporção 1:1) de reagente LAL ao primeiro teste frasco, vórtice que brevemente e insira no teste slot no carrossel do instrumento. Se a proporção de 1:1 é usada, o volume de reagente LAL é 100 µ l.
    9. Repita o procedimento descrito acima para as outras amostras. Processo de amostras de um de cada vez.

5. gel-coágulo LAL

Nota: Este teste identifica a presença de endotoxinas na amostra baseado na observação visual e deteção de um coágulo no tubo de reação. As etapas experimentais são descritas abaixo. Use uma folha de bancada para gravar os resultados. Esta folha de banco não é obrigatória, e outras formas de gravar os resultados do ensaio são igualmente aceitáveis. Um exemplo de tal uma folha do banco é fornecido em materiais complementares para a conveniência de um leitor. Lambda (l) é a sensibilidade do ensaio do gel-coágulo e 0,03 EU/mL.

  1. Rotule como muitos tubos de reação conforme necessário para acomodar o número de amostras analisadas. Consulte a folha de banco para obter detalhes sobre o número de repetições usado na etapa 1, etapa 2 e etapa 3 do ensaio.
  2. Alíquotas de 100 μL de amostra de água, controles ou teste por tubo.
  3. Prepare o CSE tal que a concentração final é igual a 4λ.
  4. Combine a 100 μL do padrão mencionado acima com 100 μL de amostra de água ou teste para obter a concentração final do CSE de 2λ. Repita mais três vezes para conseguir lambda e metade-lambda e lambda de um quarto.
  5. Certifique-se de que a temperatura em banho-maria a 37 ° C.
  6. Adicionar 100 μL de lisado por tubo de ensaio, vórtice brevemente e coloque o Carré com todos os tubos em banho-maria por 1h.
  7. Inverta o tubo com um movimento suave.
  8. Resultados registros manualmente usando "+" (coágulo firme) ou "-" (sem coágulo ou coágulo solta) na folha de banco.
  9. Prosseguir com a análise de acordo com a USP aposta 854; use a folha de banco como material de apoio

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O exemplo de dados gerados após o teste esta formulação em ensaios LAL é mostrado na tabela 1. Doxorrubicina lipossomal peguilado interferiu com LAL cromogênico a diluição 5. No entanto, esta interferência foi superada pelo maiores diluições. Recuperação de Spike foi entre 50 e 200% quando esta formulação foi testada em diluições 50 e 500 turbidez e LAL cromogênico, bem como a diluição 5 na turbidez LAL. Quando ajustado pelo factor de diluição, os resultados foram consistentes entre as diluições em ambos os ensaios. Além disso, os resultados foram consistentes entre os três ensaio formatos.

Amostra de teste Turbidez LAL, EU/mg (spike recuperação, %) Cromogênico LAL, EU/mg, (spike recuperação, %) Gel-coágulo LAL, EU/mg (teste válido, sim ou não)
Doxorrubicina lipossomal peguilado (consulte a tabela de materiais)
Diluição 5 0,01 (141) interferência < 0.75 (Y)
Diluição 50 < 0.025 (187) 0,029 (82) < 1.5 (Y) *
Diluição 500 < 0,25 (182) < 0,25 (86) < 3 (Y) * *

Tabela 1: deteção da endotoxina em peguilado ensaios de doxorrubicina lipossomal usando LAL. Peguilado doxorrubicina lipossomal foi testada usando turbidez, cromogênico e gel-coágulo LAL ensaios. Interferência de amostra foi estimada usando IECs. Recuperação de pico é mostrada entre parênteses. Valores entre 50 e 200% são considerados aceitáveis de acordo com a USP aposta 85 padrão para endotoxina deteção4. * e * * os resultados de teste desta amostra foram obtidos em diluições 100 e 200, respectivamente. As diluições de ensaio do gel-coágulo são diferentes daqueles usados em cromogênico e turbidez LAL porque a sensibilidade e a máxima diluição válida deste teste é menor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

As informações fornecidas neste protocolo tem sido descritas antes15,26 e se baseia em vários documentos normativos publicados pela Food e Drug Administration (FDA ou FDA) e farmacopeia dos Estados Unidos (USP)4 , 5 , 6 , 27e também está disponível no site NCL20 em protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.3 (gel-coágulo LAL) e STE1.4 (LAL cromogênico).

Teste-nanomateriais são preparados em água reagente LAL ou PBS estéril, livre de pirogênio. O pH da amostra do estudo é importante porque pH alto (> 8) e baixo (< 6) irão interferir com o desempenho ideal do lisado. Se o pH do teste-nanopartículas está fora do intervalo de 6-8, pode ser ajustado usando apirógena hidróxido de sódio ou ácido clorídrico. Quando esse ajustamento é executado, é vital para evitar a contaminação da amostra de microeletrodos. Portanto, para executar este procedimento, uma pequena alíquota da amostra é removida em um tubo separado e usada para medir o pH.

Quando a amostra é preparada em PBS ou outra reserva, a reserva em branco também está incluída neste teste. A concentração de cada nanomaterial é específica. O teste é usado para estimar a quantidade de contaminantes endotoxina por miligrama do ingrediente farmacêutico ativo (API). No entanto, dependendo do tipo de nano-formulação, a concentração pode também ser estimada em mg da formulação total ou total elemento (ex., ouro, prata ou de ouro, prata e nanopartículas de óxido de ferro, ferro, respectivamente). A amostra é testada do estoque usando várias diluições não superior o MVD. Todas as diluições das teste-nanopartículas são preparadas com água LAL-grau.

Três parâmetros são usados para calcular o MVD. Eles são o limite de endotoxina (EL), a concentração da amostra e o ensaio de sensibilidade (λ)4. Use a seguinte fórmula para calcular o limite de endotoxina (EL): EL = K/M, onde K é uma dose de pirogênio limiar (EG., 5 EU/kg como discutido na introdução) e M é a dose máxima do nanomaterial teste destinado a administração por quilograma de corpo peso em uma única hora4. Como discutido acima, a estimativa de EL para nanomateriais utilizados como radiofarmacêutico ou como dispositivo médico depende de uma dose de limiar pirogênicas ou fórmula, que é diferente de 5/M. Esses detalhes são mencionados na introdução e podem ainda ser revistos na USP e FDA diretrizes4,5,6. O limite de endotoxina recomendados para soluções oftálmicas e dispositivos intra-oculares é fornecido na orientação do FDA para estes produtos6. Quando um modelo animal (ex., rato) foi usado para estabelecer a dose de nanoformulation, esta informação é usada para estimar a dose equivalente humana chamada (HED). O HED é calculado dividindo-se a dose de animais por um fator de conversão, que é específico para cada espécie animal. Por exemplo, o fator de conversão é 12.3, 6.2 e 3.1 para o rato, o rato e o coelho, respectivamente,27. O procedimento de conversão e justificativa para usá-lo são descritas em detalhes na FDA diretriz27. Terapêutica do câncer muitas vezes são dosados por expresso em mg/m2de área de superfície do corpo. Um pode seguir a diretriz da USP para calcular EL para drogas dosadas em miligrama por metro quadrado ou converter esta dose gama mg/kg. A dose em mg/m2 pode ser ajustada para a dose em mg/kg, usando uma espécie de fator de conversão de27. Para um ser humano adulto, é indicado como Km para referir-se a massa constante27e 37. O fator de km tem unidades de kg/m2; é igual ao peso do corpo em quilogramas (kg) divididas pela área da superfície em metros quadrados (m2)27. Por exemplo, uma dose humana ou HED de 74 mg/m2 corresponde a 2 mg/kg ou 74/37. Para determinar a MVD, use a seguinte fórmula, que também está disponível a partir do padrão de USP aposta 85: MVD = (EL x concentração de amostra) / λ)4. Em um cenário hipotético, uma concentração de amostra de nanopartículas é de 10 mg/mL e sua dose máxima no mouse é 615 mg/kg. Neste caso, o HED é 615/12,3 = 50 mg/kg; EL para todas as rotas, exceto intratecal é 0.1 EU/mg (5 kg/EU/50 mg/kg) e MVD é 1.000 ((0.1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 EU/mL).

Muitas vezes, quando um precisa avaliar a contaminação de endotoxinas em um nanomaterial grau de investigação, as informações de dose não estão disponíveis. Não há nenhum processo harmonizado de como estimar o MVD e EL por estes materiais. Este estudo de caso realiza o teste diretamente do estoque (comumente a concentração desta solução é de 1 mg/mL) e em várias diluições, geralmente 5, 50, 500 - e 5.000 dobras. Quando a dose, a via de administração, a concentração da amostra e a infusão tempo para a mudança do nanomaterial determinado teste, o EL e MVD também mudam. Portanto, um tem que avaliar as informações e realizar estimativa de EL e MVD no contexto de outros parâmetros relacionados com a quantidade, o tempo, se destina a via de administração e concentração da formulação dada.

É importante notar que o número de catálogo e especificações do produto (ex., potência, eleva-se por frasco) do CSE são diferentes para diferentes formatos LAL. O CSE usado na turbidez que Lal também pode ser usado em um gel-coágulo LAL. No entanto, o CSE para uma cromogénico LAL é específico para esse formato de ensaio. As instruções abaixo são gerais e aplicáveis para o CSE usado em todos os formatos de ensaio. O CSE é um Escherichia coli lipopolissacarídeo (LPS) fornecido como um pó liofilizado. Esta norma é certificada pelo fabricante contra uma referência padrão endotoxinas (RSE) com uma concentração conhecida. O conteúdo do frasco contendo o CSE deve ser reconstituído com ~3.2 - 5,0 mL de água de reagente LAL livre de pirogênio. Além da diferença entre CSE utilizado para ensaio de diferentes formatos, o volume de reconstituição também é específico para cada lote desta norma. Portanto, um tem que calcular a concentração final da solução CSE para cada lote da norma. O cálculo é efetuado com base na potência de norma e a quantidade contida em cada frasco. O certificado de análise específico para cada lote de endotoxina padrão contém as informações sobre a potência e a quantidade por frasco. Deve-se rigorosamente vórtice o padrão para 30-60 segundos, durante a reconstituição e durante o uso. Também é recomendável realizar a reconstituição usando 5-10 min, fixando-se vezes e sobre um 30-60 minutos de tempo para garantir que tudo liofilizado material entra em solução. Antes de utilizar no ensaio, equilibrar o estoque CSE, à temperatura ambiente. Após a reconstituição, o estoque CSE pode ser refrigerado para o armazenamento e é estável durante quatro semanas.

Semelhantes para o CSE, o reagente LAL também é específico para cada formato. As instruções abaixo são gerais e aplicáveis a todos os formatos de ensaio LAL. O reagente LAL é fornecido como um pó liofilizado. As recomendações do fabricante são seguidas para reconstituir cada frasco. Água de grau LAL ou buffer de inibição da beta-glucans pode ser usado. O buffer de inibição da beta-glucans é preferido neste estudo de caso porque permite excluir a interferência do beta-glucanos. Esta interferência de falso-positivo é muito comum em nanomateriais porque filtros de acetato de celulose são comumente usados durante a síntese de nanomateriais e servem como uma fonte de contaminação de glucan15. A maioria dos frascos exigirá a reconstituição de um volume final de 5 mL. Com base em mais de 10 anos de experiência dos autores com este ensaio, foi notado que a inclusão desse buffer retarda a reação e pode exigir aumentando o tempo de latência máxima nas configurações do instrumento para permitir que o calibrador menor em um concentração de 0,001 EU/mL para desenvolver.

Para garantir precisa diluição durante a elaboração de normas, é recomendável usar 10 vezes as etapas de diluição. Diluições de 10 vezes em série podem ser preparadas pela cravação 100 µ l de estoque ou de uma norma com maior concentração em 900 µ l de água livre de pirogênio. Desde que a concentração da unidade populacional CSE é geralmente alta (~ 1.000 EU/mL), preparação de diluições intermediárias com concentrações de 100 e 10 EU/mL é recomendado antes de preparar o calibrador de ensaio com uma concentração de 1 EU/mL. Dois rácios entre a amostra e lisado são descritos no presente protocolo. Mesmo que ambos os rácios são comumente usados, a linearidade da curva é aceitável, mas não é o ideal quando a proporção de 4:1 e buffer de inibição da beta-glucanos (consulte a Tabela de materiais) são utilizados.

As mesmas regras conforme descrito acima, em matéria de preparação padrão de calibração também se aplicam à elaboração de controles de qualidade (QC). Esses controles são usados para verificar se o teste está funcionando corretamente. É preparado pela cravação a quantidade conhecida do CSE na água livre de pirogênio. A concentração do QC é geralmente escolhida no meio do intervalo de ensaio. O intervalo do ensaio LAL turbidez é 0.001 a 1 EU/mL. Portanto, um QC na concentração de 0,05 EU/mL é usada. Outras concentrações dentro do intervalo de ensaio também podem ser usadas na preparação do controle da qualidade.

O controle de aprimoramento de inibição (IEC) é também conhecido como controle positivo do produto (PPC). É preparado pela cravação uma concentração conhecida do CSE para a amostra de teste. A concentração do IEC (PPC) é geralmente escolhida no meio do intervalo de ensaio. O intervalo do ensaio LAL turbidez é 0.001 a 1 EU/mL. Portanto, o IEC numa concentração de 0,05 EU/mL é usada. Para preparar este IEC um precisa combinar 50 µ l da 1 solução CSE EU/mL com 950 µ l de teste-nanopartículas. O IEC é preparado para cada diluição de um nanomaterial-teste. Por exemplo, se um nano-formulação testada em três diluições (01:50, 1: 500 e 1:5, 000), um tem que preparar três IECs, um para cada uma dessas diluições. Outras concentrações dentro do intervalo de ensaio também podem ser usadas para preparar a amostra IEC. Este controle é usado para entender a validade dos resultados dos testes para a formulação nano-determinado. De acordo com a USP, os resultados do teste são válidos se a recuperação de pico do IEC (PPC) é entre 50 e 200%4. Pico recuperação, menos de 50% significa que o teste-nanomaterial inibe a detecção de endotoxinas e, portanto, o teste resulta contaminação de endotoxina subestima e é inválida. Recuperação de pico mais de 200% sugere que o material de teste melhora o resultado do ensaio ou contém um nível muito alto de endotoxina do contaminante. No caso de realce, o resultado do ensaio também é impreciso. Exemplos de tais interferências e algumas maneiras de superá-las têm sido descritos anterior12,15.

Ao realizar a turbidez e ensaios cromogênico, é recomendável usar uma pipeta Repetidora para adicionar o reagente LAL para todas as amostras. O tempo de operação do instrumento média é 7200 segundos. No entanto, a reação pode ser mais rápido ou mais lento com certos lotes do lisado. Em casos, quando a reação é lenta, um pode precisar alterar as configurações do instrumento de 9600s ou mais. Essa alteração permitirá que o calibrador menor desenvolver.

Doxorrubicina lipossomal peguilado é uma formulação que contém um ingrediente farmacêutico ativo (API) em uma concentração de 2 mg/mL. É usado na clínica como uma dose de 50 mg/m2. Para converter esta dose gama mg/kg, é dividido pelo fator 3727. A dose de peguilado doxorrubicina lipossomal em mg/kg, portanto, é de 1,35. Para calcular EL, 5 (a dose limiar pirogênio em EU/kg) é dividido por 1,35 (a dose de Doxil em mg/kg) e obter 3.7 EU/mg4. Este número significa que a doxorrubicina lipossomal peguilado na dose de 1,35 mg/kg pode ser administrada com segurança por hora única se endotoxina na formulação não exceda EU 3.7/mg, onde mg refere-se à API.

Em seguida, use essas informações para calcular o MVD para ensaios LAL. A sensibilidade (lambda), da turbidez, cromogênico e ensaios de gel-coágulo apresentados neste estudo é 0,001, 0,001 e 0,03 EU/mL, respectivamente. Portanto, o MVD é 7.407 para turbidez e ensaios cromogênico ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 EU/mL) e 247 para o ensaio de gel-coágulo ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 EU/mL).

Doxorrubicina tem um espectro de absorbância amplo que se sobrepõe com comprimento de onda do ensaio do cromogênico LAL28,29. Além disso, a maioria das formulações de lipossomas são turvas e aparecem leitosas. Esta turvação inerente é a razão muito comum para a interferência de lipossomas com ensaio de turbidez. No caso de doxorrubicina lipossomal peguilado, a interferência devido a turbidez foi superada por diluição cinco como evidenciado pelos valores de recuperação de pico entre 50 e 200% (tabela 1). No entanto, a mesma doxorrubicina diluição concentração era ainda é alta o suficiente para interferir com o LAL cromogênico (tabela 1). Duas diluições subsequentes (50 e 500) ajudaram a superar a interferência de doxorrubicina lipossomal peguilado com LAL cromogênico. Desde que o ensaio de gel-coágulo é independente de turbidez e cor da amostra, e o nível de endotoxinas na formulação está dentro do intervalo de gel-coágulo, a doxorrubicina lipossomal peguilado não interferiu com o ensaio de gel-coágulo diluições em tudo testadas. Neste estudo de caso, utilizaram-se várias diluições de doxorrubicina lipossomal peguilado para estes ensaios. As diluições de 5, 50 e 500 para turbidez e cromogênico, bem como 50, 100 e 200 para o ensaio de gel-coágulo foram escolhidas porque eles estão dentro do MVD. O MVD do ensaio do gel-coágulo é menor do que a turbidez e cromogênico larissa leite porque a sensibilidade deste teste é também menor. Se a formulação interferido com o leite a diluição 500 na turbidez e ensaios cromogênico, a análise em diluições maiores (por exemplo, 5.000, 6.000, 7.000 ou 7.407) poderia ser realizada. Desde que o nível de endotoxina obtido a diluição 50 no ensaio de gel-coágulo foi abaixo do EL, a análise da formulação em diluições menores não foi realizada. No entanto, em outros casos, o teste poderia ser continuou em diluições de 20, 10, 5 ou 2 para identificar o mais baixo, não interferindo a diluição e entender se o nível de endotoxina na formulação é inferior a EL.

É importante mencionar que para o ensaio de gel-coágulo é essencial para desligar a função de circulação de água em banho-maria para a duração deste teste ou usar um banho de água sem essa opção, porque o fluxo de água danifica o coágulo e pode afetar a precisão do g ensaio LAL El-coágulo. Não é sempre possível superar a interferência de nanopartículas com ensaios LAL, aumentando as diluições da amostra. Estratégias e algumas abordagens para a superação de vários tipos de interferência e exemplos de nanopartículas comumente representando um problema para os ensaios LAL foram discutidos por outros grupos e nos outro lugar12,13,14 ,15,30,31. A análise apresentada neste manuscrito é baseada em uma formulação modelo. A experiência com outros nanoformulations pode ser diferente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

O estudo foi apoiado por fundos federais do Instituto Nacional de câncer, National Institutes of Health, sob contrato HHSN261200800001E. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do departamento de saúde e serviços humanos, nem faz menção de nomes comerciais, produtos comerciais, ou organizações implicam o endosso pelo governo dos EUA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36, (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11, (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4, (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. Bacterial Endotoxins Test. (2011).
  5. FDA, U. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. (2012).
  6. FDA, U. Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44, (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19, (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409, (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220, (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5, (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9, (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. NCL. NCL assay cascade. Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015).
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4, (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9, (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33, (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160, (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31, (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9, (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11, (9-10), 1157-1175 (2017).
Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter