Summary
Ha dimostrato qui sono protocolli per isolamento (1) appena endothelial cerebrali intatti "tubi" e misure (2) simultanee di calcio endoteliale e potenziale durante endotelio-derivato hyperpolarization della membrana. Inoltre, questi metodi consentono per la sintonizzazione farmacologico di calcio delle cellule endoteliali e segnali elettrici come variabili sperimentali individuali o interattive.
Abstract
Arterie cerebrali e loro rispettivi microcircolazione fornire ossigeno e sostanze nutritive per la regolazione del cervello tramite flusso sanguigno. Cellule endoteliali linea del lume dei vasi sanguigni e modifiche dei comandi in diametro vascolare come necessario per soddisfare la richiesta metabolica dei neuroni. Vie di segnalazione endoteliale-dipendente primarie di hyperpolarization di potenziale di membrana (Vm) e ossido nitrico in genere operano in parallelo per mediare la vasodilatazione e quindi aumentare il flusso sanguigno. Anche se parte integrante del coordinamento vasodilatazione sopra parecchi millimetri di lunghezza vascolare, componenti di hyperpolarization endotelio-derivato (EDH) sono stati storicamente difficili da misurare. Questi componenti di EDH comportano intracellulare Ca2 + [Ca2 +]io aumenta e la successiva attivazione dei piccoli e intermedi conduttanza Ca2 +-attivato K+ (SKCa/IKCa) canali.
Qui, presentiamo un'illustrazione semplificata dell'isolamento di endotelio fresco da arterie cerebrali del mouse; misurazioni simultanee di endoteliale [Ca2 +]i e Vm utilizzando Fura-2 fotometria e intracellulare degli elettrodi affilati, rispettivamente; e un continuo superfusione di soluzioni saline e agenti farmacologici in condizioni fisiologiche (pH 7.4, 37 ° C). Arterie cerebrali posteriori dal cerchio di Willis vengono rimossi senza il comunicante posteriore e le arterie basilare. Digestione enzimatica di segmenti arteriosi cerebrali posteriori puliti e successiva triturazione facilita la rimozione del adventitia, nervi perivascolari e cellule di muscolo liscio. Risultanti posteriori cerebrali arteriosi endoteliali "tubi" sono quindi protetti sotto un microscopio ed esaminati usando una macchina fotografica, fotomoltiplicatore, elettrometri e uno o due mentre sotto superfusione continua. Collettivamente, questo metodo può misurare simultaneamente variazioni endoteliali [Ca2 +]i e Vm in luoghi discreti cellulare, oltre alla diffusione di EDH attraverso giunzioni di gap fino a distanze di millimetro lungo l'intatta endotelio. Questo metodo è previsto un analisi di alto-rendimento delle funzioni endoteliali cerebrali sottesi ai meccanismi di regolazione del flusso sanguigno nel cervello normale e malato.
Introduction
Il flusso sanguigno in tutto il cervello è regolato dal coordinamento di vasodilatazione tra cerebrale arterie ed arteriole in reti vascolari1. Cellule endoteliali che allineano i cambiamenti di comando resistenza cerebrale arterie di diametro vascolare come necessaria a soddisfare la richiesta metabolica di neuroni1,2,3. In particolare, durante il hyperpolarization endotelio-derivato (comunemente noto come EDH), intracellulare di Ca2 + ([Ca2 +]i) e i segnali elettrici in cellule endoteliali vasodilatazione delle coordinate tra cellule endoteliali e la loro cellule di muscolo liscio circostanti attraverso giunzioni di gap per rilassamento arterioso4. Fisiologico iniziazione di EDH in sequenza comporta la stimolazione di Gq-accoppiato i ricevitori (GPCR), un aumento [Ca2 +]ie l'attivazione endoteliale piccolo - e intermedio-Ca2 +-attivato K+ (SKCa/IKCa) canali per hyperpolarize membrana endoteliale cerebrale potenziale (Vm)5,6,7. Così, l'intima relazione di endoteliale [Ca2 +]i e Vm è parte integrante della regolazione del flusso sanguigno e indispensabile per cardio - e cerebrovascolare funzione6,8. In tutta la letteratura più ampia, numerosi studi hanno segnalato l'associazione di disfunzione endoteliale vascolare con lo sviluppo di malattie croniche (ad es., ipertensione, diabete, insufficienza cardiaca, malattia coronarica, insufficienza renale cronica, malattia delle arterie periferiche)9,10, che indica l'importanza di studiare la funzione endoteliale in condizioni fisiologiche nonché patologiche.
Endotelio vascolare è parte integrante della produzione di hyperpolarization, vasodilatazione e perfusione tissutale e così, dall'esame delle sue proprietà cellulari nativo è cruciale. Come un modello di studio generale, preparazione del modello di tubo endoteliale arteriosa del topo è stato pubblicato prima per muscolo scheletrico11,12, gut13, polmone14e recentemente per il cervello6. In particolare sono stati pubblicati studi di simultanea [Ca2 +]i e Vm misure per muscolo scheletrico endotelio arterioso15,16 , nonché di endotelio linfatico del vaso17. Oltre a studi primari che utilizzano l'approccio di tubo endoteliale, una rassegna completa dei suoi vantaggi e svantaggi8 può essere consultata per determinare se questo strumento sperimentale è adatto per uno studio specifico. In breve, un vantaggio è che la chiave componenti fisiologiche della funzione delle cellule endoteliali sono state conservate (per esempio, afflusso di Ca2 + e rilascio intracellulare, hyperpolarization di Vm fino al potenziale di Nernst per K+ via SKCa/IKCa l'attivazione e l'accoppiamento intercellulari endoteliali tramite giunzioni di gap) senza confondenti quali perivascolare del nervo input, la funzione dei canali voltaggio-dipendenti del muscolo liscio e la contrattilità, circolazione del sangue e influenze ormonali8. Al contrario, gli approcci comunemente utilizzati cella cultura introducono alterazioni significative nella morfologia18 e ioni canale espressione19 in un modo che può offuscare notevolmente confronti alle osservazioni fisiologiche determinate ex vivo o in vivo. Limitazioni includono la mancanza di integrazione con altri componenti essenziali per la regolazione del flusso sanguigno, come il muscolo liscio e limitata flessibilità in un piano sperimentale, come questo modello viene testato in modo ottimale all'interno di 4 h di isolamento del segmento vascolare intatto dall'animale.
Edificio da un precedente video protocollo scritto da Socha e Segal12 e recenti sviluppi sperimentali in provvisorio6,15,16, dimostriamo dichiara l'isolamento dell'endotelio fresco da arterie cerebrali posteriori e misure simultanee di endoteliale [Ca2 +]i e Vm utilizzando Fura-2 fotometria e intracellulare degli elettrodi affilati, rispettivamente. Inoltre, questo esperimento comporta superfusione continua di soluzioni saline e agenti farmacologici durante condizioni fisiologiche (pH 7.4, 37 ° C). Abbiamo scelto l'arteria cerebrale posteriore, in quanto produce endotelio isolato con l'integrità strutturale (cellule accoppiate tramite giunzioni gap) e sufficienti dimensioni (larghezza ≥ 50 µm, lunghezza ≥ 300 µm) trattabili per intra e segnalazione intercellulare lungo e tra cellule endoteliali. Inoltre, studi dell'arteria cerebrale posteriore roditore sono sostanzialmente rappresentati nella letteratura e comprendono l'esame dei fondamentali meccanismi di segnalazione endoteliale, sviluppo/invecchiamento vascolare e patologia20, 21 , 22. questa applicazione sperimentale è previsto per produrre un'analisi di alto-rendimento della funzione endoteliale cerebrale (e disfunzione) e permetterà quindi per avanzamenti significativi nella comprensione della regolazione del flusso sanguigno in tutto invecchiamento e lo sviluppo delle malattie neurodegenerative.
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Protocol
Prima di condurre i seguenti esperimenti, assicurarsi che tutte le cure degli animali utilizzare e protocolli sono approvati dalla istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) ed eseguite in accordo con del Consiglio nazionale delle ricerche "guida per la cura e l'uso di Animali da laboratorio "" (8th Edition, 2011) e le linee guida ARRIVE. Il IACUC della Loma Linda University ha approvato tutti i protocolli utilizzati per questo manoscritto per topi C57BL/6 maschi e femmine (fascia d'età: 3-30 mo).
1. attrezzature e materiali
Nota: Dettagli dei materiali necessari per il protocollo possono essere trovati nella Tabella materiali, reagentie manuali o siti Web connessi con i rispettivi fornitori.
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Camera di flusso
- Fissare una camera di sopraffusione con un fondo di vetrino coprioggetti di vetro in una piattaforma in alluminio anodizzato. Fissare la piattaforma con alloggiamento in un palcoscenico di compatto in alluminio.
- Impostare un micromanipolatore a ciascuna estremità della piattaforma sul palco in alluminio per tenere la pipetta il blocco.
Nota: Come un'opzione pratica, è possibile utilizzare questo apparecchio fase trasferibili con un'unità di alloggiamento di flusso fissata per agevolare la transizione dall'isolamento del tubo endoteliale alle prestazioni degli esperimenti.
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Microscopi
- Uso stereomicroscopi (5 x 50 gamma di ingrandimento x) dotato di sorgenti di luce ottica di fibra per le procedure di macro - e micro-dissezione.
- Per la preparazione dei tubi endoteliali, usare un microscopio rovesciato dotato di contrasto o differenziale interferenza contrasto (DIC) compatibili gli obiettivi di fase (10x, 20x e 40x) e una fase di alluminio.
- Per isolare i tubi endoteliali dai vasi sanguigni parzialmente digeriti, posizionare un controller di pompa di microsiringa adiacente all'apparato di preparazione tubo endoteliale.
- Per l'apparato sperimentale, è possibile usare un microscopio rovesciato con obiettivi standard (4 x e x 10) oltre a obiettivi fluorescenti (20x e 40x, apertura numerica 0.75) e una fase manuale in alluminio su un tavolo di isolamento delle vibrazioni.
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Apparecchiatura di registrazione intracellulare
- Per registrare i Vm di cellule endoteliali in tubi endoteliali isolate, connettersi Elettrometro l'headstage compatibile. Se necessario, è possibile collegare un generatore di funzioni o stimolatore a Elettrometro per esperimenti che richiedono iniezione di corrente.
- Collegare le uscite amplificatore per un sistema di acquisizione dati, monitoraggi di base udibile e un oscilloscopio. Fissare l'elettrodo di riferimento (Ag/AgCl pellet) vicino all'uscita di camera di flusso durante gli esperimenti.
- Utilizzare un sistema fotometrico con componenti integrati di fluorescenza sistema interfaccia, alta intensità lampada ad arco e potenza elettrica, hyperswitch, fotomoltiplicatore (o PMT) e la macchina fotografica per misurare [Ca2 +]i in cellule endoteliali.
- Utilizzare un regolatore di temperatura dotato di un riscaldatore di inline per sollevare e mantenere una temperatura fisiologica (37 ° C) in tutto l'esperimento.
- Utilizzare una piattaforma di sei-serbatoio collegata a un controller di valvola con una valvola di controllo flusso inline per controllare la consegna delle rispettive soluzioni al cannotto endoteliale, fissata nella camera.
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Micropipette e degli elettrodi affilati
Nota: Per la fabbricazione di pipette per la triturazione e la stabilizzazione meccanica dei tubi endoteliali isolati, utilizzare un estrattore elettronico per la trazione le pipette e una micro-fucina per la rottura e lucidatura del fuoco.- Per separare il adventitia, muscolo liscio e il tubo endoteliale dal segmento arterioso parzialmente digerito, preparare triturazione pipette (ciascuna con un diametro interno di punta di 80 – 120 µm) a seconda dei casi, utilizzando tubi capillari in vetro borosilicato e fuoco lucidare la punta.
- Per fissare il tubo endoteliale contro il fondo della camera di sopraffusione, usare pipette blocco con un'estremità smussata, sferica (calore-lucidato, OD di 100 – 150 µm; preparato da tubi in vetro borosilicato a parete sottile).
- Per registrare Vm di una cellula endoteliale, preparare degli elettrodi affilati con una resistenza di punta di ~ 150 ± 30 MΩ da tubi capillari di vetro usando un estrattore elettronico.
2. preparazione di soluzioni e farmaci
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Soluzione salina fisiologica (PSS)
- Per un esperimento con le preparazioni di droga, preparare un minimo di 1 L di PSS utilizzando: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2mm CaCl2, 1mm MgCl2, acido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic (HEPES) di 10 mM e 10 mM glucosio.
- Per preparare le soluzioni necessarie per dissezione, isolamento dell'arteria cerebrale e la preparazione del tubo endoteliale, preparare PSS carente CaCl2 (zero Ca2 + PSS).
- Preparare tutte le soluzioni in ultrapura deionizzata H2O, regolare il pH a 7,4, sterilizzarli attraverso un filtro (dimensione dei pori di 0.22 µm) e assicurarsi che l'osmolalità delle soluzioni sia tra 290 e 300 mOsm.
Nota: Soluzioni possono essere conservati a 4 ° C per circa due settimane.
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10% albumina di siero bovino (BSA)
- Per preparare 10% BSA, sciogliere 1 g di polvere liofilizzata in un becher di 10ml zero Ca2 + PSS.
- Coprire il becher con la pellicola di paraffina e consentire un periodo di diverse ore per passare, con agitazione lenta per i BSA a dissolversi.
- Filtrare la soluzione finale utilizzando una siringa da 10 mL più un filtro da 0,22 µm e rendere le aliquote di 1 mL deve essere conservato a-20 ° C.
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Soluzione di dissezione
- Per preparare 50 mL di soluzione di dissezione, aggiungere 500 µ l di BSA (10%) a 49,5 mL di zero Ca2 + PSS.
- Immediatamente dopo la preparazione, è possibile trasferire questa soluzione di dissezione in una capsula Petri per dissezione arteriosa.
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Soluzione di dissociazione
- Per preparare 50 mL di soluzione di dissociazione, aggiungere 5 µ l di CaCl2 (1m) e 500 µ l di BSA (10%) a 49,5 mL di zero Ca2 + PSS. Lasciare la soluzione a temperatura ambiente (TA).
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Enzimi
- Per digestione parziale dei segmenti arteriosi, preparare 1 mL di soluzione di digestione con papaina 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, collagenosi 0,75 mg/mL (miscela tipo H) e dell'elastasi 0,13 mg/mL.
Nota: Attività enzimatiche possono variare; Tuttavia, per i nostri protocolli di successo, le attività enzimatiche in commercio fornito sono state utilizzate come segue: papaina ≥ 10 unità/mg; collagenasi ≥ 1 unità/mg, per fatturato di substrato N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala o FALGPA; ed elastasi ≥ 5 unità/mg.
- Per digestione parziale dei segmenti arteriosi, preparare 1 mL di soluzione di digestione con papaina 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, collagenosi 0,75 mg/mL (miscela tipo H) e dell'elastasi 0,13 mg/mL.
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Preparazione di Fura-2 e agenti farmacologici
- Preparare la concentrazione d'archivio (1 mM) di Fura-2 tintura AM in DMSO. Preparare una concentrazione di lavoro (10 µM) aggiungendo 5 µ l di brodo a 495 µ l di PSS per il caricamento.
- Preparare ≥ 50 mL di concentrazioni di agenti farmacologici (ad es., ATP) di lavoro in PSS come appropriato.
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Lo svolgimento di soluzione
- Preparare lo svolgimento di una soluzione, 2 M KCl, sciogliendo KCl deionizzata H2O (7,455 g KCl in 50 mL di H2O).
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa da 0,22 µm prima del reinterro gli elettrodi taglienti.
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Ioduro di propidio (0,1%)
- Sciogliere 10 mg di ioduro di propidio liofilizzato in 10 mL di KCl M 2.
- Mescolare bene e conservare a TA.
3. la dissezione e l'isolamento dell'arteria cerebrale
Nota: Tutte le procedure di dissezione richiedono ingrandimento campione (fino a 50 x) via stereomicroscopi e illuminazione fornita da fonti di luce ottica della fibra. Per eseguire procedure di dissezione per l'isolamento delle arterie e cervello, utilizzare strumenti per la dissezione affilata. Microdissection strumenti per isolare e pulire le arterie includono affilate punta fine pinze e forbici di Allerød stile dissezione (3 a 9,5 mm lame).
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Isolamento di cervello di topo
- Anestetizzare una C57BL/6 mouse (3-30 mesi; maschi o femminile) tramite inalazione di isoflurane (3% per 2 – 3 minuti), poi decapitare l'animale immediatamente dopo completa induzione dell'anestesia. Posizionare la testa in una capsula Petri (diametro 10 cm, profondità 1,5 cm) contenenti freddo (4 ° C) zero Ca2 + PSS sotto un microscopio stereoscopico.
- Visualizzazione attraverso il microscopio, rimuovere la pelle e capelli sul cranio e rimuovere sangue eccessivo con freddo zero Ca2 + PSS. Fare un'incisione utilizzando solo le punte delle forbici per dissezione standard (ad es., lama 24 mm), inizia con l'osso occipitale e si estende fino attraverso l'osso nasale del cranio.
- Aprire il cranio con attenzione lungo l'incisione utilizzando pinze con la punta grossa e tessuto connettivo separato per isolare il cervello con un cerchio di Willis intatto.
Nota: In alternativa, Littauer osso-pinze possono essere utilizzate per aprire il cranio ed esporre il cervello. - Lavare delicatamente il cervello isolato con freddo zero Ca2 + PSS in un becher per rimuovere il sangue. Posizionare il lato ventrale del cervello rivolto verso l'alto in una camera contenente soluzione di dissezione freddo per l'isolamento delle arterie cerebrali (Figura 1A).
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Isolamento delle arterie cerebrali
Nota: Arteria cerebrale posteriore è stato selezionato come un modello di studio endoteliale cerebrovascolare rappresentativo per questo protocollo.- Proteggere il cervello isolato in soluzione fredda dissezione mediante perni in acciaio inox (diametro 0,2 mm, lunghezza ~ 11 – 12 mm) per essere inserito in un polimero di silicone carbone-infuso rivestimento del fondo (profondità ≥ 50 cm) di un vetro di Petri.
- Per mantenere una temperatura refrigerata di PSS durante la dissezione, è necessario utilizzare una camera di dissezione raffreddata da un sistema refrigerante continuamente in bicicletta una miscela di 1:1. acqua-etilene glicole. In alternativa, la dissezione può essere eseguita su ghiaccio fresco.
- Chirurgicamente isolare le arterie cerebrali posteriori (~0.3 a segmenti di 0,5 cm, nessuna tensione assiale) posteriore che comunica e arterie basilare mediante microdissezione strumenti Allerød stile forbici e affilato punta fine forcipe (Figura 1B ). Utilizzare perni in acciaio inox (diametro 0,1 mm, lunghezza ~ 13 – 14 mm) di sicuro entrambi isolato le arterie cerebrali posteriori della soluzione di dissezione in di Petri (Figura 1).
- Pulire accuratamente le arterie cerebrali posteriori isolate rimuovendo il tessuto connettivo usando il forcipe affilato punta fine (Figura 1). Tagliare le arterie intatte in segmenti (lunghezza 1 – 2 mm) per digestione enzimatica (Figura 1; inserto).
4. preparazione del tubo endoteliale e superfusione
Nota: Il tubo endoteliale è preparato come descritto in precedenza12, con le modifiche per l' arteria cerebrale6.
- Preparare l'apparato di triturazione utilizzando un microscopio dotato di obiettivi (10x, 20x e 40x), una fotocamera e una fase di alluminio che tiene una camera e micromanipolatori. Fissare una microsiringa con un regolatore della pompa adiacente al palco e campione (Figura 2A).
- Completamente backfill una triturazione pipetta con olio minerale e fissarlo sopra il pistone di micro-siringa. Quindi, usando la micro-siringa con regolatore della pompa, aspirare la soluzione di dissociazione nella pipetta (~ 130 nl) sopra l'olio minerale, garantendo nel contempo l'assenza di bolle d'aria nella pipetta.
- Posizionare i segmenti arteriosi intatti in 1 mL di soluzione di dissociazione in un tubo di vetro da 10 mL (Figura 2B), contenenti papaina 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, collagenosi 0,75 mg/mL e dell'elastasi 0,13 mg/mL. Incubare a 34 ° C per 10 – 12 min per digestione parziale.
- In seguito la digestione, sostituire la soluzione di enzima con ~ 5 mL di soluzione fresca di dissociazione. Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire un segmento in una camera contenente la soluzione di dissociazione a TA.
- Inserire la pipetta la soluzione di dissociazione nella camera e la posizione vicino a un'estremità della nave digerita. Impostare una velocità all'interno della gamma di 2 a 5 nL/s sul controller pompa per triturazione delicato (Figura 2; inserto).
- Durante la visualizzazione attraverso 100x ingrandimento 200x, prelevare ed espellere il segmento arterioso per dissociare le cellule di muscolo liscio, producendo un tubo endoteliale. Se necessario, accuratamente di utilizzare pinze a punta fine per separare adventitia dissociato e lamina elastica interna dal tubo endoteliale. Confermare che tutte le cellule di muscolo liscio sono dissociate e che rimangano solo endothelial cellule come un intatto "tubo" (Figura 2).
- Utilizzando micromanipolatori, fissare ciascuna estremità del tubo endoteliale nella distinta di copertura di vetro della camera di sopraffusione usando vetro borosilicato pinning pipette (Figura 2D).
- Sbiaditura dissociato adventitia e cellule di muscolo liscio dall'aula e sostituire la soluzione di dissociazione con 2 mM CaCl2 PSS. Trasferire la piattaforma mobile con tubo protetto endoteliale sul microscopio di sopraffusione e sperimentale rig.
- Utilizzare 6 serbatoi pulito 50 mL (Figura 3A) per una distribuzione continua di PSS e droga rispettive soluzioni durante l'esperimento, come appropriato. Utilizzare la valvola di controllo flusso inline per impostare manualmente la velocità di flusso in tutto come coerente con flusso laminare durante il flusso di alimentazione per aspirazione di vuoto di corrispondenza. Consegnare PSS all'alloggiamento (Figura 3B) per il superfusione del tubo endoteliale per ≥ 5 min prima di registrare i dati in background e tintura di caricamento.
5. carico dye, Wash-Out e impostazioni della temperatura
- Accendere tutti i componenti del sistema per la misurazione [Ca2 +]iofotometria. Utilizzare il microscopio sulla piattaforma sperimentale (Figura 3) per visualizzare la provetta endoteliale a 400 ingrandimenti e messa a fuoco sulle cellule nella finestra fotometrica utilizzando la suite di software di sistema di fotometria.
- Misurare il diametro del tubo endoteliale e registrare valori di autofluorescenza del fondo in accordo con 510 nm emissione durante l'eccitazione alternati a 340 e 380 nm (≥ 10 Hz).
- Per misurare [Ca2 +]ho risposte, carico il tubo endoteliale con Fura-2 AM tingere (concentrazione finale di 10 µM) a RT e consentire ~ 30 – 40 min in assenza di luce.
- Riavviare superfusione del tubo endoteliale con PSS fresco per circa 30 – 40 min di wash-out l'eccesso di colorante e consentire intracellulare Fura-2 AM a-esterificare. Durante il periodo di interruzione, aumentare la temperatura gradualmente da RT a 37 ° C con il regolatore di temperatura (Figura 3A) con un riscaldatore in linea, quindi mantenere a 37 ° C in tutto l'esperimento.
Nota: La transizione incrementale consigliata tra RT a 37 ° C comporta tre passaggi (ad es., 5 ° C) con un tempo di equilibramento ≥ 5 min ad ogni passo.
6. simultanea misurazione della [Ca2 +]i e Vm
- Accendere tutte le altre apparecchiature e la suite di software Elettrometro per misurare Vm (Vedi Figura 3, Figura 4). Regolare velocità di acquisizione dati di conseguenza (≥ 10 Hz).
- Tirare un elettrodo tagliente e backfill con 2 M KCl. Per gli studi di intercellulare accoppiamento tramite sublimazione, recupero informazioni i microelettrodi con ioduro di propidio 0,1% disciolto in 2 M KCl.
- Fissare l'elettrodo sopra un filo d'argento ricoperto in cloruro nel supporto pipetta attaccato ad una fase di testa Elettrometro fissata con un micromanipolatore. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare brevemente la punta dell'elettrodo in PSS che scorre nella camera durante la visualizzazione attraverso l'obiettivo 4x.
- Impostare il riposo Vm 0 come coerente con vasca a terra potenziale. Posizionare la punta dell'elettrodo di poco più di una cella del tubo endoteliale. Se lo si desidera, è possibile utilizzare monitoraggi di base acustico collegati a elettrometri per associare pitch del suono con registrazioni potenziali.
- Aumentare l'ingrandimento di 400 x utilizzando l'obiettivo 40x e riposizionare la punta dell'elettrodo come necessario. Modificare la finestra fotometrica usando il software di fotometria di concentrarsi sulle cellule endoteliali ~ 50 a 80.
- Delicatamente posizionare l'elettrodo in una delle cellule del tubo endoteliale utilizzando il micromanipolatore e ≥ 2 min per il riposo Vm stabilizzare l'ora. Allo stesso modo, è possibile inserire un secondo elettrodo in un'altra cella (distanza ≥ 100 µm) dalla prima cella impalata con primo elettrodo.
- Una volta Vm di riposo è stabile a suoi valori previsti (da -30 a -40 mV)6, accendere la PMT nell'interfaccia di fluorescenza in assenza di luce e iniziare acquisizione di intracellulare [Ca2 +]io di emozionante Fura-2 alternativamente (10 Hz) presso 340 e 380 nm, mentre la raccolta l'emissione di fluorescenza a 510 nm.
Nota: Alla prova intercellulare accoppiamento elettrico, corrente (± 0.5-3 nA, durata di impulso di s ~ 20) possono essere consegnati tramite uno Elettrometro come "Sito 1", e cambiamenti di Vm possono essere registrati con un altro Elettrometro come "sito 2" (distanza ≥ 100 µm). - Una volta che vengono stabilite misure simultanee di Vm e [Ca2 +]i , consentire ~ 5 min di superfusione del tubo endoteliale con PSS ad un tasso costante flusso laminare prima dell'applicazione di farmaci.
- Applicare il farmaco (ad es., ATP) preparato in PSS alla camera di sopraffusione con il tasso di flusso costante. Dopo circa 3 min (o un periodo di tempo appropriato per la cinetica del farmaco), lavare con PSS fino al Vm e il rapporto di380 F/f340tornare loro condizioni di base. Contrassegnare le rispettive registrazioni come temporalmente sincronizzato attraverso la suite di software fotometro ed Elettrometro durante ogni transizione di soluzioni.
- Una volta fatto l'esperimento, ritirare elettrodo dalla cella utilizzando il micromanipolatore e notare Vm ~ 0 mV a cui fa riferimento tramite l'elettrodo di vasca. Interrompere le rispettive registrazioni di Vm e [Ca2 +]i e salvare i record su file per l'analisi dei dati.
7. visualizzazione della cellula--cellula accoppiamento
- Per visualizzare la cellula--cellula accoppiamento tramite ioduro di propidio, utilizzare una x 40 o 60 x fluorescente obiettivo con un'apertura numerica relativamente elevata (ad es., 0.95) e filtro rodamina impostato con illuminazione allo stato solido, una fotocamera ad alta risoluzione (ad esempio, 16- megapixel) e una suite di software di imaging.
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Representative Results
La dimostrazione schematica del protocollo descritto sopra è illustrata nelle figure allegate. Un cervello isolato da un giovane maschio adulto C57BL/6N topo (5 mesi) è mostrato in Figura 1A. Arterie cerebrali posteriori sono accuratamente isolate dal cerchio di Willis, rimosso senza tessuto connettivo e tagliato in segmenti (Figura 1B-D). Da segmenti arteriosi parzialmente digeriti, il tubo endoteliale intatto è prodotta e assicurato il coprioggetto di vetro utilizzando pipette pinning. Dolce stretch meccanico è applicato usando due pipette pinning per approssimare la lunghezza lineare in vivo senza tortuosità del vaso. Questo è stato ulteriormente chiarito nel manoscritto (Figura 2A-D). Tubi endoteliali isolate da arterie cerebrali posteriori sono ~ 90 – 100 µm in larghezza e ≥ 300 µm di lunghezza. Il tubo viene caricato con Fura-2 AM seguita da wash-out con PSS. Misura simultanea della [Ca2 +]i e Vm nel tubo endoteliale è eseguita da fotometria2 + Ca così come sharp elettrofisiologia elettrodo (impianto di perforazione sperimentale mostrato in Figura 3 e Figura 4).
Valutazione funzionale del tubo endoteliale viene eseguita applicando un classico agonista di GPCR endoteliale quali ATP nella camera di flusso in condizioni fisiologiche. Come illustrato nella Figura 5, [Ca2 +]i e Vm sono registrati contemporaneamente in risposta all'ATP (100 µM). Un significativo hyperpolarization di Vm (≥ 5 mV) si verifica in concomitanza con un intracellulare [Ca2 +]io aumento, che indica che un aumento della [Ca2 +]io attiva SKCa/IK canali delCa e quindi permette di K+ efflusso attraverso la membrana plasmatica per produrre EDH. Prova di accoppiamento intercellulare mediante iniezione di corrente (± 0.5-3 nA, gli impulsi di s ~ 20) possono essere trovati nel nostro lavoro pubblicato di recente (riferimento6, figura 1). Si noti che lo ioduro di propidio ha una massa di ~ 668 Da in riferimento a secondi messaggeri, noto per il passaggio attraverso giunzioni di gap come inositolo trifosfato (IP3, ~ 420 Da), monofosfato di adenosina ciclico (cAMP, Da ~ 329).
Figura 1 : Isolamento dell'arteria cerebrale dal cervello. (A) cervello isolato con arterie intatte (freccia bianca indica l'arteria cerebrale posteriore) in soluzione di dessection. (B) Magnified Mostra dell'arteria cerebrale posteriore (freccia bianca; ~ 3 x vs. Pannello A). (C) isolato posteriore arterie cerebrali fissate con perni in acciaio inox in piatto esemplare. (D) posteriore arterie cerebrali dopo la rimozione dei tessuti connettivi. Inserto mostra tagliati segmenti delle arterie; Barra della scala = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Preparazione del tubo endothelial cerebrale. (A) attrezzature utilizzate per triturazione i segmenti arteriosi parzialmente digeriti; un = micromanipolatore, b = camera per la preparazione di tubo, c = fase in alluminio, d = microsiringa, e = microscopio, f = microsiringa regolatore della pompa. (B) i segmenti arteriosi (frecce bianche) in soluzione per digestione enzimatica. (C) tubi endoteliali preparati da triturazione; un = triturazione pipetta, b = tubo endoteliale intatte. Inserto Mostra il processo di triturazione per rimuovere adventitia e cellule di muscolo liscio; Barra della scala = 100 µm. (D) un tubo endoteliale intatto fissato nella distinta di coperchio di vetro con pipetta di blocco; un = pinning pipetta, b = intatto endothelial tubo con diametro di ~ 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Apparecchiature per sopraffusione e simultanea [Ca2 +] ho e V m misure. (A) Attrezzature per superfusione del tubo endoteliale e controllo della temperatura, un = ad alta intensità lampada ad arco di alimentazione, b = interfaccia di sistema a fluorescenza, c = regolatore di temperatura, d = sei-serbatoi del sistema sopraffusione, e = luce in fibra ottica fonti, f = posizionatore, g = hyperswitch del [Ca2 +]io fotometria sistema. Apparecchio di sopraffusione camera (B); un e b = headstages, c = elettrodo a terra, d = inline riscaldatore, e = tubazione sopraffusione, f = vuoto aspirazione, g = camera di sopraffusione, h = fase di alluminio che tiene la camera. (C) piattaforma sperimentale su un tavolo di isolamento delle vibrazioni; un adattatore di inquadratura = cellulare con fotocamera, b = microscopio luce, c = microscopio, d = fase in alluminio, e = micromanipolatore per controllo headstage, f = tabella di isolamento delle vibrazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Apparecchiature per elettrofisiologia e registrazione dei dati di funzionamento. un = oscilloscopio, b = generatore di funzioni, c = monitoraggio acustico della linea di base, d = filtro di rumore 50/60 Hz, e e f = elettrometri, g = sistema di acquisizione dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Simultanea [Ca2 +] ho e V m registrazioni. (A) contrasto differenziale di interferenza dell'immagine (400 x) di un tubo endoteliale arteriosa cerebrale del mouse regolata per esperimento nella finestra fotometrica usando un obiettivo 40x. Un elettrodo tagliente viene inserito in una cella, come mostrato nella parte superiore dell'immagine (freccia bianca). (B) tracce Raw per la misura simultanea di rapporto di F340/f380 (in alto) e Vm (in basso) in risposta all'ATP (100 µM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Alla luce dei recenti sviluppi6,15,16,17, ora dimostriamo il metodo per isolare endotelio arterioso cerebrale del mouse in preparazione per la misura simultanea della [Ca2 +] i e Vm sottostante EDH costantemente per ~ 2 h a 37 ° C. Anche se tecnicamente difficile, possiamo misurare la cellula--cellula che accoppiamento pure (Vedi riferimento6, figura 1). In questo modo, possiamo misurare discreti e condotto segnalazione eventi contemporaneamente. Per un conto delle problematiche generali isolando endotelio arterioso del mouse consultare riferimenti11,12. Diamo risalto a passaggi critici per isolare le arterie cerebrali del mouse, le nostre misurazioni particolare di endoteliale [Ca2 +]i e Vm, suggerimenti per la risoluzione dei problemi e considerazioni per metodi alternativi alla luce delle punti di forza/debolezza sperimentale qui sotto.
Arteria cerebrale posteriore richiede l'isolamento attenzione dal cerchio di Willis e tessuto connettivo senza danni al muscolo liscio e cellule endoteliali. Strumenti chirurgici (pinze e le forbici) dovrebbero essere adatti per procedure di dissezione di microcircolazione del mouse mantenendo con bordi taglienti, puliti. Relativa al muscolo scheletrico12, abbiamo ridotto il periodo di tempo per incubazione enzimatica di due terzi e le concentrazioni di papaina, collagenosi e dithioerythritol del mezzo, mentre l'aggiunta di uso di concentrazione empiricamente ottimizzata di elastasi. Per successo costante nell'isolamento dei tubi endoteliale arteriose cerebrale, è importante agli enzimi di ordine in lotti (2 a 4 fiale) da un fornitore altamente affidabile con pratiche di produzione coerente in accordo con la frequenza di uso e shelf-life. Anche con il potenziale per la variazione nell'attività enzimatica da un sacco di enzima per il prossimo, è suggerito che le concentrazioni negli enzimi mantenuto pur ottimizzando i tempi di digestione entro 10-12 min. Vale la pena notare che né il sesso né l'età dell'animale (3-30 mesi) è stato un ostacolo significativo alla preparazione di endotelio isolato dalle arterie cerebrali nella nostra esperienza. Pertanto, si raccomanda che la composizione dell'enzima cocktail e tempo di digestione degli enzimi rimangono invariati in studi su età e sesso.
Come sottolineato, attenzione è richiesta durante la triturazione delicato e isolamento dell'endotelio da adventitia e cellule di muscolo liscio fusiformi al fine di evitare di danneggiare le cellule endoteliali12. Per la fase di triturazione, l'olio minerale viscoso serve come mezzo di idraulico tra il pistone della siringa-micro e il PSS acquoso al fine di ritirare o espellere i segmenti vascolari inondate di PSS. Si noti che se il segmento di vaso a contatto con l'olio minerale, questo passaggio deve essere ripetuto utilizzando una pipetta pulita triturazione con sequenza reinterro di olio minerale e PSS. Prima di un esperimento, è consigliabile che una lunghezza approssimativamente lineare in vivo deve essere ripristinato il tubo endoteliale per quanto possibile, per cui le singole celle assumono una morfologia "casalinghi", longitudinale (ad es., diametro ~ 5 µm; lunghezza ~ 100 µm; spessore ~0.5 µm)8. Tuttavia, la tensione assiale non deve essere applicato nella misura dove le cellule ai bordi del provino sono tirando lontano da sotto il rispettivi blocco pipette e quindi compromettere stabilità meccanica per misurazioni affidabili cellulare durante il esperimento.
La fotometriche [Ca2 +]io sistema utilizzato in questa tecnica di misura è adatto per misurazioni continue di endoteliale [Ca2 +]i utilizzando raziometrici tintura Fura-2. Singoli protocolli possono durare in genere ≥ 10 min senza significativi photobleaching. Inoltre, usiamo comunemente questo approccio per la misurazione [Ca2 +]io perché è favorevole alla tempestive pause nella frequente movimento degli obiettivi del microscopio come necessario per garantire degli elettrodi affilati per misurem V e acquisizione dati. Si noti che questo è un approccio fotometrico che cattura solo globale, una media di [Ca2 +]io tra più celle. In generale, per [Ca2 +]io le misure, si consiglia di fotometria per la caratterizzazione iniziale delle risposte delle cellule endoteliali agli agenti farmacologici (es., corso di tempo di picco e plateau fasi) garantendo piani per procedere per quantificare microdomain segnalazione eventi mediante microscopia confocale o multifotonica standard12,23.
L'approccio di elettrofisiologia elettrodo tagliente è favorevole per le registrazioni dim V integrate nelle preparazioni multicellulari fisiologici. La misura di intracellulare Vm è di gran lunga il più tecnicamente impegnativo con numerosi passaggi critici che possono facilitare o cancellare il successo delle misure. In primo luogo, lo sperimentatore deve determinare le condizioni del programma ottimale su un estrattore di vetro per la produzione costantemente degli elettrodi affilati con una resistenza di punta di ~ 150 ± 30 MΩ. Utilizzando un test di rampa di calore filamento lettura come riferimento, è consigliabile che lo sperimentatore determinare parametri empiricamente, soprattutto per quanto riguarda la variazione nell'impostazione "calore" massimizzando il tempo di tirare. Prossima, meccanica stabilità del micromanipolatori, headstages, titolari di pipetta ed esemplare è assolutamente fondamentale. A parte l'evidente necessità per una tabella di isolamento delle vibrazioni, lo sperimentatore dovrà assicurarsi che tutti i raccordi siano saldi e che l'area palco intorno e sotto i manipolatori sia pulito. Idealmente, rumore estraneo dovrebbe essere ridotto nella misura in cui la risoluzione delle registrazioni di elettrodo tagliente è all'interno di 1 mV. Nella nostra esperienza, la più comune fonte di rumore è il filo d'argento fissato nel supporto pipetta che ha bisogno di un rivestimento di cloruro sufficiente o la sostituzione del tutto. Se il rumore a 50/60 Hz comune è presente, "hum silenziamento" tecnologia possa essere usata e viene fornita di serie con un elettrometro di moderno. Se il rumore viene visualizzata completamente ingestibile, controllare per vedere se c'è una perdita nel bagno o overflow dove PSS entrerà in contatto con le resistenze per controllo della temperatura. Se le complicazioni rimangono con l'acquisizione di un segnale stabile dim V, verificare l'integrità dei cavi elettrici e connettori a t.
Complessivamente, se stabilire che una registrazione di elettrodo tagliente ha esito negativo, è comunemente dovuto un elettrodo inappropriato, instabilità meccanica o scarsa salute cellulare. In alternativa, lo sperimentatore può anche prendere in considerazione una configurazione della tecnica del patch-clamp su celle individuali, elettricamente disgiunti dove possono essere ottenuti informazioni su registrazioni di canali singolo ione e cellule intere correnti. Anche se di fronte alle sfide generale dell'utilizzo di un colorante fluorescente (per esempio carico intracellulare eterogenea di, , imbianchimento, calibrazione utilizzando ionofori, rilevamento modesta risoluzione), tensione-sensibili coloranti come Di-8-ANEPPS sono anche disponibili in commercio.
La nostra comprensione dell'endotelio nella regolazione del flusso sanguigno a e in tutto il cervello è cruciale con un rapido invecchiamento della popolazione umana e la crescente incidenza di malattie croniche cardiovascolari e neurodegenerative. Quindi, mettiamo a disposizione un metodo per l'isolamento di endotelio intatto da una vitale arteria cerebrale, che può essere adattata ad altre strutture vascolari del cervello. Inoltre, ci mostra un approccio utile per la misura simultanea di sottostante [Ca2 +]i e Vm. Infine, utilizzando elettrodi intracellulari dual, cellula--cellula che accoppiamento attraverso giunzioni gap può essere valutato anche. Con interventi farmacologici e/o genetici attentamente pianificati, l'attuale protocollo ragionevolmente e quantitativamente comprende lo studio della funzione endoteliale cerebrale nella sua forma nativa. La nostra aspettativa è che gli sperimentatori costruirà da e adattare queste informazioni per avanzare di Neuroscienze e biologia vascolare in generale. In particolare, sarebbe soddisfacente vedere lotte sperimentale comuni coinvolti con misure elettriche minimizzate complessivamente. Anche se questo protocollo non è un insieme autonomo di tecniche con qualsiasi mezzo, può essere utilizzato come un approccio complementare per determinare precisamente come endoteliale determinanti biofisiche traducono in cambiamenti nella resistenza vascolare e come essi perfezionare il regolamento di flusso sanguigno rispetto condizioni rappresentative di salute malattia vs. .
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo Charles Hewitt per l'eccellente assistenza tecnica durante la creazione di attrezzature e forniture necessarie per i protocolli attuali. Ringraziamo la d. ssa Sean M. Wilson e Christopher G. Wilson, dal centro per biologia perinatale, LLU per averci fornito un ulteriore microscopio invertito e l'elettrometro, rispettivamente. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) e nuovi fondi di Start-up facoltà di Loma Linda University School of Medicine. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Elastase | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
| Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
References
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