Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University

Summary

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Abstract

Serebral arterler ve onların anılan sıraya göre mikro beyin yoluyla kan akışını düzenleme için oksijen ve besin teslim. Endotel hücreleri kan damarları ve komut değişiklikleri damar çapı lümen nöronların metabolik talebi karşılamak için gerektiği kadar satır. Hyperpolarization membran potansiyeli (Vm) ve nitrik oksit birincil endotel bağımlı sinyal yollar genellikle vazodilatasyon aracılık ve böylece kan akışını artırmak için paralel olarak çalışır. Vazodilatasyon damar uzunluğu birkaç milimetre koordine için ayrılmaz rağmen endotel kaynaklı hyperpolarization (EDH) bileşenlerinin ölçmek tarihsel olarak zor olmuş. EDH aşağıdaki bileşenlerden intrasellüler Ca2 + [Ca2 +]ben artırır ve sonraki harekete geçirmek-in küçük - gerektirecektir ve gürültülerinden Ca2 +orta-K+ aktif (SKCatelefonuCa) kanalları.

Burada, fare serebral arterler gelen taze endotel yalıtım basitleştirilmiş bir örnek mevcut; endotel [Ca2 +]ben ve Vm Fura-2 fotometri ve hücre içi keskin elektrotlar, sırasıyla kullanarak eşzamanlı ölçümler; ve tuz çözümleri ve farmakolojik ajanlar (pH 7.4, 37 ° C) fizyolojik koşullarda sürekli bir superfusion. Posterior serebral arter Willis daire dan kaldırılır posterior iletişim ve baziler arter. Enzimatik sindirim temizlenmiş posterior serebral arter kesimleri ve sonraki toz adventitia, perivasküler sinirler ve düz kas hücreleri kaldırılmasını kolaylaştırır. Elde edilen posterior serebral arter endotel "tüpler" sonra mikroskop altında güvenli ve kullanma a fotoğraf makinesi, photomultiplier Tüp, ve bir iki electrometers sürekli superfusion iken altında inceledi. Toplu olarak, bu yöntem aynı anda endotel [Ca2 +]ben değişiklikler ve Vm EDH gap kavşak milimetre mesafeler boyunca bozulmadan kadar aracılığıyla yayılan ek olarak ayrı hücresel yerlerde ölçebilirsiniz endotel. Bu yöntem bir yüksek üretilen iş analiz serebral endotel fonksiyonları normal ve hastalıklı beyin kan akışı Yönetmelikte mekanizmaları temel verim bekleniyor.

Introduction

Beyin çevresinde kan akış vazodilatasyon serebral arterler ve arteriyoller damar ağları1arasında koordinasyonu tarafından düzenlenmiştir. Serebral direnç arterler komut değişiklikleri nöronlar1,2,3metabolik talebi karşılamak için gerektiği gibi damar çapı astar endotel hücreleri. Özellikle, endotel kaynaklı hyperpolarization (genellikle EDH bilinir), sırasında intrasellüler Ca2 + ([Ca2 +]ben) ve endotel hücreleri koordinat vazodilatasyon endotel hücreleri arasında içinde elektrik sinyal ve onların arteryel gevşeme4için boşluk kavşak ile düz kas hücreleri çevreleyen. EDH fizyolojik inisiyasyon sırayla Gquyarılması gerektirir-reseptörleri (GPCRs), [Ca2 +]benve harekete geçirmek-in endotel küçük ve orta Ca2 +artış birleştiğinde-Kaktif + (SKCatelefonuCa) kanalları serebral endotel membran potansiyeli (Vm)5,6,7hyperpolarize. Böylece, endotel [Ca2 +]ben ve Vm samimi ilişki kan akışı düzenleme için ayrılmaz ve vazgeçilmez kardiyo - ve serebrovasküler işlevi6,8. Daha geniş edebiyat çok sayıda çalışma vasküler endotelyal disfonksiyon Derneği kronik hastalıklar (örn, hipertansiyon, diyabet, kalp yetmezliği, koroner arter hastalığı, kronik böbrek yetmezliği gelişimi ile bildirdin endotel işlevin yanı sıra patolojik fizyolojik koşullarda eğitim önemini belirten periferik arter hastalığı)9,10.

Vasküler endotel hyperpolarization, vazodilatasyon ve doku perfüzyon üretimi için ayrılmaz bir parçasıdır ve bu nedenle yerel hücresel özellikleri incelenmesi önemlidir. Genel çalışma modeli olarak fare arteriyel endotelyal tüp modelinin hazırlanması daha önce iskelet kas11,12, gut13, akciğer14ve son zamanlarda beyin6yayımlandı. Aynı anda [Ca2 +]ben ve Vm ölçümler özellikle lenf damarı endotel17yanı sıra kas iskelet damar endotel15,16 yayınlanmıştır. Endotelyal tüp yaklaşım kullanarak birincil çalışmalar yanı sıra, kendi avantajları ve dezavantajları8 kapsamlı bir incelemesini bu deneysel araç belirli bir çalışma için uygun olup olmadığını belirlemek için danışılmalıdır. Kısacası, endotel hücre işlevi temel fizyolojik bileşenleri korunur bir avantaj olduğunu (örneğin, Ca2 + akını ve hücre içi serbest bırakmak, Vm Nernst potansiyel ilâ hyperpolarization K+ için yolu ile SKCatelefonuCa harekete geçirmek ve endotelyal hücreler arası bağlantı yolu ile gap kavşak) perivasküler sinir giriş, düz kas voltaj kanal işlevi ve contractility, gibi faktörler semptomlarıdır olmadan kan ve hormonal etkiler8dolaşımını. Buna ek olarak, yaygın olarak kullanılan hücre kültür yaklaşımlar morfoloji18 ve iyon kanal ifade19 büyük ölçüde karşılaştırmalar için fizyolojik gözlemler ex vivo belirlenen karartmak bir şekilde önemli değişiklikler tanıtmak veya Vivo. Bu model en iyi şekilde sağlam vasküler segment tecrit içinde 4 h test gibi düz kas ve deneysel bir zamanlamada sınırlı esneklik gibi kan akışını düzenleyen diğer temel bileşenleriyle bütünleşme eksikliği sınırlamaları içerir --dan belgili tanımlık hayvan.

Socha ve Segal12 ve geçici6,15,16, son deneysel gelişmeler tarafından hazırlanan bir önceki video protokolden bina bu vesile ile taze endotel yalıtım göstermek posterior serebral arter ve endotel [Ca2 +]ben ve Vm Fura-2 fotometri ve hücre içi keskin elektrotlar, sırasıyla kullanarak eşzamanlı ölçümler. Ayrıca, bu deneyi tuz çözümleri ve farmakolojik sürekli superfusion fizyolojik şartlarda (pH 7.4, 37 ° C) sırasında üzerine kuruludur. Yapısal bütünlük (gap kavşak ile birleştiğinde hücreleri) ve yeterli Boyutlar (Genişlik ≥50 µm, uzunluğu ≥300 µm) içi - ve hücreler arası boyunca ve arasında sinyal için mükellef ile izole endotel verimleri kadar posterior serebral arter seçti endotel hücreleri. Buna ek olarak, kemirgen posterior serebral arter çalışmaları önemli ölçüde literatürde gösterilir ve muayene, temel endotel sinyal mekanizmaları, vasküler geliştirme/yaşlanma ve patoloji20, kapsayacak 21 , 22. bu deneysel uygulama serebral endotel fonksiyonları (ve fonksiyon bozukluğu) yüksek üretilen iş analizini verim bekleniyor ve böylece kan akışı düzenleme anlamada önemli gelişmeler sağlayacak yaşlanma ve nörodejeneratif hastalık gelişimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıdaki deneyler gerçekleştirmeden önce tüm hayvan bakımı kullanın ve iletişim kuralları hayvan Kurulusları ve kullanmak Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Ulusal Araştırma Konseyi ''Kılavuzu ile uyum içinde gerçekleştirilen bakım ve kullanımı için olun Laboratuvar hayvanlarının" (8th Edition, 2011) ve varış yönergeleri. Loma Linda Üniversitesi IACUC erkek ve dişi C57BL/6 fareler için bu el yazması için kullanılan tüm iletişim kuralları onayladı (Yaş Aralığı: 3-30 gün).

1. ekipman ve malzemeleri

Not: Ayrıntılar iletişim kuralı için gerekli malzemelerin Malzemeler tablo, reaktiflerve kılavuzları veya ilgili satıcıları ile ilişkili Web siteleri bulunabilir.

  1. Akış odası
    1. Superfusion odası ile bir cam coverslip alt bir anodize alüminyum platforma bağlayın. Odası platformuyla kompakt alüminyum sahne içine güvenli.
    2. Bir micromanipulator her iki uçta platformu sabitleme pipet tutmak için alüminyum sahnede ayarlayın.
      Not: Pratik bir seçenek olarak, bu transfer edilebilir sahne cihaz deneyler performansını yalıtım endotelyal tüp geçiş kolaylaştırmak için güvenli bir akış odası birim ile kullanın.
  2. Mikroskoplar
    1. Kullanım stereomicroscopes (5 x 50 x büyütme aralığı için) fiber optik ışık kaynağı makro ve mikro diseksiyon yordamları için donatılmıştır.
    2. Endotel tüpler hazırlanması için faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) uyumlu hedefler (10 x, 20 x ve 40 x) ve bir alüminyum sahne ile donatılmış bir ters mikroskobu kullanın.
    3. Kısmen sindirilmiş kan damarları üzerinden endotel tüpler yalıtmak için bir microsyringe pompa denetleyicisi endotelyal tüp hazırlama cihazları için bitişik yerleştirin.
    4. Deneysel cihazları için standart objektif (4 x ve 10 x) ile donatılmış bir ters mikroskobu (20 x ve 40 x, sayısal diyafram 0,75) Floresan hedefleri ve titreşim yalıtım tabloya el ile alüminyum sahnede ek olarak kullanın.
  3. Hücre içi kayıt cihazları
    1. Endotel hücrelerinin Vm izole endotel tüplerde kaydetmek için uyumlu headstage electrometer bağlayın. Gerekirse, bir işlev üreteci veya uyarıcı geçerli enjeksiyon gerektirir deneyleri için electrometer takın.
    2. Amplifikatör çıkış veri toplama sistemi, sesli temel monitörler ve bir osiloskop bağlayın. Referans elektrot (Ag/AgCl Pelet) akış odası çıkış deneyler sırasında güvenli.
    3. Fotometrik sistemle bir floresan sistem arabirimi, yüksek yoğunluk ark lambası ve güç kaynağı, hyperswitch, photomultiplier tüp (veya Devresel_ödeme), entegre bileşenlerle kullanın ve kamera [Ca2 +]ben endotel hücrelerinde ölçmek için.
    4. Bir satır içi ısıtıcı ile donatılmış bir sıcaklık denetleyicisi yükseltmek ve deneme boyunca fizyolojik bir sıcaklık (37 ° C) güncelleştirmek için kullanın.
    5. Bir satır içi akış kontrol valfi ile vana denetleyicisine bağlı bir altı-rezervuar platform odasında güvenli endotelyal tüp için ilgili çözümleri teslim denetlemek için kullanın.
  4. Mikropipetler ve keskin elektrotları
    Not: Pipetler toz ve izole endotel tüpler mekanik stabilizasyon için üretimi için Pipetler ve mikro-demirhane kırma için çekmek için bir elektronik çektirmenin kullanın ve parlatma yangın.
    1. Adventitia, düz kas ve endotel tüp kısmen sindirilir arteryel segmentten ayırmak için borosilikat cam kılcal tüpler, kullanarak toz pipetler (her bir iç uç çapı 80 – 120 µm) uygun olarak hazırlamak ve ateş İpucu Lehçe.
    2. Endotel boru superfusion odası alt karşı güvenliğini sağlamak için sabitleme Pipetler ile körelmenin, küresel bir uçla çalışırsınız (ısı-cilalı, 100-150 µm; OD ince duvar borosilikat cam tüpler hazır).
    3. Vm endotel hücre kaydetmek için bir ipucu direnci ~ 150 ± 30 ile keskin elektrotları hazırlayın cam kılcal tüpler bir elektronik çektirme kullanarak üzerinden MΩ.

2. çözüm ve uyuşturucu hazırlanması

  1. Fizyolojik tuz solüsyonu (PSS)
    1. Uyuşturucu hazırlıkları ile bir deneme için en az 1 L PSS kullanarak hazırlamak: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic asit (HEPES) ve 10 mM glikoz.
    2. Diseksiyon için gerekli çözümleri hazırlamak için yalıtım serebral arter ve endotelyal Tüp, hazırlanması hazırlamak PSS CaCl2 (sıfır Ca2 + PSS) eksik.
    3. Ultrasaf deiyonize H2O tüm çözümler hazırlamak, pH 7.4 için ayarlamak, onları bir filtreden (0,22 µm gözenek boyutu) sterilize ve çözümleri osmolalite 290 ve 300 mOsm arasında olduğundan emin olun.
      Not: Çözümler 4 ° C'de yaklaşık iki hafta boyunca saklanır.
  2. % 10 sığır Serum Albumin (BSA)
    1. % 10 BSA hazırlamak için 1 g lyophilized tozu bir ölçek-10 mL sıfır Ca2 + PSS geçiyoruz.
    2. Parafin film ile kabı kapsar ve BSA erimeye için yavaş karıştırma ile geçmek, birkaç saatlik bir süre olanak sağlar.
    3. Nihai çözüm 10 mL şırınga artı 0,22 µm filtre kullanarak filtre ve 1 mL aliquots-20 ° C'de depolanan yapmak
  3. Diseksiyon çözüm
    1. 50 mL diseksiyon çözeltisi hazırlamak için BSA (% 10) 500 µL 49,5 mL için sıfır Ca2 + PSS ekleyin.
    2. Hemen hazırlık sonra bu diseksiyon çözüm içine arteriyal diseksiyon için Petri kabına aktarın.
  4. Ayrılma çözüm
    1. 50 mL ayrılma çözeltisi hazırlamak için 5 µL CaCl2 (1 M) ekleyin ve BSA (% 10) 500 µL sıfır Ca2 + PSS 49,5 mL için. Oda sıcaklığında (RT) oturmak çözüm sağlar.
  5. Enzimler
    1. Arteryel kesimleri kısmi sindirim için 1 mL sindirim çözeltisi 0.31 mg/mL papain, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL collagenase (tip H karışım) ve 0.13 mg/mL elastase hazırlayın.
      Not: Enzim aktiviteleri değişebilir; Ancak, bizim başarılı iletişim kuralları için ticari olarak sağlanan enzim aktiviteleri aşağıdaki gibi kullanılmıştır: papain ≥10 birimleri/mg; collagenase ≥1 birimleri/mg, N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala veya FALGPA substrat ciro için; ve elastase ≥ 5 adet/mg.
  6. Fura-2 ve farmakolojik hazırlanması
    1. Hisse senedi toplama (1 mM) Fura-2 hazırlamak DMSO AM boya. Bir çalışma konsantrasyonu (10 µM) yükleme için PSS 495 µL için stok 5 µL ekleyerek hazırlayın.
    2. Farmakolojik ajanlar (örneğin, ATP) konsantrasyonları çalışma ≥50 mL PSS içinde uygun şekilde hazırlayın.
  7. Çözüm iletken
    1. Bir iletken hazırlamak KCl (7.455 g KCl 50 mL H2O) deiyonize H2O içinde eriterek tarafından çözüm, 2 M KCl,.
    2. Çözüm keskin elektrotlar aracılığıyla 0,22 µm şırınga filtre dolgu önce filtre uygulayın.
  8. Propidium iyodür (% 0,1)
    1. 10 mg liyofilize propidium iyodür 10 ml 2 m KCl geçiyoruz.
    2. Mix iyi ve RT. mağaza

3. diseksiyon ve yalıtım serebral arter

Not: Tüm diseksiyon yordamlar örnek büyütme (50 x) stereomicroscopes ve fiber optik ışık kaynağı tarafından sağlanan aydınlatma yoluyla gerektirir. Beyin ve damar yalıtımı için diseksiyon yordamları gerçekleştirmek için keskin diseksiyon aletleri kullanın. İzole ve arterler temiz mikrodiseksiyon araçlar bilenmiş ince uçlu forseps ve kenasen tarzı diseksiyon makası (3-9,5 mm bıçaklar) içerir.

  1. Yalıtım fare beyin
    1. Bir C57BL/6 fare (3-30 ay eski; erkek veya kadın) üzerinden zehirlenmesinden isoflurane (2-3 dakika için % 3) anestezi, sonra hemen ardından tam anestezi indüksiyon hayvan başını kesmek. Başından bir Petri kabına yerleştirin (çapı 10 cm, derinliği 1,5 cm) soğuk (4 ° C) içeren sıfır Ca2 + PSS bir stereomicroscope altında.
    2. İle mikroskop ile ilgilenen, cilt ve saç üzerinde kafatasını ve soğuk ile aşırı kan sıfır Ca2 + PSS kaldırın. Oksipital kemik ile başlayan ve kafatası burun kemiği uzanan sadece ipuçlarını standart diseksiyon makası (örneğin, 24 mm bıçak) kullanarak bir kesi yapmak.
    3. Kafatası dikkatle Willis bir bozulmamış daire ile beyin yalıtmak için kaba uçlu forseps ve ayrı bağ dokusu kullanarak kesi boyunca açın.
      Not: Alternatif olarak, Littauer kemik kesme forseps kafatasını açıp beyin ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
    4. Sıfır Ca2 + kan kaldırmak için PSS bir ölçek yavaşça soğuk ile izole beyin yıkama. Yukarı bakacak şekilde soğuk diseksiyon çözüm için yalıtım serebral arter (Şekil 1A) içeren bir odasında beyin ventral yanına koyun.
  2. Yalıtım serebral arter
    Not: Posterior serebral arter bu iletişim kuralı için bir temsilci serebrovasküler endotel çalışma modeli olarak seçilmiş olabilir.
    1. Paslanmaz çelik pim kullanarak soğuk diseksiyon çözüm izole beyin güvenli (çapı 0.2 mm, uzunluğu ~ 11-12 mm) bir cam Petri kabına (Derinlik ≥50 cm) alt kaplama bir kömür-infüzyon silikon polimer eklenecek.
    2. Diseksiyon sırasında PSS soğutulmuş sıcaklığını korumak için sürekli bir 1:1 su-etilen glikol karışımı Bisiklete binme bir soğutucu sistem tarafından soğutmalı bir diseksiyon odası kullanın. Alternatif olarak, diseksiyon taze buz üzerinde gerçekleştirilebilir.
    3. Cerrahi olarak posterior önlememek posterior serebral arter (0.5 cm kesimine ~0.3, eksenel gerginlik yok) ve baziler arter mikrodiseksiyon aletleri kenasen tarzı makas ve keskinleşmiş ince uçlu forseps (Şekil 1B kullanarak izole etmek ). Paslanmaz çelik pim kullanmak (çapı 0.1 mm, uzunluğu ~ 13-14 mm) için güvenli her ikisi de posterior serebral arter Petri kabına (Şekil 1 c) diseksiyon çözümde izole.
    4. İzole posterior serebral arter dikkatle bağ dokusu bilenmiş ince uçlu forseps (Şekil 1 d) kullanarak kaldırarak temizleyin. Sağlam damar parça halinde kesilmiş (uzunluğu 1-2 mm) (Şekil 1 d; iç metin) enzimatik sindirim için.

4. endotel tüp ve Superfusion hazırlanması

Not: Endotelyal tüp12, değişiklikler için serebral arter6ile daha önce açıklandığı gibi hazırlanır.

  1. Hedefler (10 x, 20 x ve 40 x), bir kamera ve bir oda ve micromanipulators tutan bir alüminyum sahne ile donatılmış bir mikroskop kullanarak toz aparatı hazırlayın. Bir microsyringe sahne ve numune (Şekil 2A) bitişik bir pompa denetleyicisiyle güvenli.
  2. Tamamen backfill bir toz mineral yağ ile pipet ve mikro-şırınga pistonu üzerinde güvenli. O zaman, mikro şırınga pompa denetleyicisi ile kullanarak, ayrılma çözüm pipet çekilme (~ 130 nl) madeni yağ pipet hava kabarcıkları yokluğu sağlanması sırasında üstüne.
  3. Sağlam arteryel kesimleri 0.31 mg/mL papain, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL collagenase ve 0.13 mg/mL elastase içerir bir 10 mL Cam Tüp (Şekil 2B), ayrılma çözeltinin 1 mL içine yerleştirin. Kısmi sindirim için 10-12 dakika 34 ° C'de kuluçkaya.
  4. Sindirim, enzim çözüm ~ 5 mL taze ayrılma çözeltisi ile değiştirin. 1 mL pipet kullanarak, bir kesimi RT., ayrılma solüsyon içeren bir odaya transfer
  5. Ayrılma çözüm odasında pipet yerleştirin ve sindirilmiş gemi bir ucunu yakın konumlandırın. Pompa denetleyicisindeki nazik toz (Şekil 2C; iç metin) için 2 ile 5 nL/s aralığında bir oranını ayarlamak.
  6. 100 x 200 x büyütme ile görüntüleme, süre geri çekilin ve düz kas hücreleri bir endotelyal tüp üretirken ayırmak için arteryel segment dışarı atmak. Dikkatle gerekirse, ince uçlu forseps Disosiye adventitia ve iç elastik lamina endotel tüpünden ayırmak için kullanın. Tüm düz kas hücreleri ayrışmış ve sadece endotel hücreleri bir bozulmamış "tüp" (Şekil 2C) kalmadığından emin olun.
  7. Micromanipulators kullanarak, her iki ucuna borosilikat cam pipetler (Şekil 2B) bağlantılarını kullanarak superfusion odasının cam kapak notu üzerindeki endotelyal tüp güvenli.
  8. Wash-out adventitia ve düz kas hücrelerinden odası ve Değiştir ayrılma çözüm 2 mM CaCl2 PSS ile ilişkisini. Mobil platformu ile güvenli endotelyal tüp mikroskop superfusion ve deneysel teçhizat üzerine aktarın.
  9. 6 temiz 50 mL rezervuar (Şekil 3A) uygun olarak deney sırasında PSS ve ilgili ilaç çözümleri sürekli teslimi için kullanın. Satır içi akış kontrol vanası el ile ayarlamak debi boyunca laminar akış ile tutarlı olarak vakum emme için yem akışı eşleştirme için kullanın. PSS odasına (Şekil 3B) ≥ 5 min için endotelyal tüp superfusion için arka plan veri ve yükleme boya kaydetmeden önce teslim.

5. boya yük, Wash-Out ve sıcaklık ayarları

  1. [Ca2 +]benölçme fotometri sisteminin tüm bileşenleri etkinleştirin. Mikroskop deneysel Kulesi (Şekil 3 c) 400 x büyütme ve odak endotelyal tüp hücreleri fotometri sistem yazılım paketi kullanarak fotometrik penceresinde görüntülemek için kullanın.
  2. Endotelyal tüp çapı ölçmek ve 510 nm Emisyon 340 ve 380 nm (≥10 Hz), alternatif uyarma sırasında ile uyum içinde arka plan autofluorescence değerlerini kaydedin.
  3. [Ca2 +]ben yanıt-e doğru ölçmek için yük Fura-2 ile endotel tüp RT boya (10 µM son konsantrasyonu) kulüpler ve ~ 30-40 izin ışık yokluğunda min.
  4. Superfusion ~ 30 – 40 için taze PSS ile endotel tüpün yeniden wash-out için dakika fazla boya ve hücre içi izin Fura-2 de-esterify üzereyim. Wash-out süresi içinde yavaş yavaş üzerinden RT sıcaklığı 37 ° c sıcaklık kontrolörü (Şekil 3A) ile bir satır içi ısıtıcı kullanarak artırmak sonra deneme boyunca 37 ° C'de korumak.
    Not: RT 37 ° c arasında önerilen artımlı geçiş ≥5 min denge teker teker her adım ile üç adım (örneğin, 5 ° C) üzerine kuruludur.

6. aynı zamanda yapılan ölçüm [Ca2 +]ben ve Vm

  1. Diğer ekipman ve Vm ölçme electrometer yazılım paketi açın (bkz: Şekil 3, Şekil 4). Veri toplama hızı uygun şekilde ayarlayın (≥10 Hz).
  2. Bir keskin elektrot ve IS ile 2 M KCl çekin. Hücreler arası çalışmaları için %0,1 propidium iyodür 2 M KCl çözünmüş ile microelectrodes boya transferi, backfill kaplin.
  3. Elektrot bir micromanipulator ile güvenli bir electrometer kafa sahne bağlı pipet tutucu klorür ile kaplı bir gümüş tel üzerinde güvenli. Micromanipulator kısa bir süre ise 4 x objektif aracılığıyla görüntüleme odasında akan PSS içine elektrot ucunu konumlandırmak için kullanın.
  4. Dinlenme Vm potansiyel için topraklı banyo ile tutarlı olarak 0 olarak ayarlanır. Elektrot ucunu sadece endotelyal tüp bir hücrenin üzerine getirin. İsterseniz, sesli temel monitörler için electrometers bağlı ses pitch potansiyel kayıtları ile ilişkilendirmek için kullanın.
  5. 400 x 40 x amacı istimal büyütmeyi ve elektrot ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın. ~ 50-80 endotel hücreleri üzerinde odaklanmaya fotometri yazılımını kullanarak fotometrik penceresi ayarlamak.
  6. Yavaşça elektrot micromanipulator kullanarak endotelyal tüp hücrelerinin yerleştirin ve ≥2 dakika stabilize etmek dinlenme Vm için bekleyin. Benzer şekilde, ikinci bir elektrot ile ilk elektrot Impaled ilk hücreden başka bir hücreye (mesafe ≥100 µm) ekleyin.
  7. Vm dinlenme onun beklenen değerler stabil bir kez (-30 -40 ile mV)6, Devresel_ödeme ışık yokluğunda floresans arabirimde etkinleştirin ve hücre içi [Ca2 +]ben heyecan verici Fura-2 edinimi dönüşümlü olarak başlar (10 Hz), 510, floresans emisyon toplarken 340 ve 380 nm nm.
    Not: Hücreler arası elektrik bağlantı, geçerli test etmek için (± 0,5-3 nA, ~ 20 s darbe süresi) ile bir electrometer "Site 1" olarak teslim edilebilir ve değişiklikleri Vm başka bir electrometer ile kaydedilen "2" (mesafe ≥100 µm) Site.
  8. Vm ve [Ca2 +]ben eşzamanlı ölçümler kurulur, ~ 5 min için uygulamadan önce ilaçların sürekli laminer akış hızında PSS ile endotel tüp superfusion izin verme.
  9. Sürekli akış hızı ile superfusion odasına PSS içinde hazırlanan ilaç (örneğin, ATP) uygulanır. ~ 3 dk (veya ilaç kinetik için uygun bir süre) sonra Vm kadar PSS ile yıkama ve F340/F380 oranı temel durumları döndürür. İlgili kayıtları geçici eşitlenmiş olarak foto ölçüler ve electrometer yazılım paketleri arasında çözümler her geçişinde işaretleyin.
  10. Deneme yaptıktan sonra elektrot micromanipulator kullanarak hücreden çekilme ve Vm fark ~ 0 olarak banyo elektrot tarafından başvurulan mV. İlgili kayıtları Vm ve [Ca2 +]ben durdurmak ve kayıtları veri analizi için dosyayı kaydedin.

7. görsel olarak hücre hücre kaplin

  1. Hücre hücre kaplin yoluyla propidium iyodür görselleştirmek için 40 x veya 60 x floresan amacı ile nispeten yüksek bir sayısal diyafram kullanın (örneğin, 0.95) ve rodamine filtre ayarlamak katı hal aydınlatma ile bir yüksek çözünürlüklü kamera (örneğin, 16- megapiksel) ve bir görüntüleme yazılım paketi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıda açıklanan protokol şematik gösterimi ekli resimler gösterilir. Bir genç yetişkin erkek C57BL/6N fare (5 ay) izole bir beyin Şekil 1Aile gösterilir. Posterior serebral arterler gelen daire, bağ dokusu kaldırıldı ve kesimleri (Şekil 1B-D) içine kesilmiş Willis, dikkatli bir şekilde izole edilmiştir. Kısmen sindirilir arteryel kesimleri sağlam endotel tüp üretilen ve cam kapak sabitleme pipetler kullanarak slip üzerinde güvenli. Nazik Mekanik streç gemi tortuosity olmadan doğrusal içinde vivo uzunluğu yaklaşık iki sabitleme pipetler kullanılarak uygulanır. Bu makale (Şekil 2A-D) daha fazla açıklık vardır. Posterior serebral arterler izole endotel tüpler vardır ~ 90-100 µm genişlik ve ≥300 µm uzunluğunda içinde. Tüp dolu olan Fura-2 wash-out PSS ile takip. Hem elektrot elektrofizyoloji ( resim 3 resim 4görüldüğü deneysel teçhizat) keskin eş zamanlı ölçüm [Ca2 +]ben ve endotelyal tüp Vm Ca2 + fotometri tarafından gerçekleştirilir.

Endotelyal tüp işlevsel değerlendirme bir klasik endotel GPCR agonist ATP gibi fizyolojik koşullar altında akışı odasına uygulayarak gerçekleştirilir. Şekil 5' te gösterildiği gibi [Ca2 +]ben ve Vm aynı anda yanıt ATP olarak kaydedilir (100 µM). Vm (≥5 mV) önemli bir hyperpolarization kullanılazlar [Ca2 +]ben bir artış SKCatelefonu etkinleştirir gösteren bir hücre içi [Ca2 +]ben bir artış ileCa kanalları oluşur. ve böylece K+ sızma EDH üretmek için plazma zarı arasında sağlar. Hücreler arası bağlantı geçerli enjeksiyon kullanarak kanıtı (± 0,5-3 nA, ~ 20 s Bakliyat) kısa bir süre önce çalışmamızda (başvuru6, Şekil 1) bulunabilir. Not Bu propidium iyodür ~ 668 Da referans olarak ikinci haberci siklik adenozin monofosfattır (kampı, ~ 329 Da) gap kavşak inositol trisphosphate (IP3~ 420 Da), gibi geçen bilinen bir kitle vardır.

Figure 1
Resim 1 : Yalıtım beyin serebral arterin. (A)ile (beyaz ok posterior serebral arter gösterir) dessection çözüm sağlam arterlerde izole beyin. (B) Magnified görüntülemek posterior serebral arter (beyaz ok; ~ 3 x vs. Masası'A). Paslanmaz çelik pim numune tabak ile güvenli (C) izole posterior serebral arter. (D) Posterior serebral arter bağ dokusu çıkarılması takip. İç metin arter kesme kesimleri gösterir; Ölçek çubuğu 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Serebral endotelyal tüp hazırlanması. Kısmen sindirilir arteryel kesimleri triturating için(a)cihazları; bir micromanipulator, = b = Tüp, c hazırlama odası alüminyum sahne, d = microsyringe, = e mikroskop, = f microsyringe pompa denetleyicisi =. (B) arteryel segmentlerinde (beyaz ok) çözüm enzimatik sindirim için. (C) endotel tüpler toz tarafından hazırlanan; bir toz = pipet, b sağlam endotel tüp =. İç metin adventitia ve düz kas hücreleri kaldırmak için toz süreci gösterir; Ölçek çubuğu 100 µm ile sabitleme pipet; cam kapak notu üzerindeki güvenli. (D) bir sağlam endotel tüp = bir sabitleme = pipet, b = ~ 100 µm. çapı ile sağlam endotel tüp Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Superfusion ve eş zamanlı Araçlar [Ca2 +[] ben ve V m ölçümler. Endotelyal tüp ve sıcaklık kontrolü, superfusion için(a)donatım bir yüksek yoğunluklu ARC lamba güç kaynağı, = b floresan Spektrometre sistemi arabirimi, c = sıcaklık denetleyicisi, d = 6-rezervuar superfusion sisteminin = e fiber optik ışık = kaynakları, f = Vana denetleyicisi, g = hyperswitch [Ca2 +]ben fotometri sistemi. (B) Superfusion odası cihaz; bir ve b headstages, c = toprak elektrodu, d = satır içi = ısıtıcı, e = superfusion boru, f vakum emme, g = superfusion odası, s = odası tutarak alüminyum sahne =. (C) bir titreşim yalıtım tablo deneysel platformunda; = hücre çerçeveleme adaptör kamera ile b mikroskop ışık, c = mikroskop, d = alüminyum sahne, = e headstage denetiminin, micromanipulator = f = titreşim yalıtım tablo. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Elektrofizyoloji ve veri kayıt faaliyet için donatım. bir osiloskop, = b işlev üreteci, c = sesli temel monitör, d = 50/60 Hz gürültü filtresi, e ve f = electrometers, = g veri toplama sistemi =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Aynı anda [Ca2 +[] ben ve V m kayıtları. (A)fark girişim kontrast görüntü (400 x) bir fare serebral arteriyel endotelyal tüp ayarlanabilir fotometrik penceresinde bir 40 x hedefi kullanarak deneme için. Keskin bir elektrot görüntü (beyaz ok) üst kısmında gösterildiği gibi bir hücreye yerleştirilir. (B) ham izleri aynı anda ölçüm F340/F380 oranı (üst) ve Vm (alt) ATP Yanıt için (100 µM). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Son gelişmeler6,15,16,17ışığında, biz şimdi fare serebral damar endotel [Ca2 +] eşzamanlı ölçümü için hazırlık yalıtmak için yöntem göstermek ben ve sürekli olarak 37 ° C'de ~ 2 h için EDH temel Vm Her ne kadar teknik olarak zor, hücre hücre de (bkz: başvuru6, Şekil 1) kaplin ölçebilirsiniz. Bu şekilde, ayrı ve yürütülen olaylar aynı anda sinyal ölçebilirsiniz. Bir hesap fare damar endotel yalıtma sırasında karşılaştıkları genel sorunlar için başvurular11,12başvurun. Biz fare serebral arterler, endotel [Ca2 +]ben ve Vm, sorun giderme önerileri ve konuları için alternatif yöntemler ışığında, bizim belirli ölçümleri izole için kritik adımları vurgulamak Deneysel güçlü/zayıf yönleri aşağıdaki.

Posterior serebral arter Willis daire ve bağ dokusu zarar vermeden dikkatli izolasyonu düz kas ve endotel hücreleri gerektirir. Cerrahi alet (forseps ve makas) temiz, keskin kenarları ile muhafaza ederken fare mikro diseksiyon yordamlar uygun olmalıdır. Göreli iskelet kas12, biz zaman dilimi enzimatik kuluçka için üçte iki ve papain, collagenase ve dithioerythritol konsantrasyonları tarafından yanında yarı elastase ampirik olarak en iyi duruma getirilmiş bir konsantrasyon kullanımı ekleme süre indirgenir. Serebral arteriyel endotelyal tüp yalıtma tutarlı başarı için bu gruplar halinde (2-4 şişe) sipariş enzimler için frekans kullanımı ve raf ömrü ile uyum içinde tutarlı üretim uygulamaları ile son derece saygın bir satıcıdan önemlidir. Hatta sonraki enzim aktivite enzim bir çok varyasyon için potansiyel ile bu enzim konsantrasyonları zaman sindirim 10-12 dakika içinde en iyi duruma getirme sırasında muhafaza edilmesi önerilmektedir. Bu ne cinsiyet ne de hayvan (3 ile 30 ay) yaşın önemli bir bariyer izole endotel hazırlanması deneyimlerimiz serebral arterlerde üzerinden olmuştur dikkati çekiyor. Böylece, kokteyl ve zaman enzim sindirim enzim kompozisyon çalışmalarında aynı yaş ve cinsiyet kalır salık vermek.

Vurguladığım gibi dikkat nazik toz ve adventitia ve seklinde düz kas hücreleri endotel yalıtım sırasında hasar endotel hücreleri12önlemek için gereklidir. Toz adıma viskoz madeni yağ çekilme veya PSS içinde banyo gemi parçaları çıkarmak için sulu PSS arasındaki mikro şırınga piston hidrolik bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu mineral yağ damarı segment temasa geçerse, bu adım temiz toz pipet ile madeni yağ ve PSS sıralı dolgu kullanarak tekrarlanması gerekir olduğunu belirtmek gerekir. Tek tek hücreleri "düz", boyuna morfoloji (örneğin, çapı ~ 5 µm; uzunluğu ~ 100 µm; varsayalım sayede bir deneme önce bu bir yaklaşık doğrusal vivo içinde uzunluk olası, endotelyal tüp geri yüklenmesini tavsiye edilir kalınlığı ~0.5 µm)8. Ancak, eksenel gerginlik yer hücrelerin numune kenarlarında alıyor uzak ilgili sabitleme Pipetler ve böylece ödün mekanik sağlamlık için güvenilir hücresel ölçümler sırasında altında ölçüde uygulanmamalıdır deneme.

Ölçüm sistemi bu teknikte kullanılan fotometrik [Ca2 +]ben ratiometric Fura-2 boya kullanarak endotel [Ca2 +]i sürekli ölçümler için uygundur. Bireysel iletişim kuralları genellikle ≥10 min önemli photobleaching olmadan sürebilir. Ayrıca, biz genellikle bu yaklaşımı için veri toplama ve sık hareketi Vm ölçümler için keskin elektrotlar güvenliğini sağlamak için gerektiği gibi mikroskop hedeflere zamanında duraklar mükellef olduğundan [Ca2 +]ben ölçmek için kullanın. Not Bu yalnızca yakalar fotometrik bir yaklaşım geneldir, [Ca2 +]ben birden çok hücre arasında ortalama olarak. Genel olarak, [Ca2 +]ben ölçülerini, fotometri farmakolojik ajanlar (örneğin, zaman tabii tepe ve Plato aşama) endotel hücre yanıt ilk karakterizasyonu için planları için güvenli hale getirme sırasında tavsiye ediyoruz Standart confocal veya multiphoton mikroskobu12,23kullanarak olayları sinyal microdomain quantitate devam edin.

Keskin elektrot Elektrofizyoloji yaklaşım tümleşik Vm kayıtları fizyolojik çok hücreli müstahzarları için mükellef olur. Hücre içi Vm ölçüm tarafından çok teknik açıdan en kolaylaştırmak veya ölçümleri başarısı yok çok sayıda kritik adımlar ile zordur. İlk olarak, sürekli olarak bir ipucu direnci ~ 150 ± 30 ile keskin elektrotları üretimi için en iyi program koşulları bir cam çektirmenin tarih belirlemek deneyci ihtiyacı MΩ. Bir referans olarak okuma filaman ısı rampa test kullanılması, özellikle zamanının en üst düzeye çıkarma sırasında "ısı" ortamda değişimi ile ilgili olarak deneyci parametreleri belirlemek ampirik olarak, önerilir. Sonraki, mekanik sağlamlık-in micromanipulators, headstages, pipet sahipleri ve numune kesinlikle önemlidir. Bir titreşim yalıtım tablo için apaçık gerekliliğini kenara deneyci tüm bağlantı parçaları güvenli ve sahne alanı çevresinde ve kollarının altında temiz olduğundan emin olun gerekir. 1 içinde keskin elektrot kayıtları çözümlemesidir ölçüde bu ideal olarak, gereksiz gürültü azaltılması gereken mV. Deneyim, gümüş tel yeterli klorür kaplama veya yenisi ile değiştirme ihtiyacı tamamen bir pipet tutucu içinde güvenli gürültü en yaygın kaynağıdır. Ortak 50/60 Hz gürültü varsa, "susturmak hum" teknoloji kullanılabilir ve modern electrometer ile standarttır. Gürültü tamamen yönetilemez görünür, bir sızıntı banyo veya taşma nerede PSS dirençler sıcaklık kontrolü için temas olup olmadığını denetleyin. Komplikasyonlar istikrarlı bir Vm sinyal alınıyor ile kalırsa, elektrik kabloları ve t-konektörler bütünlüğünü denetleyin.

Özet olarak, keskin elektrot kayıt başarısız olur kurulması, yaygın bir uygunsuz elektrot, MEKANIK kararsızlık veya hücresel sağlık durumu nedeniyle mi. Alternatif olarak, deneyci da yama-klemp tekniği nerede tüm cep telefonu akımları ve tek iyon kanal kayıtları hakkında bilgi elde edilebilir bireysel, elektrikle edilişi hücrelerde oluşan bir yapılandırma göz önünde bulundurmak isteyebilirsiniz. Gibi di-8-ANEPPS da (, türdeş olmayan hücre içi yükleme, beyazlatma, ionophores, mütevazı algılama çözünürlük kullanarak kalibrasyon) Floresan bir boya kullanarak genel sorunlarla karşı karşıya olmasına rağmen voltaj duyarlı boya ticari olarak kullanılabilir.

Endotel için ve beyin boyunca kan akışı Yönetmelikte anlayışımızı hızla yaşlanma ile önemlidir insan nüfusu ve kronik kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıkların artan insidansı. Böylece, biz diğer vasküler yapılar beyin adapte olabilir hayati bir serebral arter üzerinden sağlam endotel izole için bir yöntem sağlar. Buna ek olarak, biz temel [Ca2 +]ben ve Vmeşzamanlı ölçümler için faydalı bir yaklaşım gösteriyor. Son olarak, Çift hücre içi elektrot kullanarak, hücre hücre boşluğu kavşak ile kaplin da tespit edilebilir. Dikkatle planlanan farmakolojik ve/veya genetik müdahaleler ile geçerli protokol yerel haliyle serebral endotel fonksiyonunun çalışma makul ve kantitatif kapsar. Bizim beklenti Denemecileri kurmak ve vasküler biyoloji ve neuroscience genel olarak ilerlemek için bu bilgileri adapte olduğunu. Özellikle, ortak deneysel mücadeleler tamamen minimize elektrik ölçümleri ile ilgili görmek tatmin edici olacaktır. Bu iletişim kuralı teknikleri herhangi bir yöntemle tek başına bir dizi olmasa da, kullanılabilir belirlemek için tamamlayıcı bir yaklaşım tam olarak ne kadar endotel biyofiziksel belirleyicileri vasküler direnç ve nasıl yönetmelik ince ayar değişiklikleri çevirmek kan akışı koşullar sağlık vs. hastalığın temsilcisi göre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Acknowledgments

Biz Charles Hewitt malzeme ve ek malzemeler için geçerli iletişim kurallarına gerek kuran mükemmel teknik yardım için teşekkür ederim. Biz Drs. Sean M. Wilson ve Christopher G. Wilson, Perinatal biyoloji, LLU Merkezi'nden bize bir ek ters mikroskop ve electrometer, sırasıyla verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri grant R00-AG047198 (EJB) ve Loma Linda Üniversitesi Tıp Fakültesi yeni öğretim başlamak-yukarıya fon tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).

Tags

Biyoloji sayı 143 beyin mikro endotel hyperpolarization G-protein birleştiğinde reseptörleri Ca2 +-aktif K+ kanalları Fura-2 fotometri hücre içi microelectrodes hücreler arası kaplin
Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hakim, M. A., Behringer, E. J.… More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter