Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

doi: 10.3791/58832 Published: January 20, 2019

Summary

המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.

Abstract

העורקים המוחיים ו microcirculation בהתאמה שלהם לספק חמצן וחומרים מזינים המוח דרך הדם לזרום ברגולציה. תאי אנדותל קו לומן של כלי דם ושינויים הפקודה קוטר כלי הדם לפי הצורך כדי בדרישה המטבולית של נוירונים. תלויי-אנדותל העיקרי איתות המסלולים של hyperpolarization של תחמוצת החנקן ו קרומית אפשרית (Vm) בדרך כלל פועלים במקביל כדי לתווך vasodilation ובכך להגביר את זרימת הדם. אמנם חלק בלתי נפרד תיאום vasodilation מעל מספר מ מ אורך כלי הדם, רכיבים של אנדותל, נגזר hyperpolarization (EDH) היה מבחינה היסטורית קשה למדוד. רכיבים אלה של EDH כרוכה תאיים Ca2 + [Ca2 +]אני מגדילה והפעלה עוקבות של קטן - ו ביניים מוליכות Ca2 +-מופעל K+ (SKCaגבירותייCa) ערוצים.

כאן, אנו מציגים דוגמה מפושטת של הבידוד של אנדותל טריים מן העורקים המוחיים העכבר; מדידות סימולטני של אנדותל [Ca2 +]אני ו- Vm באמצעות Fura-2 photometry ואלקטרודות חד תאיים, בהתאמה; של superfusion רציפה של פתרונות מלח וסוכני תרופתי בתנאים פיזיולוגיים (pH 7.4, 37 ° C). העורקים המוחיים האחורי של המעגל של וויליס יוסרו חינם של תקשורת האחורי, העורקים למפרצת. עיכול אנזימטי של נקי האחורי מקטעי עורקי המוח, trituration הבאים מקלה על הסרת adventitia, perivascular העצבים ותאי שריר חלק. וכתוצאה מכך האחורי מוחית עורקית אנדותל "צינורות" ואז מאובטחים תחת מיקרוסקופ ובחן באמצעות מצלמה, האופטיקה צינור, 1 ו- 2 electrometers תחת superfusion מתמשך. באופן קולקטיבי, בשיטה זו ניתן למדוד בו זמנית לשינויים אנדותל [Ca2 +]אני ו- Vm במיקומים הסלולר דיסקרטית, בנוסף הפצת EDH דרך הפער צמתי עד מילימטר במרחקים לאורך ללא פגע אנדותל. שיטה זו צפוי להניב ניתוח תפוקה גבוהה של הפונקציות אנדותל מוחי שבבסיס מנגנוני ויסות זרימת דם במוח רגיל וחולים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

זרימת הדם ברחבי המוח מוסדר על ידי התיאום של vasodilation בין העורקים המוחיים רבים רשתות כלי דם1. תאי אנדותל רירית מוחי התנגדות העורקים פקודה משתנה קוטר כלי הדם לפי הצורך לפגוש את הדרישה המטבולית של נוירונים1,2,3. בפרט, במהלך hyperpolarization נגזר אנדותל (הידוע בכינויו EDH), Ca תאיים2 + ([Ca2 +]אני) ההספק ואת האותות חשמליים, תאי אנדותל vasodilation לתאם בין תאי אנדותל שלהם תאי שריר חלק שמסביב דרך צמתים הפער עבור הרפיה עורקים4. חניכה פיזיולוגיים של EDH כרוכה ברצף גירוי של Gq-בשילוב קולטנים (GPCRs), עלייה [Ca2 +]אני, והפעלה של אנדותל קטן - ו ביניים-קה2 +-מופעל K+ (SKCaגבירותייCa) ערוצים hyperpolarize מוחי ממברנה אנדותל פוטנציאליים (Vm)5,6,7. לכן, הקשר האינטימי של אנדותל [Ca2 +]אני ו- Vm הוא חלק בלתי נפרד ויסות זרימת דם והכרחי cardio -, פונקציה כשאבדן6,8. בכל הספרות רחבה יותר, מחקרים רבים דיווחו על איגוד בתפקוד אנדותל כלי הדם עם התפתחותן של מחלות כרוניות (כגון: יתר לחץ דם, סוכרת, אי ספיקת לב, מחלת עורקים כללית, אי ספיקת כליות כרונית, מחלת עורקים היקפיים)9,10, המציין את המשמעות של הלומדים פונקציה אנדותל בתנאים פיזיולוגיים, כמו גם פתולוגי.

אנדותל כלי הדם הינו חיוני להצלחת תהליך הייצור של hyperpolarization, vasodilation רקמות זלוף, לפיכך, בחינת תכונותיו הסלולר מקורית היא קריטית. כמודל כללי מחקר, הכנת דגם צינור אנדותל עורקי העכבר שפורסם לפני על שרירי השלד11,12, הבטן13, ריאות14, ועל לאחרונה את המוח6. מחקרים של סימולטני [Ca2 +]אני ומדידות Vm בפרט פורסמו שרירי השלד אנדותל עורקי15,16 , כמו גם כלי הלימפה אנדותל17. בנוסף ראשי לימודי ניצול הגישה צינור אנדותל, סקירה מקיפה של יתרונות וחסרונות8 ניתן להתייעץ עם כדי לקבוע אם כלי ניסיוני זה מתאים למחקר ספציפי. בקצרה, יתרון זה רכיבי מפתח פיזיולוגיים של תפקוד תאי אנדותל נשמרות (למשל, Ca2 + זרם ושחרור תאיים, hyperpolarization של Vm עד פוטנציאל נרנסט עבור K+ ויה SKCaגבירותייCa הפעלה, והצמתים אנדותל צימוד המערכת באמצעות הפער) ללא בלבול גורמים כגון קלט עצבי perivascular, הפונקציה ערוץ ממותגת מתח שריר חלק contractility, מחזור הדם ואת השפעות הורמונליות8. לעומת זאת, גישות התרבות התא נפוץ להציג שינויים משמעותיים מורפולוגיה18 ויון ערוץ ביטוי19 בצורה מאוד יכול המאפילים על השוואות אל תצפיות פיזיולוגיים נקבע ex-vivo או אין ויוו. מגבלות לכלול חוסר אינטגרציה עם רכיבים חיוניים אחרים כדי לווסת את זרימת הדם, כגון שריר חלק וגמישות מוגבלת, לוח זמנים ניסיוני של מודל זה נבדק בצורה אופטימלית תוך 4 שעות של בידוד קטע כלי הדם ללא פגע מהחיה.

בניין פרוטוקול וידאו קודמים שנכתבו על ידי Socha, סגל12 התפתחויות ניסיוני ב ביניים6,15,16, נדגים בזאת את ניתוקה של אנדותל צח מ העורקים המוחיים האחורי ומדידות סימולטני של אנדותל [Ca2 +]אני ו Vm באמצעות Fura-2 photometry ואלקטרודות חד תאיים, בהתאמה. בנוסף, ניסוי זה כרוך superfusion רציפה של פתרונות מלח וסוכני תרופתי במהלך בתנאים פיזיולוגיים (pH 7.4, 37 ° C). בחרנו את עורק המוח האחורי, כפי שהיא נושאת אנדותל מבודד עם שלמות מבנית (תאים מצמידים דרך צמתים הפער), מספיק מידות (רוחב ≥50 מיקרומטר, אורך ≥300 מיקרומטר) לשכנוע אינטרה - והאיתות המערכת לאורך ובקרב תאי אנדותל. בנוסף, מחקרים של עורק המוח האחורי מכרסם מיוצגים באופן משמעותי בספרות ולהכיל בתוכו בחינת יסוד מנגנוני איתות אנדותל, פיתוח כלי דם/הזדקנות, פתולוגיה20, 21 , 22. יישום ניסיוני זה צפוי להניב ניתוח תפוקה גבוהה של מוחי אנדותל (ותפקוד לקוי), ובכך יאפשר התקדמות משמעותית ההבנה של תקנה זרימת דם בכל רחבי הזדקנות, התפתחות מחלות ניווניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לפני ביצוע הניסויים הבאים, להבטיח כי כל טיפול בבעלי חיים להשתמש, פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים הוועדה להשתמש (IACUC) וביצע בהסכמה עם המועצה הלאומית למחקר של "מדריך טיפול ושימוש חיות מעבדה" (8th מהדורה, 2011) ואת ההנחיות יגיעו. IACUC של לומה לינדה האוניברסיטה אישר כל הפרוטוקולים משמש כתב יד זה על עכברים C57BL/6 זכר ונקבה (טווח גילאים: 3-30 מו).

1. ציוד וחומרים

הערה: ניתן למצוא פרטים של החומרים הנדרשים עבור הפרוטוקול שולחן של חומרים, ריאגנטים, וגם מדריכים או המזוהים עם הספקים המתאימים.

  1. זרימה קאמרית
    1. הדקו תא superfusion עם חלק תחתון coverslip זכוכית לתוך פלטפורמת אלומיניום. אבטח את הפלטפורמה עם הקאמרית לתוך שלב אלומיניום קומפקטי.
    2. הגדר micromanipulator בכל קצה של פלטפורמת על הבמה אלומיניום עבור מחזיק את פיפטה ההצמדה.
      הערה: כאפשרות מעשית, השתמש והתותח שלב ניתן להעברה עם זרימה קאמרית יחידה מאובטחת כדי להקל על המעבר בידוד של הצינור אנדותל הביצועים של הניסויים.
  2. מיקרוסקופים
    1. שימוש stereomicroscopes (5 x טווח הגדלה x 50) מצוידים עם סיבים אופטיים מקורות אור עבור שגרות מאקרו - ו ניתוח מיקרו.
    2. עבור הכנה של צינורות אנדותל, השתמש במיקרוסקופ הפוכה מצויד שלב חדות או דיפרנציאלית הפרעות ניגודיות (DIC) תואם יעדים (10 x, 20 x ו- 40 x), שלב אלומיניום.
    3. לבידוד צינורות אנדותל של כלי דם מעוכל חלקית, מקום של בקר משאבת microsyringe סמוכים זה המנגנון הכנה צינור אנדותל.
    4. המנגנון ניסיוני, להשתמש במיקרוסקופ הפוכה מצויד עם מטרות רגיל (4 x ו- 10 x) בנוסף יעדים פלורסנט (20 x ו- 40 x, מפתח נומרי 0.75), שלב אלומיניום ידנית על שולחן בידוד רטט.
  3. ציוד הקלטה תאיים
    1. כדי להקליט את ה-Vm תאי אנדותל צינורות אנדותל מבודד, להתחבר אלקטרומטר את headstage תואם. במידת הצורך, חבר של מחולל אותות או ממריץ אלקטרומטר לניסויים הדורשים נוכחי הזרקת.
    2. להתחבר התוצרים מגבר מערכת רכישת נתונים בסיסית נשמעים צגים, אוסצילוסקופ. לאבטח האלקטרודה הפניה (גלולה Ag/AgCl) ליד היציאה קאמרית זרימה במהלך הניסויים.
    3. להשתמש במערכת בהשוואת עם רכיבים משולבים של קרינה פלואורסצנטית מערכת ממשק, גבוהה עוצמת מנורת קשת וכוח האספקה, hyperswitch, האופטיקה צינור (או PMT), ואת המצלמה למדוד [Ca2 +]אני בתאי האנדותל.
    4. השתמש בקר טמפרטורה מצויד שמש בתוך השורה להעלות ולשמור על טמפרטורה פיזיולוגיים (37 מעלות צלזיוס) לאורך כל הניסוי.
    5. השתמש פלטפורמה מאגר ששת המחוברים לבקר שסתום עם שסתום בקרת זרימה מוטבעת לשלוט המשלוח של פתרונות המתאימים הצינור אנדותל מאובטח בבית הבליעה.
  4. Micropipettes ואלקטרודות חדה
    הערה: כדי לייצר פיפטות trituration וייצוב מכני של צינורות אנדותל מבודד, לשימוש של פולר אלקטרונית מושך את מדי סוכר, מיקרו-פורג לשבירה ואש ליטוש.
    1. להפריד המקטע עורקי מעוכל חלקית adventitia שריר חלק, הצינור אנדותל, להכין trituration מכשור ניסוי ברטט (כל אחד בקוטר טיפ פנימי של 80-120 מיקרומטר) לפי הצורך, באמצעות צינורות קפילר זכוכית בורוסיליקט, ואש ללטש את הטיפ.
    2. כדי לאבטח את הצינור אנדותל בתחתית תא superfusion, להשתמש פיפטות ההצמדה עם קצה קהות, כדורית (חום-מלוטש, OD של 100 – 150 מיקרומטר; מקריסטלים של צינורות זכוכית בורוסיליקט דק-קיר).
    3. כדי להקליט Vm של תא אנדותל, להכין אלקטרודות חדה עם התנגדות עצה של ~ 150 ± 30 MΩ של זכוכית צינורות קפילר באמצעות של פולר אלקטרונית.

2. אופן ההכנה של פתרונות וסמים

  1. תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS)
    1. בניסוי אחד עם ההכנות סמים, להכין מינימום של 1 ליטר של PSS שימוש: 140 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ CaCl2, 1 מ MgCl גלוקוז2, 10 מ מ N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic חומצה (HEPES) ו- 10 מ מ.
    2. כדי להכין את הפתרונות הנדרשים עבור ניתוח, בידוד של עורק המוח, והכנה של צינור אנדותל, להכין PSS חסר CaCl2 (אפס Ca2 + PSS).
    3. להכין את כל פתרונות הנדסה גנטית יונים H2O, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4, לעקר אותם דרך מסנן (0.22 µm גודל הנקבוביות) ולהבטיח כי osmolality הפתרונות הוא בין mOsm 290 עד 300.
      הערה: פתרונות שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כשבועיים.
  2. 10% אלבומין שור (BSA)
    1. כדי להכין 10% BSA, יתמוסס 1g של האבקה lyophilized גביע של 10 מ"ל אפס Ca2 + PSS.
    2. לכסות את. הספל עם סרט פרפין ולאפשר תקופה של כמה שעות יעברו, ללא ערבוב איטי עבור BSA להתמוסס.
    3. לסנן את הפתרון הסופי באמצעות מזרק 10 מ ל בתוספת מסנן מיקרומטר 0.22 ולעשות 1 מ"ל aliquots להיות מאוחסנים ב-20 ° C.
  3. פתרון לנתיחה
    1. כדי להכין 50 מ של פתרון לנתיחה, להוסיף 500 µL של BSA (10%) 49.5 מ של אפס Ca2 + PSS.
    2. מיד לאחר ההכנה, להעביר פתרון זה דיסקציה לתוך צלחת פטרי עבור ניתוח עורקי.
  4. פתרון דיסוציאציה
    1. כדי להכין 50 מיליליטר דיסוציאציה פתרון, להוסיף 5 µL של CaCl2 (1 מ'), µL 500 של BSA (10%) 49.5 מ של אפס Ca2 + PSS. לאפשר את הפתרון לשבת בטמפרטורת החדר (RT).
  5. אנזימים
    1. לעיכול חלקי עורקי המקטעים, להכין 1 מ"ל של פתרון מערכת העיכול עם פפאין 0.31 מ"ג/מ"ל, dithioerythritol 0.5 מ"ג/מ"ל, collagenase 0.75 mg/mL (H סוג מיזוג) elastase 0.13 מ"ג/מ"ל.
      הערה: פעילות האנזים עשויה להשתנות; עם זאת, עבור פרוטוקולים מוצלח שלנו, פעילות האנזים מסחרית שסופקו שימשו כדלקמן: פפאין ≥ 10 יחידות/מ ג; collagenase ≥1 יחידות/mg, עבור מחזור המצע N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala או FALGPA; ו elastase ≥ 5 יחידות/mg.
  6. הכנת Fura-2 וסוכני תרופתי
    1. להכין מלאי ריכוז (1 מ מ) של Fura-2 AM לצבע דימתיל סולפוקסיד. הכנת ריכוז העבודה (10 מיקרומטר) על-ידי הוספת µL 5 מניות µL 495 של PSS לטעינה.
    2. להכין ≥50 מ ל עובד ריכוזים של סוכנים תרופתי (למשל, ATP) ב PSS לפי הצורך.
  7. ניצוח פתרון
    1. להכין ניצוח על פתרון, 2 מ' אשלגן כלורי, על ידי המסת אשלגן כלורי יונים H2O (7.455 גרם אשלגן כלורי 50 מ ל H2O).
    2. לסנן הפתרון דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22 לפני למלא את משבצות האלקטרודות חדה.
  8. Propidium יודיד (0.1%)
    1. להמיס 10 מ ג של יודיד lyophilized propidium ב- 10 מ"ל של 2 מ' אשלגן כלורי.
    2. מערבבים היטב ולאחסן ב RT.

3. ניתוח ובידוד של חסימת עורק צרברלי אמצעי

הערה: כל ההליכים לנתיחה דורשים הדגימה הגדלה (עד 50 x) דרך stereomicroscopes ותאורה הניתנים על ידי סיבים אופטיים מקורות אור. כדי לבצע הליכים לנתיחה בידוד של המוח ושל העורקים, להשתמש בכלים לנתיחה מחודדים. Microdissection כלים לבודד ולנקות את העורקים כוללים מחודדים שקצהו הקנס מלקחיים ומספריים Vannas סגנון לנתיחה (להבים 3 ל 9.5 מ מ).

  1. בידוד של מוח העכבר
    1. עזים ומתנגד העכבר (3-30 חודשים ישן; זכר או נקבה) של C57BL/6 דרך שאיפה של איזופלוריין (3% למשך 2-3 דקות) ולאחר מכן לערוף את החיה מיד לאחר אינדוקציה מלאה של הרדמה. שים את ראשך בצלחת פטרי (בקוטר 10 ס מ, עומק 1.5 ס מ) המכיל קר (4 ° C) אפס Ca2 + PSS תחת stereomicroscope.
    2. הצגת מבעד למיקרוסקופ, להסיר את העור והשיער על הגולגולת ולהסיר מוגזמת בדם קר אפס Ca2 + PSS. לעשות חתך באמצעות רק הקצוות של ניתוח סטנדרטי מספריים (למשל, 24 מ מ להבים), החל עצם העורף ולהרחיב את דרך העצם באף של הגולגולת.
    3. לפתוח את הגולגולת בקפידה לאורך החתך באמצעות מלקחיים גס שקצהו, רקמת חיבור נפרד כדי לבודד את המוח עם מעגל שלם של וויליס.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש מלקחיים חיתוך עצם Littauer כדי לפתוח את הגולגולת וחושפים את המוח.
    4. לשטוף בעדינות המוח מבודדים עם הקור אפס Ca2 + PSS בתוך ולהסיר את הדם. מניחים בצד הגחוני במוח פונה למעלה בחדר המכיל ניתוח קר פתרון עבור בידוד של העורקים המוחיים (איור 1 א').
  2. בידוד של העורקים המוחיים
    הערה: עורק המוח האחורי נבחרה כמודל נציג מחקר אנדותל כשאבדן עבור פרוטוקול זה.
    1. לאבטח את המוח מבודדים בתמיסה לנתיחה קר באמצעות פינים מנירוסטה (קוטר 0.2 מ מ, אורך ~ 11 – 12 מ מ) שיוכנס לתוך פולימר סיליקון חלוטים פחם ציפוי התחתון (עומק ≥50 ס מ) של כוס, צלחת פטרי.
    2. כדי לשמור מקורר לטמפרטורה של PSS במהלך ניתוח, השתמש תא לנתיחה מקורר על ידי מערכת צינון ללא הרף על אופניים תערובת 1:1 מים אתילן גליקול. לחלופין, ניתן לבצע חיתוך קרח טרי.
    3. בניתוח לבודד את העורקים המוחיים האחורי (~0.3 עד 0.5 ס מ מקטעים, אין מתח צירית) תקשורת האחורי ואת למפרצת העורקים באמצעות microdissection מכשירים Vannas סגנון מספריים ומלקחיים מחודדים שקצהו פיין (איור 1B ). השתמש פינים מנירוסטה (בקוטר 0.1 מ"מ, אורך ~ 13 – 14 מ מ) כדי מאובטח שניהם מבודדים האחורי העורקים המוחיים בפתרון לנתיחה בצלוחית הפטרי (איור 1C).
    4. לנקות את העורקים המוחיים האחורי מבודד היטב על-ידי הסרת רקמת חיבור באמצעות מלקחיים שקצהו הקנס מחודדים (איור 1D). לחתוך את העורקים שלם לחלקים (אורך 1-2 מ מ) לעיכול אנזימטי (איור 1D; שיבוץ).

4. הכנת צינור אנדותל, Superfusion

הערה: הצינור אנדותל מוכן כפי שתואר לעיל12, עם השינויים עבור עורק המוח6.

  1. הכינו את המנגנון trituration באמצעות מיקרוסקופ מצוידים עם מטרות (10 x, 20 x ו- 40 x), מצלמה, שלב אלומיניום מחזיקים תא micromanipulators. מאובטחת microsyringe עם בקר המשאבה סמוך לשלב הדגימה (איור 2 א).
  2. לחלוטין מילוי trituration פיפטה עם שמן מינרלי ואבטח אותו מעל הבוכנה מיקרו-מזרק. לאחר מכן, באמצעות המזרק המיקרו עם משאבת בקר, להתכנס דיסוציאציה פתרון בתוך פיפטה (~ 130 nl) מעל שמן מינרלי תוך הקפדה על העדר של בועות אוויר פיפטה.
  3. מקם מקטעי עורקי שלם לתוך 1 מיליליטר דיסוציאציה פתרון שפופרת זכוכית 10 מ ל (איור 2B), המכיל פפאין 0.31 מ"ג/מ"ל, dithioerythritol 0.5 מ"ג/מ"ל, collagenase 0.75 mg/mL, elastase 0.13 מ"ג/מ"ל. דגירה ב 34 מעלות צלזיוס למשך 10 – 12 דקות לעיכול חלקי.
  4. בעקבות העיכול, החלף את הפתרון האנזים ~ 5 מיליליטר דיסוציאציה טריים פתרון. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, להעביר קטע אחד לתא המכיל את הפתרון דיסוציאציה-RT.
  5. למקם את פיפטה הפתרון דיסוציאציה בבית הבליעה ומקם אותה ליד קצה אחד של כלי השיט מעוכל. לקבוע שיעור בטווח של 2-5 nL/s הבקר משאבת עבור trituration עדין (איור 2C; שיבוץ).
  6. תוך כדי צפייה דרך x 100 200 x הגדלה, לסגת והוצא על קטע עורקי מביצועם תאי שריר חלק תוך ייצור של צינור אנדותל. במידת הצורך, השתמש בזהירות מלקחיים שקצהו בסדר כדי להפריד adventitia הפומבית ו פרופריה אלסטית פנימית מהצינור אנדותל. לאשר כי הם חלופה מועדפת של כל תאי שריר חלק, כי תאי אנדותל רק להישאר שלם "צינור" (איור 2C).
  7. באמצעות micromanipulators, אבטח בכל קצה הצינורית אנדותל על תגית כיסוי זכוכית לשכת superfusion באמצעות זכוכית בורוסיליקט הצמדה מכשור ניסוי ברטט (איור דו-ממדי).
  8. שטיפת-אאוט הפומבית adventitia ותאי שריר חלק קאמרית, החלף הפתרון דיסוציאציה עם 2 מ מ CaCl2 PSS. להעביר את פלטפורמת הניידים עם צינור אנדותל מאובטחת אל המיקרוסקופ של האסדה superfusion וניסויים.
  9. השתמש נקי 50 מ ל 6 מאגרים (איור 3 א) למסירה רציפה של PSS ופתרונות בהתאמה סמים במהלך הניסוי, לפי הצורך. השתמש את השסתום בקרת זרימה בתוך השורה להגדיר ידנית את קצב הזרימה ברחבי כמו עקבי עם זרימה שכבתית תוך התאמת זרימת להאכיל שאיבה ואקום. לספק PSS לתא (איור 3B) בשביל superfusion של הצינור אנדותל עבור ≥ 5 דקות לפני הקלטת נתוני רקע וצבע טעינה.

5. צבע עומס, שטיפת-אאוט והגדרות טמפרטורה

  1. הפעל את כל הרכיבים של מערכת photometry למדידת [Ca2 +]אני. השתמש המיקרוסקופ על האסדה ניסיוני (איור 3C) כדי להציג את הצינור אנדותל-400 x הגדלה, ולהתרכז על תאים בחלון בהשוואת באמצעות חבילת התוכנות של מערכת photometry.
  2. למדוד את הקוטר של הצינור אנדותל והקלטה של ערכי autofluorescence הרקע בהסכמה עם פליטה 510 ננומטר במהלך עירור חלופי-340 ו 380 nm (≥ 10 Hz).
  3. כדי למדוד [Ca2 +]אני תגובות, טען הצינור אנדותל עם Fura-2 אני צובע (10 מיקרומטר ריכוז סופי) ב RT ולאפשר ~ 30-40 דקות בהיעדרו של אור.
  4. מחדש superfusion של הצינור אנדותל עם PSS טריים ~ 30 – 40 דקות לשטוף-out עודף צבע ולאפשר תאיים Fura-2, אני מבטל את esterify. במהלך תקופת שטיפת-אאוט, להעלות את הטמפרטורה בהדרגה מ- RT עד 37 ° C באמצעות בקר טמפרטורה (איור 3A) עם חימום בתוך השורה ולאחר מכן לשמור ב 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הניסוי.
    הערה: המעבר מצטבר המומלץ בין RT עד 37 ° C כרוכה בשלושה שלבים (למשל, 5 ° C) עם זמן equilibration ≥5 דקות בכל שלב.

6. סימולטני מדידה של [Ca2 +]אני ו- Vm

  1. הפעל כל ציוד אחר ואת חבילת התוכנות אלקטרומטר למדידת Vm (ראו איור 3, איור 4). להתאים את קצב רכישת נתונים בהתאם (≥ 10 Hz).
  2. משוך אלקטרודה חדה עם מילוי עם 2 מ' אשלגן כלורי. ללימודים של המערכת צימוד באמצעות העברה צבע, מילוי של microelectrodes עם יודיד propidium 0.1% מומס 2 מ' אשלגן כלורי.
  3. לאבטח את האלקטרודות על חוט כסף מצופה כלורי המחזיק פיפטה צמוד לשלב ראש אלקטרומטר מאובטח עם micromanipulator. השתמש את micromanipulator למיקום בקצרה את קצה האלקטרודה לתוך PSS זורמים בבית הבליעה תוך כדי צפייה דרך המטרה 4 x.
  4. הגדר את מנוחתו Vm 0 בקנה אחד עם אמבטיה מוארק פוטנציאליים. מקמו את קצה האלקטרודה רק תא של הצינור אנדותל. במידת הצורך, השתמש צגים בסיסית נשמעים קשורה electrometers לשייך גובה צליל הקלטות פוטנציאליים.
  5. הגברת ההגדלה 400 x באמצעות המטרה 40 x, ולמקם מחדש את קצה האלקטרודה כנדרש. התאם לחלון בהשוואת באמצעות התוכנה photometry להתמקד על תאי אנדותל ~ 50 עד 80.
  6. בעדינות מניחים אחד התאים של הצינור אנדותל באמצעות micromanipulator את האלקטרודה ולא לחכות מינימום ≥2 מנוחתו Vm לייצב. באופן דומה, הכנס את האלקטרודה השנייה של תא אחר (מרחק ≥100 מיקרומטר) מהתא הראשון עם אלקטרודה הראשון.
  7. לאחר מנוחה Vm יציב על ערכיה צפוי (-30 ל-40 mV)6, להפעיל את PMT בממשק פלורסצנטיות, בהעדר אור ולהתחיל רכישת תאיים [Ca2 +]אני מאת מרגש Fura-2 לסירוגין (10 Hz)- 340 ו 380 nm תוך איסוף פליטת קרינה פלואורסצנטית-510 ננומטר.
    הערה: כדי לבדוק את המערכת צימוד חשמלי, הנוכחי (± 0.5-3 נה, משך פעימה s ~ 20) יכולה להיות מועברת דרך אחד אלקטרומטר כאתר"1", ניתן לרשום שינויים של Vm אלקטרומטר אחר כמו "באתר 2" (מרחק ≥100 מיקרומטר).
  8. מרגע בו זמנית מדידות של Vm ו [Ca2 +]אני מבוססים, תאפשר ~ 5 דקות עבור superfusion צינור אנדותל עם PSS בקצב קבוע זרימה שכבתית לפני היישום של סמים.
  9. להחיל את התרופה (למשל, ATP) המבושלות PSS לתא superfusion עם קצב הזרימה מתמדת. לאחר ~ 3 דקות (או פרק זמן מתאים קינטיקה של התרופה), לשטוף עם PSS עד Vm והיחס380 F /F340להחזיר את תנאי התוכנית הבסיסית שלהם. סמן הקלטות בהתאמה כמו חנותם מסונכרן על פני הסוויטות תוכנה photometer ו אלקטרומטר במהלך כל המעבר של פתרונות.
  10. ברגע נעשה את הניסוי, לסגת אלקטרודה מהתא באמצעות micromanipulator את ושים לב Vm ~ 0 mV כמו המופנה על ידי האלקטרודה אמבט. לעצור הקלטות בהתאמה של Vm ו [Ca2 +]אני ולהציל את הרשומות בקובץ לניתוח נתונים.

7. ויזואליזציה של צימוד לתא

  1. כדי להמחיש צימוד לתא דרך propidium יודיד, להשתמש סימן x 40 או 60 x המטרה פלורסנט עם צוהר מספרי גבוה יחסית (למשל, 0.95) rhodamine מסנן מוגדר עם תאורה של מצב מוצק, מצלמה ברזולוציה גבוהה (למשל, 16- מגה פיקסל), ואת חבילת תוכנות הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ההפגנה סכמטי של הפרוטוקול המתואר לעיל מוצג הדמויות המצורפת. מוח מבודד צעירים למבוגרים זכר C57BL/6N עכבר (5 חודשים) מוצג איור 1A. העורקים המוחיים האחורי מבודדים היטב מן מעגל ויליס, להסיר אותן ללא רקמת חיבור, ולחתוך לחלקים (איור 1B-D). מ מקטעי עורקי מעוכל חלקית, הצינור אנדותל שלם המיוצר, מאובטח על תגית כיסוי זכוכית באמצעות פיפטות ההצמדה. מתיחה מכנית עדינה מיושמת באמצעות פיפטות הצמדה שני אומדן אורך ויוו ללא כלי tortuosity. זה יש נוספת הובהרו בכתב היד (איור 2 א). אנדותל מבודד מן העורקים המוחיים האחורי הצינורות ~ 90 – 100 מיקרומטר ב רוחב ו ≥300 מיקרומטר באורכו. הצינור היא עמוסה Fura-2 אני ואחריו שטיפת-אאוט עם PSS. מדידת סימולטני [Ca2 +]אני ו- Vm בצינור אנדותל מתבצע על ידי Ca2 + photometry, כמו גם חדה אלקטרודה electrophysiology (ניסיוני הציוד שמוצג באיור 3 ו- 4 באיור).

הערכה תפקודית של הצינור אנדותל מתבצע על-ידי החלת קלאסית אנדותל GPCR אגוניסט כגון ATP אל החדר זרימה בתנאים פיזיולוגיים. כמוצג באיור5, [Ca2 +]אני ו- Vm נרשמים בו זמנית בתגובה ATP (100 מיקרומטר). Hyperpolarization משמעותית של Vm (≥5 mV) מתרחשת/ת עם תאיים [Ca2 +]אני עלייה, המציין כי עלייה [Ca2 +]אני מפעיל SKCaגבירותיי ערוציCa ובכך מאפשר בזרימת K+ על פני קרום פלזמה כדי לייצר EDH. עדות צימוד המערכת באמצעות הזרקת הנוכחי (± 0.5 עד 3 נה, ~ 20 s פולסים) ניתן למצוא בעבודתנו שפורסם לאחרונה (הפניה6, איור 1). הערה שיודיד propidium הזה יש מסה של Da ~ 668 ביחס שליחים השנייה ידועה עובר דרך צמתים הפער כגון אינוזיטול טריפוספט (IP3, Da ~ 420), אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה, Da ~ 329).

Figure 1
איור 1 : בידוד של עורק המוח מהמוח. (א) המוח מבודדים עם עורקים שלם (חץ לבן מציין את עורק המוח האחורי) בתמיסה dessection. Magnified (B) תצוגה של עורק המוח האחורי (חץ לבן; ~ 3 x vs. פאנל A). (ג) מבודד האחורי העורקים המוחיים מאובטח עם פינים מנירוסטה בצלחת הדגימה. (ד) אחוריים העורקים המוחיים בעקבות ההסרה של רקמות החיבור. שיבוץ מראה לחתוך קטעים של העורקים; סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : הכנת צינור אנדותל מוחי. (א) ציוד המשמש triturating את מקטעי עורקי מעוכל חלקית; = micromanipulator, b = קאמרית להכנת שפופרת, c = שלב אלומיניום, d = microsyringe, e = מיקרוסקופ, f = microsyringe משאבת בקר. (B) עורקי מגזרים (החצים הלבנים) בתמיסה לעיכול אנזימטיות. (ג) אנדותל צינורות שהוכנו על ידי trituration; = trituration פיפטה, b = צינור אנדותל ללא פגע. שיבוץ מציגה את תהליך trituration כדי להסיר adventitia ותאי שריר חלק; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D) הצינור אנדותל שלם מאובטח על תגית כיסוי זכוכית עם פיפטה הצמדה; = הצמדה פיפטה, b = שלם אנדותל צינור בקוטר של ~ 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : ציוד superfusion סימולטני [Ca2 +] . אני ו- V m מידות. (א) ציוד superfusion של שפופרת אנדותל, בקרת טמפרטורה, = בעוצמה גבוהה קשת מנורת אספקת החשמל, b = ממשק מערכת פלורסצנטיות, c = בקר טמפרטורה, d = 6-מאגרים של מערכת superfusion, e = אור סיבים אופטיים מקורות, f = שסתום בקר, g = hyperswitch [Ca2 +]אני photometry במערכת. מכשיר Superfusion קאמרית (B); ו- b = headstages, c = קרקע אלקטרודה, d = מוטבעת מחמם, e = צנור superfusion, f = g היניקה, ואקום = תא superfusion, h = שלב אלומיניום מחזיק את התא. (ג) פלטפורמה ניסיוני על שולחן בידוד רטט; מתאם מסגור = תא עם מצלמה, b = c מיקרוסקופ אור, מיקרוסקופ, d = = שלב אלומיניום, e = micromanipulator לשליטה headstage, f = רטט בידוד טבלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : ציוד הפעלה אלקטרופיזיולוגיה ורישום נתונים. = אוסצילוסקופ, b = מחולל אותות, c = בסיסית נשמעים צג, d = מסנן רעשי 50/60 הרץ, e ו- f = electrometers, g = מערכת רכישת הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : סימולטני [Ca2 +] . אני ו- V m הקלטות. (א) תמונות חדות התערבות דיפרנציאלית (400 x) של העכבר מוחית עורקית אנדותל שפופרת להתאמה עבור ניסוי בחלון בהשוואת באמצעות מטרה 40 x. אלקטרודה חדה ימוקם תא כפי שמוצג בחלק העליון של התמונה (חץ לבן). עקבות Raw (B) למדידת סימולטני F340/F380 יחס (למעלה) ו- Vm (למטה) בתגובה ATP (100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לאור האחרונות התפתחויות6,15,16,17, נדגים כעת את השיטה כדי לבודד את העכבר אנדותל עורקי מוחין לקראת מדידה סימולטני של [Ca2 +] אני ו- Vm שבבסיס EDH בעקביות על ~ 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. למרות שטכנית קשה, אנו יכולים למדוד-לתא צימוד גם כן (ראה התייחסות6, איור 1). באופן זה, אנו יכולים למדוד דיסקרטית וניצח איתות האירועים בו זמנית. עבור חשבון של אתגרי כללי תוך בידוד אנדותל עורקי העכבר להתייעץ עם הפניות11,12. אנו מדגישים שלבים קריטיים עבור בידוד העורקים המוחיים העכבר, שלנו מדידות מסוים של אנדותל [Ca2 +]אני ו Vm, הצעות לפתרון, ושיקולים עבור שיטות אלטרנטיביות לאור ניסיוני עוצמות/חולשות להלן.

עורק המוח האחורי דורש זהירות בידוד מעגל של וויליס, רקמת חיבור ללא נזק שריר חלק ותאי אנדותל. כלי ניתוח (מלקחיים ומספריים) צריך להיות מתאים העכבר הליכים של דיסקציה microcirculation בזמן מתוחזק עם קצוות נקייה, חדה. יחסי אל שרירי השלד12, הורדנו תקופת זמן דגירה אנזימטי על ידי שני שלישים את ריכוזי פפאין, collagenase ו- dithioerythritol בחצי תוך הוספת שימוש ריכוז elastase מדעית ממוטבת. להצלחה עקבית לבודד מוחית עורקית צינורות אנדותל, חשוב כדי אנזימים סדר בקבוצות (2-4 בקבוקונים) מיצרן מכובד מאוד עם שיטות ייצור עקבי בהסכמה עם תדירות השימוש ואת חיי מדף. אפילו עם הפוטנציאל של וריאציה של פעילות אנזים אחד החניה של האנזים הבא, הוא הציע כי ריכוז האנזים להישמר תוך אופטימיזציה זמן העיכול בתוך 10 עד 12 דקות. ראוי לציין כי לא מגדרית ולא גיל של החיה (3-30 חודשים) כבר חסם משמעותי כדי הכנת אנדותל מבודד מן העורקים המוחיים בחוויה שלנו. לכן, מומלץ כי ההרכב של האנזים קוקטייל והשעה של אנזים עיכול נשארים זהים במחקרים על גיל ומין.

כמו הדגיש, נדרש משנה זהירות במהלך trituration עדין ובידוד של אנדותל מ- adventitia ותאי שריר חלק בצורת כישור על מנת למנוע נזק תאי אנדותל12. עבור השלב trituration, מגישה שמן מינרלי צמיגה כמדיום הידראולי בין הבוכנה של המיקרו-המזרק של PSS מימית כדי למשוך או להוציא כלי מקטעי טובל PSS. יצוין, כי אם קטע כלי יוצר קשר של שמן מינרלי, שלב זה יש לחזור בעזרת פיפטה trituration נקי למלא את משבצות רציפים של שמן מינרלי, PSS. לפני ניסוי, מומלץ כי אורך כ ליניארי ויוו לשחזר את הצינור אנדותל במידת האפשר, לפיה תאים בודדים להניח מורפולוגיה "שטוח", האורך (למשל, קוטר ~ 5 מיקרומטר; אורך ~ 100 מיקרומטר; עובי ~0.5 מיקרומטר)8. עם זאת, המתח צירית לא צריך להיות מוחל במידה שבה תאים בקצוות של הדגימה נמשכים משם מתחת פיפטות הצמדה בהתאמה ויציבות מכנית ובכך להתפשר על מדידות הסלולר אמין במהלך הניסוי.

האור [Ca2 +]אני מדידת מערכת להשתמש בטכניקה זו מתאימה מדידות רציפה של אנדותל [Ca2 +]i באמצעות רציומטרי את צבען Fura-2. פרוטוקולים בודדים יכולים סוף בדרך כלל ≥ 10 דקות בלי photobleaching משמעותית. עוד יותר, אנו משתמשים בגישה זו בדרך כלל למדידת [Ca2 +]אני כי זה נוטה הפוגות בזמן קירור והקפאה ותנועה תכופים של מיקרוסקופ מטרות לפי הצורך כדי לאבטח אלקטרודות חדה למדידותm V. שים לב כי זה היא גישה בהשוואת הלוכד רק הכללית, בממוצע [Ca2 +]אני בין תאים מרובים. באופן כללי, עבור [Ca2 +]אני מדידות, אנו ממליצים photometry על האפיון הראשוני של תאי אנדותל התגובות סוכנים תרופתי (למשל, הזמן קורס של שלבים הפסגה ואל מישור) תוך אבטחת מתכננת המשך quantitate microdomain איתות האירועים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או multiphoton רגיל12,23.

הגישה אלקטרופיזיולוגיה אלקטרודה חדה היא לשכנוע משולב הקלטותm V בהכנות multicellular פיזיולוגיים. המדד של V תאייםm היא עד כה הכי טכנית מאתגר עם שלבים קריטיים רבים יכולים להקל או להשמיד את ההצלחה של מדידות. ראשית, הנסיין צריכה לקבוע את התנאים תוכנית אופטימלית על פולר זכוכית בעקביות ייצור אלקטרודות חדה עם התנגדות עצה של ~ 150 ± 30 MΩ. באמצעות מבחן הרמפה חום פילמנט קריאה כהפניה, מומלץ כי הנסיין לקבוע פרמטרים מדעית, במיוחד בנוגע וריאציה של ההגדרה "חום" תוך מיקסום הזמן של משיכה. יציבות הבא, מכני של micromanipulators, headstages, מחזיקי פיפטה, הדגימה היא חיונית. מלבד הצורך הברור של טבלה בידוד רטט, הנסיין צריך להבטיח כי כל אביזרי מאובטחים ואת הבמה מסביב ומתחת המניפולטורים שהאזור נקי. באופן אידיאלי, הרעשים החיצוניים צריך להיות מופחת כך הרזולוציה של אלקטרודה חד הקלטות נמצא במרחק 1 mV. מניסיוננו, המקור הנפוץ ביותר של רעש הוא חוט כסף מאובטח ב בעל פיפטה כי הוא זקוק ציפוי כלוריד מספיקות או החלפת לגמרי. אם הרגילות 50/60 הרץ, טכנולוגיה "לזמזם להשתיק" יכול לשמש, מגיעה כסטנדרט עם אלקטרומטר מודרני. אם הרעש מופיעה לחלוטין דעי, בדוק אם יש נזילה באמבטיה או גלישה שבו PSS יבוא במגע עם נגדים עבור בקרת טמפרטורה. אם סיבוכים נשארים עם רכישת אותמ' V יציבה, לבדוק את תקינות כבלי חשמל ו- t-מחברים.

בסך הכל, אם הקמת שהקלטה אלקטרודה חדה אינה מצליחה, זה בדרך כלל עקב אלקטרודה לא הולם, יציבות מכנית, או בריאות לקויה הסלולר. לחלופין, הנסיין אולי גם כדאי לשקול תצורה של הטכניקה תיקון-קלאמפ על תאים בודדים, חשיפות חשמלית איפה ניתן לקבל מידע על כל התא וזרמים יון בודד ערוץ הקלטות. למרות מול האתגרים כללי השימוש של הפלורסנט (טעינת תאיים הטרוגניות, , הלבנה, באמצעות ionophores, איתור מודסט רזולוציה כיול), מתח רגיש צבענים כמו גם הם די-8-ANEPPS זמינים מסחרית.

הבנתנו אנדותל בתקנה זרימת הדם ברחבי המוח ואליה הוא קריטי עם במהירות הזדקנות האוכלוסייה האנושית לבין שכיחות העולה של מחלות קרדיו-וסקולריות ושל ניווניות כרוניות. לכן, אנו מספקים שיטה אנליטית אנדותל ללא פגע מן עורק צרברלי חיוני, אשר עשוי להיות מותאם מבנים אחרים כלי דם במוח. בנוסף, אנו מראים בגישה שימושי עבור המדידות בו זמנית של כבסיס [Ca2 +]אני ו Vm. לבסוף, באמצעות אלקטרודות תאיים כפול, צימוד דרך צמתים הפער מתא לתא יכול גם להיות מוערך. עם התערבויות תרופתי ו/או גנטי מתוכנן בקפידה, בפרוטוקול הנוכחי באופן סביר, באופן כמותי כוללת לימוד של תפקוד מוחי אנדותל בצורתו הטבעית. הציפייה שלנו היא כי ניסויים לבנות מן להתאים את המידע כדי לקדם לביולוגיה ומדעי המוח באופן כללי. בפרט, זה יהיה משביע רצון לראות את המאבקים ניסיוני משותף מעורב עם מדידות חשמל ממוזער לגמרי. למרות פרוטוקול זה אינו עצמאי סט של טכניקות בכל האמצעים, זה יכול לשמש כמו בגישה המשלימה כדי לקבוע גורמים biophysical אנדותל בדיוק איך לתרגם שינויים התנגדות כלי הדם, איך הם לכוונן רגולציה הדם לזרום יחסית לתנאים נציג של בריאות vs. המחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים צ'ארלס יואיט לסיוע טכני מעולה בזמן הקמת ציוד ואספקה הדרושים עבור הפרוטוקולים הנוכחי. אנו מודים ד"ר שון וילסון ו כריסטופר וילסון, מהמרכז LLU על ביולוגיה הלידה, על מתן אותנו עם מיקרוסקופ הפוכה נוספים ו אלקטרומטר, בהתאמה. מחקר זה היא נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים גרנט R00-AG047198 (EJB), לומה לינדה הספר לרפואה של אוניברסיטת סגל חדש ראשונית. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3, (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78, (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202, (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219, (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6, (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285, (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24, (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15, (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9, (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593, (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72, (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595, (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293, (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297, (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3, (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170, (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, (8), 757-770 (2012).
מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter