Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

قياسات متزامنة من الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات غشاء في البطانة الدماغي الماوس معزولة طازجة وسليمة

doi: 10.3791/58832 Published: January 20, 2019

Summary

تظاهر هنا بروتوكولات لعزل (1) طازجة غشائي الدماغية سليمة "أنابيب" والقياسات (2) المتزامنة من الكالسيوم بطانية وغشاء المحتملة خلال المستمدة من البطانة فرط الاستقطاب. علاوة على ذلك، تسمح هذه الأساليب لضبط الدوائي الكالسيوم غشائي الخلايا والإشارات الكهربائية كمتغيرات تجريبية فردية أو التفاعلية.

Abstract

شرايين المخ وعلى دوران الأوعية الدقيقة الخاصة بكل منها تسليم الأوكسجين والمواد المغذية إلى الدماغ عن طريق تنظيم تدفق الدم. خلايا بطانية خط التجويف الأوعية الدموية والتغييرات الأمر في قطر الأوعية الدموية اللازمة لتلبية الطلب على التمثيل الغذائي للخلايا العصبية. عادة ما تعمل الابتدائي غشائي تعتمد على مسارات إشارات من فرط الاستقطاب غشاء المحتملة (تم) وأكسيد النيتريك في نفس الوقت التوسط من أجل توسع الأوعية ومن ثم زيادة تدفق الدم. على الرغم من أن جزءا لا يتجزأ من تنسيق توسع الأوعية عبر عدة ملليمترات من طول الأوعية الدموية، كان من الصعب تاريخيا لقياس مكونات المستمدة من البطانة فرط الاستقطاب (إده). هذه المكونات من إده تنطوي داخل الخلية Ca2 + [Ca2 +]أنا يزيد والتنشيط اللاحقة للصغيرة-والمتوسط الموصلية Ca2 +-تنشيط ك+ (كورونا/IKCaCa) القنوات.

وهنا، نقدم مثالاً مبسطة لعزله البطانة الطازجة من الماوس الشرايين الدماغية؛ قياسات متزامنة غشائي [Ca2 +]أنا والخامسم استخدام Fura-2 قياس الضوء واقطاب حادة داخل الخلية، على التوالي؛ ومن سوبيرفوسيون مستمر لحلول الملح ووكلاء الدوائية في ظل الظروف الفسيولوجية (درجة الحموضة 7.4، 37 درجة مئوية). تتم إزالة الشرايين الدماغية الخلفية من "دائرة ويليس" مجاناً للاتصال اللاحق والشرايين باسيلار. ويسهل الهضم الأنزيمي لتنظيف القطع الشرياني الدماغي الخلفي واللاحقة تريتوريشن إزالة والبرانية وارتشاح الأعصاب وخلايا العضلات الملساء. الناتج الخلفي الدماغي الشرياني بطانية "أنابيب" ثم يتم تأمينها تحت مجهر ودرست باستخدام كاميرا، وأنبوب ضوئي، اليكتروميتيرس واحدة واثنين في حين ظل سوبيرفوسيون المستمر. جماعياً، في نفس الوقت يمكن قياس هذا الأسلوب التغييرات في غشائي [Ca2 +]أنا و الخامسم في مواقع الخلوية منفصلة، بالإضافة إلى انتشار إده عن طريق تقاطعات الفجوة حتى مسافات ملليمتر على طول حالها البطانة. هذا الأسلوب من المتوقع أن تسفر عن إجراء تحليل الفائق لمهام غشائي الدماغية الكامنة وراء آليات لتنظيم تدفق الدم في المخ العادي والمريضة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وينظم تدفق الدم في جميع أنحاء الدماغ تنسيق توسع الأوعية بين شرايين المخ والشرايين في شبكات الأوعية الدموية1. خلايا بطانية بطانة الشرايين المقاومة الدماغية الأمر التغييرات في قطر الأوعية الدموية حسب الحاجة لتلبية الطلب الأيضية للخلايا العصبية1،،من23. خلال فرط الاستقطاب المستمدة من البطانة (المعروفة عموما باسم إده)، على وجه الخصوص، كاليفورنيا داخل الخلية2 + ([Ca2 +]أنا) والإشارات الكهربائية في خلايا بطانية توسع الأوعية تنسيق بين خلايا بطانية وبهم خلايا العضلات الملساء المحيطة بها من خلال تقاطعات الفجوة للاسترخاء الشرايين4. الفسيولوجية بدء إده تسلسلياً يستلزم تنشيط ز-إلى جانب المستقبلات (جبكرس)، زيادة في [Ca2 +]أنا، وتفعيل البطانية الصغيرة والمتوسطة Ca2 +-تنشيط ك+ (/IK كوروناالمرجع المصدقCa) القنوات هايبربولاريزي غشاء بطانة الأوعية الدموية الدماغية المحتملة (تم)5،،من67. وهكذا، العلاقة الحميمة غشائي [Ca2 +]أنا والخامسم جزء لا يتجزأ من تنظيم تدفق الدم ولا غنى عنه للقلب-والأوعية الدماغية وظيفة6،8. في جميع أنحاء الأدب أوسع نطاقا، والعديد من الدراسات أفادت رابطة خلل الأوعية الدموية غشائي مع تطور الأمراض المزمنة (مثل ارتفاع ضغط الدم، والسكري، قصور القلب، مرض الشريان التاجي، الفشل الكلوي المزمن، أمراض الشرايين الطرفية)9،10، مما يشير إلى أهمية دراسة الدالة غشائي في الظروف الفسيولوجية وكذلك المرضية.

البطانة الوعائية جزء لا يتجزأ من الإنتاج من فرط الاستقطاب، وتوسع الأوعية، ونضح الأنسجة وهكذا، دراسة خصائصه الخلوية الأصلية الحاسمة. كنموذج دراسة عامة، تم نشر إعداد نموذج أنبوب غشائي الشرياني الماوس قبل للهيكل العظمى والعضلات11،12،13من القناة الهضمية،14من الرئة، ومؤخرا ل الدماغ6. خاصة نشرت دراسات متزامنة [Ca2 +]أنا وقياساتm V للهيكل العظمى والعضلات البطانة الشريانية15،16 ، فضلا عن سفينة اللمفاوية البطانة17. وبالإضافة إلى الدراسات الأولية استخدام النهج أنبوب غشائي، يمكن الاطلاع على استعراض شامل لمزايا وعيوب8 تحديد ما إذا كانت هذه الأداة التجريبية المناسبة لدراسة محددة. باختصار، هي ميزة الاحتفاظ بالعناصر الفسيولوجية الرئيسية لوظيفة الخلايا البطانية (مثل، Ca2 + تدفق وإطلاق سراح داخل الخلايا، فرط الاستقطاب Vم تصل إلى الإمكانات] [نرنست] ك+ عن طريق كورونا/IKCaCa التنشيط، واقتران بين الخلايا البطانية عن طريق تقاطعات الفجوة) دون التباس عوامل مثل ارتشاح الأعصاب الإدخال ووظيفة القناة عن طريق بوابة الجهد العضلات الملساء وكونتراكتيليتي، دوران الدم، والتأثيرات الهرمونية8. وفي المقابل، نهج ثقافة الخلية المستخدمة عادة إدخال تعديلات هامة في مورفولوجيا18 وأيون قناة التعبير19 في طريقة إلى حد كبير يمكن أن تعتم مقارنات للملاحظات الفسيولوجية التي تحدد السابقين فيفو أو في فيفو. وتشمل القيود الافتقار إلى التكامل مع المكونات الأخرى الضرورية لتنظيم تدفق الدم، مثل العضلات الملساء والمرونة مقيدة في وضع جدول زمني تجريبية، كما يتم اختبار هذا النموذج الأمثل ضمن ح 4 من عزلة الجزء الأوعية الدموية سليمة من هذا الحيوان.

بناء من بروتوكول فيديو سابق من تأليف سوتشا وسيجال12 ومستجدات التجريبية المؤقتة6،،من1516، نثبت هنا عزلة البطانة جديدة من شرايين المخ الخلفي وقياسات متزامنة غشائي [Ca2 +]أنا والخامسم استخدام Fura-2 قياس الضوء واقطاب حادة داخل الخلية، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تستلزم هذه التجربة سوبيرفوسيون المستمر لحلول الملح ووكلاء الدوائية خلال الظروف الفسيولوجية (درجة الحموضة 7.4، 37 درجة مئوية). لقد اخترنا الشريان الدماغي الخلفي، كما غلة البطانة معزولة مع السلامة الهيكلية (الخلايا إلى جانب من خلال تقاطعات الفجوة) ويكفي الأبعاد (العرض إيه فايف زيرو ميكرومتر، طول إيه ثري زيرو زيرو ميكرومتر) قابلة لداخل وبين الخلايا مما يشير إلى طول وبين خلايا بطانية. وبالإضافة إلى ذلك، تمثل إلى حد كبير في الأدب دراسات الشريان الدماغي الخلفي القوارض وتشمل دراسة آليات إرسال الإشارات غشائي الأساسية والأوعية الدموية التنمية/الشيخوخة، وعلم الأمراض20، 21 , 22-ومن المتوقع أن تسفر عن إجراء تحليل الفائق للدالة غشائي الدماغي (والخلل) هذا التطبيق التجريبي وسيسمح ذلك لأوجه التقدم الكبير في الفهم لتنظيم تدفق الدم في جميع أنحاء الشيخوخة وتطور المرض الأعصاب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

قبل إجراء التجارب التالية، ضمان استخدام جميع أنواع الرعاية الحيوانية وبروتوكولات وافق "المؤسسية رعاية الحيوانات" واستخدام اللجنة (IACUC) والقيام بها في اتفاق مع "المجلس الوطني للبحوث" في ''دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية'' (8th الطبعة، 2011)، والمبادئ التوجيهية سيصلون. إياكوك من جامعة لوما ليندا قد وافق جميع البروتوكولات المستخدمة لهذه المخطوطة للذكور والإناث من الفئران C57BL/6 (العمرية: مو 3 إلى 30).

1-معدات ومواد

ملاحظة: يمكن الاطلاع على تفاصيل المواد المطلوبة للبروتوكول في الجدول للموادأو المواد الكاشفة، وكتيبات أو المواقع المرتبطة مع البائعين الخاصة بكل منها.

  1. الدائرة تدفق
    1. ربط غرفة سوبيرفوسيون مع قاع ساترة زجاجية في منصة ألومنيوم المؤكسد. تأمين المنصة مع الدائرة إلى مرحلة اتفاق ألومنيوم.
    2. تعيين ميكرومانيبولاتور في نهاية كل من المنصة على المسرح الألومنيوم لعقد ماصة التثبيت.
      ملاحظة: كخيار عملي، استخدم هذا الجهاز مرحلة قابلة للتحويل مع وحدة دائرة تدفق المضمونة لتسهيل الانتقال من العزلة لأنبوب غشائي لأداء التجارب.
  2. المجاهر
    1. استخدام ستيريوميكروسكوبيس (5 x لنطاق التكبير x 50) مجهزة بالألياف البصرية مصادر الضوء لإجراءات تشريح الكلي والجزئي.
    2. لإعداد أنابيب بطانية، استخدم مجهر مقلوب مجهزة بمرحلة التباين أو فرق التدخل التباين (DIC) متوافق مع أهداف (10 x و 20 x و 40 x) ومرحلة ألومنيوم.
    3. لعزل أنابيب غشائي من الأوعية الدموية هضمها جزئيا، وضع وحدة تحكم مضخة ميكروسيرينجي المتاخمة لجهاز إعداد أنبوب غشائي.
    4. للجهاز التجريبي، واستخدام مجهر مقلوب مزودة بأهداف قياسية (4 x و 10 x) بالإضافة إلى أهداف الفلورسنت (20 x و 40 x, الفتحة العددية 0.75) ومرحلة ألومنيوم دليل على طاولة عزل الاهتزازات.
  3. معدات التسجيل داخل الخلايا
    1. لسجل تم من خلايا بطانية في أنابيب معزولة بطانية، تتصل في الكترومتر هيدستاجي متوافقة. إذا لزم الأمر، بتوصيل مولد دالة أو مشجعا الكترومتر للتجارب التي تتطلب الحقن الحالية.
    2. قم بتوصيل النواتج مكبر للصوت لنظام الحصول على بيانات ورصد خط الأساس مسموعة والذبذبات. تأمين مسرى مرجع (Ag/AgCl بيليه) قرب مخرج الدائرة التدفق خلال التجارب.
    3. استخدام نظام القياس الضوئي مع مكونات متكاملة الأسفار نظام واجهة أو عالية الكثافة مصباح القوس والسلطة إمدادات، هايبرسويتش، أنبوب ضوئي (أو PMT)، وكاميرا لقياس [Ca2 +]أنا في خلايا بطانية.
    4. استخدام وحدة تحكم درجة حرارة مزودة سخان مضمنة لرفع والحفاظ على درجة حرارة فسيولوجية (37 درجة مئوية) في جميع أنحاء هذه التجربة.
    5. استخدام منصة 6-الخزان متصل بوحدة تحكم صمام مع صمام تحكم تدفق مضمنة للتحكم في تقديم الحلول الخاصة بكل منها لأنبوب غشائي المضمونة في الدائرة.
  4. ميكروبيبيتيس واقطاب حادة
    ملاحظة: لتصنيع الماصات تريتوريشن وميكانيكية تثبيت أنابيب معزولة بطانية، استخدم ساحبة إلكترونية لسحب الماصات والصغير-فورج لكسر وإطلاق النار التلميع.
    1. لفصل والبرانية والعضلات الملساء وأنبوب غشائي من الجزء الشرياني هضمها جزئيا، إعداد تريتوريشن الماصات (كل منها قطر الحافة داخلية من 80 – 120 ميكرون) حسب الاقتضاء، استخدام أنابيب زجاج البورسليكات الشعرية، وإطلاق النار البولندية في التلميح.
    2. لتأمين أنبوب غشائي ضد الجزء السفلي من الدائرة سوبيرفوسيون، استخدام الماصات التثبيت مع نهاية يتثلم، كروية (الحرارة-مصقول، التطوير التنظيمي من 100-150 ميكرومتر؛ أعد من أنابيب رقيقة الجدار البورسليكات الزجاج).
    3. أن سجل تم خلية بطانية، إعداد أقطاب حادة مع مقاومة نصيحة ~ 150 ± 30 MΩ من الزجاج الأنابيب الشعرية باستخدام ساحبة إلكترونية.

2-إعداد الحلول والأدوية

  1. الحل الملح الفسيولوجية (PSS)
    1. للحصول على تجربة واحدة مع المخدرات الاستعدادات، وإعداد الحد أدنى من 1 لتر من استخدام PSS: 140 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 2 مم كاكل2، 1 مم مجكل الجلوكوز2، 10 حمض N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic (حبيس)، و 10 ملم.
    2. لإعداد الحلول المطلوبة للتشريح، تعد العزلة الشريان الدماغي، وإعداد من أنبوب غشائي، PSS تفتقر كاكل2 (صفر Ca2 + PSS).
    3. إعداد كافة الحلول في عالي النقاوة منزوع ح2س وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وتعقيم لهم من خلال عامل تصفية (حجم المسام 0.22 ميكرومتر) وكفالة osmolality الحلول بين موسم 290 و 300.
      ملاحظة: ويمكن تخزين الحلول عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين تقريبا.
  2. ألبومين المصل البقري 10% (BSA)
    1. لإعداد جيش صرب البوسنة 10%، يذوب 1 غ مسحوق المجففة بالتبريد في كوب من 10 مل صفر Ca2 + PSS.
    2. تغطية الكأس بالفيلم البارافين والسماح لمدة عدة ساعات لتمرير، مع التحريك البطيء لجيش صرب البوسنة حل.
    3. تصفية الحل النهائي باستخدام حقنه 10 مل بالإضافة إلى عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وجعل 1 مل مختبرين لتخزينها في-20 درجة مئوية.
  3. تشريح الحل
    1. لإعداد 50 مل من محلول التشريح، إضافة 500 ميليلتر لجيش صرب البوسنة (10%) إلى 49.5 مل من الصفر Ca2 + PSS.
    2. فورا بعد التحضير، نقل هذا الحل تسلخ في طبق بتري لتشريح الشرايين.
  4. حل الانفصال
    1. لإعداد 50 مل من محلول الانفصال، إضافة 5 ميليلتر كاكل2 (1 م) و 500 ميليلتر لجيش صرب البوسنة (10 في المائة) إلى 49.5 مل من الصفر Ca2 + PSS. تسمح حل للجلوس في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. الإنزيمات
    1. الهضم الجزئي شرائح الشرياني، إعداد 1 مل من محلول الهضم مع غراء 0.31 ملغم/مل ديثيوريثريتول 0.5 ملغ/مل، 0.75 ملغ/مل كولاجيناز (ح نوع المزج) و elastase 0.13 مغ/مل.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف نشاطات الإنزيم؛ ومع ذلك، لدينا بروتوكولات ناجحة، نشاطات الإنزيم المتوفرة تجارياً استخدمت على النحو التالي: وحدات إيه وان زيرو غراء/ملغ؛ وحدات إيه وان كولاجيناز/ملغ، لدوران الركيزة N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala أو فالجبا؛ و elastase ≥ 5 وحدات/mg.
  6. إعداد Fura-2 ووكلاء الدوائية
    1. إعداد تركيز المخزون (1 ملم) Fura-2 صباحا صبغ في [دمس]. إعداد تركيز عامل (10 ميكرون) بإضافة 5 ميليلتر للأوراق المالية إلى ميليلتر 495 من PSS للتحميل.
    2. إعداد مل إيه فايف زيرو من العامل تركيزات وكلاء الدوائية (مثل ATP) في PSS حسب الاقتضاء.
  7. إجراء الحل
    1. التحضير إجراء الحل، 2 م بوكل، بتذويب بوكل في منزوع ح2س (ز 7.455 بوكل في 50 مل ح2س).
    2. تصفية الحل من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر قبل ردمها أقطاب كهربائية حادة.
  8. يوديد Propidium (0.1%)
    1. حل 10 مغ يوديد propidium المجففة بالتبريد في 10 مل 2 م بوكل.
    2. يخلط جيدا وتخزينها في الرايت

3-تشريح والعزلة الشريان الدماغي

ملاحظة: تتطلب جميع إجراءات تشريح العينة التكبير (تصل إلى 50 س) عبر ستيريوميكروسكوبيس والإضاءة المقدمة من الألياف البصرية مصادر الضوء. لتنفيذ إجراءات تشريح لعزل الدماغ والشرايين، استخدام أدوات تشريح شحذ. وتشمل أدوات ميكروديسيكشن لعزل وتنظيف الشرايين شحذ الملقط الجميلة ذات الرؤوس و Vannas نمط تشريح المقص (شفرات 3 إلى 9.5 مم).

  1. عزل الدماغ الماوس
    1. تخدير ماوس (3-30 شهرا القديمة؛ وذكر أو أنثى) C57BL/6 عن طريق استنشاق إيسوفلوراني (3% لمدة 2-3 دقائق)، ثم قطع رأس الحيوان مباشرة بعد الاستقراء التام للتخدير. وضع رأسه في طبق بتري (قطرها 10 سم، عمق 1.5 سم) تحتوي على الباردة (4 درجة مئوية) صفر Ca2 + PSS تحت ستيريوميكروسكوبي.
    2. عرض من خلال المجهر، قم بإزالة الجلد والشعر على الجمجمة والدم المفرط مع الباردة صفر Ca2 + PSS. جعل شق استخدام فقط نصائح مقص تشريح القياسية (مثل شفرة 24 ملم)، بدءاً بعظم قذالي وتمتد حتى عبر عظم الآنف في الجمجمة.
    3. فتح الجمجمة بعناية على طول شق استخدام الملقط الخشنة ذات الرؤوس، والنسيج الضام منفصلة لعزل الدماغ مع "دائرة ويليس" سليمة.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن استخدام الملقط العظام-قطع ليتاوير لفتح الجمجمة وفضح الدماغ.
    4. تغسل بلطف الدماغ معزولة مع الباردة صفر Ca2 + PSS في كوب لإزالة الدم. ضع الجانب البطني الدماغ التي تواجه في دائرة التي تحتوي على الحل تشريح البارد لعزل الشرايين الدماغية (الشكل 1A).
  2. عزل الشرايين الدماغية
    ملاحظة: وقد اختيرت الشريان الدماغي الخلفي كنموذج دراسة غشائي المخية ممثلة لهذا البروتوكول.
    1. تأمين الدماغ معزولة في تشريح الباردة الحل باستخدام دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ (قطرها 0.2 مم، طول ~ 11 – 12 ملم) إدراجها في بوليمر سليكون غرست الفحم طلاء الجزء السفلي (عمق إيه فايف زيرو سم) من الزجاج طبق بيتري.
    2. للحفاظ على درجة حرارة المبرد من PSS خلال التشريح، استخدام دائرة تشريح تبريد بنظام التبريد بشكل مستمر ركوب الدراجات مزيج الماء 1:1-إثيلين غليكول. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء تشريح على الجليد جديدة.
    3. عزل جراحيا الشرايين الدماغية الخلفي (~0.3 إلى شرائح 0.5 سم، لا التوتر المحوري) من الاتصال اللاحق والشرايين باسيلار استخدام مقص نمط Vannas الصكوك ميكروديسيكشن وشحذ الملقط مقلوب غرامة (1B الشكل ). استخدام دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ (قطرها 0.1 ملم، طول ~ 13 – 14 مم) لتأمين كل معزولة الشرايين الدماغية الخلفية في الحل تسلخ في طبق بتري (الشكل 1).
    4. تنظيف الشرايين الدماغية الخلفية معزولة بعناية عن طريق إزالة النسيج الضام استخدام الملقط شحذ مقلوب غرامة (الشكل 1). قطع شرايين سليمة إلى شرائح (طول 1 – 2 مم) الهضم الأنزيمي (الشكل 1؛ واقحم).

4-إعداد أنبوب غشائي وسوبيرفوسيون

ملاحظة: أنبوب غشائي مستعدة كما هو موضح سابقا،12مع بعض التعديلات ل الشريان الدماغي6.

  1. إعداد جهاز تريتوريشن استخدام مجهر مزودة بأهداف (10 x و 20 x و 40 x)، وكاميرا، ومرحلة ألومنيوم عقد دائرة وميكرومانيبولاتورس. تأمين ميكروسيرينجي مع وحدة تحكم مضخة بجوار المرحلة والعينة (الشكل 2A).
  2. تماما الردم تريتوريشن "الماصة؛" مع الزيوت المعدنية وتأمينه على المكبس الصغير-المحاقن. ثم، استخدام مايكرو-المحاقن مع وحدة تحكم المضخة، سحب الحل الانفصال في الماصة (~ 130 nl) على رأس الزيوت المعدنية مع ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في الماصة.
  3. ضع شرائح الشرايين سليمة إلى 1 مل من محلول الانفصال في أنبوب زجاج 10 مل (الشكل 2)، الذي يحتوي على غراء 0.31 ملغم/مل ديثيوريثريتول 0.5 ملغ/مل، كولاجيناز 0.75 ملغ/مل و elastase 0.13 مغ/مل. احتضان في 34 درجة مئوية لمدة 10 – 12 دقيقة لهضم جزئي.
  4. وبعد عملية الهضم، يستعاض الحل إنزيم ~ 5 مل من محلول الانفصال من جديد... باستخدام ماصة 1 مل، نقل قطعة واحدة في دائرة التي تحتوي على الحل الانفصال في الرايت
  5. ضع الماصة في الحل الانفصال في الدائرة ووضعه قريبا من نهاية واحد من السفينة هضمها. تعيين معدل ضمن المجموعة من 2 إلى 5 nL/s على وحدة تحكم المضخة للطيف تريتوريشن (الشكل 2؛ واقحم).
  6. أثناء عرض عن طريق x 100 إلى 200 x التكبير، سحب وإخراج الجزء الشرياني فصل خلايا العضلات الملساء بينما تنتج أنبوب غشائي. إذا لزم الأمر، بعناية استخدام الملقط مقلوب الجميلة لفصل والبرانية منفصلان والصفيحة المرنة الداخلية من أنبوب غشائي. تأكد من أنه يتم فصل جميع خلايا العضلات الملساء وبقاء خلايا بطانية فقط سليمة "أنبوب" (الشكل 2).
  7. باستخدام ميكرومانيبولاتورس، تأمين كل نهاية أنبوب غشائي في كشف غطاء الزجاج في دائرة سوبيرفوسيون باستخدام زجاج البورسليكات يعلقون الماصات (الشكل 2D).
  8. المياه والصرف الصحي فصل والبرانية وخلايا العضلات الملساء من الدائرة واستبدال الحل الانفصال مع 2 مم كاكل2 PSS. نقل منصة متنقلة مع أنبوب غشائي المضمون على مجهر تلاعب سوبيرفوسيون والتجريبية.
  9. استخدام الخزانات نظيفة 50 مل 6 (الشكل 3A) لتسليم المستمر من PSS والمخدرات كل الحلول خلال التجربة، حسب الاقتضاء. استخدام صمام تحكم تدفق المضمنة يدوياً لتعيين معدل التدفق في جميع أنحاء متسقا مع الاندفاق الصفحي بينما مطابقة تدفق آر لشفط فراغ. تسليم PSS للدائرة (الشكل 3B) سوبيرفوسيون أنبوب غشائي ل ≥ 5 دقائق قبل تسجيل البيانات الخلفية وصبغ تحميل.

5-صبغ الحمولة، من المياه والصرف الصحي، وضبط درجة الحرارة

  1. قم بتشغيل كافة مكونات نظام قياس الضوء لقياس [Ca2 +]أنا. استخدام المجهر على تلاعب التجريبية (الشكل 3) لعرض أنبوب غشائي في 400 x التكبير، والتركيز على الخلايا الموجودة في النافذة الضوئية باستخدام برمجيات نظام قياس الضوء.
  2. قياس قطر أنبوب غشائي وتسجيل قيم أوتوفلوريسسينسي الخلفية في اتفاق مع 510 نانومتر الانبعاثات أثناء الإثارة المناوب في 340 و 380 نانومتر (إيه وان زيرو هرتز).
  3. لقياس [Ca2 +]أنا الردود، أنا صبغ (10 ميكرون تركيز النهائية) في الرايت تحميل أنبوب غشائي مع Fura-2 والسماح ~ 30 – 40 دقيقة في الغياب الضوء.
  4. قم بإعادة تشغيل سوبيرفوسيون أنبوب غشائي مع PSS الطازجة ل ~ 30 – 40 دقيقة للمياه والصرف الصحي بالزائدة صبغ والسماح بداخل الخلايا Fura-2 صباحا لإزالة استيريفي. خلال الفترة من المياه والصرف الصحي، رفع درجة الحرارة تدريجيا من الرايت إلى 37 درجة مئوية باستخدام وحدة تحكم درجة الحرارة (الشكل 3A) مع سخان مضمنة، ثم الحفاظ على 37 درجة مئوية طوال التجربة.
    ملاحظة: يستلزم الانتقال الإضافية الموصى بها بين RT إلى 37 درجة مئوية ثلاث خطوات (مثلاً، 5 درجة مئوية) مع فترة الموازنة دقيقة إيه فايف في كل خطوة.

6-واحد قياس [Ca2 +]أنا والخامسم

  1. قم بتشغيل جميع معدات وبرمجيات الكترومتر لقياس Vm (انظر الشكل 3، الرقم 4). ضبط معدل اقتناء البيانات تبعاً لذلك (إيه وان زيرو هرتز).
  2. سحب قطب حادة والردم مع 2 م بوكل. دراسات من بين الخلايا اقتران عبر نقل الصبغ، والردم ميكرويليكتروديس مع يوديد propidium 0.1% المذاب في 2 م بوكل.
  3. تأمين الكهربائي عبر سلك فضة المغلفة بكلوريد في حامل الماصة المرفقة إلى مرحلة رأس الكترومتر المضمون مع ميكرومانيبولاتور. استخدام ميكرومانيبولاتور إيجاز موقف غيض مسرى إلى PSS المتدفقة في الدائرة أثناء عرض من خلال الهدف 4 x.
  4. تعيين الخامس يستريحم 0 كما يتفق مع أسس حمام المحتملة. ضع طرف القطب فقط فوق خلية أنبوب غشائي. إذا رغبت في ذلك، استخدام شاشات الأساس مسموعة ترتبط اليكتروميتيرس لربط الملعب سليمة مع تسجيلات المحتملة.
  5. زيادة التكبير إلى 400 x 40 x والهدف باستخدام وإعادة تحديد موضع غيض مسرى حسب الحاجة. ضبط النافذة الضوئية باستخدام البرمجيات قياس الضوء للتركيز على الخلايا البطانية ~ 50 إلى 80.
  6. بلطف ضع الكهربائي في إحدى خلايا أنبوب غشائي في ميكرومانيبولاتور باستخدام وانتظر min إيه تو الخامس يستريحم لتحقيق الاستقرار. وبالمثل، إدراج قطب ثاني في خلية أخرى (المسافة إيه وان زيرو زيرو ميكرومتر) من الخلية الأولى مخوزق مع القطب الأول.
  7. متى يستريح Vm مستقر في قيمها المتوقعة (-30 إلى-40 mV)6، قم بتشغيل PMT على الواجهة fluorescence في غياب الضوء ويبدأ اكتساب داخل الخلايا [Ca2 +]أنا مثيرة Fura-2 بالتناوب (10 هرتز) في 340 و 380 نانومتر بينما جمع الانبعاثات fluorescence في 510 نانومتر.
    ملاحظة: لاختبار اقتران الكهربائية بين الخلايا، الحالي (± 0.5-3 غ، مدة النبضة s ~ 20) يمكن تسليمها عن طريق واحد الكترومتر "الموقع 1"، ويمكن أن تسجل تغييرات الخامسم مع الكترومتر آخر ك "الموقع 2" (المسافة إيه وان زيرو زيرو ميكرومتر).
  8. بمجرد إنشاء قياسات متزامنة من Vm و [Ca2 +]أنا ، تسمح ~ 5 دقيقة سوبيرفوسيون أنبوب غشائي مع PSS بمعدل ثابت الاندفاق الصفحي قبل تطبيق المخدرات.
  9. تطبيق على المخدرات (مثل ATP) أعد PSS للدائرة سوبيرفوسيون مع معدل التدفق المستمر. بعد دقيقة ~ 3 (أو فترة زمنية مناسبة لحركية الدواء)، المياه والصرف الصحي مع PSS حتى الخامسم ونسبة380 /F340و العودة إلى ظروف خط الأساس. علامة تسجيلات كل منهما وقتيا متزامنة عبر أجنحة البرمجيات شحني والكترومتر خلال كل مرحلة انتقالية من الحلول.
  10. بمجرد القيام بالتجربة، سحب القطب من الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتور ولاحظ تم ~ 0 mV كالمشار إليه بواسطة مسرى حمام. إيقاف التسجيلات كل من تم و [Ca2 +]أنا وحفظ السجلات في ملف لتحليل البيانات.

7-التصور من خلية إلى اقتران

  1. لتصور اقتران خلية إلى خلية عن طريق يوديد propidium، استخدم علامة x 40 أو 60 x الفلورسنت الهدف مع فتحه عددية عالية نسبيا (مثلاً، 0.95) وتعيين عامل تصفية والرودامين مع الإضاءة الحالة الصلبة، وكاميرا عالية الدقة (مثلاً، 16- ميغابكسل)، وبرمجيات تصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويبين الأرقام المرفقة المظاهرة التخطيطي للبروتوكول، المذكورة أعلاه. ويبين الشكل 1Aدماغ معزولة عن ماوس C57BL/6N ذكور شباب البالغين (5 أشهر). شرايين المخ الخلفي معزولون بعناية من "دائرة ويليس"، إزالتها دون النسيج الضام، ومقطعة شرائح (الشكل 1B--د). من شرائح الشرياني هضمها جزئيا، تنتج أنبوب غشائي سليمة والمضمونة في كشف غطاء الزجاج باستخدام الماصات التثبيت. يتم تطبيق لطيف تمتد الميكانيكية باستخدام الماصات تثبيت اثنين لتقريب خطي الطول المجراة في دون تورتوسيتي السفينة. قد تم توضيح هذا كذلك في المخطوطة (الشكل 2 أ). غشائي أنابيب معزولة عن الخلفية الشرايين الدماغية هي ~ 90 – 100 ميكرومتر في إيه ثري زيرو زيرو وعرض ميكرومتر في الطول. محملة الأنبوب Fura-2 صباحا تليها خارج المياه والصرف الصحي مع PSS. قياس متزامنة [Ca2 +]أنا و الخامسم في أنبوب غشائي يؤديها Ca2 + قياس الضوء فضلا عن شارب قطب الكهربية (تلاعب التجريبي المبين في الشكل 3 و الشكل 4).

التقييم الوظيفي من أنبوب غشائي يقوم بتطبيق مؤثر GPCR غشائي كلاسيكية مثل ATP في قاعة تدفق الظروف الفسيولوجية. كما هو موضح في الشكل 5، [Ca2 +]أنا والخامسم تسجل في نفس الوقت ردا على ATP (100 ميكرومتر). فرط الاستقطاب كبير Vm (mV إيه فايف) يحدث متزامنا مع داخل الخلايا [Ca2 +]أنا زيادة، مشيراً إلى أن ارتفاع في [Ca2 +]أنا ينشط كوروناCa/IK قنواتCa ومما يسمح افلوكس ك+ عبر غشاء البلازما لإنتاج إده. دليل على اقتران بين الخلايا باستخدام الحقن الحالية (± 0.5 إلى 3 غ، البقول s ~ 20) يمكن العثور عليها في عملنا نشرت مؤخرا (مرجع6، الشكل 1). ملاحظة أن يوديد propidium كتلة دا ~ 668 إشارة إلى رسل الثاني يعرف لتمرير من خلال تقاطعات الفجوة مثل اينوزيتول تريسفوسفاتي (IP3، دا ~ 420)، دوري الادينوسين الأدينوزين (معسكر، دا ~ 329).

Figure 1
الشكل 1 : عزل الشريان الدماغي من الدماغ. (أ) الدماغ معزولة مع الشرايين سليمة (السهم الأبيض يشير إلى الشريان الدماغي الخلفي) في حل ديسيكشن. (ب) ماجنيفيد عرض الشريان الدماغي الخلفي (السهم الأبيض؛ ~ 3 x مقابل. الفريق A). (ج) عزل الخلفي الدماغي الشرايين المضمون مع دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ في صحن العينة. (د) الخلفي الشرايين الدماغية بعد إزالة الأنسجة الضامة. اقحم يظهر قطع شرائح الشرايين؛ شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : إعداد أنبوب غشائي الدماغي. (أ) المعدات المستخدمة في تريتوراتينج شرائح الشرياني هضمها جزئيا؛ = ميكرومانيبولاتور، ب = الدائرة لإعداد الأنبوبة، ج = المرحلة الألومنيوم، د = ميكروسيرينجي، ه = المجهر، f = ميكروسيرينجي مضخة تحكم. (ب) الشرياني شرائح (الأسهم البيضاء) في الحل الهضم الأنزيمي. (ج) غشائي أنابيب أعده تريتوريشن؛ = تريتوريشن ماصة، ب = أنبوب غشائي سليمة. اقحم يظهر عملية تريتوريشن لإزالة والبرانية وخلايا العضلات الملساء؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر-(د) أنبوب غشائي سليمة المضمونة في كشف غطاء الزجاج مع ماصة التثبيت؛ = تعلق ماصة، ب = أنبوب غشائي سليمة مع قطر ~ 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : معدات سوبيرفوسيون ومتزامنة [Ca2 +] أنا والخامس m القياسات. (أ) معدات سوبيرفوسيون أنبوب غشائي والتحكم في درجة الحرارة، = عالية الكثافة مصباح القوس الكهربي، ب = واجهة نظام الأسفار، ج = درجة الحرارة، د = الخزانات الستة لنظام سوبيرفوسيون، ه = الألياف البصرية الضوء المصادر، و = صمام تحكم، g = هايبرسويتش [Ca2 +]أنا قياس الضوء النظام. (ب) دائرة سوبيرفوسيون الجهاز؛ وب = هيادستاجيس، ج = القطب الأرضي، د = مضمنة سخان، e = سوبيرفوسيون الأنابيب، و = ز الشفط، فراغ = سوبيرفوسيون الدائرة، ح = المرحلة الألومنيوم عقد الدائرة. (ج) منهاج تجريبي على طاولة عزل اهتزاز؛ محول = تأطير خلية مع الكاميرا، ب = ج مجهر الضوء، المجهر، د = = المرحلة الألومنيوم، ه = ميكرومانيبولاتور لعنصر التحكم هيدستاجي، و = مائدة عزل الاهتزازات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : معدات التشغيل الكهربية وتسجيل البيانات- = الذبذبات، ب = مولد دالة، ج = رصد خط الأساس مسموعة، د = 50/60 هرتز الضوضاء فلتر وهاء وواو = اليكتروميتيرس، g = نظام الحصول على البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : واحد [Ca2 +] أنا والخامس m التسجيلات. (أ) تعديل "فرق التدخل تباين" الصورة (400 x) من أنبوب غشائي الشرياني الدماغي الماوس للتجربة في إطار مضوائيه استخدام هدفا 40 x. يوضع مسرى حادة داخل خلية كما هو موضح في الجزء العلوي من الصورة (السهم الأبيض). (ب) آثار الخام للقياس المتزامن و340/F380 نسبة (أعلى) والخامسم (أسفل) ردا على ATP (100 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ضوء الأخيرة تطورات6،15،،من1617، نظهر الآن طريقة لعزل الماوس البطانة الشريانية الدماغية تحضيرا لقياس متزامنة من [Ca2 +] الأول والخامسم الكامنة إده استمرار ح ~ 2 عند 37 درجة مئوية. على الرغم من صعوبة من الناحية التقنية، يمكن أن نقيس خلية إلى خلية اقتران كذلك (انظر المرجع6، الشكل 1). بهذه الطريقة، يمكن أن نقيس المنفصلة وأجرى مما يشير إلى الأحداث في وقت واحد. للحصول على حساب التحديات العامة التي تواجه حين عزل البطانة الشريانية الماوس راجع المراجع11،12. ونشدد على الخطوات الحاسمة لعزل الماوس الشرايين الدماغية، لدينا قياسات معينة غشائي [Ca2 +]أنا والخامسم، اقتراحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والاعتبارات المتعلقة بأساليب بديلة في ضوء التجريبية نقاط القوة/الضعف أدناه.

الشريان الدماغي الخلفي يتطلب العزلة حذراً من "دائرة ويليس" والنسيج الضام دون الأضرار بالعضلات الملساء وخلايا بطانية. الأدوات الجراحية (ملقط ومقص) ينبغي أن تكون مناسبة لإجراءات تشريح دوران الأوعية الدقيقة الماوس بينما استمر مع حواف حادة ونظيفة. النسبي للهيكل العظمى والعضلات12، خفضنا فترة الحضانة الانزيمية الثلثين وتركيزات غراء وكولاجيناز وديثيوريثريتول النصف أثناء إضافة استخدام بتركيز الأمثل تجريبيا من الستسي. للنجاح المستمر في عزل أنابيب غشائي الشرياني الدماغي، من المهم للإنزيمات أمر على دفعات (قارورة من 2 إلى 4) من بائع حسن سمعة العالية مع ممارسات التصنيع متسقة في اتفاق مع تواتر الاستخدام والعمر التخزيني. حتى مع احتمال الاختلاف في نشاط إنزيم من قطعة واحدة من إنزيم إلى التالي، اقترح الإبقاء على تركيزات الإنزيم مع الاستفادة المثلى من وقت الهضم خلال 10 إلى 12 دقيقة. تجدر الإشارة إلى أن الفوارق بين الجنسين ولا سن الحيوان (3 إلى 30 شهرا) قد حاجزاً كبيرا لإعداد البطانة معزولة من الشرايين الدماغية في تجربتنا. وهكذا، من المستحسن أن تكوين الإنزيم كوكتيل والوقت لهضم إنزيم تظل هي نفسها في الدراسات على السن ونوع الجنس.

كما أكد، الحذر مطلوب أثناء تريتوريشن لطيف وعزله البطانة من الغلالة وخلايا العضلات الملساء على شكل المغزل تفاديا لتلف خلايا بطانية12. الخطوة تريتوريشن، الزيوت المعدنية لزج بمثابة وسيلة هيدروليكية بين المكبس الصغير-المحاقن والوقائي المائية بغية سحب أو إخراج أجزاء السفينة حمم في PSS. تجدر الإشارة إلى أنه إذا كان الجزء سفينة الاتصالات الزيوت المعدنية، هذه الخطوة يجب أن يتكرر استخدام ماصة نظيفة تريتوريشن مع ردمها متسلسلة من الزيوت المعدنية و PSS. قبل تجربة، من المستحسن أن على طول خطي تقريبا في فيفو تعاد إلى أنبوب غشائي قدر الإمكان، حيث تحمل خلايا فردية مورفولوجيا "مسطح"، والطولي (مثل قطر ~ 5 ميكرومتر؛ طول ~ 100 ميكرومتر؛ سمك ~0.5 ميكرومتر)8. ومع ذلك، لا ينبغي تطبيق التوتر المحوري إلى حد حيث سحب الخلايا على حواف العينة بعيداً من تحت الماصات التثبيت الخاصة بكل منها والاستقرار وبالتالي تعريض الميكانيكية للقياسات الخلوية موثوق بها خلال التجربة.

مضوائيه [Ca2 +]أنا قياس النظام المستخدم في هذا الأسلوب مناسبة للقياسات المستمرة غشائي [Ca2 +[i باستخدام راتيوميتريك صبغ Fura-2. يمكن أن تستمر البروتوكولات الفردية عادة دقيقة إيه وان زيرو بدون فوتوبليتشينج كبيرة. علاوة على ذلك، نحن عادة استخدام هذا النهج لقياس [Ca2 +]أنا لأنها قابلة لتوقف في الوقت المناسب في الحصول على البيانات وحركة متكررة مجهر الأهداف حسب الحاجة لتأمين أقطاب حادة للقياساتم الخامس. لاحظ أن هذا هو نهج مضوائيه الذي يلتقط فقط العالمي، بلغ [Ca2 +]أنا بين خلايا متعددة. وبصفة عامة، [Ca2 +] القياساتأنا ، نوصي قياس الضوء لتوصيف الأولية من استجابات الخلايا البطانية لوكلاء الدوائية (مثل، الوقت أثناء مراحل الذروة والهضبة) مع خطط لتأمين انتقل إلى كوانتيتاتي ميكرودومين مما يشير إلى أحداث باستخدام معيار مجهرية [كنفوكل] أو مولتيفوتون12،23.

يتمثل نهج الكهربية القطب حادة قابلة لتسجيلاتم الخامس المتكاملة في الاستعدادات الفسيولوجية متعددة الخلايا. يتم قياس داخل الخلايا تم حتى الآن أكثر من الناحية التقنية الصعبة مع العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تيسر أو طمس النجاح للقياسات. أولاً، يحتاج المجرب لتحديد شروط البرنامج الأمثل على ساحبة زجاج استمرار تصنيع أقطاب حادة مع مقاومة نصيحة ~ 150 ± 30 MΩ. باستخدام اختبار منحنى حرارة شعيرة القراءة كمرجع، من المستحسن أن المجرب تحديد معلمات تجريبيا، خاصة فيما يتعلق بالاختلاف في الإعداد "الحرارة" في حين تحقيق أقصى قدر من الوقت للانسحاب. الاستقرار المقبل، والميكانيكية ميكرومانيبولاتورس، هيدستاجيس، وأصحاب ماصة، وعينه في غاية الأهمية. وبصرف النظر عن ضرورة واضحة لجدول عزل اهتزاز، ستحتاج المجرب التأكد من أن جميع التجهيزات مؤمنة وأن منطقة المرحلة حولها وتحتها المتلاعبين نظيفة. ومن الناحية المثالية، ينبغي خفض الضوضاء الدخيلة إلى الحد الذي قرار تسجيلات القطب حادة داخل 1 أم. في تجربتنا، هو المصدر الأكثر شيوعاً للضوضاء سلك الفضة المضمونة في حامل الماصة التي في حاجة إلى يكفي كلوريد طلاء أو استبدالها كلياً. في حالة وجود مشترك 50/60 هرتز الضوضاء، التكنولوجيا "همهم إسكات" يمكن استخدامها ويأتي معيار مع الكترومتر حديثة. إذا الضوضاء يظهر تماما لا يمكن السيطرة عليها، تحقق لمعرفة ما إذا كان هناك تسرب في حمام أو تجاوز السعة حيث PSS سوف تتلامس المقاومات للتحكم في درجة الحرارة. إذا تبقى مضاعفات مع اكتساب إشارةm V مستقرة، التأكد من سلامة الأسلاك الكهربائية وموصلات من نوع t.

تماما، إذا إنشاء تسجيل قطب حادة غير ناجحة، فعادة سبب الكهربائي غير ملائمة أو عدم الاستقرار الميكانيكية، أو ضعف الصحة الخلوية. بدلاً من ذلك، قد ترغب المجرب أيضا في النظر في تكوين أسلوب التصحيح-المشبك في الخلايا الفردية، أونكوبليد كهربائياً حيث يمكن الحصول على معلومات بشأن التيارات خلية كاملة وتسجيلات قناة أيون واحد. على الرغم من أن تواجه التحديات العامة لاستخدام صبغة فلورسنت (مثل، تحميل داخل الخلايا غير المتجانسة، تبيض، المعايرة باستخدام إيونوفوريس، القرار كشف متواضعة)، مراعية للجهد الأصباغ مثل دي-8-أنيبس أيضا متوفرة تجارياً.

فهمنا للبطانة في تنظيم تدفق الدم، وفي جميع أنحاء الدماغ أمر حاسم مع سرعة شيخوخة السكان وارتفاع معدلات الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية والأعصاب المزمنة. وهكذا، نحن نقدم طريقة لعزل البطانة سليمة من شريان دماغي حيوية، التي يمكن أن تتكيف مع الهياكل الأخرى الأوعية الدموية في الدماغ. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض نهجاً مفيداً لقياسات متزامنة من الأساسية [Ca2 +]أنا والخامسم. وأخيراً، استخدام ثنائي أقطاب داخل الخلايا، خلية إلى خلية اقتران من خلال تقاطعات الفجوة يمكن أيضا تقييم. مع التدخلات الدوائية و/أو الوراثي المخططة بعناية، يشمل البروتوكول الحالي معقول كما وكيفا دراسة وظيفة غشائي الدماغي في شكله الأصلي. أملنا هو أن يبني من المجربون والتكيف مع هذه المعلومات للنهوض بالأحياء والأوعية الدموية والأعصاب بشكل عام. على وجه الخصوص، سيكون مرضيا لرؤية نضالات التجريبية المشتركة المعنية بالقياسات الكهربائية إلى أدنى حد تماما. على الرغم من أن هذا البروتوكول ليس مجموعة قائمة بذاتها للتقنيات بأي وسيلة، ويمكن استخدامه كنهج تكميلية لتحديد المحددات البيولوجية الفيزيائية بطانية على وجه التحديد كيف تترجم إلى تغييرات في مقاومة الأوعية الدموية، وكيف أنها ضبط التنظيم تدفق الدم بالنسبة لظروف ممثل الصحة مقابل. المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونحن نشكر تشارلز هويت للمساعدة التقنية ممتازة حين وضع المعدات واللوازم الضرورية للبروتوكولات الحالية. ونحن نشكر الدكتور شون م. ويلسون وكريستوفر ويلسون، من مركز LLU "علم الأحياء في الفترة المحيطة بالولادة"، لتزويدنا بالمجهر المقلوب إضافية والكترومتر، على التوالي. دعمت هذه البحوث "المعاهد الوطنية للصحة" منحة R00-AG047198 (EJB) وأموال بدء التشغيل كلية جديدة "لوما ليندا مدرسة الطب في جامعة". المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3, (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78, (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202, (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219, (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6, (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285, (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24, (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15, (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9, (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593, (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72, (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595, (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293, (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297, (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3, (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170, (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, (8), 757-770 (2012).
قياسات متزامنة من الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات غشاء في البطانة الدماغي الماوس معزولة طازجة وسليمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter