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Bioengineering

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

Published: January 30, 2019 doi: 10.3791/58830
Automatic Translation
1, 1
1Nanotechnology Characterization Lab., Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by National Cancer Institute

Summary

Detección de endotoxinas en nanomateriales modificados representa uno de los grandes retos en el campo de la nanomedicina. Aquí, presentamos un estudio de caso que describe el marco compuesto por tres formatos diferentes de LAL para estimar la potencial contaminación de endotoxina en nanopartículas.

Abstract

Cuando están presentes en productos farmacéuticos, una endotoxina de componentes de pared celular bacteriana Gram-negativas (a menudo también llamada lipopolisacárido) puede causar inflamación, fiebre, hipo o hipertensión y, en casos extremos, puede conducir a daño de órganos y tejidos que pueden se convierten en fatales. Las cantidades de endotoxinas en productos farmacéuticos, por lo tanto, están estrictamente reguladas. Entre los métodos disponibles para detección de endotoxinas y cuantificación, el ensayo de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) es de uso general en todo el mundo. Mientras que cualquier producto farmacéutico puede interferir con el ensayo LAL, nano-formulaciones representan un desafío particular debido a su complejidad. El objetivo de este trabajo es proporcionar a una guía práctica a los investigadores sin experiencia en la estimación de endotoxinas en la ingeniería de nanomateriales y nanopartículas formulado drogas. En este documento, se discuten recomendaciones prácticas para llevar a cabo análisis de gel-clot y tres formatos LAL como turbidez, cromogénico. Estos ensayos pueden utilizarse para determinar contaminación por endotoxinas en productos basados en nanotecnología, vacunas y adyuvantes.

Introduction

Una endotoxina es un componente de la pared celular bacteriana Gram-negativos1,2. Puede activar las células inmunes en muy bajas concentraciones de (picogramo)1,2. Los mediadores proinflamatorios (citoquinas, leucotrienos, eicosanoides, etc.) producidos por las células en respuesta a una endotoxina son responsables de la fiebre, hipotensión, hipertensión y problemas de salud más severos incluyendo falta múltiple del órgano 1 , 2 , 3. la severidad de las mediada inmune efectos secundarios provocados por la endotoxina depende de su potencia determinada por la composición de la endotoxina y estructura y medida en unidades de endotoxina Internacional (IUs o EUs)3. El número de estas unidades por kilogramo de peso corporal se utiliza para establecer una dosis de umbral pirogénico de la endotoxina. Esta dosis es de que 5 EU/kg para productos farmacéuticos administrados vía todas las rutas pero la ruta intratecal. Medicamentos dosis por metro cuadrado de superficie del cuerpo, líquidos intraoculares, radiofármacos y productos administrados vía intratecal ruta tienen una dosis de pirógenos diferente umbral, que es de 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (donde V es la volumen del producto destinado a la administración) y 0,2 EU/kg, respectivamente4. Más detalles sobre la dosis pirogénica de umbral para varios medicamentos y dispositivos se proporcionan y discuten en otra parte4,5,6.

Animales varían ampliamente en su sensibilidad a las reacciones mediadas por endotoxinas. Los seres humanos, primates no humanos y conejos están entre las especies más extremadamente sensibles a endotoxinas3. Para evitar mediada por endotoxinas efectos secundarios en los pacientes y evitar conclusiones inexactas de toxicidad preclínica y estudios de eficacia, es esencial para detectar y cuantificar endotoxinas en ambas formulaciones de grado clínico y preclínico exactamente. Varios métodos disponibles en la actualidad pueden lograr esta tarea. Uno de ellos es el ensayo de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), que se utiliza comúnmente en todo el mundo para productos biomédicos de la pantalla de la posible contaminación de endotoxina, así como para detectar infecciones bacterianas7,8,9. El lisado se prepara de amoebocytes, las células presentan en la sangre de los cangrejos de herradura Limulus polyphemus que residen en la costa este del continente de América del norte7. Interesante, hay algunas especies de cangrejos herradura (Tachypleus gigas y Tachypleus tridentatus) en Asia10. El lisado de Amoebocyte lysate (TAL) se utiliza en varios países asiáticos para la detección de endotoxina similar a cómo la LAL se utiliza en otros libres10. Los lisados (LAL y TAL) contienen un grupo de proteínas que al activarse le confieren actividad proteasa. Una de estas proteínas, el denominado Factor C se activa al contacto con la endotoxina. C Factor activado hiende Factor B, que a su vez también se convierte en una proteasa y hiende una enzima de coagulación pro para producir una coagulación enzimática. El resultado de esta cadena de reacciones es la formación de un gel, un aumento en la turbidez de la muestra y, en presencia de un sustrato cromogénico, la aparición de un producto coloreado, que sirven como base para gel-clot, turbiedad y ensayos cromogénicos, respectivamente. Aunque no existe ningún formato obligatorio de LAL, la US Food y Drug Administration (FDA) explica en la guía para documento de industria, que en caso de discrepancia en los resultados entre distintos formatos LAL, se tomó la decisión basado en el ensayo de gel-clot5 .

Muchos productos químicos de laboratorio de uso general (por ej., EDTA) y ensayos de drogas conocidos productos (p. ej., penicilina) interfieran con LAL11. La interferencia se suele identificar mediante la evaluación de la recuperación de la endotoxina estándar con una concentración conocida en una solución que contiene el material de prueba. Si la recuperación del punto es inferior al 50% o más del 200%, entonces el resultado de la LAL Ensayo para el material de prueba dada no es válido debido a la inhibición o aumento, respectivamente4. Formulaciones en base a nanotecnología son a menudo complejas e interfieren con la LAL a través de una variedad de mecanismos12,13,14. Se han descrito muchos enfoques para superar la interferencia: reconstitución de la muestra en los amortiguadores específicos y los tensioactivos, inactivación de la proteína por calefacción, destrucción de materiales huecos de lípidos por calentamiento y que complementa la muestra con exceso cationes divalentes5,12,13,14,15. También se han descrito métodos alternativos para situaciones cuando interferencia de LAL no puede superarse: ELISA, una célula de HEK-TLR4 reportero línea de ensayo y espectrometría de masas16,17,18, 19.

En este documento, se describen procedimientos experimentales para la realización de gel-clot, turbiedad y ensayos LAL cromogénicos. Estos ensayos también están disponibles en el laboratorio de caracterización de nanotecnología (NCL) Página Web20 en protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.3 (LAL gel-clot) y STE1.4 (LAL cromogénico). Se recomienda realizar al menos dos formatos diferentes para caracterizar la misma formulación de nano. Cuando no está de acuerdo resultados de la turbidez y el LAL cromogénico, los resultados de gel-clot se consideran5. Cuando no está de acuerdo resultados de los dos formatos LAL, adicional los resultados de estudios mediante test de activación de monocitos (MAT) o prueba de pirógenos de conejo (RPT) para verificar LAL son llevado a cabo21. Es importante tener en cuenta que cada método utilizado para la detección de endotoxina y evaluación pirógenos tiene ventajas y limitaciones21,22,23,24. Reconociendo las limitaciones del procedimiento utilizado para caracterizar una formulación determinada nanotecnología es esencial para obtener la justificación científica para el uso del procedimiento óptimo para nano-formulación.

En este estudio, doxorrubicina liposomal pegilada se utilizó como una formulación de nanopartículas de modelo. Esta formulación ha sido aprobada por la FDA en 1995 y utilizado para el tratamiento de pacientes de cáncer en todo el mundo25.

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Protocol

1. preparación de muestras de nanopartículas

  1. Preparar la muestra de estudio en LAL agua de calidad.
  2. Si el pH de la muestra está fuera del rango de 6-8, ajustar el pH con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio libre de pirógenos.
  3. LAL agua grado preparar varias diluciones de la muestra de estudio. Asegúrese de que la dilución más alta no supera la máxima dilución válida (MVD). Refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la estimación del Ministerio del interior.

2. preparación de reactivos comunes entre formatos LAL

  1. Diluir la acción concentrada de hidróxido sódico con pirógenos LAL reactivo agua para preparar una solución de trabajo a una concentración de 0.1 N.
  2. Diluir la acción del ácido clorhídrico concentrado utilizando agua de reactivo LAL pirógenos y preparar una solución de trabajo a una concentración final de 0.1 N.
  3. Preparación de la endotoxina estándar de Control (CSE)
    1. Reconstituir el CSE según el certificado de análisis suministrado por el fabricante.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para notas importantes con respecto a la información proporcionada en el certificado. Consulte la Tabla de materiales para los detalles en cuanto a número de catálogo y la aplicación de una determinada formulación de CSE en diferentes formatos LAL.
  4. Preparación del reactivo LAL
    1. Reconstituir el reactivo LAL según el certificado de análisis suministrado por el fabricante.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para detalles importantes con respecto a la preparación del reactivo LAL. Consulte la Tabla de materiales para los detalles en cuanto a número de catálogo y la aplicación de una determinada formulación de reactivo LAL en diferente formato LAL.

3. turbidez ensayo LAL

  1. Preparación de los estándares de calibración
    1. 900 μl de agua grado LAL y 100 μl de CSE, preparar tantas diluciones intermedias según sea necesario para permitir la preparación de una calibración estándar con un rango de concentración de 0,001 a 1 UE/mL.
    2. Primero Etiquete tubos y agregar 900 μL de LAL-grade del agua en cada tubo. Luego agregar 100 μL de 10 UE/mL solutionn para preparar el estándar de calibración con la concentración de 1EU/mL.
    3. Repetir la dilución seriada 10 veces como se describió anteriormente para preparar tres estándares de calibración baja. Verificar que se han preparado cuatro estándares de calibración que van desde 0.001 a 1 UE/mL.
  2. Preparación de los controles de calidad
    1. Preparar un control de calidad UE/mL 0.05 combinando 50 μl de la 1 solución de la UE/mL CSE con 950 μl de LAL-grade del agua.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la preparación del control.
  3. Preparación de controles de inhibición/realce (IEC)
    1. Preparar IEC con concentración de 0.05 UE/mL mediante la combinación de 25 μl de la 1 solución de CSE UE/mL y 475 μl de los nanomateriales de prueba en una dilución dada.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles.
  4. Procedimiento experimental
    1. Que el instrumento caliente girando en aproximadamente 30 minutos de antelación. Ajuste la longitud de onda de detección a 660 nm ya que esto es apropiado para la turbiedad LAL.
    2. Identifícate escribiendo el nombre de usuario y contraseña.
    3. Abra el software (Tabla de materiales) haciendo clic en el icono correspondiente en una pantalla de ordenador.
    4. Seleccionar datos en la pantalla principal del software. Introduce la información del grupo de identificación y datos de prueba en el espacio correspondiente en la ficha General en la pantalla de inicio.
    5. Haga clic en la ficha Hardware Seleccione el tipo de instrumento en un menú desplegable.
    6. Ajuste la longitud de onda de detección a 660 nm ya que es apropiado para la turbiedad LAL por elegir el método de turbidez LAL.
    7. Verificar que un número de serie, ID de sistema e información de puerto serie aparecen en la pantalla. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Aceptar una vez más para confirmar.
    8. Introduzca el ID de la muestra en el mismo orden de que la muestra es probada. Use botones por defecto para introducir el control negativo, las muestras estándar de la curva y de la prueba.
    9. Preparar los tubos duplicados de cada muestra y agregar 200 μl (prueba de proporción 4:1) o 100 μl (prueba de relación 1:1) de control negativo (agua), estándares de calibración, control de calidad, IEC y prueba de nanopartículas en tubos de vidrio previamente etiquetados.
    10. Añadir 50 μl (prueba de proporción 4:1) o (prueba de relación 1:1) de 100 μl de reactivo LAL a primera prueba vial, vortex brevemente e insertar en la prueba de la ranura en el carrusel de instrumento. Si se usa la proporción 1:1, el volumen del reactivo LAL es 100 μl.
    11. Repita el procedimiento descrito anteriormente para otras muestras. Proceso de muestras de uno en uno.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles.

4. cromogénico LAL

  1. Preparación de estándares de calibración
    1. 900 μl de agua grado LAL y 100 μl de CSE, preparar tantas diluciones intermedias según sea necesario para permitir la preparación de una calibración estándar con una concentración de 1 UE/mL.
    2. 900 μl de agua de LAL-grado y 100 μl de la calibración EU/mL 1 estándar, preparar un segundo estándar de calibración a una concentración de 0.1 UE/mL.
    3. Repetir la dilución seriada 10 veces como se describió anteriormente para preparar estándares de calibración bajos dos. Verificar que se han preparado cuatro estándares de calibración que van desde 0.001 a 1 UE/mL.
  2. Preparación de controles de calidad.
    1. Preparar un control de calidad UE/mL 0.05 combinando 50 μl de la 1 solución de la UE/mL CSE con 950 μl de LAL-grade del agua.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la preparación del control.
  3. Preparación de controles de inhibición/realce (IEC)
    1. Preparar 0.05 UE/mL mediante la combinación de 25 μL de la 1 solución de la UE/mL CSE con 475 μL de nanomateriales de prueba.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles.
  4. Procedimiento experimental
    1. Que el instrumento caliente girando en aproximadamente 30 minutos de antelación. Ajuste la longitud de onda de detección a 405 nm ya que esto es apropiado para la turbiedad LAL.
    2. Abra el software haciendo clic en el icono correspondiente en una pantalla de ordenador. Identifícate escribiendo el nombre de usuario y contraseña.
    3. Seleccionar datos en la pantalla principal del software. Escriba prueba de identificación y datos de información del grupo en el espacio correspondiente en la ficha General en la pantalla de inicio.
    4. Haga clic en la ficha Hardware Seleccione el tipo de instrumento en un menú desplegable. Elegir el instrumento.
    5. Verificar que un número de serie, ID de sistema e información de puerto serie aparecen en la pantalla. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Aceptar una vez más para confirmar.
    6. Introduzca el ID de la muestra en el mismo orden de que la muestra es probada. Use botones por defecto para introducir control negativo, las muestras estándar de la curva y de la prueba.
    7. Preparar los tubos duplicados de cada muestra y agregar 200 μl (prueba de proporción 4:1) o 100 μl (prueba de relación 1:1) de control negativo (agua), estándares de calibración, control de calidad, IEC y prueba de nanopartículas en tubos de vidrio previamente etiquetados.
    8. Añadir 50 μl (prueba de proporción 4:1) o (prueba de relación 1:1) de 100 μl de reactivo LAL a primera prueba vial, vortex brevemente e insertar en la prueba de la ranura en el carrusel de instrumento. Si se usa la proporción 1:1, el volumen del reactivo LAL es 100 μl.
    9. Repita el procedimiento descrito anteriormente para otras muestras. Proceso de muestras de uno en uno.

5. gel-Clot LAL

Nota: Este análisis identifican la presencia de endotoxinas en la muestra basada en la observación visual y la detección de un coágulo en el tubo de reacción. A continuación se describen los pasos experimentales. Utilizar una hoja de banco para registrar los resultados. Esta hoja de banco no es obligatoria, y otras maneras de registrar los resultados del ensayo son también aceptables. Un ejemplo de una hoja de banco se encuentra en materiales suplementarios para la conveniencia del lector. Lambda (l) es la sensibilidad del ensayo de gel-clot y 0,03 UE/mL.

  1. Etiqueta de tantos tubos de reacción según sea necesario para acomodar al número de muestras analizadas de la prueba. Consulte la hoja de banco para obtener más información sobre el número de réplicas utilizados en el paso 1, paso 2 y paso 3 del ensayo.
  2. Alícuota 100 μL de agua, controles o prueba de muestra por tubo.
  3. Preparar CSE tal que la concentración final es igual a 4λ.
  4. Mezclar 100 μL de la norma mencionada con 100 μL de muestra de agua o prueba para alcanzar la concentración final de CSE de 2λ. Repetir tres veces más para lograr la lambda y lambda mitad y un cuarto lambda.
  5. Asegúrese de que la temperatura en el baño de agua es de 37 ° C.
  6. Añada 100 μL de lisado por el tubo de ensayo, vortex brevemente y colocar la gradilla con los tubos en baño María durante 1 hora.
  7. Invertir el tubo con un movimiento suave.
  8. Resultados registros manualmente mediante "+" (coágulo firme) o "-" (no coágulo o coágulo flojo) en la ficha del Banco.
  9. Proceder con el análisis según la USP apuesta 854; utilice la hoja de banco como material de apoyo

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Representative Results

El ejemplo de los datos generados después de probar esta formulación en ensayos LAL se muestra en la tabla 1. Doxorrubicina liposomal pegilada interfirió con LAL cromogénico en dilución 5. Sin embargo, esta interferencia fue superada por diluciones mayores. Recuperación de pico fue entre 50 y 200% cuando esta fórmula fue probada en diluciones 50 y 500 en turbidez y LAL cromogénico, así como en la dilución 5 en turbidez LAL. Ajustado por el factor de dilución, los resultados fueron consistentes entre las diluciones en ambos ensayos. Por otra parte, los resultados fueron consistentes entre los formatos de tres ensayo.

Toma de muestras Turbidez LAL, EU/mg (punto de recuperación, %) LAL cromogénico, EU/mg, (punto de recuperación, %) Gel-clot LAL, EU/mg (prueba válida, sí o No)
Doxorrubicina liposomal pegilada (véase la tabla de materiales)
Dilución 5 0.01 (141) interferencia < 0.75 (Y)
Dilución de 50 < 0.025 (187) 0.029 (82) < 1.5 (Y) *
Dilución de 500 < 0,25 (182) < 0,25 (86) < 3 (Y) **

Tabla 1: detección de endotoxinas en pegilado ensayos de doxorrubicina liposomal mediante LAL. Ensayos de pegilada liposomal doxorubicin se evaluó mediante turbidez, cromogénico y LAL gel-clot. Interferencia de la muestra se estimó con IECs. Recuperación de Spike se muestra entre paréntesis. Valores entre 50 y 200% se consideran aceptables según la USP apuesta 85 estándar para detección de endotoxinas4. * y ** los resultados de esta muestra se obtuvieron en diluciones de 100 y 200, respectivamente. Las diluciones de ensayo de gel-clot son diferentes de los utilizados en cromógenos y turbidez LAL porque sensibilidad y máxima dilución válida de este ensayo son más bajos.

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Discussion

La información proporcionada en este protocolo se ha descrito antes15,26 y se basa en varios documentos normativos publicados por el US Food y Drug Administration (FDA o FDA) y farmacopea de Estados Unidos (USP)4 , 5 , 6 , 27y también está disponible en el sitio web NCL20 en protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.3 (LAL gel-clot) y STE1.4 (LAL cromogénico).

Prueba de nanomateriales son preparados en agua de reactivo LAL o PBS estéril, libre de pirógenos. El pH de la muestra del estudio es importante porque el pH alto (> 8) y baja (< 6) interferirá con el rendimiento óptimo del lisado. Si el pH de la nanopartícula de prueba está fuera del rango de 6-8, se puede ajustar usando ácido clorhídrico o hidróxido de sodio libre de pirógenos. Cuando se lleva a cabo tal regulación, es vital para evitar la contaminación de la muestra del microelectrodo. Por lo tanto, para realizar este procedimiento, una pequeña alícuota de la muestra dentro de un tubo separado y utilizada para medir el pH.

Cuando la muestra es preparada en PBS o en otro buffer, buffer en blanco también se incluye en esta prueba. La concentración de cada nanomaterial es específico. La prueba se utiliza para estimar la cantidad de contaminación de endotoxina por miligramo de lo ingrediente farmacéutico activo (API). Sin embargo, dependiendo del tipo de formulación de nano, la concentración también se puede estimar en mg de la formulación total o elemento total (por ej., oro, plata o hierro de oro, plata y óxido de hierro nanopartículas, respectivamente). La muestra es la prueba del stock mediante varias diluciones no exceda el Ministerio del interior. Todas las diluciones de las nanopartículas de prueba se preparan con LAL-grade del agua.

Se utilizan tres parámetros para calcular el Ministerio del interior. Son el límite de endotoxina (EL), la concentración de la muestra y el análisis de sensibilidad (λ)4. Utilice la siguiente fórmula para calcular el límite de endotoxina (EL): EL = K/M, donde K es una dosis umbral de pirógenos (e.g., 5 EU/kg como se indica en la introducción) y M es la dosis máxima de los nanomateriales de prueba destinados a administración por kilogramo de cuerpo peso en una sola hora4. Como hemos comentado anteriormente, la estimación de EL para los nanomateriales utilizados como radiofármaco o como dispositivo médico se basa en una dosis de pirógenos de umbral o fórmula, que es diferente de 5/M. Estos detalles son mencionados en la introducción y podrían revisarse más en la USP y FDA pautas4,5,6. El límite de endotoxina recomendadas para soluciones oftálmicas y dispositivos intraoculares se proporciona en la guía de la FDA para estos productos6. Cuando un modelo animal (e.g., ratón) fue utilizado para establecer la dosis de nanoformulation, esta información se utiliza para estimar la dosis equivalente humana llamada (HED). La HED se calcula dividiendo la dosis animal por un factor de conversión, que es específico para cada especie animal. Por ejemplo, el factor de conversión es 12.3, 6.2 y 3.1 para el ratón, la rata y el conejo, respectivamente27. El procedimiento de conversión y razón de ser de uso se describen en detalle en la guía de FDA de los E.e.u.u.27. Terapéutica de cáncer a menudo son dosificadas por área de superficie corporal expresada en mg/m2. Uno puede seguir la pauta de la USP para calcular EL de medicamentos, dosificadas en miligramos por metro cuadrado, o convertir esta dosis en mg/kg rango. La dosis en mg/m2 se puede ajustar la dosis en mg/kg utilizando un factor de conversión específica27. Para un humano adulto, es indicada como Km para referirse a la masa constante27y 37. El factor de km tiene unidades de kg/m2; es igual al peso corporal en kilogramos (kg) divididos por la superficie en metros cuadrados (m2)27. Por ejemplo, una dosis humana o HED de 74 mg/m2 corresponde a 2 mg/kg o 74/37. Para determinar el MVD, utilice la fórmula siguiente, que también está disponible en el estándar de USP apuesta 85: MVD = (EL x concentración de muestra) / λ)4. En un escenario hipotético, una concentración de muestra de nanopartículas es de 10 mg/mL y la dosis máxima en el ratón es de 615 mg/kg. En este caso el HED es 615/12.3 = 50 mg/kg; EL para todas las rutas excepto intratecal es 0.1 EU/mg (5 kg/EU/50 mg/kg) y MVD es 1.000 ((0.1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 UE/mL).

A menudo, cuando uno necesita evaluar contaminación de endotoxina en un nanomaterial de grado de investigación, la información de dosis no está disponible. No existe ningún procedimiento armonizado para saber cómo estimar la MVD y EL de estos materiales. Este estudio de caso se realiza la prueba directamente de la acción (comúnmente la concentración de esta solución es 1 mg/mL) y en varias diluciones, generalmente 5, 50, 500 y 5.000-pliegues. Cuando la infusión, la concentración de la muestra, la dosis y la vía de administración tiempo para el cambio de nanomateriales de determinada prueba, la EL y MVD también cambian. Por lo tanto, uno tiene que evaluar la información y realizar la estimación de EL y de MVD en el contexto de otros parámetros relacionados con la cantidad, tiempo, previsto vía de administración y concentración de la formulación dada.

Es importante tener en cuenta que el número de catálogo y las especificaciones del producto (por ej., potencia, asciende por vial) del CSE son diferentes para diferentes formatos LAL. El CSE en turbidez que Lal puede utilizarse también en un LAL gel-clot. Sin embargo, el CSE para un LAL cromogénico es específico a este formato de ensayo. Las instrucciones siguientes son generales y aplicables a la CSE utilizada en todos los formatos de ensayo. El CSE es una e. coli lipopolisacárido (LPS) suministrado como un polvo liofilizado. Esta norma está certificada por el fabricante contra una endotoxina estándar de referencia (RSE) con una potencia conocida. El contenido del vial que contiene el CSE debe ser reconstituido con ~3.2 - 5,0 mL de agua de reactivo LAL pirógenos. Además de la diferencia entre CSE utilizada para el análisis diferentes formatos, el volumen de reconstitución es también específico para cada lote de esta norma. Por lo tanto, uno tiene que calcular la concentración final de la solución madre de CSE para cada lote de la norma. El cálculo se realiza en base a la potencia de la norma y la cantidad contenida en cada frasco. El certificado de análisis específico para cada lote de endotoxina estándar contiene la información de la potencia y la cantidad del frasco. Uno tiene que vortex rigurosamente el estándar durante 30-60 segundos, durante la reconstitución y durante el uso. Se recomienda también realizar la reconstitución con 5-10 min colocar veces y en un 30-60 min tiempo para asegurar que todos los liofilizados material entra la solución. Antes de utilizar en el ensayo, equilibrar la población CSE a temperatura ambiente. Después de la reconstitución, el CSE puede ser refrigerada para el almacenamiento y es estable por cuatro semanas.

El CSE, el reactivo LAL es también específico para cada formato. Las instrucciones siguientes son generales y aplicables a todos los formatos de ensayo LAL. El reactivo LAL se proporciona como un polvo liofilizado. Se siguen las recomendaciones del fabricante para reconstituir cada frasco. Puede utilizarse agua de calidad LAL o buffer inhibición de beta-glucanos. El búfer de inhibición de beta-glucanos es preferido en este caso ya que permite excluir la interferencia de beta-glucanos. Esta interferencia de falsos positivos es muy común en nanomateriales debido a filtros de acetato de celulosa se usan comúnmente durante la síntesis de nanomateriales y servir como una fuente de contaminación de glucano15. La mayoría viales requiere reconstitución hasta un volumen final de 5 mL. Basado en más de 10 años de experiencia de los autores con este ensayo, se ha notado que la inclusión de este tampón ralentiza la reacción y puede requerir aumentar el tiempo de inicio máximo en las opciones para permitir que el calibrador más bajo en un concentración de 0.001 EU/mL para el desarrollo.

Para asegurar la correcta dilución durante la preparación de normas, se recomienda utilizar pasos de dilución 10 veces. Diluciones seriadas de 10 veces pueden ser preparadas por spiking 100 μl de la acción o una norma con mayor concentración en 900 μl de agua libre de pirógenos. Puesto que la concentración de la población de CSE es generalmente alta (~ 1.000 UE/mL), preparación de diluciones intermedias con concentraciones de 100 y 10 UE/mL se recomienda antes de preparar el calibrador de ensayo con una concentración de 1 UE/mL. Dos cocientes entre la muestra y lisado se describen en el presente Protocolo. A pesar de que ambos ratios se utilizan, la linealidad de la curva es aceptable pero no ideal cuando se utilizan el cociente de 4:1 y el búfer de inhibición de beta-glucanos (véase la Tabla de materiales).

Las mismas reglas como se describe anteriormente con respecto a la preparación del estándar de calibración también se aplican a la preparación de controles de calidad (QC). Estos controles se usan para verificar que el ensayo está funcionando correctamente. Es preparado por clavar la cantidad conocida de CSE en el agua libre de pirógenos. La concentración de control de calidad se elige generalmente en el rango del ensayo. El rango del ensayo LAL de turbidez es 0.001 a 1 UE/mL. Por lo tanto, se utiliza un control de calidad en una concentración de 0.05 UE/mL. Otras concentraciones en el rango del ensayo también pueden utilizarse en la preparación de los controles de calidad.

El control de realce de la inhibición (IEC) es también conocido como producto positivo control (PPC). Es preparado por clavar una concentración conocida de CSE en la muestra. La concentración de IEC (PPC) se elige generalmente en el rango del ensayo. El rango del ensayo LAL de turbidez es 0.001 a 1 UE/mL. Por lo tanto, se utiliza el CEI a una concentración de 0.05 UE/mL. Para preparar esta IEC es necesario combinar 50 μl de la 1 solución de la UE/mL CSE con 950 μl de nanopartículas de prueba. El IEC está preparado para cada dilución de un nanomaterial de prueba. Por ejemplo, si una formulación nano se está probando en tres diluciones (1:50, 1: 500 y 1:5, 000), uno tiene que preparar tres IECs, uno para cada una de estas diluciones. Otras concentraciones en el rango del ensayo también pueden utilizarse para preparar la muestra IEC. Este control se utiliza para entender la validez de los resultados de la prueba de la nano-formulación dada. Según la USP, los resultados son válidos si la recuperación de la espiga de IEC (PPC) es entre 50 y 200%4. Punto recuperación de menos del 50% significa que el nanomaterial prueba inhibe la detección de endotoxina y, por tanto, la prueba como resultado contaminación de endotoxina subestima y es válido. Punto de recuperación más del 200% sugiere que el material de prueba mejora el resultado del ensayo o contiene un nivel muy alto de la endotoxina contaminante. En el caso de mejora, el resultado del ensayo es también inexacto. Ejemplos de estas interferencias y algunas formas para superarlos han sido descrito anterior12,15.

Efectuando ensayos cromogénicos y turbidez, se recomienda utilizar una pipeta repetidora añadir el reactivo LAL a todas las muestras. El tiempo de operación del instrumento promedio es de 7200 segundos. Sin embargo, la reacción puede ser más rápido o más lento con ciertas porciones del lisado. En casos, cuando la reacción es lenta, se puede necesitar cambiar la configuración de instrumento 9600s o más. Este cambio permitirá que el calibrador más bajo desarrollar.

Doxorrubicina liposomal pegilada es una formulación que contiene un ingrediente farmacéutico activo (API) en una concentración de 2 mg/mL. Se utiliza en la clínica como una dosis de 50 mg/m2. Para convertir esta dosis en rango de mg/kg, se divide por el factor 3727. La dosis de doxorrubicina liposomal pegilada en mg/kg, por lo tanto, es 1,35. Para calcular EL, 5 (la dosis umbral pirógeno en EU/kg) dividido por 1,35 (la dosis de Doxil en mg/kg) y obtener 3,7 EU/mg4. Este número significa que doxorrubicina liposomal pegilada en la dosis de 1,35 mg/kg puede ser administrada con seguridad por hora solo si endotoxina en la formulación no exceda de 3.7 EU/mg, donde mg hace referencia a la API.

A continuación, utilizar esta información para calcular el Ministerio del interior para los ensayos de LAL. La sensibilidad (lambda) de la turbidez, cromogénico y gel-clot ensayos presentados en este estudio es 0.001 0.001 y 0,03 UE/mL, respectivamente. Por lo tanto, MVD es 7.407 para turbidez y ensayos cromogénicos ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 UE/mL) y 247 para el ensayo de gel-clot ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 UE/mL).

Doxorrubicina tiene un espectro de absorción amplio que coincide con la longitud de onda de ensayo de la LAL cromogénico28,29. Por otra parte, la mayoría formulaciones de liposomas son turbias y aparecen lechosas. Esta turbidez inherente es la razón muy común para la interferencia de liposomas con análisis de turbidez. En el caso de la doxorrubicina liposomal pegilada, la interferencia debido a la turbidez fue superada por dilución cinco según lo evidenciado por los valores de recuperación del pico entre 50 y 200% (tabla 1). Sin embargo, en el mismo doxorrubicina dilución concentración era aún lo suficientemente alta como para interferir con el LAL cromogénico (tabla 1). Dos diluciones subsecuentes (50 y 500) ayudaron a evitar la interferencia de doxorubicina liposomal pegilada con LAL cromogénico. Puesto que el ensayo de gel-clot es independiente de la turbiedad y el color de la muestra y el nivel de endotoxina en la formulación es dentro de la gama de gel-clot, la doxorrubicina liposomal pegilada no interfirió con el ensayo de gel-clot diluciones probadas en absoluto. En este caso, se utilizaron varias diluciones de doxorrubicina liposomal pegilada para estos ensayos. Las diluciones 5, 50 y 500 para turbidez y cromogénico como 50, 100 y 200 para el ensayo de gel-clot fueron elegidas porque están en el Ministerio del interior. El Ministerio del interior del ensayo de gel-clot es más bajo que el de la turbidez y LALs cromogénicos porque la sensibilidad de este ensayo también es menor. Si la formulación interfiere con LAL en dilución 500 en turbidez y ensayos cromogénicos, pudo realizarse el análisis en las diluciones más altas (por ejemplo, 5.000, 6.000, 7.000 o 7.407). Puesto que el nivel de endotoxinas obtenida en dilución 50 en el ensayo de gel-clot estaba por debajo de EL, no se realizó el análisis de esta formulación en diluciones más bajas. Sin embargo, en otros casos, las pruebas podrían ser continuadas en diluciones 20, 10, 5 o 2 para identificar el menor no interferir dilución y entender si el nivel de endotoxina en la formulación es debajo de EL.

Es importante mencionar que para el ensayo de gel-clot es esencial para desactivar la función de circulación de agua en el baño de agua durante la duración de este ensayo o usar un baño de agua sin esa opción porque el flujo de agua daña el coágulo y puede afectar la exactitud de la g ensayo LAL el coágulo. No siempre es posible evitar la interferencia de nanopartículas con ensayos LAL incrementando las diluciones de la muestra. Estrategias y algunos enfoques para superar diversos tipos de interferencia y ejemplos de nanopartículas que comúnmente representa un problema para ensayos LAL se han discutido por otros grupos y nosotros en otra parte12,13,14 ,15,30,31. El análisis presentado en este manuscrito se basa en una formulación del modelo. La experiencia con otros nanoformulations puede ser diferente.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El estudio fue apoyado por fondos federales del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud, bajo contrato HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no reflejan necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de salud y servicios humanos, ni mención de nombres comerciales, productos comerciales, o las organizaciones implican la aprobación por el gobierno de Estados Unidos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

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References

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Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)
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Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

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