Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

doi: 10.3791/58830 Published: January 30, 2019

Summary

Endotoxins mühendislik Nanomalzemeler içinde tespiti nanomedicine alanında büyük zorluklardan biri temsil eder. Burada, nano tanecikleri potansiyel endotoksin kirlenme tahmin etmek için üç farklı biçimlerinin LAL oluşan çerçeve açıklar bir örnek çalışma mevcut.

Abstract

Varsa ilaç ürünlerinde (sık sık da lipopolysaccharide denir) gram-negatif bakteri hücre duvarı bileşeni endotoksin inflamasyon, ateş, hipo - veya hipertansiyon neden olabilir ve, aşırı durumlarda olabilir doku ve organ hasarı için neden olabilir ölümcül olur. Bu nedenle, eczacılık ürünleri, endotoksin miktarda kesinlikle düzenlenmektedir. Arasında için kullanılabilen yöntemleri endotoksin algılama ve miktar, Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) tahlil dünya çapında yaygın olarak kullanılır. Herhangi bir ilaç ürün LAL tahlil ile müdahale ederken, nano-formülasyonları kendi karmaşıklığı nedeniyle belirli bir meydan okuma temsil eder. Bu yazının amacı araştırmacılar endotoxins mühendislik Nanomalzemeler ve uyuşturucu nanopartikül formüle tahmininde deneyimsiz için pratik bir rehber sağlamaktır. Burada, bulanıklık, chromogenic dahil olmak üzere üç LAL biçimleri ve jel-pıhtı testleri gerçekleştirmek için pratik öneriler ele alınmıştır. Bu deneyleri endotoksin kirlenme nanoteknoloji tabanlı ilaç ürünleri, aşılar ve adjuvan belirlemek için kullanılabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir endotoksin Ayagin Gram-negatif bakteri hücre duvarı1,2bir yapı taşıdır. Daha çok, bağışıklık hücreleri etkinleştirebilirsiniz düşük (picogram) konsantrasyonları1,2. Yanıt olarak bir endotoksin hücreleri tarafından üretilen proinflamatuar aracıların (sitokinler, lökotrienler, eikozanoidler, vb) ateş, hipotansiyon, hipertansiyon ve birden fazla organ yetmezliği gibi daha ciddi sağlık sorunları sorumlu 1 , 2 , 3. immün aracılı yan etkileri-endotoksin tarafından tetiklenen önem endotoksin kompozisyon ve yapısına göre belirlenen ve uluslararası endotoksin birimleri (IUS veya EUs)3' te ölçülen onun etki gücüne bağlıdır. Bu birim vücut ağırlığının kilogram başına endotoksin eşik pyrogenic doz ayarlamak için kullanılır. Bu doz intratekal rota ama tüm yolları üzerinden 5 EU/kg ilaç ürünleri için yönetilen değil. Vücut yüzeyi, göz içi sıvı, Radyofarmasötikler ve ürünleri yönetilen yolu ile intratekal rota metrekare doz uyuşturucu var 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V bir farklı eşik pyrogenic doz (V nerede birim yönetimi için tasarlanmış ürün) ve 0,2 EU/kg, sırasıyla4. Eşik pyrogenic doz için çeşitli ilaç ürünleri ve aygıtlar hakkında daha fazla bilgi sağlanır ve başka bir yerde ele4,5,6.

Hayvanlar onların duyarlılık reaksiyonları endotoksin-aracılı değişkenlik. İnsan, insan dışı primatlar ve tavşan endotoxins3' e en son derece hassas türler arasındadır. Hastalarda endotoksin-aracılı yan etkilerinden kaçınmak ve yanlış sonuçlara preklinik toksisite ve etkinlik çalışmaları engellemek için doğru algılamak ve her iki klinik ve önceden klinik sınıf formülasyonları endotoxins ölçmek için önemlidir. Birkaç mevcut Yöntem bu görevi elde edebilirsiniz. Yaygın olarak tüm dünyada ekran Biyomedikal ürünler bakteriyel enfeksiyonlar7,8,9algılamak için potansiyel endotoksin kirlenme de için için kullanılır Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) tahlil onlardan biri. Lysate amoebocytes hazırlanır, at nalı yengeç Limulus polyphemus kan hücreleri mevcut Kuzey Amerika7kıta Doğu kıyısında bulunan. İlginçtir, at nalı yengeçler birkaç farklı türleri vardır (Tachypleus gigas ve Tachypleus tridentatus) Asya10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) birçok Asya ülkesinde endotoksin nasıl LAL diğer cuntries10dakika sonra kullanılır benzer tespiti için kullanılır. Lysates (LAL ve TAL) etkinleştirme üzerine proteaz aktivitesi görüşmek proteinleri bir grup içerir. Bu proteinler, sözde faktör C birini endotoksin ile temas üzerine devreye girer. Aktif faktör C faktörü B, hangi sırayla da bir proteaz olur ve pıhtılaşma enzim üretmek için bir pro-pıhtılaşma enzim cleaves cleaves. Bu zincir reaksiyonların bir jel, artış örnek bulanıklık içinde ve chromogenic substrat, jel-pıhtı, bulanıklık ve chromogenic deneyleri için bir temel olarak hizmet bir renkli ürün görünümünü huzurunda oluşumu sonucudur, anılan sıraya göre. ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) açıklar için sağlanan bilgilerde açıklanan hiçbir zorunlu LAL biçimi ise sanayi belgesi, test sonuçlarını farklı LAL formatları arasında tutarsızlık durumunda karar verdi jel-pıhtı tahlil5 temel .

Çok yaygın olarak kullanılan laboratuvar kimyasalları (Örn., EDTA) ve ürünleri (Örneğin, penisilin) müdahale LAL ile bilinen ilaç deneyleri11. Girişim genellikle standart endotoksin kurtarılması, bilinen bir konsantrasyon test materyalini içeren bir çözüm içine çivili değerlendirmek tarafından tanımlanır. Spike kurtarma % 50 daha az veya fazla %200, ise o zaman LAL sonucu tahlil için verilen test materyalini inhibisyon veya geliştirme, sırasıyla4nedeniyle geçersiz. Nanoteknoloji tabanlı formülasyonları genellikle karmaşık ve LAL mekanizmaları12,13,14çeşitli engel. Girişim üstesinden gelmek için pek çok yaklaşım tarif var: örnek rekonstitüsyon özel arabellekleri ve yüzey, protein inactivation Isıtma, Isıtma ve aşırı örnekle ilave lipid tabanlı içi boş malzemeler imha tarafından divalent katyonlar5,12,13,14,15. Ne zaman LAL girişim üstesinden olamaz durumlar için alternatif yöntemler Ayrıca tarif edilmiştir: ELISA, HEK-TLR4 muhabiri hücre satır tahlil ve kütle spektrometresi16,17,18, 19.

Burada, jel-pıhtı, bulanıklık ve chromogenic LAL deneyleri yürütmek için deneysel yordamlar açıklanmıştır. Bu deneyleri de protokolleri STE1.2 (bulanıklık LAL), STE1.3 (jel-pıhtı LAL) Nanoteknoloji karakterizasyon Laboratuvarı (NCL) Web sitesi20 mevcuttur ve STE1.4 (chromogenic LAL). Bu aynı nano-formülasyonu karakterize etmek için en az iki farklı biçimleri yapmak için tavsiye edilir. Bulanıklık ve chromogenic LAL sonuçlarını katılmıyorum, jel-pıhtı sonuçları5kabul edilir. Ne zaman sonuçları iki LAL biçimlerinin katılmıyorum, ek çalışmalar LAL doğrulamak için monosit harekete geçirmek testi (MAT) veya tavşan pyrogen testi (RPT) kullanarak bulgulardir21yaptı. Her yöntemin endotoksin algılama için kullanılan ve pyrogenicity değerlendirme21,22,23,24avantajları ve sınırlamalar vardır unutmamak gerekir. Verilen nanoteknoloji formülasyonu karakterize etmek için kullanılan yordam sınırlamaları kabul ederek bu nano-formülasyon için en uygun yordamı kullanmak için bilimsel gerekçesi elde etmek için esastır.

Bu çalışmada, pegile liposomal doksorubisin modeli nanopartikül formülasyonu kullanıldı. Bu formülasyon 1995'te bize FDA tarafından onaylanmış ve kanser hastaları dünya çapında25tedavi etmek için kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. hazırlanması nanopartikül örnekleri

  1. LAL çalışma örnek sınıf su hazırlamak.
  2. Örnek pH 6-8 aralığının dışında ise, pH pyrogen ücretsiz sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak ayarlayın.
  3. LAL kullanarak sınıf su çalışma örneği birkaç dilutions hazır olun. En yüksek seyreltme en fazla geçerli seyreltme (MVD) fazla olamaz emin olun. MVD tahmini hakkında ayrıntılı bilgi için tartışma bölümüne bakın.

2. LAL formatları arasında reaktifler ortak hazırlanması

  1. Seyreltik sodyum hidroksit hisse senedi 0,1 n bir konsantrasyon, çalışan bir çözüm hazırlamak için pyrogen ücretsiz LAL reaktif su kullanarak konsantre
  2. Pyrogen-Alerjik LAL reaktif su kullanarak konsantre hidroklorik asit stok sulandırmak ve 0,1 n son bir konsantrasyon, çalışan bir çözüm hazırlamak
  3. Denetim standart endotoksin (CSE) hazırlanması
    1. Üretici tarafından sağlanan analiz belgesi göre ÖAM sulandırmak.
      Not: sertifika bilgiler hakkındaki önemli notları için tartışma bölümüne bakınız. Katalog numarası ve belirli bir ÖAM formülasyon farklı LAL biçimlerde uygulanması ile ilgili ayrıntılar için Malzemeler tablo bakın.
  4. LAL reaktifin hazırlanması
    1. LAL reaktif üreticisi tarafından sağlanan analiz belgesi göre yeniden oluşturma.
      Not: LAL reaktif hazırlık ile ilgili önemli ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın. Katalog numarası ve belirli bir LAL reaktif formülasyon farklı LAL biçimde uygulanması ile ilgili ayrıntılar için Malzemeler tablo bakın.

3. bulanıklık LAL tahlil

  1. Kalibrasyon standartları hazırlanması
    1. 900 µL LAL sınıf su ve ÖAM'in 100 µL kullanarak, bir kalibrasyon standart 0,001 konsantrasyon aralığından 1 EU/ml ile hazırlanması etkinleştirmek için gerektiği kadar çok sayıda ara dilutions hazırlayın.
    2. İlk etiket tüpler ve LAL-grade su 900 μL her tüpün içine ekleyin. Sonra 10 EU/mL solutionn kalibrasyon standart 1EU/mL konsantrasyonu ile hazırlamak için 100 μL ekleyin.
    3. Seri 10 kat seyreltme üç alt kalibrasyon standartları hazırlamak için yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın. 0,001 1 EU/mL aralığında değişen dört kalibrasyon standartları hazırladık doğrulayın.
  2. Kalite denetimleri hazırlanması
    1. 0,05 EU/mL kalite kontrol 1 EU/mL ÖAM çözüm 50 µL LAL-grade su 950 µL ile birleştirerek hazırlayın.
      Not: denetim hazırlık ile ilgili ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın.
  3. İnhibisyon/geliştirme (IEC) denetimleri hazırlanması
    1. IEC 0,05 EU/mL konsantrasyonu ile 25 µL 1 EU/mL ÖAM çözüm ve test nanomaterial verilen bir seyreltme, 475 µL birleştirerek hazır olun.
      Not: ek ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın.
  4. Deneysel bir işlem
    1. Yaklaşık 30 dakika üzerinde önceden çevirerek ısınmak araç sağlar. Set-up algılama dalga boyu için 660 nm bu bulanıklık LAL için uygundur.
    2. Kullanıcı adınızı ve şifrenizi yazarak giriş yapın.
    3. Yazılım (Tablo reçetesi) bilgisayar ekranında ilgili simgesini tıklatarak açın.
    4. Veri toplama yazılım ana ekranında seçin. Test kimliği ve veri grubu bilgileri genel sekmesindeki ilgili uzaya ana ekranda girin.
    5. Tıklayın donanım sekmesini araç türü açılır menüsünden seçin.
    6. Set-up algılama dalga boyu için 660 nm bu gibi uygun için chosing tarafından bulanıklık LAL LAL bulanıklık yöntemi.
    7. Bir seri numarası, sistem kimliği ve seri bağlantı noktası bilgileri ekranda görüntülendiğinden emin olun. Tamam' ı tıklatın. Onaylamak için bir kez daha Tamam ' ı tıklatın.
    8. Örnek kimliği örnek test sırayla girin. Negatif kontrol, standart eğri ve test örnekleri girmek için varsayılan düğmeleri kullanın.
    9. Her örnek için yinelenen tüpler hazırlamak ve 200 µL (test oranı 4:1) veya negatif kontrol (su), kalibrasyon standartları, kalite kontrol, IEC ve test nano tanecikleri 100 µL (test oranı 1:1) önceden etiketli cam tüpler içine ekleyin.
    10. 50 µL (test oranı 4:1) veya 100 µL (test oranı 1:1) LAL reaktif ilk test şişe, kısaca ve test içine ekleme enstrüman atlıkarınca yuvası girdap ekleyin. 1:1 oran kullandıysanız, LAL reaktif 100 µL birimdir.
    11. Diğer örnekler için yukarıda açıklanan yordamı yineleyin. İşlem tek tek örnekler.
      Not: daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın.

4. chromogenic LAL

  1. Kalibrasyon standartları hazırlanması
    1. 900 µL LAL sınıf su ve ÖAM'in 100 µL kullanarak, bir kalibrasyon standart hazırlanması 1 EU/mL bir konsantrasyon ile etkinleştirmek için gerektiği kadar çok sayıda ara dilutions hazırlayın.
    2. 900 µL LAL-grade su ve 1 EU/mL kalibrasyon Standart 100 µL kullanarak, ikinci bir kalibrasyon standart 0.1 EU/mL bir konsantrasyon, hazır olun.
    3. Seri 10 kat seyreltme iki alt kalibrasyon standartları hazırlamak için yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın. 0,001 1 EU/mL aralığında değişen dört kalibrasyon standartları hazırladık doğrulayın.
  2. Kalite kontrol hazırlanması.
    1. 0,05 EU/mL kalite kontrol 1 EU/mL ÖAM çözüm 50 µL LAL-grade su 950 µL ile birleştirerek hazırlayın.
      Not: denetim hazırlık ile ilgili ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın.
  3. İnhibisyon/geliştirme (IEC) denetimleri hazırlanması
    1. 0,05 EU/mL 1 EU/mL ÖAM çözüm 25 μL test nanomaterial 475 μL ile birleştirerek hazırlayın.
      Not: ek ayrıntılar için tartışma bölümüne bakın.
  4. Deneysel bir işlem
    1. Yaklaşık 30 dakika üzerinde önceden çevirerek ısınmak araç sağlar. Set-up algılama dalga boyu için 405 nm bu bulanıklık LAL için uygundur.
    2. Yazılım bilgisayar ekranında ilgili simgesini tıklatarak açın. Kullanıcı adınızı ve şifrenizi yazarak giriş yapın.
    3. Veri toplama yazılım ana ekranında seçin. Test kimliği ve veri grubu bilgileri genel sekmesindeki alanlara karşılık gelen ana ekranda girin.
    4. Tıklayın donanım sekmesini araç türü açılır menüsünden seçin. Aracı seçin.
    5. Bir seri numarası, sistem kimliği ve seri bağlantı noktası bilgileri ekranda görüntülendiğinden emin olun. Tamam' ı tıklatın. Onaylamak için bir kez daha Tamam ' ı tıklatın.
    6. Örnek kimliği örnek test sırayla girin. Negatif kontrol, girmek için varsayılan düğmeleri kullanın standart eğri ve test örnekleri.
    7. Her örnek için yinelenen tüpler hazırlamak ve 200 µL (test oranı 4:1) veya negatif kontrol (su), kalibrasyon standartları, kalite kontrol, IEC ve test nano tanecikleri 100 µL (test oranı 1:1) önceden etiketli cam tüpler içine ekleyin.
    8. 50 µL (test oranı 4:1) veya 100 µL (test oranı 1:1) LAL reaktif ilk test şişe, kısaca ve test içine ekleme enstrüman atlıkarınca yuvası girdap ekleyin. 1:1 oran kullandıysanız, LAL reaktif 100 µL birimdir.
    9. Diğer örnekler için yukarıda açıklanan yordamı yineleyin. İşlem tek tek örnekler.

5. jel-pıhtı LAL

Not: Bu tahlil endotoxins görsel gözlem ve pıhtı tepki tüp tespiti dayalı örnek varlığı tanımlar. Deneysel adımlar aşağıda açıklanmıştır. Sonuçları kaydetmek için bir tezgah sayfasını kullanın. Bu tezgah sayfasını zorunlu değildir ve tahlil sonuçları kayıt başka yolları de kabul edilir. Böyle bir tezgah yaprak örneği bir okuyucu kolaylık sağlamak için ek materyalleri sağlanır. Lambda (l) jel-pıhtı Testin duyarlılığı ve 0,03 EU/mL.

  1. Analiz test örnekleri sayısını karşılamak için gerektiği kadar çok sayıda tepki tüpler etiketleyin. 1. adım, adım 2 ve adım 3 testin kullanılan çoğaltır sayısı hakkında ayrıntılı bilgi için tezgah sayfasına bakın.
  2. Aliquot 100 μL tüp başına su, denetimleri veya test örneği.
  3. Öyle ki son konsantrasyon 4λ için eşit ÖAM hazırlayın.
  4. 2λ ÖAM'in nihai toplama ulaşmak için su veya test örnek 100 μL ile yukarıda belirtilen standart 100 μL birleştirin. Lambda ve yarı-lambda ve çeyrek lambda elde etmek için üç kez daha tekrarlayın.
  5. Su banyosu sıcaklığı 37 ° c olduğundan emin olun
  6. Ve tüpler ile kabin içine su banyosu 1 h için yer, lysate Tüp, girdap kısaca başına 100 μL ekleyin.
  7. Yumuşak bir hareket ile tüp tersine çevirin.
  8. El ile kayıt sonuçları kullanarak "+" (firma pıhtı) ya da "-" (pıhtı veya gevşek pıhtı) tezgah gökyüzünde.
  9. Analizine göre USP bahis 854ile devam; destek malzemesi olarak tezgah sayfasını kullanın

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu formülasyon LAL deneyleri içinde test ettikten sonra oluşturulan veri örneği Tablo 1' de gösterilen. Pegile liposomal doksorubisin chromogenic LAL seyreltme 5, müdahale. Ancak, bu girişim büyük dilutions tarafından üstesinden oldu. Spike kurtarma 50 ile % 200 arasında bu formülasyon dilutions 50 ve 500 bulanıklık ve chromogenic LAL yanı sıra, seyreltme 5 bulanıklık LAL olarak test edildi zamandı. Seyreltme faktörü ayarlandığında sonuçları her iki deneyleri dilutions arasında tutarlı edildi. Ayrıca, sonuçları üç tahlil biçimleri arasında tutarlı edildi.

Test örneği Bulanıklık LAL, EU/mg (spike kurtarma, %) Chromogenic LAL, EU/mg, (spike kurtarma, %) Jel-pıhtı LAL, EU/mg (test geçerli, Evet veya Hayır)
Pegile liposomal doksorubisin (malzemeleri tablo görmek)
Seyreltme 5 0,01 (141) girişim < 0,75 (Y)
Seyreltme 50 < 0,025 (187) 0.029 (82) < 1.5 (Y) *
Seyreltme 500 < 0.25 (182) < 0.25 (86) < 3 (Y) **

Tablo 1: LAL kullanarak liposomal doksorubisin deneyleri pegile endotoksin tespiti. Pegile Liposomal doksorubisin bulanıklık, chromogenic ve jel-pıhtı LAL kullanarak test edildi deneyleri. Örnek girişim IECs kullanarak tahmin edilmiştir. Spike kurtarma parantez içinde gösterilir. Değerleri 50 ile % 200 arasında USP bahis 85 göre kabul edilebilir endotoksin algılama4için standart kabul edilir. * ve ** bu örnek test sonuçlarını dilutions 100 ve 200, sırasıyla elde edilmiştir. Jel-pıhtı tahlil dilutions içinde chromogenic kullanılanlardan farklıdır ve bulanıklık LAL hassasiyeti ve bu testin en fazla geçerli seyreltme daha düşük olduğu için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol için sağlanan bilgi15,26 daha önce açıklanan ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA bize veya FDA) ve Amerika Birleşik Devletleri Pharmacopoeia (USP)4 tarafından yayımlanan farklı düzenleyici belgelere dayanan , 5 , 6 , 27ve kullanılabilir protokolleri STE1.2 (bulanıklık LAL), STE1.3 (jel-pıhtı LAL) NCL Web sitesi20 ' da ve STE1.4 (chromogenic LAL).

Test-Nanomalzemeler LAL reaktif su veya steril, pyrogen-Alerjik PBS hazırlanır. Lysate en iyi performansı ile düşük (< 6) ve yüksek (> 8) pH bulunacağından çalışma örnek pH önemlidir. Test nanopartikül pH 6-8 aralığının dışında ise, pyrogen-Alerjik sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanılarak ayarlanabilir. Böyle ayarlama gerçekleştirildiğinde, elektrot üzerinden örnek kirlenmesini önlemek için çok önemlidir. Bu nedenle, bu yordamı gerçekleştirmek için örnek küçük bir aliquot ayrı bir tüpe kaldırılır ve pH ölçmek için kullanılır.

Örnek PBS veya başka bir arabellek hazırlanmıştır boş arabellek Ayrıca bu teste dahil edilir. Her nanomaterial durumda özgü bölgedir. Test endotoksin miligram aktif ilaç madde (API) başına kirletici miktarı tahmin etmek için kullanılır. Ancak, nano-formülasyonu türüne bağlı olarak, konsantrasyonu da toplam formülasyonu veya toplam öğe mg tahmin edilebilir (Örn., altın, gümüş veya altın, gümüş, demir oksit nano tanecikleri, sırasıyla demir). Örnek birkaç dilutions MVD geçmeyen kullanarak stoktan mercek altına alındı. Tüm dilutions in test-nano tanecikleri LAL-grade su kullanılarak hazırlanır.

Üç parametre MVD hesaplamak için kullanılır. Bunlar endotoksin sınırı (EL), örnek toplama ve tahlil duyarlılık (λ)4. Endotoksin sınırı (EL) hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın: EL = K/M K bir eşik pyrogen doz nerede, (Örn., 5 EU/kg giriş bölümünde anlatıldığı gibi) ve yönetim vücut kilogram başına yönelik test nanomaterial maksimum doz metredir bir tek saat4kilo. Yukarıda da açıklandığı gibi EL tahmini radiopharmaceutical veya tıbbi cihaz olarak kullanılan Nanomalzemeler için bir eşik pyrogenic doz dayanır veya formül, 5/M--dan farklı olduğu. Bu ayrıntıları giriş bölümünde belirtilen ve daha fazla USP ve bize FDA kuralları4,5,6' gözden geçirilmesi. Oftalmik çözümleri ve göz içi cihazlar için önerilen endotoksin sınırı bizim FDA kılavuz için bu ürünleri6sağlanır. Ne zaman bir hayvan modeli (Örn., fare) yapıldı nanoformulation doz kurmak için kullanılan, bu bilgileri sözde insan eşit dozu (HED) tahmin etmek için kullanılır. HED hangi hayvan her türü için belirli bir dönüştürme faktörüyle, hayvan doz bölünerek hesaplanır. Örneğin, dönüştürme faktörünü 12,3, 6.2 ve 3.1 için fareyi, fare ve tavşan, sırasıyla27dir. Dönüştürme işlemi ve onu kullanmak için gerekçe bize FDA kılavuz27' deki ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Kanser tedavi kez mg/m2içinde ifade yüzey gövde alanı başına ilaç. Bir miligram metre kare başına ilaç ilaçlar için EL hesaplamak için USP kılavuz izleyin veya bu doz mg/kg aralığa dönüştürme. Doz mg/m2 mg/kg species-specific dönüştürme faktörünü27kullanarak doz için ayarlanabilir. Yetişkin bir insan için 37 ve kitle sürekli27ile başvurmak için Km olarak belirtilen. Birimleri kg/m2km faktörüne sahiptir; Bu vücut ağırlığı bölü metre kare (m2)27' deki yüzey alanı kilogram (kg) eşittir. Örneğin, bir insan doz veya HED 74 mg/m2 2 mg/kg veya 74/37 karşılık gelir. MVD belirlemek için Ayrıca USP bahis 85 Standart kullanılabilir aşağıdaki formülü kullanın: MVD (EL örnek konsantrasyonu x) = / λ)4. Varsayımsal bir senaryo nanopartikül örnek toplama 10 mg/mL ve fareyi onun maksimum doz 615 mg/kg dır. Bu durumda olduğunu HED 615/12,3 = 50 mg/kg; İntratekal hariç tüm içindir EL olduğunu 0.1 EU/mg (5 EU/kg/50 mg/kg) ve MVD 1.000 ((0.1 EU/mg x 10 mg/mL)/0.001 EU/mL).

Çoğu zaman, ne zaman bir araştırma sınıf nanomaterial endotoksin kirlenme değerlendirmek gerekiyor, doz bilgileri kullanılabilir değil. Bu nasıl için İçişleri ve EL bu malzemeler için tahmini için uygulayabileceğiniz bir işlemdir. Bu durumda çalışma testi doğrudan stoktan gerçekleştirir (yaygın olarak bu çözüm konsantrasyonu 1 mg/mL olduğunu) ve birkaç dilutions, genellikle 5-, 50-, 500 - ve 5.000-pas geçiyor. Doz, yönetim yol, örnek konsantrasyon ve infüzyon belirli test nanomaterial değişim için ne zaman, EL ve MVD de değiştirir. Bu nedenle, bir bilgileri değerlendirin ve ilgili tutar, yönetim zaman, hedeflenen rotanın ve konsantrasyon verilen formülasyon için diğer parametreler bağlamında EL ve MVD tahmini gerçekleştirmek zorunda.

Unutmayın ki katalog numarası ve ürün belirtimleri (e.g., kudret, şişe tutarlar) ÖAM için farklı LAL biçimleri farklıdır. LAL de bir jel-pıhtı LAL kullanılabilir bulanıklık kullanılan ÖAM. Ancak, bir chromogenic LAL için ÖAM bu tahlil biçimine özgüdür. Aşağıdaki talimatları genel ve tüm tahlil biçimlerinde kullanılan ÖAM uygulanabilir. ÖAM lyophilized bir toz olarak sağlanan bir E. coli lipopolysaccharide (LPS) olduğunu. Bu standart ile bilinen bir etki gücüne karşı bir referans standart endotoksin (ŞTIR) üretici tarafından onaylıdır. ÖAM içeren flakon içeriğini yeniden ~3.2 - pyrogen-Alerjik LAL reaktif su 5.0 mL. Farklı tahlil biçimleri için kullanılan ÖAM arasındaki fark yanı sıra, sulandırma hacmi de bu standart her sürü özgüdür. Bu nedenle, bir hisse senedi ÖAM çözüm standart her sürü için son konsantrasyonu hesaplamak zorunda. Hesaplamaya bağlı olarak standart ve her şişede bulunan tutar potens gerçekleştirilir. Endotoksin standart her sürü için belirli analiz belgesi kudret ve şişe başına miktar hakkında bilgi içerir. Bir girdap titizlikle standart 30-60 saniye, sulandırma sırasında hem de kullanım sırasında vardır. Ayrıca 5-10 dk kez yerleşme kullanarak sulandırma gerçekleştirmek için önerilir ve 30-60 dakika içinde tüm malzeme liyofilize emin olmak için zaman dilimi çözüm gider. Assay olarak kullanmadan önce oda sıcaklığında stok ÖAM equilibrate. Sulandırma sonra ÖAM stok depolama için buzdolabında ve dört hafta boyunca stabildir.

CSE, LAL reaktif Ayrıca her biçimi için belirli benzer. Aşağıdaki talimatları genel ve tüm LAL tahlil biçimleri için geçerli. LAL reaktif bir lyophilized toz olarak sağlanır. Üreticinin önerilerini her şişe reconstitute için takip edilmektedir. LAL sınıf su veya beta-glukan inhibe arabellek kullanılabilir. Beta-glukan girişim hariç verdiğinden beta-glukan inhibe arabellek bu durumda çalışmada tercih edilmektedir. Selüloz asetat filtre nanomaterial sentezi sırasında sık kullanılan ve glukan kirlenme15bir kaynağı olarak hizmet çünkü bu yanlış müdahale Nanomalzemeler içinde çok yaygındır. Çoğu şişeleri son hacmi 5 mL sulandırma gerektirir. 10 yıldır bu tahlil ile yazarın deneyimi bağlı olarak, bu tepki yavaşlatır ve enstrüman ayarlara, en düşük fiyat Kalibratör maksimum başlangıçlı zamanında artan gerektirebilir bu arabellek dahil fark edilmiştir bir konsantrasyonu 0.001 EU/mL geliştirmek için.

Standartların hazırlanması sırasında doğru seyreltme emin olmak için bu 10 kat seyreltme adımları kullanmak için tavsiye edilir. Seri 10 kat dilutions hisse senedi veya bir standart pyrogen ücretsiz su 900 µL içine daha yüksek konsantrasyon ile spiking 100 µL tarafından hazırlanmış olabilir. ÖAM hisse senedi toplama genellikle olduğundan yüksek (~ 1000 EU/mL), 100 ve 10 EU/mL 1 EU/ml bir konsantrasyon ile tahlil Kalibratör hazırlamadan önce önerilir konsantrasyonları ile ara dilutions hazırlanması. İki oranları test örneği arasında ve lysate bu protokol için açıklanmıştır. Her iki oranları yaygın olarak kullanılır, 4:1 oranında ve beta-glukan ( Tablo reçetesigörmek) inhibe arabellek kullanıldığında eğrisi doğrusallık kabul edilebilir ama ideal değil olsa bile.

Aynı kurallar kalibrasyon standart hazırlama ile ilgili yukarıda açıklandığı gibi de kalite kontrol (QC) hazırlanması için geçerlidir. Bu denetimler tahlil düzgün çalıştığını doğrulamak için kullanılır. Pyrogen ücretsiz su içine ÖAM'in tutarı bilinen spiking tarafından hazırlanmıştır. QC konsantrasyonu genellikle tahlil aralığın ortasında seçilir. Bulanıklık LAL tahlil 0,001-1 EU/mL aralığıdır. Bu nedenle, bir QC, 0,05 EU/mL bir konsantrasyon kullanılır. Diğer konsantrasyonları tahlil Aralık içinde de kalite kontrol hazırlanmasında kullanılabilir.

İnhibisyon geliştirme denetim (IEC) olumlu ürün kontrolü (PPC) da denir. ÖAM bilinen bir konsantrasyon test örneği içine spiking tarafından hazırlanmıştır. IEC (PPC) konsantrasyonu genellikle tahlil aralığın ortasında seçilir. Bulanıklık LAL tahlil 0,001-1 EU/mL aralığıdır. Bu nedenle, bir konsantrasyon olarak 0,05 EU/mL, IEC kullanılır. Bu IEC hazırlamak için bir 50 µL 1 EU/mL ÖAM çözüm test-nanopartikül 950 µL ile birleştirmek gerekiyor. IEC test nanomaterial her seyreltme için hazırlanmıştır. Bir nano-formülasyon üç dilutions (1:50, 1:500 ve 1:5, 000) test, örneğin, bir beher-in bu dilutions üç IECs hazırlamak vardır. Diğer konsantrasyonları tahlil Aralık içinde IEC örnek hazırlamak için kullanılabilir. Bu denetim verilen nano-formülasyon için test sonuçlarını geçerliliğini anlamak için kullanılır. USP göre test sonuçlarını spike kurtarma IEC (PPC) 50 ile %2004arasında ise geçerlidir. Spike kurtarma % 50 daha az anlamına gelir testi-nanomaterial endotoksin algılama ve bu nedenle, test engeller hafife endotoksin kirlenme sonucu ve geçersiz. Spike kurtarma % 200'den fazla test materyalini tahlil sonucu artırır veya bulaşıcı endotoksin çok yüksek düzeyde içeren önerir. Geliştirme söz konusu olduğunda, tahlil sonucunu da yanlıştır. Bu tür etkileşimler ve onları üstesinden gelmek için bazı yollar örnekleri açıklanan önceki12,15olmuştur.

Bulanıklık ve chromogenic deneyleri yapılırken, LAL reaktif için tüm örneklerini eklemek için bir tekrarlayıcı pipet kullanılması önerilir. Ortalama araç operasyon süresi 7200 saniyedir. Ancak, reaksiyon daha hızlı veya daha yavaş lysate belirli dolu olabilir. Reaksiyon yavaş, olduğunda durumlarda, bir 9600s veya daha uzun araç ayarlarını değiştirmek gerekebilir. Bu değişiklik en düşük Kalibratör geliştirmeye olanak sağlar.

Pegile liposomal doksorubisin içeren bir etkin ilaç malzeme (API) 2 mg/mL bir konsantrasyon, bir formülasyon olduğunu. Klinikte bir doz 50 mg/m2kullanılır. Bu doz mg/kg aralığa dönüştürmek, bu faktör 3727tarafından ayrılmıştır. Mg/kg, pegile liposomal doksorubisin doz bu nedenle, 1.35. EL hesaplamak için 5 (EU/kg içinde eşik pyrogen doz) 1,35 (Doxil doz olarak mg/kg) bölünür ve 3.7 EU/mg4elde edilir. Bu sayı formülasyonu endotoksin 3.7 EU/mg, burada mg API için gösterir aşmadığı takdirde pegile liposomal doksorubisin 1,35 mg/kg doz, güvenli bir şekilde tek saat için yönetilebilir olduğunu anlamına gelir.

Ardından, MVD LAL deneyleri için hesaplamak için bu bilgileri kullanın. Duyarlılık (lambda) bulanıklık, chromogenic ve jel-pıhtı deneyleri Bu çalışmada sunulan 0,001, 0,001 ve 0,03 EU/mL, sırasıyla var. Bu nedenle, MVD bulanıklık ve chromogenic deneyleri için 7,407 olduğunu ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.001 EU/mL) ve 247 jel-pıhtı tahlil ((5 EU/kg x 2 mg/mL)/0.03 EU/mL).

Doksorubisin chromogenic LAL28,29tahlil dalga boyu ile örtüşen bir geniş absorbans spektrum vardır. Ayrıca, çoğu lipozom formülasyonları bulanık ve sütlü görünür. Bu doğal bulanıklık bulanıklık tahlil ile lipozomlar girişim çok yaygın nedeni var. Pegile liposomal doksorubisin söz konusu olduğunda, bulanıklık nedeniyle girişim seyreltme beş spike kurtarma değerleri 50 ile %200 (Tablo 1) tarafından kanıtlandığı tarafından üstesinden oldu. Ancak, aynı seyreltme doksorubisin konsantrasyon chromogenic LAL (Tablo 1) ile müdahale için hala yüksek. İki sonraki dilutions (50 ve 500) pegile liposomal doksorubisin girişim chromogenic LAL ile üstesinden gelmek için yardımcı oldu. Jel-pıhtı tahlil bulanıklık ve örnek rengi bağımsız ve formülasyonu endotoksin düzeyini jel-pıhtı aralığı içinde bu yana, pegile liposomal doksorubisin hiç test dilutions jel-pıhtı tahlil ile müdahale. Bu durumda çalışmada, birkaç dilutions pegile liposomal doksorubisin, bu deneyleri için kullanılmıştır. MVD içinde oldukları için dilutions 5, 50 ve 500 bulanıklık ve chromogenic yanı sıra 50, 100 ve 200 jel-pıhtı tahlil için seçilmiştir. Bu testin duyarlılığı da düşüktür çünkü jel-pıhtı tahlil MVD bulanıklık ve chromogenic LALs daha düşüktür. Formülasyonu bulanıklık ve chromogenic deneyleri LAL seyreltme 500, müdahale, daha yüksek dilutions (Örneğin, 5000, 6000, 7000 veya 7,407), analiz gerçekleştirilebilir. Endotoksin seyreltme 50 jel-pıhtı tahlil, elde edilen düzeyde EL altında olduğu için alt dilutions, bu formülasyon çözümleme gerçekleştirilmedi. Ancak, diğer durumlarda, test Dilutions 20, 10, 5 veya en düşük değil tanımlamak için 2 devam seyreltme müdahale ve formülasyonu endotoksin düzeyini EL altında olup olmadığını anlamak.

Jel-pıhtı tahlil için bu tahlil süresince su banyosu su dolaşımı işlevinde kapatabilir veya su akışı pıhtı zarar ve g doğruluğunu etkileyebilir çünkü bir su banyosu böyle bir seçenek olmadan kullanmak için gerekli olduğunu belirtmek önemlidir El-pıhtı LAL tahlil. Her zaman örnek dilutions artırarak LAL deneyleri ile nanopartikül girişim aşmak mümkün değildir. Stratejileri ve parazit türleri ve LAL deneyleri olmuştur için yaygın bir sorun temsil eden nano tanecikleri örnekler üstesinden gelmek için bazı yaklaşımlar diğer grupları ve bize tarafından başka bir yerde12,13,14 ele ,15,30,31. Bu el yazması sunulan çözümleme modeli formülasyon üzerinde dayanır. Diğer nanoformulations ile deneyim-ebilmek var olmak farklı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Çalışma federal fonların Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri, sözleşmeli HHSN261200800001E. Bu yayın içeriğini sayısı veya ilkeleri, bölümü sağlık ve insan Hizmetleri yansıtmayabilir ne ticari adlarını, ticari ürünler, söz etmez veya kuruluşların ABD hükümeti tarafından onaylandığı anlamına.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent Associates of Cape Cod T0051 This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent Associates of Cape Cod CG1500-5 This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod EC010 This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm Associates of Cape Cod TK100 These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader Associates of Cape Cod PKF96 Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent Associates of Cape Cod G5003 This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard Associates of Cape Cod E0005 This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide Sigma S2770 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid Sigma H9892 When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water Associates of Cape Cod WP0501 This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer Associates of Cape Cod GB051-25 Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm Associates of Cape Cod TB240 These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm Associates of Cape Cod TS050 These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL RAININ PPT25, PPT10 Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL Eppendorf 22600044 Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL Eppendorf 30089669 Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor Eppendorf 4982000020 Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge any brand Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C any brand Any brand can be used
Vortex any brand Any brand can be used
Freezer, -20 C any brand Any brand can be used
Water bath, 37 C any brand Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36, (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11, (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4, (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. Bacterial Endotoxins Test. (2011).
  5. FDA, U. Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. (2012).
  6. FDA, U. Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44, (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19, (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409, (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220, (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5, (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9, (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. NCL. NCL assay cascade. Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015).
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4, (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9, (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33, (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160, (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31, (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9, (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11, (9-10), 1157-1175 (2017).
Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).More

Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. J. Vis. Exp. (143), e58830, doi:10.3791/58830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter