Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

Påvisande av endotoxiner i nanomaterial utgör en av de stora utmaningarna inom nanomedicin. Här presenterar vi en fallstudie som beskriver ramen består av tre olika LAL format att uppskatta potentiella endotoxin kontaminering i nanopartiklar.

Abstract

När de förekommer i farmaceutiska produkter, en gramnegativa bakteriella cellväggen komponent endotoxin (kallas ofta även lipopolysackarid) kan orsaka inflammation, feber, hypo- eller hypertoni, och, i extrema fall kan leda till vävnader och organ skada som kan bli dödlig. Beloppen för endotoxin i farmaceutiska produkter, därför är strängt reglerade. Bland metoderna som är tillgängliga för endotoxin detektering och kvantifiering används Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analysen över hela världen. Medan ett läkemedel kan interferera med LAL analysen, utgör nano-formuleringar en särskild utmaning på grund av deras komplexitet. Syftet med denna uppsats är att tillhandahålla en praktisk guide till forskare oerfarna uppskatta endotoxiner i nanomaterial och nanopartiklar formulerat droger. Häri, diskuteras praktiska rekommendationer för att utföra tre LAL format inklusive grumlighet, kromogen och gel-clot analyser. Dessa analyser kan användas för att fastställa endotoxin angreppet i nanoteknikbaserade läkemedel, vacciner och tillsatsmedel.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En endotoxin är en byggsten av gramnegativa bakteriella cellväggen1,2. Det kan aktivera immuncellerna på mycket låg (pikogram) koncentrationer1,2. Den proinflammatoriska mediatorer (cytokiner, leukotriener, eikosanoider, etc.) produceras av celler som svar på en endotoxin ansvarar för feber, hypotoni, hypertoni och mer allvarliga hälsoproblem, inklusive multipel organsvikt 1 , 2 , 3. svårighetsgraden av immunmedierade biverkningar utlöses av endotoxin beror på dess styrka bestäms av endotoxin sammansättning och struktur och mäts i internationella endotoxin enheter (hormonspiral eller EUs)3. Antalet dessa enheter per kilogram kroppsvikt används för att ange en tröskel pyrogent dos endotoxin. Denna dos är 5 EU/kg för läkemedel administreras via alla vägar men intratekal rutten. Läkemedel doseras per kvadratmeter kroppsyta, intraokulära vätskor, radiofarmaka och produkter administreras via intratekal rutten har en olika pyrogent tröskeldos, vilket är 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (där V är den volymen av den produkt som är avsedd för administrering), 0,2 EU/kg respektive4. Mer information om tröskelvärdet pyrogent dosen för olika läkemedel och enheter tillhandahålls och diskuterade någon annanstans4,5,6.

Djur varierar stort i sin känslighet för endotoxin-medierade reaktioner. Människor, icke-mänskliga primater och kaniner är bland de mest extremt känsliga för endotoxiner3arterna. För att undvika endotoxin-medierade biverkningar hos patienter och förebygga felaktiga slutsatser av preklinisk toxicitet och effektstudier, är det viktigt att exakt identifiera och kvantifiera endotoxiner i både kliniska och prekliniska grade formuleringar. Flera tillgängliga metoder kan uppnå denna uppgift. En av dem är Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analysen, som används över hela världen att skärmen biomedicinska produkter för potentiella endotoxin föroreningen samt att upptäcka bakterieinfektioner7,8,9. Den lysate är beredd från amoebocytes presenterar cellerna i blodet hos hästsko krabbor Limulus Polyfemos bosatta i östra stranden av kontinenten av Nordamerika7. Intressant, finns det några olika arter av hästsko krabbor (Tachypleus gigas och Tachypleus tridentatus) i Asien10. Den Tachypleus immobiliserat Lysate (TAL) används i flera asiatiska länder för detektion av endotoxin liknar hur LAL används i andra cuntries10. Lysates (LAL och TAL) innehåller en grupp av proteiner som vid aktivering ger proteas aktivitet. Ett av dessa proteiner, så kallade faktorn C aktiveras vid kontakt med endotoxin. Aktiverad faktor C klyver faktor B, som i sin tur också blir ett proteas och klyver en pro-koagulering enzym för att producera ett enzym som deltar i koagulationen. Resultatet av denna kedja av reaktioner är bildandet av en gel, en ökning av provet turbiditeten och i närvaro av ett kromogent substrat, uppkomsten av en färgad produkt, som tjänar som en grund för gel-propp, grumlighet och kromogen analyser, respektive. Medan det finns ingen obligatorisk LAL-format, den amerikanska Food and Drug Administration (FDA) förklarar i vägledningen för baserat branschen dokument, att vid avvikelser i resultaten mellan olika LAL format, beslutet görs på gel-clot analysen5 .

Många vanliga laboratoriekemikalier (t.ex., EDTA) och känd drog produkter (t ex penicillin) störa LAL analyser11. Störningen är vanligtvis identifieras genom att bedöma återhämtningen av endotoxin standard spetsade på en känd koncentration till en lösning som innehåller testmaterialet. Om den PIK-återhämtningen är mindre än 50% eller mer än 200%, då resultatet av LAL assay för är givet testmaterialet ogiltiga på grund av hämning eller förbättring, respektive4. Nanoteknik-baserade formuleringar är ofta komplexa och störa LAL genom olika mekanismer12,13,14. Många metoder har beskrivits för att övervinna störningen: prov beredning i specifika buffertar och tensider, protein inaktivering av värme, förstörelse av lipid-baserade ihåliga material värme och komplettera provet med överskott divalenta katjoner5,12,13,14,15. Alternativa metoder för situationer när LAL störningar inte kan övervinnas har också beskrivits: ELISA, en HEK-TLR4 reporter cell linje assay och masspektrometri16,17,18, 19.

Häri, beskrivs experimentella rutiner för att bedriva gel-propp, grumlighet och kromogen LAL analyser. Dessa analyser finns också tillgängliga på nanoteknik karakterisering Lab (NCL) webbplats20 i protokoll STE1.2 (grumlighet LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) och STE1.4 (kromogen LAL). Det rekommenderas att utföra minst två olika format för att karakterisera samma nano-formulering. När resultaten av grumlighet och kromogen LAL oense, anses gel-clot resultaten5. När resultaten av två LAL format oense, genomfört ytterligare studier med hjälp av antingen monocyt aktiveringen test (MAT) eller kanin pyrogenfri test (RPT) för att verifiera LAL fynd är21. Det är viktigt att notera att varje metod som används för identifiering av endotoxin och oskadlig bedömning har fördelar och begränsningar21,22,23,24. Erkänner begränsningar av det förfarande som används för att karakterisera en given nanoteknik formulering är viktig att få vetenskaplig motivering för användning av förfarandet som är optimal för att nano-formulering.

I denna studie användes pegylerat liposomalt doxorubicin som en modell nanopartiklar formulering. Denna formulering har godkänts av FDA 1995 och används för att behandla cancer patienter världen över25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. beredning av nanopartiklar prover

  1. Förbereda studien provet i LAL grade vatten.
  2. Om provet pH-värdet är utanför intervallet 6-8, justera pH med hjälp av pyrogenfri natriumhydroxid eller saltsyra.
  3. Med hjälp av LAL grade vatten förbereda flera spädningar av studien provet. Se till att den högsta utspädningen inte överstiger maximal giltig utspädning (MVD). Se diskussionsavsnittet för mer information om MVD uppskattning.

2. beredning av reagens Common mellan LAL format

  1. Späd koncentrerad natriumhydroxidlösning lager med pyrogenfri LAL reagens vatten för att förbereda en fungerande lösning med en koncentration på 0,1 N.
  2. Späd koncentrerad saltsyra lager med pyrogenfri LAL reagens vatten och förbereda en fungerande lösning med en slutlig koncentration på 0,1 N.
  3. Beredning av kontroll Standard Endotoxin (CSE)
    1. Beredes CSE enligt analyscertifikatet som tillhandahålls av tillverkaren.
      Obs: Se diskussionsavsnittet för viktiga anteckningar angående uppgifterna i certifikatet. Se Tabell för material för detaljer om katalognummer och tillämpning av en viss CSE formulering i olika LAL format.
  4. Beredning av LAL reagens
    1. Beredes LAL reagens enligt analyscertifikatet som tillhandahålls av tillverkaren.
      Obs: Se diskussionsavsnittet viktig information angående LAL REAGENSBEREDNING. Se Tabell för material för detaljer om katalognummer och tillämpning av en viss LAL reagens formulering i olika LAL format.

3. grumlighet LAL Assay

  1. Utarbetandet av standarder kalibrering
    1. Använda 900 µL av LAL grade vatten och 100 µL av CSE, förbereda så många mellanliggande utspädningar som behövs för att möjliggöra utarbetandet av en kalibrering som standard med ett koncentrationsintervall från 0.001 till 1 EU/mL.
    2. Först märka rören och tillsätt 900 μl LAL-grade vatten in i varje rör. Sedan Tillsätt 100 μL av 10 EU/mL solutionn att förbereda kalibrering standard med koncentration på 1EU/mL.
    3. Upprepa den seriella 10-faldig utspädningen enligt ovan för att förbereda tre lägre kalibrering standarder. Kontrollera att fyra kalibrering standarder alltifrån 0,001 till 1 EU/mL har upprättats.
  2. Beredning av kvalitetskontroller
    1. Förbereda en 0,05 EU/mL kvalitetskontroll genom att kombinera 50 µL av 1 EU/mL CSE lösningen med 950 µL av LAL-grade vatten.
      Obs: Se diskussionsavsnittet för mer information angående kontroll förberedelse.
  3. Beredning av hämning/Enhancement (IEC) kontroller
    1. Förbereda IEC med koncentration av 0.05 EU/mL genom att kombinera 25 µL av 1 EU/mL CSE lösningen och 475 µL prov nanomaterialet på en viss utspädning.
      Obs: Se diskussionsavsnittet för ytterligare detaljer.
  4. Experimentell förfarande
    1. Låt instrumentet att värma upp genom att vrida den på ca 30 min i förväg. Set-up upptäcka våglängden till 660 nm som denna är lämplig för turbiditeten LAL.
    2. Logga in genom att skriva in användarnamn och lösenord.
    3. Öppna programvaran (Tabell för material) genom att klicka på motsvarande ikon på en datorskärm.
    4. Välj samla in data på skärmen programvara hem. Ange test ID och data gruppinformation i motsvarande utrymme i fliken Allmänt på skärmen Hem.
    5. Klicka på fliken maskinvara väljer instrumenttyp från en listmeny.
    6. Set-up upptäcka våglängden till 660 nm som är lämpliga för turbiditeten LAL av själv välja metoden LAL grumlighet.
    7. Kontrollera att ett serienummer, system-ID och seriell portinformation visas på skärmen. Klicka på OK. Klicka på OK en gång för att bekräfta.
    8. Ange prov-ID i samma ordning provet testas. Använd standard för att ange den negativa kontrollen, kurva och test standardproven.
    9. Förbereda dubbla rör för varje prov och tillsätt 200 µL (test förhållandet 4:1) eller 100 µL (test förhållandet 1:1) av negativ kontroll (vatten), kalibrering standarder, kvalitetskontroll, IEC och test nanopartiklar i förväg märkt glasrör.
    10. Tillsätt 50 µL (test förhållandet 4:1) eller 100 µL (test förhållandet 1:1) av LAL reagens till första test injektionsflaska, vortex den kort och infoga i test slot i instrumentet karusellen. Om förhållandet 1:1 används, är volymen av LAL reagens 100 µL.
    11. Upprepa proceduren ovan för andra prover. Processen tar prov en i taget.
      Obs: Se diskussionsavsnittet för mer detaljer.

4. kromogen LAL

  1. Utarbetandet av standarder kalibrering
    1. Använda 900 µL av LAL grade vatten och 100 µL av CSE, förbereda så många mellanliggande utspädningar som behövs för att möjliggöra utarbetandet av en kalibrering som standard med en koncentration av 1 EU/mL.
    2. Med 900 µL LAL-grade vatten och 100 µL av 1 EU/mL kalibreringen standard, förbereda en andra kalibrering standard vid en koncentration på 0,1 EU/mL.
    3. Upprepa den seriella 10-faldig utspädningen enligt ovan för att förbereda två lägre kalibrering standarder. Kontrollera att fyra kalibrering standarder alltifrån 0,001 till 1 EU/mL har upprättats.
  2. Beredning av kvalitetskontroller.
    1. Förbereda en 0,05 EU/mL kvalitetskontroll genom att kombinera 50 µL av 1 EU/mL CSE lösningen med 950 µL av LAL-grade vatten.
      Obs: Se diskussionsavsnittet för mer information angående kontroll förberedelse.
  3. Beredning av hämning/Enhancement (IEC) kontroller
    1. Förbereda 0,05 EU/mL genom att kombinera 25 μl av 1 EU/mL CSE lösningen med 475 μL av test nanomaterial.
      Obs: Se diskussionsavsnittet för ytterligare detaljer.
  4. Experimentell förfarande
    1. Låt instrumentet att värma upp genom att vrida den på ca 30 min i förväg. Set-up upptäcka våglängden till 405 nm som denna är lämplig för turbiditeten LAL.
    2. Öppna programvaran genom att klicka på motsvarande ikon på en datorskärm. Logga in genom att skriva in användarnamn och lösenord.
    3. Välj samla in data på skärmen programvara hem. Ange test ID och data gruppinformation i motsvarande utrymme i fliken Allmänt på skärmen Hem.
    4. Klicka på fliken maskinvara väljer instrumenttyp från en listmeny. Välj instrumentet.
    5. Kontrollera att ett serienummer, system-ID och seriell portinformation visas på skärmen. Klicka på OK. Klicka på OK en gång för att bekräfta.
    6. Ange prov-ID i samma ordning provet testas. Använd standard för att ange negativa kontrollen, kurva och test standardproven.
    7. Förbereda dubbla rör för varje prov och tillsätt 200 µL (test förhållandet 4:1) eller 100 µL (test förhållandet 1:1) av negativ kontroll (vatten), kalibrering standarder, kvalitetskontroll, IEC och test nanopartiklar i förväg märkt glasrör.
    8. Tillsätt 50 µL (test förhållandet 4:1) eller 100 µL (test förhållandet 1:1) av LAL reagens till första test injektionsflaska, vortex den kort och infoga i test slot i instrumentet karusellen. Om förhållandet 1:1 används, är volymen av LAL reagens 100 µL.
    9. Upprepa proceduren ovan för andra prover. Processen tar prov en i taget.

5. gel-Clot LAL

Obs: Denna analys identifierar närvaro av endotoxiner i urvalet baserat på visuell observation och upptäckt av en propp i reaktionsröret. Experimentell stegen beskrivs nedan. Använda ett bänk för att registrera resultaten. Detta bänk blad är inte obligatoriskt, och andra sätt att inspelning assay resultaten är också godtagbara. Ett exempel på sådan en bänk ark finns i kompletterande material för att underlätta för en läsare. Lambda (l) är gel-clot analysens känslighet och 0,03 EU/mL.

  1. Märka så många reaktionsrören som behövs för att rymma antalet analyserade prover. Se bladet bänk för detaljer om antalet replikat som används i steg 1, steg 2 och steg 3 i analysen.
  2. Alikvotens 100 μL av vatten, kontroller eller prov prov per rör.
  3. Förbereda CSE sådan att slutliga koncentration är lika med 4λ.
  4. Kombinera 100 μL av den standard som nämns ovan med 100 μL av vatten eller prov prov att uppnå den slutliga koncentrationen av CSE av 2λ. Upprepa tre gånger att uppnå lambda och halv-lambda och en fjärdedel lambda.
  5. Kontrollera att temperaturen i vattenbadet är 37 ° C.
  6. Tillsätt 100 μL av lysat per provrör, vortex kort och placera hyllan med alla rör i vattenbad för 1 h.
  7. Vänd röret med en mjuk rörelse.
  8. Manuellt registrera resultat med ”+” (fast koagel) eller ”-” (inga koagel eller lös propp) i bladet bänk.
  9. Gå vidare med analysen enligt USP BET 854; använda bänk plåt som underlag

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Exemplet av data som genereras efter att ha testat denna formulering i LAL analyser visas i tabell 1. Pegylerat liposomalt doxorubicin störde kromogen LAL på utspädning 5. Dock var denna inblandning övervinnas genom större utspädningar. PIK-återhämtningen var mellan 50 och 200% när denna formulering testades på spädningar 50 och 500 i grumlighet och kromogen LAL, liksom på utspädning 5 i grumlighet LAL. Justerat av utspädningsfaktorn, överensstämde resultaten mellan spädningar i båda analyser. Dessutom överensstämde resultaten mellan tre assay format.

Provet Turbiditet LAL, EU/mg (spike återhämtning, %) Kromogen LAL, EU/mg, (spike återhämtning, %) Gel-clot LAL, EU/mg (test giltig, ja eller Nej)
Pegylerat liposomalt doxorubicin (se tabell av material)
Utspädning 5 0,01 (141) störningar < 0,75 (Y)
Utspädning 50 < 0,025 (187) 0,029 (82) < 1,5 (Y) *
Utspädning 500 < 0,25 (182) < 0,25 (86) < 3 (Y) **

Tabell 1: Påvisande av endotoxin i pegylerat liposomalt doxorubicin använder LAL analyser. Pegylerat liposomalt doxorubicin testades med hjälp av grumlighet, kromogen och gel-clot LAL-analyser. Prov störningar uppskattades med hjälp av IECs. PIK-återhämtningen visas inom parentes. Värden mellan 50 och 200% anses godtagbara enligt USP BET 85 standard för endotoxin upptäckt4. * och ** resultaten av detta urval erhölls på spädningar 100 och 200, respektive. Gel-clot assay spädningarna skiljer sig från dem som används i kromogen och grumlighet LAL eftersom känslighet och maximala giltig utspädning av denna analys är lägre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Informationen i detta protokoll har beskrivits innan15,26 och bygger på flera reglerande dokument som publiceras av oss mat och Drug Administration (FDA eller FDA) och USA farmakopén (USP)4 , 5 , 6 , 27, och finns också på NCL hemsida20 i protokoll STE1.2 (grumlighet LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) och STE1.4 (kromogen LAL).

Test-nanomaterial tillagas antingen i LAL reagens vatten eller steril, pyrogenfri PBS. PH-värdet i studien provet är viktigt eftersom låg (< 6) och hög (> 8) pH kommer störa optimal prestanda för den lysate. Om pH test-nanopartikelportföljen är utanför intervallet 6-8, kan det justeras med pyrogenfri natriumhydroxid eller saltsyra. När justeringen utförs är det viktigt att undvika prov kontaminering från mikroelektrod. Därför, för att utföra den här proceduren en liten delmängd av provet tas bort i ett separat rör och används för att mäta pH-värdet.

När provet är beredd i PBS eller en annan buffert, ingår tom bufferten också i detta test. Koncentrationen av varje nanomaterial är fallspecifika. Testet används för att uppskatta beloppet av kontaminerande endotoxin per milligram av den aktiva farmaceutiska ingrediensen (API). Dock beroende på vilken typ av nano-formulering, koncentrationen kan också uppskattas i mg totala utformningen eller totala element (t.ex., guld, silver eller järn för guld, silver och järnoxid nanopartiklar, respektive). Provet är testade från lager använder flera spädningar inte överstiger MVDEN. Alla är av de test-nanopartiklarna spädningar med LAL-grade vatten.

Tre parametrar används för att beräkna MVDEN. De är gränsen endotoxin (EL), prov koncentrationen och analysens känslighet (λ)4. Använd följande formel för att beräkna endotoxin gräns (EL): EL = K/M, där K är en tröskeldos pyrogenfri (t.ex., 5 EU/kg som diskuterats i inledningen) och M är den maximala dosen av test nanomaterialet avsett för administrering per kilogram av kroppen vikt i en enda timme4. Som diskuterats ovan, skattning av EL för nanomaterial som används som radioaktivt läkemedel eller medicintekniska bygger på en tröskeldos pyrogent eller formel, som skiljer sig från 5/M. Dessa detaljer nämns i inledningen och kunde omprövas i USP och amerikanska FDA riktlinjer4,5,6. Den rekommendera endotoxin gränsen för oftalmologiska lösningar och intraokulära enheter tillhandahålls i de amerikanska FDA riktlinjer för dessa produkter6. När en djurmodell (t.ex., mus) var används för att fastställa dosen av nanoformulation, denna information används för att beräkna den så kallade human ekvivalent dos (HED). HED beräknas genom att dividera den animaliska dosen med en omvandlingsfaktor som är specifika för varje djurart. Exempelvis är konverteringsfaktorn 12,3, 6.2 och 3.1 för musen, råtta och kanin, respektive27. De lingsförfarande och motivet för att använda det beskrivs i detalj i de amerikanska FDA riktlinje27. Cancer therapeutics är ofta doseras per yta kropp areal uttryckt i mg/m2. Man kan antingen följa USP riktlinjen för att beräkna EL för droger doseras i milligram per kvadratmeter eller konvertera denna dos till mg/kg intervall. Dosen i mg/m2 kan justeras till dosen i mg/kg med en artspecifik konverteringsfaktor27. För en vuxen människa är det 37 och anges som Km att hänvisa till de massa konstant27. Den km-faktorn har enheter i kg/m2. Det är lika med kroppsvikten i kilo (kg) dividerat med ytan i kvadratmeter (m2)27. Till exempel motsvarar en människa eller HED 74 mg/m2 2 mg/kg eller 74/37. För att avgöra MVD, använder du följande formel, som också är tillgängliga från USP BET 85 standard: MVD = (EL x provets koncentration) / λ)4. I ett hypotetiskt scenario, en nanopartikel provets koncentration är 10 mg/mL och dess maximala dosen i musen är 615 mg/kg. I detta fall HED är 615/12,3 = 50 mg/kg; EL för alla vägar utom intratekal är 0.1 EU/mg (5 EU/kg/50 mg/kg) och MVD är 1000 ((0.1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 EU/mL).

Ofta, när man måste utvärdera endotoxin förorening i ett forskning grade nanomaterial, är dos informationen inte tillgänglig. Det finns inga harmoniserade förfarande för hur man bedömer den MVD och EL för dessa material. Denna fallstudie utför testet direkt från lager (ofta koncentrationen av denna lösning är 1 mg/mL) och vid flera spädningar, vanligen 5-, 50-, 500- och 5000-veck. När dosen, administreringsväg, provets koncentration och infusionen tid för givet test nanomaterial ändringen, ändra den EL och MVD också. Därför måste man utvärdera information och utföra skattning av EL och MVD i samband med andra parametrar relaterade till belopp, tid, avsedda administreringsväg och koncentration av den givna formuleringen.

Det är viktigt att notera att katalognummer och produktspecifikationer (t.ex., potens, uppgår per injektionsflaska) av CSE är olika för olika LAL format. CSE används i grumlighet LAL kan också användas i en gel-clot LAL. CSE för ett kromogent LAL är dock specifik för detta test format. Instruktionerna nedan är allmänna och gäller för CSE används i alla assay format. CSE är en E. coli -lipopolysackarid (LPS) som levereras som ett frystorkat pulver. Denna standard är certifierad av tillverkaren mot en referens Standard Endotoxin (RSE) med en känd potens. Innehållet i injektionsflaskan med CSE ska beredas med ~3.2 - 5,0 mL pyrogenfri LAL reagens vatten. Förutom skillnaden mellan CSE används för olika assay format, är volymen av beredning också specifika för varje parti av denna standard. Därför måste man beräkna den slutliga koncentrationen CSE stamlösning för varje parti av standarden. Beräkningen utförs baserat på styrkan hos standarden och beloppet på varje injektionsflaska. Analyscertifikatet som är specifika för varje parti av endotoxin standard innehåller information om potens och belopp per injektionsflaska. Måste man noggrant vortex standarden för 30-60 sekunder, både under beredning och användning. Det rekommenderas också att utföra beredning med 5-10 min lösa tider och över en 30-60 min tidsramen för att säkerställa att alla frystorkade materialet går i lösning. Innan du använder i analysen, temperera beståndet CSE till rumstemperatur. Efter beredning, CSE beståndet kan förvaras i kylskåp för förvaring och är stabil i fyra veckor.

Liknar CSE, LAL reagens är också specifika för varje format. Instruktionerna nedan är generella och gäller för alla LAL assay format. LAL reagensen tillhandahålls som ett frystorkat pulver. Tillverkarens rekommendationer följs för att Rekonstituera varje injektionsflaska. Antingen LAL grade vatten eller buffert att hämma beta-glukaner kan användas. Bufferten att hämma beta-glukaner är att föredra i detta fall studie eftersom det tillåter exklusive störningen från beta-glukaner. Denna falska positiva inblandning är mycket vanliga i nanomaterial eftersom cellulosaacetat filter används ofta under nanomaterial syntes och fungera som en källa av glukan kontaminering15. De flesta flaskor kommer att kräva beredning till en slutlig volym av 5 mL. Baserat på över 10 år av författarnas erfarenhet med denna analys, man har märkt att införandet av denna buffert saktar ner reaktionen och kräva ökar maximal debut tiden i instrumentet för att möjliggöra lägsta kalibratorn på en koncentration av 0,001 EU/mL att utveckla.

För att säkerställa korrekt utspädning under utarbetandet av standarder, är det rekommenderat att använda 10-faldig utspädning steg. 10-faldig seriespädningar kan förberedas av tillsatta 100 µL av beståndet eller en standard med högre koncentration till 900 µL pyrogenfri vatten. Eftersom koncentrationen av CSE beståndet är oftast hög (~ 1.000 EU/mL), förberedelse av mellanliggande spädningar med koncentrationer 100 och 10 EU/mL rekommenderas innan du förbereder assay kalibratorn med en koncentration av 1 EU/mL. Två nyckeltal mellan provet och lysat beskrivs i detta protokoll. Även om båda nyckeltal används ofta, är kurvan Linjäriteten acceptabelt men inte perfekt när proportionen 4:1 och bufferten att hämma beta-glukaner (se Tabell för material) används.

Samma regler gälla som beskrivs ovan angående det kalibrering standardpreparatet även beredning av kvalitetskontroller (QC). Dessa kontroller används för att kontrollera att analysen fungerar korrekt. Det tillagas av tillsatta kända mängden CSE i pyrogenfri vattnet. Koncentrationen av QC väljs vanligtvis i mitten av assay intervallet. Utbudet av grumlighet LAL analysen är 0,001 till 1 EU/mL. Därför används en QC i en koncentration av 0.05 EU/mL. Andra koncentrationer inom intervallet test kan också användas vid beredning av kvalitetskontroll.

Kontrollen över enhancement hämning (IEC) är också känd som positiv produktkontroll (PPC). Det tillagas av tillsatta en känd koncentration av CSE i provet. Koncentrationen av IEC (PPC) väljs vanligtvis i mitten av assay intervallet. Utbudet av grumlighet LAL analysen är 0,001 till 1 EU/mL. Därför används IEC vid en koncentration av 0.05 EU/mL. För att förbereda detta IEC behöver man kombinera 50 µL av 1 EU/mL CSE lösningen med 950 µL av test-nanopartiklar. IEC är förberedd för varje utspädning av ett test-nanomaterial. Exempelvis om en nano-formulering testas på tre utspädningar (1:50, 1: 500 och 1:5, 000), måste man förbereda tre IECs, en för varje av dessa utspädningar. Andra koncentrationer inom intervallet assay kan också användas för att förbereda IEC provet. Den här kontrollen används för att förstå giltigheten av testresultaten för viss nano-utformningen. Enligt USP är test-resultaten giltiga om den PIK-återhämtningen av IEC (PPC) är mellan 50 och 200%4. Spike återhämtning är mindre än 50% betyder att test-nanomaterialet hämmar endotoxin upptäckt och därför testet leda underskattningar endotoxin kontaminering och är ogiltig. PIK-återhämtningen över 200% tyder på att testämnet-förbättrar analysens resultat eller innehåller en för hög nivå av kontaminerande endotoxin. När det gäller förbättring är assay resultatet också felaktig. Exempel på sådana störningar och några sätt för att övervinna dem har beskrivits tidigare12,15.

När du utför grumlighet och kromogen analyser, är det rekommenderat att använda en repeater pipett till LAL reagenset i alla prover. Genomsnittliga instrument operationstiden är 7200 sekunder. Reaktionen kan dock snabbare eller långsammare med vissa partier av den lysate. I fall när reaktionen är långsam, kan man behöva ändra instrumentinställningarna för till 9600s eller längre. Denna förändring gör att lägsta kalibratorn att utveckla.

Pegylerat liposomalt doxorubicin är en formulering som innehåller en aktiv farmaceutisk ingrediens (API) vid en koncentration på 2 mg/mL. Det används i kliniken som en dos på 50 mg/m2. För att konvertera denna dos mg/kg intervall, delas det av faktor 3727. Dosen av pegylerat liposomalt doxorubicin i mg/kg, därför är 1,35. För att beräkna EL, 5 (tröskelvärde pyrogenfri dosen i EU/kg) dividerat med 1,35 (dos av Doxil i mg/kg) och få 3.7 EU/mg4. Detta nummer innebär att pegylerat liposomalt doxorubicin vid dosen 1,35 mg/kg kan administreras säkert per timme om endotoxin i formuleringen inte överstiger 3,7 EU/mg, där mg refererar till API.

Använd sedan denna information för att beräkna MVDEN för LAL analyser. Känsligheten (lambda) av grumlighet, kromogen och gel-clot-analyser som presenteras i denna studie är 0,001 0,001 och 0,03 EU/mL, respektive. MVD är därför 7,407 för grumlighet och kromogen analyser ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 EU/mL), och 247 för gel-clot analysen ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 EU/mL).

Doxorubicin har ett brett absorbansen spektrum som överlappar med assay våglängd av den kromogen LAL28,29. Dessutom de flesta Liposom formuleringar är grumligt och visas mjölkaktig. Denna inneboende turbiditet är mycket vanliga orsaken till störningen av liposomer med grumlighet analys. När det gäller pegylerat liposomalt doxorubicin övervanns störningar på grund av turbiditeten genom utspädning fem vilket framgår av spike återhämtning värdena mellan 50 och 200% (tabell 1). Men på den samma utspädning doxorubicin var koncentrationen fortfarande tillräckligt hög för att störa den kromogen LAL (tabell 1). Två efterföljande utspädningar (50 och 500) bidragit till att övervinna pegylerat liposomalt doxorubicin störningar med kromogent LAL. Eftersom den gel-clot-analysen är oberoende av grumlighet och färgprov och endotoxin i formuleringen är inom intervallet gel-propp, den pegylerat liposomalt doxorubicin inte interferera med gel-clot analysen vid alla testade utspädningar. I denna fallstudie användes flera spädningar av pegylerat liposomalt doxorubicin för dessa analyser. Spädningarna 5, 50 och 500 för grumlighet och kromogen samt 50, 100 och 200 för gel-clot analysen valdes eftersom de är inom MVDEN. MVDEN gel-clot analysens är lägre än det av grumlighet och kromogen LALs eftersom känsligheten i denna analys är också lägre. Om formuleringen hindrat LAL på utspädning 500 i grumlighet och kromogen analyser, kunde analysen vid högre spädningar (t.ex., 5000, 6000, 7.000 eller 7,407) utföras. Eftersom nivån på endotoxin erhålls vid utspädning 50 i gel-clot-analysen var nedanför EL, utfördes inte analysen av denna formulering på lägre utspädningar. I andra fall testning kan vara fortsatte dock utspädningar 20, 10, 5 eller 2 att identifiera den lägsta inte stör utspädning och förstå om nivån på endotoxin i formuleringen är nedanför EL.

Det är viktigt att nämna att det är viktigt att stänga av funktionen vatten cirkulation i vattenbad för varaktigheten av denna analys eller använda ett vattenbad utan sådant alternativ eftersom vattenflödet skadar koagel och kan påverka noggrannheten på g för gel-clot analysen El-clot LAL assay. Det är inte alltid möjligt att övervinna nanopartiklar störningar med LAL-analyser genom att öka provspädningar. Strategier och vissa metoder för att övervinna olika typer av störningar och exempel på nanopartiklar som ofta representerar ett problem för LAL analyser har varit diskuteras av andra grupper och oss någon annanstans12,13,14 ,15,30,31. Den analys som presenteras i detta manuskript är baserad på en modell formulering. Upplevelsen med andra nanoformulations kan vara olika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Studien har finansierats av federala medel från National Cancer Institute, National Institutes of Health, kontrakterade HHSN261200800001E. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller politik av Department of Health and Human Services, eller nämner av varunamn, kommersiella produkter eller organisationer antyda av den amerikanska regeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36, (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11, (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4, (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. Bacterial Endotoxins Test. (2011).
  5. FDA, U. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. (2012).
  6. FDA, U. Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44, (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19, (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409, (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220, (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5, (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9, (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. NCL. NCL assay cascade. Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015).
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4, (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9, (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33, (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160, (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31, (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9, (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11, (9-10), 1157-1175 (2017).
Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter