Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Samtidige målinger af intracellulære Calcium og membran potentiale i frisk isoleret og intakt mus Cerebral endotelet

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University

Summary

Vist her er protokoller for (1) frisk isolere intakt cerebral endotel "rør" og (2) samtidige målinger i endothelial calcium og membran potentiale under endotel-afledte hyperpolarisering. Yderligere, disse metoder mulighed for farmakologiske tuning i endothelial celle calcium og elektriske signaler som enkelte eller interaktive eksperimentel variable.

Abstract

Cerebrale arterier og deres respektive mikrocirkulationen levere ilt og næringsstoffer til hjernen via blod flow regulering. Endotelceller linje lumen af blodkar og kommando ændringer i vaskulære diameter, som kræves for at opfylde den metaboliske efterspørgsel af neuroner. Primære endotel-afhængig signaling veje af hyperpolarisering af membran potentiale (Vm) og nitrogenoxid fungerer typisk sideløbende at mægle vasodilation og dermed øge blodgennemstrømningen. Selv om integreret til at koordinere vasodilation over flere millimeter af vaskulære længde, har komponenter af endotel-afledte hyperpolarisering (EDH) været historisk vanskelig at måle. Disse komponenter af EDH medfører intracellulære Ca EUR2 + [Ca2 +],jeg øger og efterfølgende aktivering af små - og mellemliggende konduktans Ca2 +-aktiveret K+ (SKCa/IKCa) kanaler.

Vi præsenterer her, en forenklet illustration af isolation af frisk endotel fra mus cerebrale arterier; samtidige målinger i endothelial [Ca2 +]jeg og Vm benytter Fura-2 fotometri og intracellulære skarpe elektroder, henholdsvis; og en kontinuerlig superfusion af saltopløsninger og farmakologiske midler under fysiologiske tilstande (pH 7,4, 37 ° C). Posteriore cerebrale arterier fra kredsen af Willis er fjernet uden den posteriore kommunikere og de basilar arterier. Enzymatisk nedbrydning af renset posterior cerebral arteriel segmenter og efterfølgende ændring letter fjernelse af adventitia, perivascular nerver og glatte muskelceller. Resulterende posterior cerebral arteriel endotel "rør" er sikret under et mikroskop og undersøgt ved hjælp af et kamera, photomultiplier tube, og en til to elektrometre under kontinuerlig superfusion. Kollektivt, kan denne metode samtidigt måle ændringer i endothelial [Ca2 +]jeg og Vm diskrete cellulære steder, ud over spredning af EDH gennem kløften kryds op til millimeter afstande langs den intakt endotelet. Denne metode ventes at give en høj overførselshastighed analyse i endothelial hjernevirksomheden underliggende mekanismer af blod flow regulering i den normale og syge hjerne.

Introduction

Blodgennemstrømningen i hele hjernen er reguleret af koordineringen af vasodilation blandt cerebrale arterier og arterioler i vaskulære netværk1. Endotelceller foring cerebral modstand arterier kommando ændringer i vaskulære diameter som er nødvendig for at opfylde den metaboliske efterspørgsel af neuroner1,2,3. Især under endotel-afledte hyperpolarisering (almindeligvis kendt som EDH), intracellulære Ca2 + ([Ca2 +]jeg) og elektrisk signalering i endothelial celler koordinere vasodilation blandt endotelceller og deres omkringliggende glatte muskelceller gennem kløften knudepunkter for arteriel afslapning4. Fysiologiske indledning af EDH sekventielt medfører stimulering af Gq-koblede receptorer (GPCRs), en stigning i [Ca2 +],jeg, og aktivering i endothelial små - og mellemliggende-Ca2 +-aktiveret K+ (SKCa/IKCa) kanaler til hyperpolarize cerebral endotel membran potentiale (Vm)5,6,7. Den intime forhold i endothelial [Ca2 +]jeg og Vm er således integreret del af blod flow regulering og uundværlig til hjerte- og cerebrovaskulær funktion6,8. I hele den bredere litteratur, har talrige undersøgelser rapporteret sammenslutning af vaskulære endotel dysfunktion med udvikling af kroniske sygdomme (f.eks hypertension, diabetes, hjerteinsufficiens, koronararteriesygdom, kronisk nyresvigt, perifer arteriesygdom)9,10, der angiver betydningen af at studere endotelfunktion i fysiologiske såvel som patologiske betingelser.

Vaskulære endotel er integreret produktion af hyperpolarisering, vasodilation og væv perfusion og undersøgelse af sin indfødte cellulære egenskaber er således afgørende. Som en generel undersøgelse model, er forberedelse af arteriel endotel tube musemodel blevet offentliggjort før skeletmuskulatur11,12, gut13, lunge14, og for nylig for hjernen6. Undersøgelser af samtidige [Ca2 +]jeg og Vm målinger er navnlig blevet offentliggjort for skeletmuskulatur arteriel endotelet15,16 samt lymfatisk fartøj endotelet17. Ud over primære undersøgelser udnytter i endothelial tube tilgang, kan en omfattende gennemgang af sine fordele og ulemper8 konsulteres for at afgøre, om denne eksperimentelle værktøj er passende for en specifik undersøgelse. Kort sagt, er en fordel, at de fysiologiske nøglekomponenter i endothelial cellefunktion bevares (f.eks., Ca2 + tilstrømning og intracellulære frigivelse, hyperpolarisering af Vm op til Nernst potentiale for K+ via SKCa/IKCa aktivering og endotel intercellulære kobling via gap vejkryds) uden forstyrrende faktorer såsom perivascular nerve input, glat muskel spænding-gated kanal funktion og kontraktilitet, blodcirkulationen, og hormonelle påvirkninger8. Derimod anvendte celle kultur tilgange indføre betydelige ændringer i morfologi18 og ion-kanal udtryk19 på en måde, der kan meget obfuscate sammenligninger til fysiologiske observationer bestemmes ex vivo eller in vivo. Begrænsninger omfatter manglende integration med andre vigtige komponenter for at regulere blodgennemstrømningen, glatte muskulatur og begrænset fleksibilitet i en eksperimentel tidsplan, som denne model er optimalt testet inden for 4 h intakt vaskulære segment isolation fra dyret.

Bygning fra en tidligere video protokol forfattet af Socha og Segal12 og seneste eksperimentel udvikling i den foreløbige6,15,16, demonstrere vi hermed dyrkning af friske endotelet fra posteriore cerebrale arterier og samtidige målinger i endothelial [Ca2 +]jeg og Vm benytter Fura-2 fotometri og intracellulære skarpe elektroder, henholdsvis. Derudover medfører dette eksperiment kontinuerlig superfusion af saltopløsninger og farmakologiske midler under fysiologiske tilstande (pH 7,4, 37 ° C). Vi valgte den posteriore cerebrale arterie, som det giver isoleret endotel med strukturelle integritet (celler kombineret gennem kløften vejkryds) og tilstrækkelige dimensioner (bredde ≥50 µm, længde ≥300 µm) modtagelig for intra- og intercellulære signalering langs og blandt endotelceller. Desuden, undersøgelser af den gnavere posterior cerebral arterie er væsentligt repræsenteret i litteraturen og omfatte undersøgelse af grundlæggende endotel signaling mekanismer, vaskulære udvikling/ældning og patologi20, 21 , 22. dette eksperimentelle program forventes at give en høj overførselshastighed analyse af cerebral endotelfunktion (og dysfunktion) og giver dermed mulighed for betydelige fremskridt i forståelsen af blod flow regulering i hele ældning og udvikling af neurodegenerative sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Før du udfører de følgende eksperimenter, sikre at alle dyrs pleje bruger og protokoller godkendes af institutionelle dyrs pleje og bruge udvalg (IACUC) og udført i overensstemmelse med National Research Councils " "Guide til pleje og brug af Forsøgsdyr" (8th Edition, 2011) og retningslinjerne for ANKOMME. IACUC i Loma Linda University har godkendt alle protokoller, der bruges til dette manuskript til mandlige og kvindelige C57BL/6 mus (alder rækkevidde: 3-30 mo).

1. udstyr og materialer

Bemærk: Oplysninger om materialeudgiften til protokollen kan findes i Tabel af materialer, reagenser, og manualer eller hjemmesider forbundet med de respektive leverandører.

  1. Flow kammer
    1. Fastgør en superfusion kammer med et glas coverslip bund i en anodiseret aluminium platform. Sikre platform med kammer til kompakte aluminium scene.
    2. Angive en micromanipulator i hver ende af platformen på aluminium scenen for at holde den fastgørelse pipette.
      Bemærk: Som en praktisk indstilling, Brug denne overdrages fase apparater med en flow kammer enhed sikret for at lette overgangen fra isolation i endothelial røret til udførelsen af eksperimenter.
  2. Mikroskoper
    1. Brug stereomikroskoper (5 x til 50 x forstørrelse række) udstyret med fiber optic lyskilder til makro - og mikro-dissektion procedurer.
    2. Forberedelse i endothelial rør, bruge en inverteret mikroskop udstyret med fase kontrast eller differential interferens kontrast (DIC) kompatibel mål (10 x, 20 x, og 40 x) og en aluminium fase.
    3. For at isolere endotel rør fra delvist fordøjet blodkar, placere en mikrosprøjte Pumpestyring støder op til i endothelial tube forberedelse apparatet.
    4. For den eksperimentelle apparater, skal du bruge en inverteret mikroskop udstyret med standard mål (4 x og 10 x) ud over fluorescerende mål (20 x og 40 x, numerisk blænde 0,75) og en manuel aluminium scenen på en vibration isolation tabel.
  3. Intracellulære kontrolapparatet
    1. Du kan optage Vm i endothelial celler i endothelial isolerede rør, skal du slutte electrometer til den kompatible headstage. Hvis det er nødvendigt, slutte en funktionsgenerator eller stimulator til electrometer for eksperimenter, der kræver nuværende injektion.
    2. Tilslut forstærker udgange til en dataoptegningssystem, hørbare baseline skærme og et oscilloskop. Sikre referenceelektrode (Ag/AgCl pellet) i nærheden af afkørslen flow kammer under eksperimenter.
    3. Bruge en fotometrisk system med integrerede komponenter af en fluorescens system interface, høj intensitet arc lamp og power supply, hyperswitch, photomultiplier tube (eller ydelse), og kameraet til at måle [Ca2 +]jeg i endothelial celler.
    4. Bruge en temperatur controller udstyret med en indbygget varmelegeme til at øge og opretholde en fysiologisk temperatur (37 ° C) i hele eksperimentet.
    5. Brug en seks-reservoir platform tilsluttet en ventil controller med en inline flow kontrolventil til at kontrollere leveringen af respektive løsninger til i endothelial røret sikret i salen.
  4. Mikropipetter og skarpe elektroder
    Bemærk: For at fremstille pipetter til ændring og den mekaniske stabilisering af isolerede endotel rør, bruge en elektronisk aftrækker til at trække pipetter og en mikro-forge for at bryde og brand polering.
    1. For at adskille adventitia, glatte muskulatur og i endothelial røret fra den delvist fordøjet arteriel segment, forberede ændring pipetter (hver med en intern spids diameter på 80-120 µm) som passende, ved hjælp af borsilikatglas kapillarrør, og brand Polsk spidsen.
    2. For at sikre i endothelial røret mod bunden af den superfusion afdeling, bruge fastgørelse pipetter med afrundede, kugleformet spids (varme-poleret, OD af 100-150 µm; fremstillet af tynde væg borsilikatglas rør).
    3. Hvis du vil optage en endotel celle V,m , forberede skarpe elektroder med en spids modstand ~ 150 ± 30 MΩ fra glas kapillarrør ved hjælp af en elektronisk aftrækker.

2. udarbejdelsen af løsninger og stoffer

  1. Fysiologiske saltopløsning (PSS)
    1. Til et eksperiment med præparater, narkotika, forberede et minimum på 1 L med en PSS: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic syre (HEPES) og 10 mM glukose.
    2. For at forberede de nødvendige løsninger for dissektion, forberede isolation af cerebral arterie, og forberedelse i endothelial tube, PSS mangler CaCl2 (nul Ca2 + PSS).
    3. Forberede alle løsninger i ultrarent deioniseret vand H2O, ph indstilles til 7.4, sterilisere dem gennem et filter (0,22 µm porestørrelse) og sikre, at osmolalitet af løsningerne, der er mellem 290-300 mOsm.
      Bemærk: Løsninger kan opbevares ved 4 ° C i ca. to uger.
  2. 10% bovint serumalbumin (BSA)
    1. For at forberede 10% BSA, 1 g af den frysetørrede pulver opløses i et bægerglas af 10 mL nul Ca2 + PSS.
    2. Bægerglasset dækkes med paraffin film og give mulighed for en periode på flere timer at passere, med langsom omrøring for BSA at opløse.
    3. Filtrere den endelige løsning ved hjælp af en 10 mL sprøjte plus et 0,22 µm filter og gøre 1 mL delprøver opbevares ved-20 ° C.
  3. Dissektion løsning
    1. For at forberede 50 mL af dissektion løsning, tilsættes 500 µL af BSA (10%) til 49,5 mL af nul Ca2 + PSS.
    2. Umiddelbart efter tilberedning, dette dissektion opløsning overføres til en petriskål arteriel dissektioner.
  4. Dissociation løsning
    1. For at forberede 50 mL af dissociation løsning, tilsæt 5 µL af CaCl2 (1 M) og 500 µL af BSA (10%) til 49,5 mL af nul Ca2 + PSS. Tillade løsning til at sidde ved stuetemperatur (RT).
  5. Enzymer
    1. For delvis fordøjelsen af til arterielle segmenter, forberede 1 mL af fordøjelsen løsning med 0.31 mg/mL papain, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0,75 mg/mL collagenase (Type H blanding) og 0,13 mg/mL elastase.
      Bemærk: Enzym aktiviteter kan variere; men for vores succesfulde protokoller, kommercielt leverede enzym aktiviteter har været anvendt som følger: papain ≥10 enheder/mg; collagenase ≥ 1 enheder/mg, for N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala eller FALGPA substrat omsætning; og elastase ≥ 5 enheder/mg.
  6. Forberedelse af Fura-2 og farmakologiske midler
    1. Forberede lager koncentration (1 mM) af Fura-2 AM farvestof i DMSO. Forbered en arbejdende koncentration (10 µM) ved at tilføje 5 µL af materiel til 495 µL af PSS til indlæsning.
    2. Forberede ≥50 mL arbejder koncentrationer af farmakologiske stoffer (fx ATP) i PSS som passende.
  7. Gennemføre løsning
    1. Forberede en udførelse løsning, 2 M KCl, ved at opløse KCl i ionbyttet H2O (7.455 g KCl i 50 mL H2O).
    2. Opløsningen filtreres gennem et 0,22 µm sprøjte filter før opfyldning skarpe elektroderne.
  8. Propidium Iodid (0,1%)
    1. 10 mg af frysetørret propidium Iodid i 10 mL 2 M KCl opløses.
    2. Bland godt og gemme på RT.

3. dissektion og Isolation af Cerebral arterie

Bemærk: Alle dissektion procedurer kræver modellen forstørrelse (op til 50 x) via stereomikroskoper og belysning af fiber optic lyskilder. For at udføre dissektion procedurer for isolation af hjernen og arterier, anvende skærpet dissektion instrumenter. Microdissection værktøjer til at isolere og rense arterierne omfatter skærpet bøde-tippet pincet og markriyor stil dissektion saks (3 til 9,5 mm vinger).

  1. Isolering af musen hjernen
    1. Bedøver en C57BL/6 mus (3-30 måneder gamle, mandlig eller kvindelig) via inhalation af isofluran (3% i 2-3 min) og derefter halshugge dyret umiddelbart efter komplet induktion af anæstesi. Placere hovedet i en petriskål (diameter 10 cm, dybde 1,5 cm) indeholdende kolde (4 ° C) nul Ca2 + PSS under et stereomikroskop.
    2. Se gennem mikroskopet, fjerne hud og hår over kraniet og fjerner overdreven blod med kolde nul Ca2 + PSS. Gøre et snit ved hjælp af kun de tips standard dissektion saks (f.eks 24 mm klinge), starter med nakkeknude og strækker sig op gennem den nasale knogler i kraniet.
    3. Åbne kraniet forsigtigt langs den indsnit ved hjælp af grov-tippet pincet, og separate bindevæv for at isolere hjernen med en intakt cirkel Willis.
      Bemærk: Alternativt kan Littauer knogle-opskæring pincet bruges til at åbne kraniet og udsætte hjernen.
    4. Forsigtigt vaske den isolerede hjernen med kolde nul Ca2 + PSS i et bægerglas til at fjerne blod. Læg hjernen ventrale side opad i en sal, der indeholder kold dissektion løsning til isolering af cerebrale arterier (figur 1A).
  2. Isolering af cerebrale arterier
    Bemærk: Den posteriore cerebrale arterie er blevet udvalgt som repræsentative cerebrovaskulær endotel undersøgelse model for denne protokol.
    1. Sikre den isolerede hjernen i kolde dissektion løsning ved hjælp af rustfrit stål pins (diameter på 0,2 mm, længde ~ 11-12 mm) til at blive indsat i et kul-infunderes silicium polymer belægning i bunden (dybde ≥50 cm) i et glas petriskål.
    2. For at opretholde en kølet temperatur af PSS under dissektion, bruge en dissektion kammer køles af et kølemiddel system løbende cykling en 1:1 vand-ethylen glycol blanding. Dissektion kan der alternativt udføres på frisk is.
    3. Kirurgisk isolere den posteriore cerebrale arterier (~0.3 til 0,5 cm segmenter, ingen aksiale spændinger) fra den posteriore kommunikere og basilar arterierne ved hjælp af microdissection instrumenter markriyor stil saks og skærpet bøde-tippet pincet (figur 1B ). Bruge rustfrit stål pins (diameter på 0,1 mm, længde ~ 13-14 mm) til at sikre både isoleret posteriore cerebrale arterier i opløsningen dissektion i petriskål (figur 1 c).
    4. Ren den isolerede posteriore cerebrale arterier forsigtigt ved at fjerne bindevæv med skærpet bøde-tippet pincet (fig. 1 d). Skær intakt arterier i segmenter (længde 1-2 mm) for enzymatisk fordøjelsen (figur 1 d, indsatser).

4. forberedelse i Endothelial rør og Superfusion

Bemærk: I endothelial røret er forberedt som beskrevet tidligere12, med modifikationer for cerebral arterie6.

  1. Forberede ændring apparatet ved hjælp af et mikroskop udstyret med mål (10 x, 20 x, og 40 x), et kamera og en aluminium scenen holder et kammer og micromanipulators. Sikre en mikrosprøjte med en pumpe controller støder op til scenen og modellen (figur 2A).
  2. Helt opfyldning en ændring afpipetteres med mineralsk olie og sikre det over mikro-sprøjte stempel. Derefter, ved hjælp af mikro-sprøjte med Pumpestyring, trække dissociation løsning i pipetten (~ 130 nl) på toppen af mineralolie samtidig mangel af luftbobler i pipetten.
  3. Placer intakt arteriel segmenter i 1 mL af dissociation løsning i en 10 mL glasrør (figur 2B), der indeholder 0.31 mg/mL papain, 0,5 mg/mL dithioerythritol, 0,75 mg/mL collagenase og 0,13 mg/mL elastase. Der inkuberes ved 34 ° C i 10-12 min til delvis fordøjelsen.
  4. Efter fordøjelsen, erstatte enzym løsning med ~ 5 mL frisk dissociation løsning. Bruger 1 mL pipette, overføre et segment til et kammer, som indeholder dissociation løsning på RT.
  5. Placer pipetten oploesningen dissociation i salen og placere det tæt på ene ende af det nedbrudte fartøj. Indstille en sats inden for 2 til 5 nL/s på Pumpestyring for blid ændring (figur 2 c; indsatser).
  6. Mens visning gennem 100 x 200 x forstørrelse, trække og skubbe den arterielle segment for at adskille glatte muskelceller mens der producerer en endotel tube. Om nødvendigt omhyggeligt brug bøde-tippet pincet til at adskille dissocierede adventitia og indre elastisk lamina fra i endothelial røret. Bekræfte, at alle glatte muskelceller der dissocieres og at kun endotelceller forbliver som en intakt "tube" (figur 2 c).
  7. Bruger micromanipulators, sikre hver ende i endothelial røret på glas dækning slip for superfusion afdeling ved hjælp af borsilikatglas pinning pipetter (figur 2D).
  8. Wash-out dissocieres adventitia og glatte muskelceller fra salen og erstat dissociation løsning med 2 mM CaCl2 PSS. Overføre den mobile platform med sikrede endotel rør på mikroskop af superfusion og eksperimenterende rig.
  9. Bruge 6 clean 50 mL reservoirer (figur 3A) for kontinuerlig levering af PSS og respektive narkotika løsninger under eksperimentet, som passende. Bruge inline flow kontrolventil indstilles manuelt strømningshastighed i hele som konsekvent med laminar flow mens matchende flow foder til vakuum sug. Levere PSS til kammer (figur 3B) for superfusion i endothelial røret for ≥ 5 min før optagelsen baggrundsdata og farvestof lastning.

5. farvestof belastning, Wash-Out og temperaturindstillinger

  1. Slå alle komponenter af fotometri system til måling af [Ca2 +],jeg. Anvende mikroskopet på den eksperimentelle rig (figur 3 c) til at se i endothelial røret på 400 x forstørrelse og fokus på celler i vinduet fotometriske brug af fotometri system software suite.
  2. Måle diameteren i endothelial røret og optage baggrund autofluorescence værdier i overensstemmelse med 510 nm emission under alternative excitation på 340 og 380 nm (≥10 Hz).
  3. For at måle [Ca2 +]jeg svar, belastning i endothelial tube med Fura-2 AM farvestof (10 µM slutkoncentration) på RT og tillade ~ 30-40 min. i fravær af lys.
  4. Genstart superfusion i endothelial røret med friske PSS for ~ 30-40 min. til wash-out overskydende farvestof og tillade intracellulære Fura-2 er til de-esterify. Den wash-out periode hæve temperaturen gradvis fra RT til 37 ° C ved hjælp af temperatur controller (figur 3A) med en indbygget varmelegeme, så opretholde ved 37 ° C i hele eksperimentet.
    Bemærk: Den anbefalede trinvis overgang mellem RT til 37 ° C indebærer tre skridt (f.eks. 5 ° C) med en ≥5 min ekvilibreringstid på hvert trin.

6. samtidig måling af [Ca2 +],jeg og Vm

  1. Slå alle andre udstyr og electrometer software suite til måling af Vm (Se figur 3, figur 4). Justere data erhvervelse sats i overensstemmelse hermed (≥10 Hz).
  2. Trække en skarp elektrode og opfyldning med 2 M KCl. For undersøgelser af intercellulære kobling via dye transfer, opfyldning af microelectrodes med 0,1% propidium Iodid opløst i 2 M KCl.
  3. Sikre elektroden over en sølv wire belagt med chlorid i pipette indehaveren er knyttet til et electrometer hoved Stadium sikret med en micromanipulator. Brug micromanipulator kort placere spidsen af elektroden i den flydende PSS i salen mens visning gennem 4 x mål.
  4. Angiv den hvilende Vm til 0 som konsekvent med jordet bad potentielle. Placer spidsen af elektrode lige over en celle i endothelial røret. Hvis det ønskes, bruge hørbare baseline skærme forbundet med elektrometre til at knytte lyd pitch med potentielle optagelser.
  5. Forøge forstørrelsen til 400 x ved hjælp af 40 x mål og re-holdning spidsen af elektroden efter behov. Justere vinduet fotometriske bruger fotometri software til at fokusere på ~ 50 til 80 endotelceller.
  6. Forsigtigt placere elektroden i en af cellerne i endothelial røret ved hjælp af micromanipulator og vente ≥2 min for den hvilende Vm at stabilisere. På samme måde, indsætte en anden elektrode i en anden celle (afstand ≥100 µm) fra den første celle spiddet med første elektrode.
  7. Når hvile Vm er stabilt på dens forventede værdier (-30 til-40 mV)6, tænde ydelse på grænsefladen fluorescens i fravær af lys og begynde erhvervelse af intracellulære [Ca2 +]jeg af spændende Fura-2 skiftevis (10 Hz) på 340 og 380 nm mens indsamling fluorescens emission på 510 nm.
    Bemærk: At teste intercellulære elektriske kobling, nuværende (± 0,5-3 nA, ~ 20 s impulslængde) kan leveres via en electrometer som "Side 1", og ændringer af Vm kan registreres med en anden electrometer som "Site 2" (afstand ≥100 µm).
  8. Når samtidige målinger af Vm og [Ca2 +]jeg er etableret, tillade ~ 5 min til superfusion i endothelial tube med PSS på en konstant laminar flow før anvendelse af narkotika.
  9. Anvende stof (fx ATP) udarbejdet i PSS til superfusion kammer med konstant strømningshastigheden. Efter ~ 3 min (eller en periode, der er relevante for kinetik af narkotika) tilbage vask med PSS indtil Vm og F340/f380 forholdet til deres oprindelige betingelser. Markere respektive optagelser som tidsligt synkroniseret på tværs af softwarepakker fotometer og electrometer under hver overgang af løsninger.
  10. Når eksperimentet er gjort, trække elektrode fra cellen ved hjælp af micromanipulator og mærke Vm ~ 0 mV som der refereres til af Bad elektroden. Stoppe respektive optagelser af Vm og [Ca2 +],jeg og gemme posterne på fil til dataanalyse.

7. visualisering af celle til celle kobling

  1. For at visualisere celle til celle kobling via propidium Iodid, bruge en 40 x eller 60 x fluorescerende mål med en relativt høj numerisk blænde (fx 0,95) og rhodaminfilteret sæt med solid state belysning, en høj opløsning kamera (f.eks. 16- megapixel), og en billedbehandling software suite.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den skematiske demonstration af protokollen beskrevet ovenfor er vist i de vedlagte tal. En hjerne, isoleret fra en unge voksne mandlige C57BL/6N mus (5 måneder) er vist i figur 1A. Posteriore cerebrale arterier er grundigt isoleret fra kredsen af Willis, fjernes uden bindevæv, og skæres i segmenter (figur 1B-D). Fra delvist fordøjet arteriel segmenter, er intakt endotel røret produceret og sikret på glas dækning slip ved hjælp af fastgørelse pipetter. Blid mekanisk stræk anvendes ved hjælp af to fastgørelse pipetter til at tilnærme lineær in vivo længde uden fartøj tortuosity. Dette er blevet yderligere præciseret i manuskript (figur 2A-D). Endotel rør isoleres fra posteriore cerebrale arterier er ~ 90-100 µm i bredde og ≥300 µm i længden. Røret er fyldt med Fura-2 er efterfulgt af wash-out med PSS. Samtidig måling af [Ca2 +],jeg og Vm i endothelial røret er udført af Ca2 + fotometri samt skarpe elektrode Elektrofysiologi (eksperimentel rig vist i figur 3 og figur 4).

Funktionel vurdering i endothelial røret udføres ved at anvende en klassisk endotel GPCR agonist som ATP i flow kammer under fysiologiske forhold. Som vist i figur 5, [Ca2 +],jeg og Vm registreres samtidigt i reaktion på ATP (100 µM). En betydelig hyperpolarisering af Vm (≥5 mV) opstår samtidig med en intracellulær [Ca2 +]jeg stigning, som angiver, at en stigning i [Ca2 +],jeg aktiverer SKCa/IKCa kanaler og dermed giver mulighed for K+ efflux over plasmamembran at producere EDH. Dokumentation af intercellulære kobling ved hjælp af nuværende injektion (± 0,5 til 3 nA, ~ 20 s bælgfrugter) kan findes i vores nyligt offentliggjorte arbejde (reference6, figur 1). Bemærk at propidium Iodid har en masse ~ 668 Da med henvisning til anden messengers kendt for passerer gennem hullet knudepunkter såsom inositol trisphosphate IP3, ~ 420 Da, cyklisk adenosin fra (cAMP, ~ 329 Da).

Figure 1
Figur 1 : Isolering af cerebral arterie fra hjernen. (A) hjerne isoleret med intakt arterier (hvid pil angiver den posterior cerebral arterie) i dessection løsning. (B) Magnified Se af posterior cerebral arterie (hvid pil; ~ 3 x vs. Panel A). (C) isolerede posteriore cerebrale arterier sikret med rustfrit stål stifter i modellen parabol. (D) posteriore cerebrale arterier efter fjernelse af bindevæv. Inset viser klip segmenter af arterierne; Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Forberedelse af cerebral endotel tube. (A) udstyr anvendt til triturating af delvist fordøjet arteriel segmenter; en = micromanipulator, b = kammer for at forberede tube, c = aluminium fase, d = mikrosprøjte, e = mikroskop, f = mikrosprøjte pumpe controller. (B) arterielle segmenter (hvide pile) i løsning for Enzymatisk nedbrydning. (C) endotel rør udarbejdet af ændring; en = ændring pipette, b = intakt endotel tube. Inset viser ændring proces at fjerne adventitia og glatte muskelceller; Skalalinjen = 100 µm. (D) en intakt endotel tube sikret på glas dækning slip med fastgørelse pipette; en = pinning pipette, b = intakt endotel tube med diameter på ~ 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Udstyr til superfusion og samtidige [Ca2 +] jeg og V m målinger. (A) udstyr til superfusion i endothelial tube og temperaturkontrol, en = høj intensitet ARC lamp strømforsyning, b = fluorescens system interface, c = temperatur controller, d = seks-reservoirer for superfusion system, e = fiberoptisk lys kilder, f = ventil controller, g = hyperswitch [Ca2 +]jeg fotometri system. (B) Superfusion kammer apparater; en og b = headstages, c = jorden elektrode, d = indbygget varmelegeme, e = superfusion slanger, f = vakuum sug, g = superfusion afdeling, h = aluminium fase holde kammeret. (C) eksperimentelle platform på en vibration isolation tabel; en = celle indramning adapter med kamera, b = mikroskopet lys, c = mikroskop, d = aluminium stadium, e = micromanipulator for headstage kontrol, f = vibration isolation tabel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Udstyr til betjening af Elektrofysiologi og dataregistrering. en = oscilloskop, b = funktionsgenerator, c = hørbare baseline skærm, d = 50/60 Hz støjfilter, e og f = elektrometre, g = dataoptegningssystem. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Samtidige [Ca2 +] jeg og V m optagelser. (A) Differential interferens kontrast billede (400 x) i en mus cerebral arteriel endotel tube justeret for eksperiment i fotometriske vindue ved hjælp af en 40 x mål. En skarp elektrode placeres i en celle, som vist i toppen af billedet (hvid pil). (B) rå spor samtidig måling af F340/f380 ratio (øverst) og Vm (nederst) i svar til ATP (100 µM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I lyset af de seneste udviklinger6,15,16,17demonstrere vi nu metode til at isolere mus cerebral arteriel endotelet forberedelse til samtidige målinger af [Ca2 +] jeg og Vm underliggende EDH konsekvent i ~ 2 timer ved 37 ° C. Selv om teknisk set vanskelig, kan vi måle celle-til-celle kobling samt (Se reference6, figur 1). På denne måde kan vi måle diskrete og gennemførte signalering begivenheder samtidigt. En beretning om de generelle udfordringer samtidig isolere mus arteriel endotelet konsultere henvisninger11,12. Vi lægger vægt på kritisk trin til at isolere mus cerebrale arterier, vores særlige målinger af endotel [Ca2 +]jeg og Vm, forslag til fejlfinding og overvejelser i forbindelse med alternative metoder i lyset af eksperimentelle styrker/svagheder nedenfor.

Den posteriore cerebrale arterie kræver omhyggelig isolation fra kredsen af Willis og bindevævet uden skader til glatte muskulatur og endotelceller. Kirurgiske værktøjer (saks og pincet) bør være egnet til musen mikrocirkulationen dissektion procedurer mens vedligeholdes med rene, skarpe kanter. I forhold til skeletmuskulatur12, vi reduceret tidsperiode for enzymatisk inkubation med to tredjedele og koncentrationer af papain, collagenase og dithioerythritol halve samtidig tilføjer brugen af en empirisk optimeret koncentration af elastase. For vedvarende succes i isolere cerebral arteriel endotel rør, er det vigtigt at bestille enzymer i partier (2 til 4 hætteglas) fra en velrenommeret leverandør med konsekvent fremstillingspraksis i overensstemmelse med hyppigheden af anvendelse og holdbarhed. Endda med mulighed for variation i enzymaktivitet fra en masse enzym til næste foreslås det, at enzymet koncentrationer opretholdes mens optimering tidspunktet for fordøjelsen inden for 10-12 min. Det er værd at bemærke, at hverken køn eller alder (3-30 måneder) har været en væsentlig barriere til forberedelse af isolerede endotel fra den cerebrale arterier i vores erfaring. Det anbefales således, at sammensætningen af enzymet cocktail og tid af enzymet fordøjelsen forbliver den samme i undersøgelser på alder og køn.

Som understreget, er forsigtighed påkrævet under blid ændring og isolation af endotel fra adventitia og spindel-formede glatte muskelceller for at undgå skade på endotelceller12. For trinnet ændring serverer den tyktflydende mineralolie som en hydraulisk middelvej mellem stempel af mikro-sprøjte og det vandige PSS for at trække eller skubbe fartøj segmenter badet i PSS. Det skal bemærkes, at hvis fartøjet segment kontakter mineralsk olie, dette trin gentages ved hjælp af en ren ændring pipette med sekventiel opfyldning af mineralsk olie og PSS. Før et eksperiment anbefales det at en ca lineær i vivo længde tilbage i endothelial røret så vidt muligt, hvorved individuelle celler går ud fra en "flad", langsgående morfologi (f.eks., diameter ~ 5 µm; længde ~ 100 µm; tykkelse ~0.5 µm)8. Aksiale spændinger bør dog ikke anvendes i det omfang, hvor cellerne ved kanten af prøven trækker væk fra nedenunder respektive fastgørelse pipetter og dermed kompromitterende mekanisk stabilitet for pålidelig cellulære målinger under den eksperiment.

De fotometriske [Ca2 +]jeg måle system, der anvendes i denne teknik er velegnet til kontinuerlig måling af endotel [Ca2 +]jeg bruger ratiometric Fura-2 farvestof. Individuelle protokoller kan typisk vare ≥10 min uden betydelige photobleaching. Yderligere, vi ofte bruger denne fremgangsmåde til at måle [Ca2 +],jeg fordi det er indstillet til rettidig pauser i dataopsamling og hyppige bevægelser af mikroskop mål efter behov for at sikre skarpe elektroder til Vm målinger. Bemærk, at dette er en fotometrisk metode, der kun fanger globale, gennemsnit [Ca2 +]jeg blandt flere celler. I almindelighed [Ca2 +]jeg målinger anbefaler vi fotometri for den oprindelige karakterisering i endothelial celle svar med farmakologiske stoffer (f.eks., tiden løbet af peak og plateau faser) mens sikring planer om at gå videre til at kvantificere microdomain signalering begivenheder ved hjælp af standard Konfokal eller multiphoton mikroskopi12,23.

Den skarpe elektrode Elektrofysiologi tilgang er modtagelig for integreret Vm optagelser i fysiologiske flercellede præparater. Måling af intracellulære Vm er langt den mest teknisk udfordrende med talrige kritiske trin, der kan enten lette eller udslette succes af målinger. Første eksperimentatoren skal afgøre de optimale program betingelser på et glas aftrækker for konsekvent fremstiller skarpe elektroder med en spids modstand ~ 150 ± 30 MΩ. Brug af en glødetråd varme rampe test læsning som reference, anbefales det, at eksperimentatoren bestemme parametre empirisk, især med hensyn til variation i indstillingen "varme" mens maksimering tidspunktet for pull. Næste, mekanisk stabilitet af micromanipulators, headstages, pipette indehavere og modellen er helt afgørende. Bortset fra den indlysende nødvendighed for en vibration isolation tabel skal eksperimentatoren sikre, at alle fittings er sikker og at sceneområdet rundt og nedenunder manipulatorer er ren. Ideelt, uvedkommende støj bør reduceres, at løsningen af skarpe elektrode optagelser er inden for 1 mV. Den mest almindelige kilde til støj er vores erfaring, sølvtråd sikret i pipette indehaveren, der er behov for en tilstrækkelig chlorid belægning eller udskiftning helt. Hvis fælles 50/60 Hz støj er til stede, "hum silencing" teknologi kan bruges og leveres som standard med en moderne electrometer. Hvis støj forekommer helt uoverskuelig, skal du kontrollere, om der er en utæthed i bad eller overløb, hvor PSS vil komme i kontakt med modstande til temperaturkontrol. Hvis komplikationer fortsat med erhvervelse af en stabil Vm signal, tjekke integriteten af elektriske ledninger og t-stik.

Helt, hvis oprettelse af en skarp elektrode optagelse er forgæves, det er almindeligt på grund af en upassende elektrode, mekanisk ustabilitet eller dårlig cellulære sundhed. Alternativt kan eksperimentatoren ønsker også at overveje en konfiguration af patch-clamp-teknik på individuelle, elektrisk afkoblede celler hvor der kan indhentes oplysninger om hele cellen strømninger og enkelt ion-kanal optagelser. Selv konfronteret med de generelle udfordringer for at bruge et fluorescerende farvestof (f.eks., heterogene intracellulære lastning, blegning, kalibrering ved hjælp af ionophores, beskedne opdagelse beslutning), farvestoffer spænding-følsomme som Di-8-ANEPPS er også kommercielt tilgængelige.

Vores forståelse af endotel i blod flow regulering og gennem hele hjernen er afgørende med en hurtigt aldrende befolkning og den stigende forekomst af kronisk hjerte-kar- og neurodegenerative sygdomme. Dermed, vi leverer en metode til at isolere intakt endotelet fra en vital cerebral arterie, der kan tilpasses til andre vaskulære strukturer i hjernen. Derudover viser vi en nyttig tilgang til de samtidige målinger af underliggende [Ca2 +]jeg og Vm. Endelig kan celle-til-celle kobling gennem kløften vejkryds også vurderes på bruger dual intracellulære elektroder. Med omhyggeligt planlagte farmakologiske og/eller genetiske indgreb omfatter den nuværende protokol med rimelighed og kvantitativt undersøgelse af cerebral endotelfunktion i sin oprindelige form. Vores forventning er, at eksperimentatorer vil bygge fra og tilpasse disse oplysninger for at fremme vaskulær biologi og neurovidenskab generelt. Det ville især være tilfredsstillende at se fælles eksperimentelle kampe involveret med elektriske målinger minimeret helt. Selv om denne protokol ikke er en enkeltstående sæt af teknikker som helst måde, det kan bruges som en supplerende tilgang til at bestemme præcist, hvordan endotel biofysiske determinanter oversætte til ændringer i vaskulære modstand og hvordan de finjustere forordning af blodgennemstrømningen i forhold til betingelserne repræsentant for sundhed vs. sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Charles Hewitt fremragende teknisk bistand under oprettelse af udstyr og forsyninger til de nuværende protokoller. Vi takker Drs. Sean M. Wilson og Christopher G. Wilson, fra byens ubundtet adgang til Perinatal biologi, for at forsyne os med en yderligere inverteret mikroskop og electrometer, henholdsvis. Denne forskning har været støttet af National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) og Loma Linda University School of Medicine nye Fakultet start-up midler. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).

Tags

Biologi spørgsmålet 143 hjernen mikrocirkulationen endotel hyperpolarisering G-protein koblede receptorer Ca2 +-aktiveret K+ kanaler Fura-2 fotometri intracellulære microelectrodes intercellulære kobling
Samtidige målinger af intracellulære Calcium og membran potentiale i frisk isoleret og intakt mus Cerebral endotelet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hakim, M. A., Behringer, E. J.… More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter