Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

Обнаружения эндотоксинов в инженерии наноматериалов представляет собой один из Гранд вызовы в области наномедицины. Здесь мы представляем тематическое исследование, которое описывает платформу, состоящий из трех различных форматов Лал оценить потенциальное загрязнение эндотоксина в наночастиц.

Abstract

Когда присутствует в фармацевтической продукции, грамотрицательных бактериальных клеточных стенок компонент эндотоксина (часто также называют липополисахарида) может вызвать воспаление, лихорадка, гипо - или гипертензия и, в крайних случаях, может привести к повреждения тканей и органов, которые может стать смертельным. Таким образом, количество эндотоксина в фармацевтической продукции, строго регламентированы. Среди методов, доступных для обнаружения эндотоксинов и количественной оценки пробирного Limulus Lysate Amoebocyte (Лал) широко используется во всем мире. Хотя любой фармацевтический продукт может мешать Лал assay, нано составы представляют собой особую проблему из-за их сложности. Этот документ призван служить практическим руководством для исследователей неопытных в оценке эндотоксинов в инженерии наноматериалов и сформулированы наночастиц наркотиков. Здесь обсуждаются практические рекомендации для выполнения трех Лал форматов, включая мутность, Хромогенный и гель сгусток анализов. Эти анализы могут использоваться для определения эндотоксина загрязнения на основе нанотехнологий лекарственных препаратов, вакцин и адъювантов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Эндотоксина является строительным блоком грамотрицательных бактериальных клеточных стенок1,2. Он может активировать клетки иммунной системы в очень низкой концентрации (пикограмм)1,2. Провоспалительных медиаторов (цитокинов, лейкотриенов, эйкозаноидов, и т.д.) производятся клетками в ответ на эндотоксина отвечают за лихорадка, гипотония, гипертония и более серьезные проблемы здравоохранения, включая несколько полиорганной недостаточности 1 , 2 , 3. тяжесть иммунной опосредованного побочных эффектов, вызванных эндотоксина зависит от его потенции определяется эндотоксина состав и структура и измеряется в международных эндотоксина единиц (IUs или EUs)3. Количество этих единиц на килограмм массы тела используется для задания порога пирогенных дозы эндотоксина. Эта доза является 5 ЕС/кг для лекарственных средств осуществляется через все маршруты но Интратекальное маршрут. Препараты, дозированной на квадратный метр поверхности тела, внутриглазной жидкости, радиофармацевтические препараты и продукты управляемых через Интратекальное маршрута имеют разные порог пирогенных дозу, которая составляет 100 ЕС/м2, 0,2 ЕС/мл, 175 ЕС/V (где V- объем продукта, предназначенные для администрирования) и 0,2 ЕС/кг, соответственно4. Подробнее о порог пирогенных дозы для различных лекарственных средств и устройств предоставляются и обсуждаться в другом месте4,5,6.

Животные отличаются в их чувствительность к эндотоксинов опосредованной реакций. Среди наиболее чрезвычайно чувствительны к эндотоксинов3видов людей, нечеловеческих приматов и кроликов. Чтобы избежать эндотоксинов опосредованной побочных эффектов у пациентов и предотвратить неточные выводы доклинических токсичности и эффективности исследований, важно для точного выявления и количественной оценки эндотоксинов в обе формулировки доклинические и клинические класса. Несколько имеющихся в настоящее время методов можно добиться выполнения этой задачи. Одним из них является assay Limulus Lysate Amoebocyte (Лал), который широко используется во всем мире для экрана биомедицинских продуктов для потенциальных эндотоксина загрязнения, а также относительно выявления бактериальных инфекций7,8,9. Lysate готовится из amoebocytes, клетки присутствует в крови подковы крабов Limulus Полифема проживающих в Восточном берегу континента Северной Америке7. Интересно, что есть несколько различных видов подковы крабов (Tachypleus gigas и Tachypleus tridentatus) в Азии10. Tachypleus Lysate Amoebocyte (Таль) используется в нескольких странах Азии для обнаружения эндотоксинов аналогичны как Лал используется в других cuntries10. Лизатов (Лал и Таль) содержат группы белков, которые после активации предоставляют активности протеаз. Один из этих белков, так называемый фактор C активируется при контакте с эндотоксин. Активированный фактор C расщепляет фактор B, который в свою очередь также становится протеазы и расщепляет про свертывания фермента производить фермент свертывания крови. Результатом этой цепи реакций является формирование гель, увеличение образца мутности и, при наличии Хромогенный субстрат, появление цветных продукта, которые служат основой для гель сгусток, мутность и хромогенных анализов, соответственно. Пока не существует обязательной Лал формата, США продуктов питания и медикаментов (FDA) объясняет в руководстве для промышленности документа, что в случае расхождения в результатах теста между различными форматами Лал, решение принимается на основании гель сгусток assay5 .

Многие часто используемые Лабораторные химикаты (например., ЭДТА) и известных наркотиков продуктов (например, пенициллин) вмешиваться в Лал assays11. Вмешательство обычно определяется путем оценки восстановления стандартных эндотоксина шипами в известных концентрациях в решение, содержащее тестовый материал. Если Спайк восстановления менее чем 50% или более чем на 200%, то в результате Лал проба для данного испытания материал является недопустимым из-за торможения или повышение, соответственно4. Составы на основе нанотехнологий часто сложны и мешать Лал через различные механизмы12,,1314. Были описаны многие подходы для преодоления вмешательства: пример воссоздания в конкретных буферов и ПАВ, инактивация белка путем нагревания, уничтожение липидов-материалов на основе полых путем нагрева и дополняющего образца с избытком двухвалентной катионов5,12,13,14,15. Также были описаны альтернативные методы для ситуаций, когда Лал вмешательство не может преодолеть: ELISA, мобильный репортер ГЭС-TLR4 линия пробирного и масс-спектрометрии16,,1718, 19.

Здесь описаны экспериментальной процедуры для проведения гель сгусток, мутность и хромогенных Лал анализов. Эти анализы также доступны на веб-сайт Лаборатории характеристика нанотехнологий (NCL)20 в протоколах STE1.2 (мутность Лал), STE1.3 (гель сгусток Лал) и STE1.4 (хромогенных Лал). Рекомендуется проводить по крайней мере два различных форматов характеризовать же нано разработке. Когда результаты мутность и хромогенных Лал согласны, гель сгусток результаты считаются5. Когда результаты двух форматов Лал согласны, дополнительные исследования с использованием Моноцит активации тест (мат) или кролик пирогена тест (RPT) для проверки Лал выводы, провел21. Важно отметить, что каждый метод, используемый для обнаружения эндотоксинов и pyrogenicity оценки имеет свои преимущества и недостатки21,,2223,24. Признавая ограничения процедуры, используемые для характеристики данного нанотехнологии формулировка имеет важное значение для получения научного обоснования оптимального для этого нано разработки процедуры для использования.

В этом исследовании Пегилированный липосомальных доксорубицин был использован как формулировка наночастиц модели. Эта формулировка был одобрен FDA США в 1995 году и используется для лечения раковых больных во всем мире25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. подготовка проб наночастиц

  1. Подготовьте исследование образца в Лал класс воды.
  2. Если образец pH находится за пределами диапазона 6-8, настройте pH с помощью пирогена свободного гидроксида натрия или соляной кислоты.
  3. С помощью Лал класс воды подготовить несколько разведений исследование образца. Убедитесь, что высокого разрежения не превышает максимально допустимые разрежения (МВД). Обратитесь к разделу обсуждения для подробной информации о МВД оценки.

2. Подготовка реагентов общего между форматами Лал

  1. Разбавьте концентрированный гидроксида натрия складе с использованием свободных пирогена Лал реагента воды приготовить рабочий раствор в концентрации 0,1 н.
  2. Разбавить фондовой концентрированной соляной кислоты с помощью пирогена свободной воды Лал реагента и приготовить рабочий раствор в конечной концентрации 0,1 н.
  3. Подготовка элемента управления стандартный эндотоксина (CSE)
    1. Воссоздать CSE согласно сертификатом анализа, поставляемые производителем.
      Примечание: Обратитесь к разделу обсуждения для важные примечания относительно информации, представленной в сертификате. Обратитесь к Таблице материалов для деталей относительно номер каталога и применения данного CSE разработки в различных форматах Лал.
  4. Подготовка реагента Лал
    1. Воссоздать Лал реагента по данным сертификатом анализа, предоставляемых производителем.
      Примечание: Обратитесь к разделу обсуждения для важные детали относительно подготовки Лал реагента. Обратитесь к Таблице материалов для деталей относительно номер каталога и применения данной формулировки Лал реагента в другом формате Лал.

3. мутности Лал Assay

  1. Подготовка стандартов калибровки
    1. С помощью 900 мкл Лал класс воды и 100 мкл CSE, подготовьте столько промежуточных разведениях как необходимо включить подготовку эталоном с диапазоном концентрации от 0,001 до 1 ЕС/мл.
    2. Первый этикетке трубки и добавить 900 мкл воды Лал класса в каждую пробирку. Затем добавьте 100 мкл 10 ЕС/мл solutionn подготовить стандарт калибровки с концентрацией 1EU/мл.
    3. Повторите серийный десятикратного разрежения, как описано выше, подготовить три нижних стандартов калибровки. Убедитесь, что были подготовлены четыре калибровочных стандартов, начиная от 0,001 до 1 ЕС/мл.
  2. Подготовка процедур контроля качества
    1. Подготовьте 0,05 контроля качества ЕС/мл, объединяя 50 мкл раствора 1 КСЭ ЕС/мл с 950 мкл воды Лал класса.
      Примечание: Обратитесь к разделу обсуждения относительно управления подготовки.
  3. Подготовка контроля ингибирования/повышение (IEC)
    1. Подготовьте IEC с концентрации 0,05 ЕС/мл, объединяя 25 мкл КСЭ ЕС/мл раствора 1 и 475 мкл Наноматериал тест на данной разрежения.
      Примечание: Обратитесь к разделу обсуждения для получения дополнительной информации.
  4. Экспериментальная процедура
    1. Разрешить инструмент для разминки, повернув его на приблизительно 30 мин заранее. Настройка обнаружения волны до 660 нм, как это подходит для мутность Лал.
    2. Войдите, введя имя пользователя и пароль.
    3. Откройте программное обеспечение (Таблица материалов), нажав на соответствующий значок на экране компьютера.
    4. Выберите собирать данные на домашнем экране программного обеспечения. Введите тест ID и данные группы информацию в соответствующее пространство на вкладке Общие на домашнем экране.
    5. Нажмите на вкладку аппаратное обеспечение выберите тип документа из ниспадающего меню.
    6. Настройка обнаружения волны до 660 нм как это подходит для мутность Лал, избрав метод Лал мутность.
    7. Убедитесь, что серийный номер, идентификатор системы и последовательный порт информация отображаются на экране. Нажмите кнопку ОК. Нажмите кнопку OK еще раз для подтверждения.
    8. Введите идентификатор образца в том же порядке, протестированных образцов. Используйте кнопки по умолчанию для ввода отрицательного контроля, стандартной кривой и испытаний образцов.
    9. Подготовьте дубликаты трубы для каждого образца и добавить 200 мкл (коэффициент 4:1 тест) или 100 мкл (тест соотношение 1:1) отрицательного контроля (вода), калибровки стандартов, контроль качества, IEC и тест наночастиц в предварительно помечены стеклянных трубок.
    10. Добавьте 50 мкл (коэффициент 4:1 тест) или 100 мкл (тест соотношение 1:1) реагента Лал первый тест флакон, вихря, он кратко и вставить в тест слот в инструмент карусель. Если используется соотношение 1:1, объем реагента Лал-100 мкл.
    11. Повторите процедуру, описанную выше для других образцов. Процесс образцов по одному.
      Примечание: Обратитесь к разделу обсуждения для получения более подробной информации.

4. хромогенных Лал

  1. Подготовка стандартов калибровки
    1. С помощью 900 мкл Лал класс воды и 100 мкл CSE, подготовьте столько промежуточных разведениях как необходимо включить подготовку калибровки стандартных с концентрацией 1 ЕС/мл.
    2. С помощью 900 мкл Лал класс воды и 100 мкл 1 ЕС/мл эталоном, подготовьте второй стандарт калибровки в концентрации 0,1 ЕС/мл.
    3. Повторите серийный десятикратного разрежения, как описано выше, подготовить два нижних стандартов калибровки. Убедитесь, что были подготовлены четыре калибровочных стандартов, начиная от 0,001 до 1 ЕС/мл.
  2. Подготовка служб контроля качества.
    1. Подготовьте 0,05 контроля качества ЕС/мл, объединяя 50 мкл раствора 1 КСЭ ЕС/мл с 950 мкл воды Лал класса.
      Примечание: Обратитесь к разделу обсуждения относительно управления подготовки.
  3. Подготовка контроля ингибирования/повышение (IEC)
    1. Готовят 0,05 ЕС/мл, объединяя 25 мкл раствора 1 КСЭ ЕС/мл с 475 мкл Наноматериал теста.
      Примечание: Обратитесь к разделу обсуждения для получения дополнительной информации.
  4. Экспериментальная процедура
    1. Разрешить инструмент для разминки, повернув его на приблизительно 30 мин заранее. Настройка обнаружения волны до 405 нм как это подходит для мутность Лал.
    2. Откройте программное обеспечение, нажав на соответствующий значок на экране компьютера. Войдите, введя имя пользователя и пароль.
    3. Выберите собирать данные на домашнем экране программного обеспечения. Введите тест ID и данные группы информацию в соответствующие места на вкладке Общие на домашнем экране.
    4. Нажмите на вкладку аппаратное обеспечение выберите тип документа из ниспадающего меню. Выберите инструмент.
    5. Убедитесь, что серийный номер, идентификатор системы и последовательный порт информация отображаются на экране. Нажмите кнопку ОК. Нажмите кнопку OK еще раз для подтверждения.
    6. Введите идентификатор образца в том же порядке, протестированных образцов. Используйте кнопки по умолчанию для ввода отрицательного контроля, стандартной кривой и испытаний образцов.
    7. Подготовьте дубликаты трубы для каждого образца и добавить 200 мкл (коэффициент 4:1 тест) или 100 мкл (тест соотношение 1:1) отрицательного контроля (вода), калибровки стандартов, контроль качества, IEC и тест наночастиц в предварительно помечены стеклянных трубок.
    8. Добавьте 50 мкл (коэффициент 4:1 тест) или 100 мкл (тест соотношение 1:1) реагента Лал первый тест флакон, вихря, он кратко и вставить в тест слот в инструмент карусель. Если используется соотношение 1:1, объем реагента Лал-100 мкл.
    9. Повторите процедуру, описанную выше для других образцов. Процесс образцов по одному.

5. гель сгусток Лал

Примечание: Этот assay определяет наличие эндотоксинов в образце на основе визуального наблюдения и обнаружения сгусток в пробке реакции. Экспериментальные шаги описаны ниже. Используйте лист скамейке для записи результатов. Это скамейке листа не является обязательным, и другие способы записи результатов анализа также являются приемлемыми. Пример такого листа скамейке приводится в дополнительных материалах для удобства читателя. Лямбда (l) является чувствительность гель сгусток пробирного и 0,03 ЕС/мл.

  1. Ярлык столько реакции трубы, как требуется, чтобы вместить количество анализируемых проб. Обратитесь к скамейке лист для подробной информации о количестве повторных измерений, используемых в шаге 1, шаг 2 и шаг 3 assay.
  2. Аликвота 100 мкл воды, элементы управления или тестирования образца в трубку.
  3. Подготовьте CSE, таким образом, что конечная концентрация равна 4λ.
  4. Объединить 100 мкл упомянутых выше с 100 мкл воды или тестирования образца для достижения конечной концентрации CSE 2λ стандарта. Повторите три раза для достижения лямбда и половину лямбда и четверти лямбда.
  5. Убедитесь, что температура в ванне воды 37 ° C.
  6. Добавить 100 мкл lysate в пробирку, вихревой кратко и место стойки с все трубы в ванну воды для 1 h.
  7. Инвертируйте трубку с плавным движением.
  8. Запишите результаты, используя «+» (фирмы сгусток) или «-» (не сгусток или потерять сгусток) на листе скамейке.
  9. Продолжите анализ в соответствии с USP ставка 854; используйте лист скамейке как вспомогательные материалы

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В таблице 1приведен пример данных, сформированное после тестирования эта формулировка в Лал анализов. Пегилированный липосомальных доксорубицин вмешивались хромогенных Лал при разбавлении 5. Однако это вмешательство было преодолено больше разведений. Спайк восстановления был между 50 и 200%, когда эта формулировка была протестирована в разведениях 50 и 500 в мутность и хромогенных Лал, а также при разбавлении 5 в мутность Лал. Когда регулируется коэффициент разрежения, результаты согласуются между разведений в обоих анализов. Кроме того результаты согласуются между тремя пробирного форматов.

Испытательный образец Мутность Лал, ЕС/мг (Спайк восстановления, %) Хромогенный Лал, ЕС/мг, (Спайк восстановления, %) Гель сгусток Лал, ЕС/мг (тест действительный, да или нет)
Пегилированный липосомальных доксорубицин (см. таблицу материалы)
Разрежения 5 0.01 (141) вмешательство < 0,75 (Y)
Разбавление 50 < 0,025 (187) 0,029 (82) < 1.5 (Y) *
Разбавление 500 < 0,25 (182) < 0,25 (86) < 3 (Y) **

Таблица 1: обнаружения эндотоксинов в Пегилированный липосомальных доксорубицина с помощью Лал assays. Пегилированный протестированных липосомальных доксорубицин, мутность, Хромогенный и гель сгусток Лал assays. Пример вмешательства оценивалась с использованием ИННЦ. Спайк восстановления отображается в скобках. Значения между 50 и 200% считаются приемлемым согласно 85 Бет USP Стандартный для эндотоксина обнаружения4. * и ** были получены результаты тестирования этого образца в разведениях 100 и 200, соответственно. Гель сгусток пробирного разведений отличаются от тех, которые используются в хромогенных и мутность Лал потому, что чувствительность и максимальный допустимый разрежения этот assay ниже.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Информация, представленная в настоящем протоколе было описано до15,26 и опирается на ряд нормативных документов, опубликованных в США продуктов питания и медикаментов (FDA, США или FDA) и Фармакопеи США (USP)4 , 5 , 6 , 27, а также доступен на веб-сайте NCL20 в протоколах STE1.2 (мутность Лал), STE1.3 (гель сгусток Лал) и STE1.4 (хромогенных Лал).

Тест наноматериалы готовятся в Лал реагента воды или стерильной, пирогена бесплатные PBS. PH исследование образца важно, потому что температура (< 6) и высокой (> 8) рН будет вмешиваться с оптимальной производительностью lysate. Если рН тест наночастиц находится за пределами диапазона 6-8, может регулироваться с помощью свободных пирогена гидроксида натрия или соляной кислоты. Когда такая корректировка производится, жизненно важно чтобы избежать контаминации образцов от микроэлектродные. Таким образом для выполнения этой процедуры, небольшой Алиготе образца удаляется в отдельную трубу и используется для измерения рН.

Когда образец подготовлен в PBS или другой буфер, пустой буфер также включены в этот тест. Концентрация каждого Наноматериал каждого конкретного случая. Тест используется для оценки количества загрязняющих эндотоксина на миллиграмм активных фармацевтических ингредиентов (API). Однако, в зависимости от типа нано формулировка, концентрации могут также быть оценены мг всю рецептуру или общий элемент (например., золото, серебро или железа для золота, серебра и наночастиц оксида железа, соответственно). Образец тестируется на складе, используя несколько разведений, не превышающей МВД. Все разведения теста-наночастиц готовятся с использованием воды Лал класс.

Три параметра используются для вычисления МВД. Они являются предел эндотоксина (EL), концентрация образца и анализа чувствительности (λ)4. Используйте следующую формулу для вычисления эндотоксина предел (EL): EL = K/M, где K является доза пирогена порога (например., 5 ЕС/кг как описано во введении) и M является максимальная доза тест Наноматериал, предназначенные для администрирования на килограмм тела Вес в один час4. Как обсуждалось выше, оценка Эль для наноматериалов, используется как радиофармпрепарата или как медицинское устройство опирается на порог пирогенных дозы или формула, которая отличается от 5/М. Эти детали в введении упоминаются и может быть продолжено в USP и США FDA руководящих принципов4,5,6. Рекомендуется эндотоксина предел для офтальмологических решения и внутриглазных устройств предоставляется в США FDA руководства для этих продуктов6. Когда Животные модели (например., мышь) был использован для установления доза nanoformulation, эта информация используется для оценки так называемых человека эквивалентной дозы (HED). HED рассчитывается путем деления животного доза коэффициент пересчета, который специфичен для каждого животного вида. Например коэффициент пересчета составляет 12,3, 6.2 и 3.1 для мыши, крысы и кролик, соответственно27. Процедура преобразования и обоснования для его использования описаны подробно в США FDA руководящего положения27. Терапия рака часто дозированной на площади поверхности тела, выраженная в мг/м2. Можно либо следовать рекомендации USP для вычисления Эль наркотиков дозируется в миллиграмм на квадратный метр или преобразовать эта доза мг/кг диапазон. Доза в мг/м2 может настраиваться в дозе с помощью вегетационных коэффициент пересчета27мг/кг. Для взрослого человека это указывается как Km сослаться массы постоянно27и 37. Фактор км имеет единиц кг/м2; он равен вес тела в килограммах (кг), деленная на площади поверхности в27квадратных метров (2m). Например человека доза или HED 74 мг/м2 соответствует 2 мг/кг или 74/37. Чтобы определить МВД, используйте следующую формулу, которая также доступна из USP ставка 85 стандарта: МВД = (EL x концентрации образца) / λ)4. В гипотетическом сценарии концентрация наночастиц образца составляет 10 мг/мл, и его максимальная доза в мышь-615 мг/кг. В этом случае HED-615/12.3 = 50 мг/кг; EL для всех маршрутов, за исключением Интратекальное составляет 0,1 ЕС/мг (5 кг/ЕС/50 мг/кг) и МВД – 1000 ((0.1 ЕС/мг x 10 mg/mL)/0.001 ЕС/мл).

Часто когда нужно оценить эндотоксина загрязнение в Наноматериал класса исследований, доза информация не доступна. Существует без согласованной процедуры как оценить МВД и EL для этих материалов. Этот пример выполняет тест непосредственно со склада (обычно концентрация этого решения составляет 1 мг/мл) и несколько разведений, обычно 5-, 50-, 500 и 5000 складки. Когда дозы, маршрут администрации, концентрация образца и настой времени для изменения данного испытания Наноматериал, Эль и МВД также изменить. Таким образом надо оценить информацию и выполнить оценку Эль и МВД в контексте других параметров, связанных с суммы, времени, предполагаемый маршрут администрации и концентрации данной формулировки.

Важно отметить, что каталог номер и характеристики продукта (например., потенции, составляет в флаконе) ПОСЭ различны для разных форматов Лал. CSE, используемые в мутность, Лал могут также использоваться в Лал гель сгусток. Однако СПП для хромогенных Лал специфичен для этот assay формат. Общие и применимых к СПП, используемых во всех форматах пробирного инструкциям, приведенным ниже. Куэ является липополисахарида E. coli (LPS) поставляются как лиофилизированный порошок. Этот стандарт сертифицирована изготовителем против ведения стандарта эндотоксина (РГП) с известным потенции. Содержимое флакона, содержащие CSE следует воссоздать с ~3.2 - 5,0 мл пирогена свободной воды Лал реагента. Помимо различий между СПП, используемые для анализа различных форматов объем растворения также специфичные для каждой партии этого стандарта. Таким образом надо рассчитать конечная концентрация запасов CSE решения для каждой партии стандарта. Расчет производится на основании потенции стандарта и сумма, содержащихся в каждом флаконе. Сертификат анализа, специфичным для каждой партии эндотоксина стандарт содержит информацию о потенции и сумма за флакон. Надо строго вихревой стандарт на 30-60 секунд, как в ходе реорганизации, так и во время использования. Также рекомендуется выполнять восстановление с помощью 5-10 мин, урегулирования раз и через 30-60 мин сроки обеспечить, что все лиофилизированный материал переходит в раствор. Перед использованием в assay, сбалансировать запасы CSE до комнатной температуры. После растворения запас CSE может храниться в холодильнике для хранения и стабилен в течение четырех недель.

Подобно CSE, Лал реагент также специфичен для каждого формата. Инструкциям, приведенным ниже, общие и применимыми для всех форматов пробирного Лал. Реагент Лал предоставляется как лиофилизированный порошок. Для воссоздания каждого флакона следовать рекомендациям изготовителя. Лал класс водой или буфера, ингибирующих бета глюканов может использоваться. Буфер, ингибирующих бета глюканов предпочтителен в этом исследовании-потому что она позволяет исключить помехи от бета глюканов. Это вмешательство ложно положительных очень распространены в наноматериалов, потому что ацетат целлюлозы фильтры широко используются при синтезе Наноматериал и служат источником загрязнения глюкан15. Большинство флаконов потребует растворения в окончательный объем 5 мл. Основываясь на более чем 10 лет опыта авторов с этот assay, было замечено, что включение этого буфера замедляет реакцию и могут потребовать увеличения времени максимальный наступление в параметрах инструмента позволяет низкие калибратора на концентрация 0,001 ЕС/мл для разработки.

Чтобы обеспечить точное разрежения во время подготовки стандартов, рекомендуется использовать десятикратного разрежения шаги. Серийных разведений десятикратного может быть подготовлен пики µL 100 акций или стандарта, с более высокой концентрации в 900 мкл пирогена свободной воды. Так как концентрация CSE фондовой обычно высокий (~ 1000 ЕС/мл), подготовка промежуточных разведений с концентрацией 100 и 10 ЕС/мл рекомендуется перед подготовкой пробирного калибратор с концентрацией 1 ЕС/мл. Два соотношения между испытательного образца и lysate описаны в настоящем Протоколе. Несмотря на то, что оба коэффициенты обычно используются, кривая линейность приемлемым, но не идеально при использовании соотношения 4:1 и буфера, ингибирующих бета глюканов (см. Таблицу материалов).

Те же правила как описано выше в отношении калибровки стандартных подготовки также применяются к подготовке контроля качества (КК). Эти элементы управления используются для проверки правильности работы assay. Он подготовлен пики известно количество CSE в воду пирогена бесплатно. Концентрация КК обычно выбирается в середине диапазона assay. Диапазон assay Лал мутность — 0,001 до 1 ЕС/мл. Таким образом используется КК в концентрации 0,05 ЕС/мл. Другие концентрации в диапазоне assay может использоваться также в подготовке контроля качества.

Ингибирование улучшение управления (МЭК) является также известен как позитивные продукта управления (КПП). Он подготовлен пики известной концентрации СПП в испытательный образец. Концентрация IEC (КПП) обычно выбирается в середине диапазона assay. Диапазон assay Лал мутность — 0,001 до 1 ЕС/мл. Таким образом используется IEC в концентрации 0,05 ЕС/мл. Подготовить этот IEC необходимо объединить 50 мкл раствора 1 КСЭ ЕС/мл с 950 мкл тест наночастиц. Для каждого разведения теста Наноматериал готовится IEC. Например если нано формулировка испытывается в трех разведений (1:50, 1: 500 и 1:5, 000), надо подготовить три ИННЦ, один для каждого из этих разведениях. Другие концентрации в диапазоне пробирного может использоваться также для подготовки образца IEC. Этот элемент управления используется чтобы понять действительность результатов теста для данного нано разработки. В соответствии с USP результаты теста являются действительными, если Спайк восстановления IEC (КПП) между 50 и 200%4. Спайк восстановления, менее чем в 50% означает, что тест Наноматериал подавляет эндотоксина обнаружения и, следовательно, тест результат недооценивает эндотоксина загрязнения и является недопустимым. Спайк восстановления более 200% свидетельствует о том, что тест материал повышает результат анализа или содержит слишком высокий уровень загрязняющих эндотоксина. В случае повышения результат анализа также является неточной. Примеры таких взаимодействий и несколько способов их преодоления были описаны ранее12,15.

При выполнении мутность и хромогенных анализов, рекомендуется использовать репитер пипетки для добавления Лал реагент для всех образцов. Время работы средняя инструмент — 7200 секунд. Однако реакция может быть быстрее или медленнее, с определенным количеством lysate. В тех случаях когда реакция идет медленно, один может потребоваться изменить параметры инструмента для 9600s или больше. Это изменение позволит низкие калибратор развивать.

Пегилированный липосомальных доксорубицин является формулировка, содержащая активного фармацевтического вещества (API) в концентрации 2 мг/мл. Он используется в клинике в дозе 50 мг/м2. Чтобы преобразовать этот доза мг/кг, он делится на фактор 3727. Доза Пегилированный липосомальных доксорубицина в мг/кг, таким образом, составляет 1,35. Чтобы вычислить Эль, 5 (порог пирогена доза в ЕС/кг) делится на 1.35 (доза Doxil в мг/кг) и получить 3.7 ЕС/мг4. Это число означает, что Пегилированный липосомальных доксорубицин в дозе 1,35 мг/кг можно безопасно управляться в один час если эндотоксина в разработке не превышает 3,7 ЕС/мг, где мг относится к API.

Далее используйте эту информацию для вычисления МВД для Лал анализов. Чувствительность (лямбда) мутность, Хромогенный и гель сгусток анализов, представленные в настоящем исследовании — 0,001 и 0,001 0,03 ЕС/мл, соответственно. Таким образом, МВД является 7,407 мутность и хромогенных анализов ((5 ЕС/кг x 2 mg/mL)/0.001 ЕС/мл) и 247 для assay гель сгусток ((5 ЕС/кг x 2 mg/mL)/0.03 ЕС/мл).

Доксорубицин имеет широкий абсорбция спектра, который пересекается с Пробирной волны хромогенных Лал28,29. Кроме того большинство липосом формулировки мутная и появляются Млечный. Это неотъемлемое мутности является весьма распространенная причина вмешательства липосомы с замутненностью assay. В случае Пегилированный липосомальных доксорубицин вмешательства из-за мутности была преодолена путем разбавления, пять как подтверждается Спайк восстановления значений между 50 и 200% (Таблица 1). Однако в же разбавления доксорубицин концентрация была еще достаточно высоки, чтобы мешать хромогенных Лал (Таблица 1). Два последующих разведениях (50 и 500) помог преодолеть Пегилированный липосомальных доксорубицин вмешательства с хромогенных Лал. Так как гель сгусток assay независимо от мутности и образец цвета, и уровень эндотоксина в разработке находится в пределах диапазона гель сгусток, липосомальных доксорубицин Пегилированный не вмешиваться гель сгусток assay на всех протестированных разведениях. В этом исследовании были использованы несколько разведений Пегилированный липосомальных доксорубицина для этих анализов. Разведений 5, 50 и 500 мутность и Хромогенный, а также 50, 100 и 200 для assay гель сгусток были выбраны потому, что они находятся в МВД. МВД гель сгусток assay ниже, чем это замутненности и хромогенных LALs потому, что чувствительность этот assay также ниже. Если формулировка прервет с Лал при разбавлении 500 мутность и хромогенных анализов, анализ на более высоких разведениях (например, 5000, 6000, 7000 или 7,407) может быть выполнена. Поскольку уровень эндотоксинов, полученные при разбавлении 50 в assay гель сгусток ниже Эль, не проведен анализ этой формулировки на нижней разведениях. Однако, в других случаях, тестирование можно было бы продолжить в разведениях 20, 10, 5 или 2 для определения низких не вмешиваясь разрежения и понять, является ли уровень эндотоксина в разработке ниже Эль.

Важно отметить, что для assay гель сгусток необходимо выключить функцию циркуляции воды в водяной бане в течение этот assay или использовать водяной бане без такой вариант, потому что поток воды ущерб сгусток и может повлиять на точность g Эль Сгусток Лал assay. Это не всегда можно преодолеть наночастиц вмешательства с Лал анализов по повышению разведениях образца. Стратегии и некоторые подходы для преодоления различных видов вмешательства и примеры наночастиц, обычно представляет проблему для Лал анализов были обсуждены с другими группами и нас других12,13,14 ,15,30,31. Анализ, представленный в этой рукописи на основе разработки моделей. Опыт работы с другими nanoformulations могут быть разными.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано федеральным фондам от национального института рака, национальные институты здравоохранения, по контракту HHSN261200800001E. Содержание этой публикации, не обязательно отражают взгляды или политику Департамента здравоохранения и социальных служб, ни упоминание названия торговых марок, коммерческих продуктов, или организаций означает одобрения правительства США.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36, (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11, (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4, (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. Bacterial Endotoxins Test. (2011).
  5. FDA, U. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. (2012).
  6. FDA, U. Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44, (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19, (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409, (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220, (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5, (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9, (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. NCL. NCL assay cascade. Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015).
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4, (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9, (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33, (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160, (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31, (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9, (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11, (9-10), 1157-1175 (2017).
Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter