Summary
여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.
Abstract
대뇌 동맥 및 그들의 각각 미세 혈액 흐름 규칙을 통해 뇌에 산소와 영양분을 제공합니다. 내 피 세포의 변화 수요를 충족 하는 데 필요한 혈관과 혈관 직경에서 명령 변경의 루멘 라인. 막 잠재력 (Vm) 및 질소 산화물의 hyperpolarization의 기본 내 피 종속 신호 경로 일반적으로 중재 혈관 확장 및 혈액 흐름 증가 하는 동시에 작동 합니다. 혈관의 혈관 길이 몇몇 밀리미터 이상의 조정에 필수적인, 하지만 내 피 파생 hyperpolarization (EDH)의 구성 요소 역사적으로 측정 하기 어려운 되었습니다. EDH의 이러한 구성 요소 세포내 캘리포니아2 + [캘리포니아2 +]나 증가의 작은-후속 활성화 수반 및 중간 계수 캘리포니아2 +-K+ 를 활성화 (SKCa/IKCa) 채널.
여기, 우리가 마우스 대뇌 동맥;에서 신선한 피 내 막의 절연의 단순화 된 그림 제시 내 피 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 각각; Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극를 사용 하 여 동시 측정 그리고 소금 솔루션 및 약리 에이전트 생리 조건 (pH 7.4, 37 ° C)에서 지속적인 superfusion. 윌리스의 원형에서 후부 대뇌 동맥 제거 됩니다 후부 통신 및 두개골 기저 부의 동맥. 청소 후부 대뇌 동맥 세그먼트 및 후속 분쇄의 효소 소화 adventitia, 혈관 주위 신경, 그리고 부드러운 근육 세포의 제거를 촉진 한다. 결과 후부 대뇌 동맥 내 피 "튜브" 다음 현미경으로 확보 하 고 카메라, 광 전 증폭 관 관, 고 1 ~ 2 연속 superfusion에서 electrometers를 사용 하 여 시험. 내 피 [캘리포니아2 +]나 변화와 그대로 따라 밀리미터 거리까지 간격 접속점 통해 EDH의 확산 뿐만 아니라 개별 세포 위치에 Vm 이 방법은 동시에 측정할 수 있습니다 피입니다. 이 방법은 정상과 병에 걸린 뇌에 혈액 흐름의 메커니즘을 기본 대뇌 내 피 기능의 높은 처리량 분석을 얻을 전망 이다.
Introduction
두뇌를 통해 혈액 흐름 중 대뇌 동맥과 혈관 네트워크1arterioles 혈관의 조정에 의해 통제 된다. 내 피 세포 신경1,2,3의 대사 요구에 맞게 필요에 따라 혈관 직경에 대뇌 저항 동맥 명령 변경 안 감. 내 피 파생 hyperpolarization (일반적으로 라고도 EDH), 동안에, 특히 세포내 캘리포니아2 + ([캘리포니아2 +]나) 및 내 피 세포 좌표 혈관 내 피 세포 사이에서 전기 신호 그리고 그들의 간격 접속점 동맥 이완4통해 주변의 부드러운 근육 세포. EDH의 생리 개시 순차적으로 Gq의 자극을 수반-결합 수용 체 (GPCRs), [캘리포니아2 +]나, 그리고 내 피 성장 작은 및 중간 Ca2 +의 활성화에서 증가-K활성화 + (SKCa/IKCa) 채널 hyperpolarize 대뇌 내 피 막 잠재력 (Vm)5,,67. 따라서, 내 피 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 의 친밀 한 관계 혈액 흐름 조절에 필수적인 이며 불가결 하 심장-뇌혈관 기능6,8. 광범위 한 문학에 걸쳐 다 수의 연구 개발 (예: 고혈압, 당뇨병, 심장 마비, 관상 동맥 질환, 만성 신부전, 만성 질환의 혈관 내 피 기능 장애의 협회 보고 주변 동맥 질환)9,10, 생리 뿐만 아니라 병 적인 조건에서 내 피 기능 공부의 중요성을 나타내는.
혈관 내 피 hyperpolarization, 혈관 확장, 그리고 조직 관류의 생산에 필수적인 것 이며 따라서, 기본 셀룰러 속성의 검사는 중요 한. 일반 연구 모델로, 마우스 동맥 내 피 튜브 모델의 준비 게시 되었습니다 전에 골격 근11,12, 창 자13,14, 폐 그리고 최근 뇌6. 동시 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 측정 연구 특히 골격 근육 동맥 내 피15,16 뿐만 아니라 림프 혈관 내 피17출판 되었습니다. 내 피 튜브 접근을 이용 하 여 기본 연구, 뿐만 아니라 그것의 장단점과8 의 종합적인 검토는이 실험 도구는 특정 연구에 적합 여부를 확인 하 상담 수 있습니다. 간단히는 장점은 내 피 세포 기능의 주요 생리 적인 구성 요소 유지 됩니다 (예:, 캘리포니아2 + 유입 및 intracellular 자료, hyperpolarization Nernst 잠재력까지 Vm 의 k+ 통해 SKCa/IKCa 활성화 및 내 피 세포 결합을 통해 간격 접속점) 혈관 주위 신경 입력, 부드러운 근육 전압-문이 채널 기능 및 수축, 같은 요인을 혼동 없이 혈액, 그리고 호르몬 영향8의 순환. 대조적으로, 일반적으로 사용 되는 세포 문화 접근 소개 형태학18 및 이온 채널 식19 크게 생리 적인 관측 비보 전 결정에 대 한 비교를 난독 처리할 수 있습니다 방식에서에 중요 한 변경 또는 vivo에서. 이 모델은 그대로 혈관 세그먼트 격리의 4 h 이내 테스트 최적으로 혈액의 흐름, 부드러운 근육과 실험 일정에 제한 된 유연성 등 규제에 대 한 다른 필수 구성 요소와 통합의 부족 등 동물.
Socha 및 시걸12 및 중간6,,1516, 최근 실험 개발 저술로 이전 비디오 프로토콜에서 건물 이로써 설명에서 신선한 피 내 막의 절연 후부 대뇌 동맥 그리고 내 피 [캘리포니아2 +]i 와 Vm Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극, 각각 사용 하 여 동시 측정. 또한,이 실험 생리 적인 조건 (pH 7.4, 37 ° C) 동안 소금 솔루션 및 약리 에이전트의 연속 superfusion를 수반 한다. 우리 후부 대뇌 동맥, 구조적 무결성 (셀 간격 접속점 통해 결합)와 충분 한 크기 (폭 50 µ m, 길이 ≥300 µ m) 내부 및 세포 신호 따라 중에 대 한 의무가 격리 endothelium 생성 선택 내 피 세포입니다. 또한, 설치류 후부 대뇌 동맥의 연구는 실질적으로 문학에서 나타내고 근본적인 내 피 신호 메커니즘, 혈관 개발/노화, 그리고 병 리20, 의 시험을 포함 21 , 22.이 실험의 대뇌 내 피 기능 (기능 장애) 높은 처리량 분석을 얻을 것으로 예상 된다 애플리케이션과 통해 혈액 흐름의 이해에서 중요 한 발전 그로 인하여 허용 한다 노화 및 신경 질환의 개발
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Protocol
다음과 같은 실험을 수행 하기 전에 모든 동물 보호 사용 및 확인 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되 고 국가 연구 위원회의 "가이드에 수행 관리 및 활용에 대 한 실험실 동물' (8번째 판, 2011)와 도착 지침. Loma Linda 대학의 IACUC 남성과 여성의 C57BL/6 마우스에 대 한이 원고에 대 한 사용 되는 모든 프로토콜을 승인 했습니다 (나이 범위: 3 ~ 30 개월).
1. 장비 및 재료
참고: 프로토콜에 필요한 자료의 세부 정보 테이블의 재료, 시 약설명서 또는 해당 공급 업체와 관련 된 웹사이트에서 찾을 수 있습니다.
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흐름 챔버
- 양극 처리 한 알루미늄 플랫폼에 유리 coverslip 바닥 superfusion 챔버를 고정. 소형 알루미늄 단계에 챔버와 플랫폼을 확보.
- 알루미늄 고정 피 펫을 들고 무대에는 micromanipulator 플랫폼의 각 끝에 설정 합니다.
참고: 실용적인 옵션으로이 양도 무대 장치를 사용 하 여 실험의 성능에 내 피 튜브의 격리에서 전환을 촉진 하기 위하여 보안 흐름 챔버 장치.
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현미경
- 스테레오 현미경 사용 (5 x 50 x 배율 범위를) 매크로 및 마이크로 해 부 절차에 대 한 섬유 광섬유 광원을 갖추고 있습니다.
- 내 피 튜브의 준비에 대 한 위상 대비 또는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 호환 목표 (10 배, 20 x 40 x)와 알루미늄 단계는 거꾸로 한 현미경을 사용 합니다.
- 부분적으로 소화 혈관에서 내 피 튜브를 분리 하는 microsyringe 펌프 컨트롤러를 내 피 튜브 준비 장치에 인접 한 장소.
- 실험 기구에 대 한 표준 목표 (4 x 10 x) 장비는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 형광 목표 (20 x와 40 x, 숫자 조리개 0.75) 및 진동 절연 테이블에 수동 알루미늄 단계.
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세포내 녹음 장비
- 격리 된 내 피 튜브에 내 피 세포의 Vm 를 기록 하는 전위 계 호환 headstage에 연결 합니다. 필요한 경우, 함수 발생기 또는 자극 전류 주입을 필요로 하는 실험에 대 한 전위 계를 연결 합니다.
- 데이터 수집 시스템, 가청 기준선 모니터, 오실로스코프를 앰프 출력을 연결 합니다. 실험 하는 동안 흐름 챔버 출구 근처 참조 전극 (Ag/AgCl 펠 릿)를 보호 합니다.
- 형광 시스템 인터페이스, 높은 강도 아크 램프와 전원 공급 장치, hyperswitch, 광 전 증폭 관 관 (PMT)의 통합된 구성 요소와 포토 메트릭 시스템을 사용 하 여 및 [캘리포니아2 +]나 내 피 세포에서 측정 하는 카메라.
- 인라인 히터를 갖춘 온도 조절기를 사용 하 여 인상 하 고 실험을 통해 생리 적인 온도 (37 ° C)를 유지.
- 인라인 흐름 제어 밸브와 밸브 컨트롤러에 연결 된 6-저수지 플랫폼을 사용 하 여 내 피 튜브 챔버에 보안을 각각 솔루션의 배달 제어.
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Micropipettes와 날카로운 전극
참고: 분쇄 및 절연된 내 피 튜브의 기계적인 안정화 펫을 제조 하는 펫 및 위반에 대 한 마이크로 포지 당기 전자 끌어당기는 사람을 사용 하 고 연마 화재.- 부분적으로 소화 동맥 세그먼트에서 adventitia, 부드러운 근육과 내 피 튜브를 분리, 분쇄 펫 (각각 80-120 µ m의 내부 팁 직경), 붕 규 산 유리 모 세관 튜브를 사용 하 여 준비 하 고 화재 폴란드어는 팁.
- Superfusion 챔버의 하단에 대 한 내 피 튜브를 보안 하려면 고정 펫 무딘, 둥근 엔드 (열-광택, 100-150 µ m;의 OD 얇은 벽 붕 규 산 유리 관에서 준비).
- 내 피 세포의 Vm 를 기록 하려면 준비 ~ 150 ± 30의 팁 저항을 가진 날카로운 전극에서 전자를 끌어당기는 사람을 사용 하 여 유리 모 세관 튜브 m ω.
2입니다. 솔루션 및 약물의 준비
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생리 적 소금물 (PSS)
- 약 준비와 함께 한 실험에 대 한 PSS를 사용 하 여 1 L의 최소 준비: 140 mM NaCl, KCl, 2mm CaCl2, 5mm 1 mM MgCl2, 10 m m N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic 산 (HEPES), 그리고 10 mM 포도 당.
- 해 부에 대 한 필요한 솔루션을 준비, 대뇌 동맥의 절연 및 내 피 튜브의 준비 준비 PSS CaCl2 (제로 캘리포니아2 + PSS) 부족.
- 초순 이온된 H2O에서에서 모든 솔루션을 준비 하 고, pH 7.4 조정 하 고 필터 (0.22 μ m 기 공 크기)를 통해 그들을 소독 한 솔루션 osmolality 290와 300 mOsm 사이 인지 확인 하십시오.
참고: 솔루션 4 ° C에서 약 2 주 동안 저장할 수 있습니다.
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10% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)
- 10 %BSA 준비 하려면 10 mL 0 캘리포니아2 + PSS의 비 커에 동결 건조 된 분말의 1 g을 분해.
- 파라핀 영화 비 커를 커버 하 고 통과, 해산 BSA에 대 한 느린 교 반으로 몇 시간의 기간을 허용.
- 10 mL 주사기 플러스 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 최종 솔루션을 필터링 하 고 1 mL aliquots-20 ° c.에 저장할 수
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해 부 솔루션
- 해 부 솔루션 50 mL를 준비 하려면 BSA (10%)의 500 µ L 0 캘리포니아의2 + PSS 49.5 mL를 추가 합니다.
- 즉시 준비 후에,이 해 부 솔루션 동맥 해 부에 대 한 페 트리 접시에 전송 합니다.
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분리 솔루션
- 분리 솔루션 50 mL를 준비 하려면 5 µ L CaCl2 (1 개 M)의 추가 0 캘리포니아의2 + PSS 49.5 ml BSA (10%)의 500 µ L. 실 온 (RT)에 앉아 솔루션을 수 있습니다.
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효소
- 동맥 세그먼트의 부분 소화, 소화 솔루션 0.31 mg/mL papain, 0.5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL 콜라 (유형 H 조화)과 0.13 mg/mL elastase의 1 mL를 준비 합니다.
참고: 효소 활동 다를 수 있습니다; 그러나, 우리의 성공적인 프로토콜에 대 한 상업적으로 제공 된 효소 활동 사용 되었습니다 다음과 같습니다: papain ≥10 단위/mg; mg/콜라 ≥1 단위, N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala 또는 FALGPA 기판 매출;에 대 한 그리고 elastase ≥ 5 단위/밀리 그램.
- 동맥 세그먼트의 부분 소화, 소화 솔루션 0.31 mg/mL papain, 0.5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL 콜라 (유형 H 조화)과 0.13 mg/mL elastase의 1 mL를 준비 합니다.
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Fura-2 및 약리 에이전트의 준비
- Fura-2의 사진 농도 (1 mM) 준비 DMSO에 오전 염료. 로드에 대 한 PSS의 495 µ L에 주식의 5 µ L을 추가 하 여 작업 농도 (10 µ M)를 준비 합니다.
- 적절 한 PSS에 약리학 대리인 (예를 들어, ATP)의 농도의 50 mL를 준비 합니다.
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솔루션을 실시
- 실시 준비 솔루션, 2 M KCl, KCl 이온 H2O (7.455 g 50 mL H2O KCl)을 용 해 하 여.
- 날카로운 전극 백필 이전 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
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Propidium 요오드 화물 (0.1%)
- 10ml 2 M KCl의 요오드 화 동결 건조 된 propidium의 10 mg을 디졸브.
- 잘 혼합 하 고 실시간 저장
3. 해 부 및 대뇌 동맥의 절연
참고: 모든 해 부 절차 스테레오 현미경 및 조명 섬유 광섬유 광원에 의해 제공을 통해 표본 확대 (최대 50 x) 필요 합니다. 두뇌 및 동맥의 격리에 대 한 해 부 절차를 수행 하려면 날카롭게 해 부 악기를 사용 합니다. 서 분리 하 고 동맥을 청소 도구 날카롭게 뾰족한 집게 등 욕실이 스타일 해 부가 위 (3 9.5 m m 블레이드).
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마우스 뇌의 격리
- Anesthetize는 C57BL/6 마우스 (3-30 개월 이전, 남성 또는 여성)를 통해 흡입 isoflurane (2-3 분 동안 3%), 다음 완전 한 유도 마 취의 직후 동물 목을 벨. 페 트리 접시에 머리를 배치 (직경 10 ㎝, 깊이 1.5 c m) 제로 감기 (4 ° C)를 포함 된 Ca2 + PSS는 stereomicroscope에서.
- 현미경을 통해 봅니다, 두개골을 통해 피부와 머리카락을 제거 하 고 감기와 과도 한 혈액 제거 제로 캘리포니아2 + PSS. 절 개는 팁만 표준 해 부가 위 (예를 들어,: 24 m m 블레이드)의 시작 후 두 뼈 및 두개골의 코 뼈를 통해 확장을 사용 하 여 확인 합니다.
- 절 개는 그대로 원형 윌리스와 함께 뇌를 분리 거친 밀고 집게, 그리고 별도 결합 조직을 사용 하 여 함께 신중 하 게 두개골을 엽니다.
참고: 또는, Littauer 뼈 절단 집게를 두개골을 열고 뇌를 노출 사용할 수 있습니다. - 부드럽게 감기와 격리 된 두뇌 세척 제로 캘리포니아2 + 혈액을 제거 하는 비 커에 PSS. 뇌 복 부 측을 대뇌 동맥 (그림 1A)의 절연을 위한 차가운 해 부 솔루션을 포함 하는 챔버에 향하도록 놓습니다.
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대뇌 동맥의 절연
참고: 후부 대뇌 동맥이이 프로토콜에 대 한 대표적인 뇌혈관 내 피 연구 모델로 선정 되었습니다.- 스테인레스 스틸 핀을 사용 하 여 차가운 해 부 솔루션에서 격리 된 두뇌 확보 (직경 0.2 m m, 길이 ~ 11-12 m m) 숯 주입 실리콘 폴리머 코팅 유리 페 트리 접시의 하단 (깊이 50 cm)를 삽입할 수.
- 해 부 동안 PSS의 냉장된 온도 유지, 지속적으로 1:1 물-에틸렌 글리콜 혼합물을 순환 냉각 시스템에 의해 냉각 해 부 챔버를 사용 합니다. 또는 해 부 신선한 얼음에 수행할 수 있습니다.
- 수술 후부 통신 후부 대뇌 동맥 (0.5 cm 세그먼트에 ~0.3, 아니 축 긴장)와 서 악기 욕실이 스타일 위와 날카롭게 뾰족한 집게 (그림 1B 사용 하 여 두개골 기저 부 동맥을 분리 ). 스테인레스 스틸 핀을 사용 하 여 (직경 0.1 m m, 길이 13 ~-14 m m)를 보안 둘 다 고립 된 페 트리 접시 (그림 1C)에 해 부 솔루션에 후부 대뇌 동맥.
- 결합 조직 날카롭게 뾰족한 집게 (그림 1D)를 사용 하 여 제거 하 여 격리 된 후부 대뇌 동맥을 신중 하 게 청소. 세그먼트로 그대로 동맥을 잘라 (길이 1-2 m m) (그림 1D; 인세트) 효소 소화.
4입니다. 내 피 튜브 및 Superfusion의 준비
참고: 내 피 튜브는 앞에서 설명한12, 대뇌 동맥6수정 준비가 되어 있습니다.
- 목표 (10 배, 20 x 40 x), 카메라, 및 챔버와 micromanipulators는 알루미늄 단계 현미경을 사용 하 여 분쇄 장치를 준비 합니다. 무대와 견본 (그림 2A)에 인접 한 펌프 컨트롤러는 microsyringe를 보안 합니다.
- 완전히 백필은 분쇄 미네랄 오일 플라스틱 하 고 마이크로 주사기 피스톤을 통해 그것을 확보. 그런 다음에 피펫으로 분리 솔루션 철회 마이크로 주사기 펌프 컨트롤러를 사용 하 (~ 130 nl) 위에 피 펫에서 공기 방울의 부재를 보장 하면서 미네랄 오일.
- 0.31 mg/mL papain, 0.5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL 콜라, 그리고 0.13 mg/mL elastase 10 mL 유리 튜브 (그림 2B)에 분리 솔루션의 1 mL에 그대로 동맥 세그먼트를 놓습니다. 부분적인 소화에 대 한 10-12 분 34 ° C에서 품 어.
- 따라 소화, 효소 솔루션을 ~ 5 mL 신선한 분리 솔루션의 바꿉니다. 실시간에서 분리 솔루션이 포함 된 챔버에 한 세그먼트를 전송 1 mL 피 펫을 사용 하 여,
- 피펫으로 챔버에서 분리 솔루션에 배치 하 고는 소화의 1 개의 끝에 가까운 위치. 펌프 용 컨트롤러에 부드러운 분쇄 (그림 2C, 삽입) 2 ~ 5 nL/s의 범위 내에서 속도 설정 합니다.
- 100 x 200 x 확대를 통해 보기, 철회 하 고 부드러운 근육 세포는 내 피 튜브를 생산 하는 동안 해리를 동맥 세그먼트를 추출. 필요한 경우, 신중 하 게 사용 하 여 뾰족한 집게 내 피 튜브에서 별도 해리 adventitia 및 내부 탄력 있는 lamina. 모든 부드러운 근육 세포는 해리만 내 피 세포는 그대로 "튜브" (그림 2C)로 유지 확인 합니다.
- Micromanipulators를 사용 하 여, 펫 (그림 2D)를 고정 하는 붕 규 산 유리를 사용 하 여 superfusion 챔버의 유리 커버 슬립에 내 피 튜브의 각 끝을 보안 합니다.
- 워시 아웃 adventitia 및 평활 근 세포 챔버 및 바꾸기 2 mm CaCl2 PSS 분리 솔루션에서 해리 했다. Superfusion 및 실험 장비의 현미경에 보안된 내 피 튜브와 모바일 플랫폼을 전송 합니다.
- PSS 및 각각 마약 솔루션의 지속적인 납품을 위한 6 깨끗 한 50 mL 저수지 (그림 3A)를 사용 하 여 적절 한 실험 기간 동안. 인라인 흐름 제어 밸브를 사용 하 여 수동으로 설정 하려면 전체 유량 층 류와 진공 흡입을 피드 하는 흐름을 일치 하는 동안. 배경 데이터와 염료 로드를 기록 하기 전에 챔버 (그림 3B) ≥ 5 분 내 피 튜브의 superfusion에 대 한 PSS 제공 합니다.
5. 염료 부하, 워시 아웃 및 온도 설정
- [캘리포니아2 +]나측정 광도 측정 시스템의 모든 구성 요소를 켭니다. 실험 장비 (그림 3C)에 현미경을 사용 하 여 광도 측정 시스템 소프트웨어 제품군을 사용 하 여 광도 창 셀에 400 배 확대와에서 내 피 튜브 볼.
- 내 피 튜브의 직경을 측정 하 고 340 및 380 nm (≥10 Hz) 대체 여기 동안 510 nm 방출에 배경 autofluorescence 값을 기록 합니다.
- [캘리포니아2 +]나 응답을 측정 하기 위해 부하 Fura-2 내 피 튜브 RT에 (10 µ M 최종 농도)를 염색 오전 및 ~ 30-40를 허용 빛의 부재에 분.
- Superfusion ~ 30-40에 대 한 신선한 PSS와 내 피 튜브의 다시 시작 워시 아웃 분 염료를 초과 하 고 세포내 Fura-2 드 esterify 야. 워시 아웃 기간 동안 RT에서 점차적으로 온도 37 ° c에서 인라인 히터로 온도 컨트롤러 (그림 3A)를 사용 하 여 다음 실험에 걸쳐 37 ° C에서 유지 합니다.
참고: 권장된 증분 전환 RT 37 ° C에 ≥5 분 평형 시간 각 단계에서 3 단계를 (예: 5 ° C)을 수반 한다.
6. [캘리포니아2 +]i 와 Vm 동시 측정
- 다른 모든 장비 및 Vm 를 측정 하기 위한 전위 계 소프트웨어 제품군 ( 그림 3, 그림 4참조). 그에 따라 데이터 수집 속도 조정 (≥10 Hz).
- 날카로운 전극 및 2 M KCl 백필을 당겨. 세포의 연구에 대 한 커플링 염료 전송, 백필 통해는 microelectrodes 0.1 %propidium 요오드 화물 2 M KCl에에서 녹아 있는 함께.
- 실버 와이어는 micromanipulator 확보 하는 전위 계 머리 단계에 연결 된 피 펫 홀더에 염화 코팅에 전극을 보호 합니다. micromanipulator를 사용 하 여 간단히 4 x 목표 통해 보는 동안 챔버에 흐르는 PSS에 전극의 팁의 위치.
- 휴식 Vm 0 설정 일치 접지 목욕으로 잠재적인 합니다. 그냥 내 피 튜브의 셀 위에 전극의 끝을 놓습니다. 원하는 경우 가청 기준선 모니터 electrometers에 연결을 사용 하 여 잠재적인 녹음 사운드 피치 연관.
- 40 x 목표를 사용 하 여 x 400 배율 증가 하 고 필요에 따라 전극의 팁 위치. 50 ~ ~ 80 내 피 세포에 초점을 광도 측정 소프트웨어를 사용 하 여 광도 창을 조정 합니다.
- 부드럽게 전극은 micromanipulator를 사용 하 여 내 피 튜브의 셀 중 하나에 놓고 안정 휴식 Vm 에 대 일 분을 기다립니다. 마찬가지로, 첫 번째 전극으로 찔 려 첫 번째 셀에서 다른 셀 (거리 ≥100 µ m)에서 두 번째 전극을 삽입 합니다.
- Vm 를 휴식 하는 것입니다 그것의 예상 값에 안정 되 면 (-40-30 mV)6, 빛의 부재에 형광 인터페이스에 PMT 설정 하 고 또는 세포내 [캘리포니아2 +]내가 흥미로운 Fura-2의 수집을 시작 (10 Hz)에 510에서 형광 방출 수집 하는 동안 340 및 380 nm nm.
참고: 세포 전기 커플링, 현재 테스트 (± 0.5-3 나, ~ 20의 펄스 기간) "사이트 1", 전위 계 를 통해 하나를 배달 될 수 있다 그리고 Vm 의 변경으로 다른 전위 계를 기록 될 수 있습니다 "사이트 2" (거리 ≥100 µ m). - Vm 및 [캘리포니아2 +]나 의 동시 측정, 설정 한 후 약물의 적용 전에 일정 층 유량에 PSS 함께 내 피 튜브의 superfusion에 대 한 ~ 5 분 수 있습니다.
- 일정 유량과 superfusion 챔버를 PSS에 준비 약물 (예를 들어, ATP)를 적용 합니다. 후 ~ 3 분 (또는 약의 활동에 대 한 적절 한 기간), PSS Vm 까지 세척과 F340/F380 비율 그들의 초기 조건에 반환합니다. 솔루션의 각 전환 중 광도 전위 계 소프트웨어 스위트를 통해 일시적으로 동기화로 각각 녹화를 표시 합니다.
- 실험 완료 되 면, 전극은 micromanipulator를 사용 하 여 셀에서 철회 고 Vm ~ 0 mV 목욕 전극에 의해 참조 된로. Vm 및 [캘리포니아2 +]나 의 각각 녹음을 중지 하 고 파일에 데이터 분석에 대 한 레코드를 저장.
7. 셀 커플링의 시각화
- 셀 커플링을 통해 propidium 요오드 화물을 시각화 하려면 사용 40 x 또는 60 x 형광 목표는 상대적으로 높은 수 가늠 구멍 (예: 0.95) 및 솔리드 스테이트 조명, 고해상도 카메라 (예: 16-rhodamine 필터 설정 메가 픽셀), 및 이미징 소프트웨어 제품군.
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜의 도식 데모 연결 된 그림에 표시 됩니다. 두뇌는 젊은 성인 남성 C57BL/6N 마우스 (5 개월)에서 고립 된 그림 1A에 표시 됩니다. 후부 대뇌 동맥은 윌리스의 원, 결합 조직, 없이 제거 하 고 (그림 1B-D) 세그먼트로 잘라에서 신중 하 게 격리 됩니다. 부분적으로 소화 동맥 세그먼트에서 그대로 내 피 튜브 생산 이며 고정 펫을 사용 하 여 유리 커버 슬립에. 부드러운 기계 스트레치 선박 tortuosity 없이 선형 vivo에서 길이을 두 고정 펫을 사용 하 여 적용 됩니다. 이 원고 (그림 2A-D)에 더 명확히 되었습니다. 후부 대뇌 동맥에서 분리 된 내 피 튜브는 ~ 90-100 µ m 폭 및 ≥300 µ m 길이에서. 튜브와 로드 Fura 2 워시 아웃 PSS 다음 오전. [캘리포니아2 +]내가 내 피 튜브에 Vm 의 동시 측정은 날카로운 전극 전기 생리학 ( 그림 3 및 그림 4에 표시 된 실험 장비) 뿐만 아니라 캘리포니아2 + 광도 의해 수행 됩니다.
내 피 튜브의 기능 평가 클래식 내 피 GPCR 주 작동 근 ATP 등 생리 적 조건 하에서 흐름 챔버에 적용 하 여 수행 됩니다. 그림 5에서처럼 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 기록 동시에 ATP에 대 한 응답에서 (100 µ M). Vm (mV ≥5)의 중요 한 hyperpolarization 발생 수반 증가 함께 세포내 [캘리포니아2 +]나 , [캘리포니아2 +]나 상승 SKCa/IK 활성화 나타내는Ca 채널 그로 인하여 생산 EDH 플라즈마 막에 걸쳐 K+ 경과 수 있습니다. 현재 분사를 사용 하 여 작성 커플링의 증거 (± 0.5 ~ 3 나, ~ 20의 펄스) 우리의 최근에 출판 된 작품 (참조6, 그림 1)에서 찾을 수 있습니다. Note propidium 요오드 화물 그 두번째 메신저 이노 시 톨 trisphosphate (IP3, 420 ~ 다), 등 간격 접속점 순환 아데노신 monophosphate (캠프, 다 ~ 329) 통과 대 한 알려진 참조 ~ 668 다의 질량은.
그림 1 : 뇌에서 대뇌 동맥의 절연. (A) 두뇌 dessection 솔루션에서 그대로 동맥 (흰색 화살표 나타냅니다 후부 대뇌 동맥)와 격리. 후부 대뇌 동맥 (흰색 화살표; 3 x vs. 의 (B) 확대 보기 패널 A)입니다. (C) 절연된 후부 대뇌 동맥 견본 접시에 스테인레스 스틸 핀을 확보. (D) 후부 대뇌 동맥 결합 조직의 제거 다음. 삽입 표시 컷된 세그먼트의 동맥; 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 대뇌 내 피 튜브 준비. (A) 장비 분쇄 부분적으로 소화 동맥 세그먼트;에 사용 = micromanipulator, b = 튜브, c를 준비 하기 위한 챔버 알루미늄 단계, d = = microsyringe, 전자 현미경, = f = microsyringe 펌프 컨트롤러. (B) 동맥 세그먼트 (흰색 화살표) 효소 소화에 대 한 솔루션. (C) 내 피 튜브 준비한 분쇄; 분쇄 = 피 펫, b = 그대로 내 피 관. 인세트는 adventitia 및 평활 근 세포; 제거 하 분쇄 과정을 보여 줍니다. 눈금 막대 = 100 µ m. (D)는 그대로 내 피 튜브 고정 피 펫;와 유리 커버 슬립에 고정 = 피 펫, b ~ 100 µ m.의 직경이 그대로 내 피 튜브 = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Superfusion 및 동시 장비 [Ca2 +] 난 그리고 V m 측정. 내 피 튜브 및 온도 제어의 superfusion (A) 장비는 = 강도 높은 아크 램프 전원 공급 장치, b 형광 시스템 인터페이스, c = 온도 컨트롤러, d = 6-superfusion 시스템의 저수지 = e = 광섬유 빛 소스, f = 밸브 컨트롤러, g = hyperswitch [캘리포니아2 +]나 광도 측정 시스템의. (B) Superfusion 챔버 장치; b headstages, c = 접지 전극, d = 인라인 = 히터, e = superfusion 튜브, f 진공 흡입, g = superfusion 챔버, h = = 알루미늄 단계 챔버를 들고. 진동 절연 테이블; (C) 실험 플랫폼 카메라, = 셀 프레임 어댑터 b 현미경 빛, c = 현미경, d = = 알루미늄 단계, e = headstage 제어용 micromanipulator f = 진동 절연 테이블. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 운영 전기 생리학 및 데이터 기록에 대 한 장비. 오실로스코프, = b 함수 발생기, c = = 가청 기준선 모니터, d = 50/60 Hz 노이즈 필터, e 및 f = electrometers, g = 데이터 수집 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 동시 [Ca2 +] 난 그리고 V m 녹음. (A) 마우스 대뇌 동맥 내 피 튜브의 차동 간섭 콘트라스트 이미지 (400 x) 40 x 목표를 사용 하 여 광도 창에서 실험에 대 한 조정. 날카로운 전극 (흰색 화살표) 이미지의 상단에 표시 된 대로 셀에 배치 됩니다. (B) F340/F380 비율 (위)와 Vm (아래) ATP에 대 한 응답에서의 동시 측정에 대 한 원시 추적 (100 µ M). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
최근 개발6,15,,1617에 비추어 우리 지금 [캘리포니아2 +]의 동시 측정을 위한 준비에 마우스 대뇌 동맥 내 피 분리 하는 방법을 보여 줍니다. i 및 Vm EDH 일관 되 게 ~ 2 h 37 ° c.에 대 한 기본 비록 기술적으로 어려운 우리 셀-커플링 뿐 (참조6, 그림 1 참조)을 측정할 수 있습니다. 이러한 방식으로 우리 이산 하 고 실시 하는 이벤트를 동시에 신호를 측정할 수 있습니다. 마우스 동맥 피를 분리 하는 동안 직면 하는 일반적인 과제의 계정에 대 한 참조11,12를 참조 하십시오. 마우스의 대뇌 동맥, 내 피 [캘리포니아2 +]나 하 고 Vm, 문제 해결을 위한 제안 및 고려 사항에 비추어의 다른 방법에 대 한 우리의 특정 측정 하기 위한 중요 한 단계를 강조 하는 우리 실험적 강점/약점 아래입니다.
후부 대뇌 동맥 평활 근과 내 피 세포에서 윌리스의 원 및 결합 조직 손상 없이 주의 절연을 해야합니다. 외과 도구 (집게와가 위)는 깨끗 하 고 선명한 가장자리를 유지 하는 동안 마우스 미세 해 부 절차에 적합 해야 합니다. 골격 근육12상대, 우리 감소 효소 인큐베이션 기간 2/3와 papain, 콜라, 그리고 dithioerythritol의 농도 의해 반 elastase의 경험적으로 최적화 된 농도의 사용을 추가 하는 동안. 대뇌 동맥 내 피 튜브 분리에 일관 된 성공을 위해 중요 하다 배치 (2 ~ 4 병)에 주문 효소에 일관 된 제조 관행의 사용 및 수명 주파수에 높은 평판 공급 업체에서. 다음에서 한 많은 효소의 효소 활동에 변화에 대 한 가능성도 함께 효소 농도 10 ~ 12 분 이내 소화의 시간을 최적화 하는 동안 유지 하는 것이 좋습니다. 그것은 그도 성별도 나이 (3 ~ 30 개월) 동물의 되었습니다 중요 한 장벽 격리 endothelium의 준비를 우리의 경험에의 하면 대뇌 동맥에서 지적 가치가 있다. 따라서, 효소 칵테일 및 효소 소화의 시간 구성 연령과 성별에 연구에서 동일을 유지 하는 것이 좋습니다.
강조, 주의 필요 부드러운 분쇄 및 격리 endothelium adventitia 및 스핀 들 모양의 부드러운 근육 세포의 내 피 세포12에 손상을 방지 하기 위해 합니다. 분쇄 단계에 대 한 점성 미네랄 오일 마이크로 주사기의 피스톤과 철회 하거나 PSS에서 목욕 하는 선박 세그먼트를 꺼내기 수성 PSS 사이 유압 매체 역할을 합니다. 그것은 그 선박 세그먼트 연락해 미네랄 오일,이 단계를 반복 해야 합니다 미네랄 오일과 PSS의 순차적 백필으로 깨끗 한 분쇄 피 펫을 사용 하 여 주목 한다. 실험 전에 것이 좋습니다 약 선형 vivo에서 길이, 가능한 범위 내 피 튜브 복원할 수 면 개별 셀 가정 "플랫", 경도 형태 (예를 들어, 지름 ~ 5 µ m, 길이 ~ 100 µ m; 두께 ~0.5 µ m)8. 그러나, 축 긴장 적용 해서는 안 어디는 시료의 가장자리에서 셀 각각 고정 펫 및 동안 신뢰할 수 있는 셀룰러 측정 함으로써 타협 기계적 안정성 밑에서 당기는 정도 실험입니다.
광도 [캘리포니아2 +]내가 측정 하는이 기술에 사용 되는 시스템은 내 피 [캘리포니아2 +]i 비율 Fura 2 염료를 사용 하 여 연속 측정에 적합 합니다. 개별 프로토콜 일반적으로 뜻깊은 photobleaching 없이 ≥10 분을 지난 수 있습니다. 또한, 우리는 일반적으로 데이터 수집 및 Vm 측정에 대 한 날카로운 전극 보호 하는 데 필요한 현미경 목표의 빈번한 움직임에 적시 일시 의무가 있기 때문에 [캘리포니아2 +]나 측정을 위해이 방법을 사용 합니다. 이 방식은 한 광도만 글로벌, [캘리포니아2 +]내가 여러 셀 간에 평균 note. 일반적으로, [캘리포니아2 +]나 측정을 위해 좋습니다 광도를 약리 에이전트 (예:, 시간 코스와 고원 단계의)에 대 한 내 피 세포 응답의 초기 특성에 대 한 계획을 확보 하는 동안 quantitate microdomain 신호 표준 confocal 또는 multiphoton 현미경12,23을 사용 하 여 이벤트를 진행 합니다.
날카로운 전극 전기 생리학 방법은 생리 다세포 준비에 통합된 Vm 녹음에 대 한 순종입니다. 세포내 Vm 의 측정은 지금까지 가장 기술적으로 도전적인 수많은 중요 한 단계를 촉진 하거나 측정의 성공을 없애다. 첫째,는 실험 일관 ~ 150 ± 30의 팁 저항을 가진 날카로운 전극 제조를 위한 유리 끌어당기는 사람에 최적의 프로그램 조건을 결정 하는 데 필요한 m ω. 참고로 읽고 필 라 멘 트 열 램프 테스트를 사용 하 여, 그는 실험 결정 매개 변수 경험적으로, 특히 풀의 시간을 극대화 하는 동안 "열"에 변화에 관하여 추천 된다. Micromanipulators, headstages, 피 펫 소유자, 및 견본의 다음, 기계적 안정성은 절대적으로 중요 합니다. 진동 절연 테이블에 대 한 명백한 필요 이외에 실험 모든 피팅 안전 하 고 무대 지역 주변과 조작자 아래는 깨끗 해야 합니다. 날카로운 전극 녹음의 해상도 1 내는 정도로 외부 잡음을 감소 해야 이상적으로, 뮤직 비디오. 우리의 경험에서 잡음의 가장 일반적인 소스는 전부 충분 한 염화 비닐 코팅 또는 교체 필요는 피 펫 홀더에 보안은 철사 이다. 일반적인 50/60 Hz 노이즈 있으면 "입을 흠" 기술 사용 될 수 있다 하 고 현대 전위 계도 표준 온다. 소음 완전히 관리 하기 어려운 경우, 있는지 여부는 목욕 또는 오버플로에 누출 PSS 온도 제어에 대 한 저항 접촉으로 올 것 이다 확인 합니다. 합병증 안정적인 Vm 신호 획득 유지, 전기 코드와 t-커넥터의 무결성을 확인 하십시오.
전부, 날카로운 전극 녹음은 설정 하는 경우 그것은 일반적으로 부적절 한 전극, 기계적인 불안정성, 또는 세포 건강. 또는,는 실험 또한 개별, 전기 uncoupled 셀 전체 셀 전류와 단일 이온 채널 녹음에 대 한 정보를 구할 수 있는 패치 클램프 기술의 구성을 고려 하는 것 좋습니다. 전압에 민감한 염료와 같은 디-8-ANEPPS도 있지만 (예:, 이종 세포내 로드, 표백, ionophores, 겸손 한 탐지 해상도 사용 하 여 교정) 형광 염료를 사용 하 여 일반적인도 전에 직면 하 고, 상업적으로 사용할 수 있습니다.
혈액 흐름 조절 하 고 뇌 전체에 피에 대 한 우리의 이해는 빠르게 노화와 함께 중요 한 인구 및 만성 심혈 관 및 신경 퇴행 성 질환의 발생률이 상승. 따라서, 우리는 뇌의 다른 혈관 구조에 적응 될 수 있는 중요 한 대뇌 동맥에서 그대로 피를 격리 하기 위한 방법을 제공 합니다. 또한, 우리는 기본 [캘리포니아2 +]i 와 Vm의 동시 측정을 위한 유용한 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 듀얼 세포내 전극에 사용 하 여, 셀-간격 접속점 통해 커플링 수 또한 부과. 신중 하 게 계획 된 약리학 및 유전자 중재, 현재 프로토콜 합리적으로 그리고 양이 많게 포함 기본 형태로 뇌 내 피 기능 연구. 우리의 기대는 경험에서 구축 하 고이 정보를 미리 혈관 생물학 및 신경 과학 일반적 적응 이다. 특히, 전기 측정 전부 최소화와 관련 된 일반적인 실험적인 투쟁 보고 만족 스러운 것입니다. 이 프로토콜은 아니지만 어떠한 수단에 의해 기술의 독립 실행형 세트, 사용 될 수 있습니다 결정 하는 보완적인 접근 방식으로 정확 하 게 어떻게 내 피 생물 결정 혈관 저항에 어떻게 그들이 조정 규정 변경으로 번역 혈액의 건강 대. 질병의 조건에 상대 흐름.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 우수한 기술 지원 장비 및 현재 프로토콜에 필요한 용품을 설정 하는 동안 찰스 휴이 트 감사 합니다. 우리 감사 박사 숀 M. 윌슨과 크리스토퍼 G. 윌슨 Perinatal 생물학의 LLU 센터에서 제공 하는 추가 거꾸로 한 현미경 및 전위 계, 각각. 이 연구는 건강의 국가 학회 교부 금 R00 AG047198 (EJB) 및 Loma Linda 대학의 학부의 새로운 교수 창업 자금 지원 되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Elastase | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
| Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
References
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