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Biology

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

doi: 10.3791/58832 Published: January 20, 2019

Summary

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Abstract

Artérias cerebrais e sua respectiva microcirculação entregam oxigênio e nutrientes para o cérebro através do sangue fluxo do regulamento. Células endoteliais linha o lúmen dos vasos sanguíneos e mudanças de comando no diâmetro vascular conforme necessário para atender a demanda metabólica dos neurônios. Primárias vias de sinalização endotélio-dependente de hiperpolarização do potencial de membrana (Vm) e óxido nítrico normalmente operam em paralelo para mediar a vasodilatação e, assim, aumentar o fluxo sanguíneo. Embora integral para coordenar a vasodilatação mais vários milímetros de comprimento vascular, componentes do endotélio-derivado hiperpolarização (EDH) foram historicamente difíceis de medir. Esses componentes de EDH implicar intracelular Ca2 + [Ca2 +]eu aumenta e subsequente ativação de pequenas e intermediário condutância de Ca2 +-ativado K+ (SKCacomoCa) canais.

Aqui, apresentamos uma ilustração simplificada do isolamento de fresco endotélio de artérias cerebrais do rato; medições simultâneas de endotelial [Ca2 +]eu e Vm usando fotometria de Fura-2 e eletrodos afiados intracelulares, respectivamente; e uma superfusion contínua de soluções salinas e agentes farmacológicos sob condições fisiológicas (pH 7,4, 37 ° C). Artéria cerebral posterior do círculo de Willis é removida sem a comunicação posterior e as artérias basilar. Digestão enzimática de segmentos de arteriais cerebrais posteriores limpos e posterior trituração facilita a remoção da adventícia, perivascular nervos e células musculares lisas. Resultantes posteriores cerebrais arteriais endoteliais "tubos" Então são protegidos sob um microscópio e examinaram usando uma câmera, tubo fotomultiplicador, e um ou dois Electrómetros sob contínua superfusion. Coletivamente, esse método pode medir simultaneamente alterações endoteliais [Ca2 +]eu e Vm em locais celulares discretas, além da propagação de EDH através de junções até distâncias milímetros ao longo da intacta endotélio. Este método é esperado para produzir uma análise do elevado-throughput das funções endoteliais cerebrais subjacente mecanismos de regulação de fluxo de sangue no cérebro normal e doente.

Introduction

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Fluxo de sangue em todo o cérebro é regulado pela coordenação da vasodilatação entre artérias cerebrais e arteríolas em redes vasculares1. Células endoteliais que revestem mudanças de comando de artérias de resistência cerebral vascular diâmetro conforme necessário para atender a demanda metabólica dos neurônios1,2,3. Em particular, durante a hiperpolarização derivado de endotélio (vulgarmente conhecida por EDH), intracelular Ca2 + ([Ca2 +]eu) e sinalização eléctrica em células endoteliais vasodilatação coordenada entre as células endoteliais e seus células de músculo liso circundante através de junções para relaxamento arterial4. Iniciação fisiológica de EDH sequencialmente implica a estimulação do Gq-acoplados a receptores (GPCRs), um aumento de [Ca2 +]eue ativação de endotelial pequeno - e intermediário-Ca2 +-ativado K+ (SKCacomoCa) canais para hiperpolarizar a membrana endotelial cerebral potenciais (Vm)5,6,7. Assim, a relação íntima de endotelial [Ca2 +]eu e Vm é parte integrante do Regulamento de fluxo de sangue e indispensável para cardio e cerebrovascular função6,8. Em toda a literatura mais ampla, numerosos estudos relataram Associação de disfunção endotelial vascular com o desenvolvimento de doenças crônicas (por exemplo, hipertensão, diabetes, insuficiência cardíaca, doença arterial coronariana, insuficiência renal crônica, doença arterial periférica)9,10, indicando a importância de se estudar a função endotelial em condições fisiológicas, bem como patológicas.

Endotélio vascular é essencial para a produção de hiperpolarização, vasodilatação e perfusão do tecido e assim, o exame de suas propriedades celulares nativas é crucial. Como um modelo de estudo geral, preparação de modelo de tubo endotelial arterial o mouse foi publicada antes por músculo esquelético11,12, intestino13, pulmão14e, recentemente, para o cérebro6. Estudos de simultânea [Ca2 +]eu e medições dem V em particular têm sido publicados para o músculo esquelético endotélio arterial15,16 , bem como de endotélio de vasos linfáticos17. Além de estudos primários, utilizando a abordagem de tubo endotelial, uma revisão abrangente das suas vantagens e desvantagens8 pode ser consultada para determinar se esta ferramenta experimental é apropriada para um estudo específico. Em breve, uma vantagem é que os principais componentes fisiológicos da função endothelial da pilha são retidos (por exemplo,, Ca2 + influxo e liberação intracelular, hiperpolarização de Vm até o potencial de Nernst para K+ através SKCacomo ativação deCa e acoplamento intercelular endoteliais através de junções) sem confusão de fatores tais como a entrada do nervo perivascular, função de canais voltagem-dependentes de músculo liso e contratilidade, circulação do sangue e influências hormonais8. Em contraste, abordagens de cultura celular comumente usados introduzir alterações significativas na morfologia18 e íon canal expressão19 de uma maneira que grandemente pode ofuscar as comparações fisiológicas observações determinadas ex vivo ou na vivo. Limitações incluem a falta de integração com outros componentes essenciais para regular o fluxo de sangue, tais como músculo liso e flexibilidade restrita em um horário experimental, como este modelo ideal é testado dentro de 4 h de isolamento de segmento vascular intacta do animal.

Construção de um protocolo de vídeo anterior de autoria de Socha e Segal12 e recentes desenvolvimentos experimentais no intercalar6,15,16, por este meio demonstrar o isolamento do endotélio fresco de artéria cerebral posterior e medições simultâneas de endotelial [Ca2 +]eu e Vm usando fotometria de Fura-2 e eletrodos afiados intracelulares, respectivamente. Além disso, esta experiência implica superfusion contínua de soluções salinas e agentes farmacológicos durante condições fisiológicas (pH 7,4, 37 ° C). Escolhemos a artéria cerebral posterior, como rende endotélio isolado com a integridade estrutural (células acopladas através de junções) e dimensões suficientes (largura ≥ 50 µm, comprimento ≥300 µm) favoráveis para intrae sinalização intercelular ao longo e entre células endoteliais. Além disso, estudos da artéria cerebral posterior roedor estão substancialmente representados na literatura e abrangem o exame de mecanismos fundamentais de sinalização endoteliais vascular desenvolvimento/envelhecimento e patologia20, 21 , 22. esta aplicação experimental é esperada para produzir uma análise de alto rendimento da função endotelial cerebral (e disfunção) e desse modo permitirá avanços significativos no entendimento do Regulamento de fluxo de sangue ao longo envelhecimento e o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.

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Protocol

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Antes de realizar os experimentos seguintes, certifique-se de que usar de todos os cuidados com animais e protocolos são aprovados pelos cuidados institucionais do Animal e usar Comité (IACUC) e executados de acordo com do Conselho Nacional de pesquisa "guia para o cuidado e o uso de ' De animais de laboratório (8th Edition, 2011) e as diretrizes de chegada. O IACUC da Loma Linda University aprovou todos os protocolos utilizados para este manuscrito para masculinos e femininos camundongos C57BL/6 (faixa etária: 3 a 30 mo).

1. equipamentos e materiais

Nota: Detalhes do material necessário para o protocolo podem ser encontrados na Tabela de materiais, reagentese manuais ou sites associados com os respectivos fornecedores.

  1. Câmara de fluxo
    1. Fixe uma câmara de superfusion com um fundo de lamela de vidro em uma plataforma de alumínio anodizado. Proteger a plataforma com a câmara em um estágio de alumínio compacto.
    2. Defina um micromanipulador em cada extremidade da plataforma na fase de alumínio para segurar a pipeta de fixação.
      Nota: Como uma opção prática, use este aparato de palco transferível com uma unidade de câmara de fluxo protegida para facilitar a transição do isolamento do tubo endotelial para desempenho dos experimentos.
  2. Microscópios
    1. Microscópios de duas oculares uso (5x a gama de ampliação x 50) equipado com fontes de luz da fibra óptica para procedimentos de macro e microdissecação.
    2. Para a preparação dos tubos endoteliais, use um microscópio invertido equipado com fase diferencial ou contraste interferência contraste (DIC) compatível com os objectivos (10x, 20x e 40x) e numa fase de alumínio.
    3. Para isolar tubos endoteliais dos vasos de sangue parcialmente digeridos, coloque um controlador de bomba micro-seringa adjacente ao aparelho de preparação de tubo endotelial.
    4. Para o aparato experimental, use um microscópio invertido equipado com objectivos padrão (4 x e x 10) Além de objectivos fluorescentes (20x e 40x, abertura numérica 0,75) e um palco de manual de alumínio em uma tabela de isolamento de vibração.
  3. Equipamento de gravação intracelular
    1. Para gravar o Vm de células endoteliais em tubos endoteliais isolados, conecte o eletrômetro para o headstage compatível. Se necessário, conecte um gerador de função ou estimulador para o eletrômetro para experimentos que requerem injeção atual.
    2. Conecte as saídas do amplificador para um sistema de aquisição de dados, monitores audível de base e um osciloscópio. Fixe o eléctrodo de referência (pellet de Ag/AgCl) perto da saída de câmara de fluxo durante as experiências.
    3. Usar um sistema fotométrico com componentes integrados de uma fluorescência sistema interface, alta intensidade lâmpada de arco e poder abastecimento, hyperswitch, tubo fotomultiplicador (ou PMT) e uma câmera para medir [Ca2 +]eu nas células endoteliais.
    4. Use um controlador de temperatura equipado com um aquecedor embutido para aumentar e manter a temperatura fisiológica (37 ° C) durante todo o experimento.
    5. Use uma plataforma de seis-reservatório conectada a um controlador de válvula com uma válvula de controle de fluxo inline para controlar a entrega das respectivas soluções para o tubo endotelial garantido na câmara.
  4. Micropipetas e eletrodos afiados
    Nota: Para fabricar pipetas para trituração e a estabilização mecânica dos tubos endoteliais isolados, use um extrator eletrônico para puxar as pipetas e forjar um micro para quebrar e polimento de fogo.
    1. Para separar a adventícia, músculo liso e o tubo endotelial do segmento arterial parcialmente digerido, preparem trituração pipetas (cada um com um diâmetro interno de ponta de 80 – 120 µm) conforme apropriado, usando tubos capilares de vidro de borosilicato e fogo polir a ponta.
    2. Para fixar o tubo endotelial contra o fundo da câmara superfusion, usar pipetas de fixação com uma extremidade cega, esférica (calor-lustrado, OD de 100 – 150 µm; preparados a partir de tubos de vidro de borosilicato de parede fina).
    3. Para gravar Vm de uma célula endotelial, preparar eletrodos afiados com resistência de ponta de ~ 150 ± 30 MΩ de tubos capilares de vidro usando um extrator de eletrônico.

2. preparação de soluções e drogas

  1. Solução salina fisiológica (PSS)
    1. Para um experimento com preparações da droga, prepare um mínimo de 1 L de PSS usando: 140 mM de NaCl, KCl, 2 mM CaCl2, de 5 mM 1 mM MgCl2, ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic (HEPES) de 10 mM e 10 mM de glicose.
    2. Para preparar as soluções necessárias para dissecação, isolamento da artéria cerebral e preparação do tubo endotelial, preparar PSS falta CaCl2 (zero Ca2 + PSS).
    3. Preparar todas as soluções em desionizada ultrapura H2O, ajustar o pH para 7,4, esterilizá-los através de um filtro (tamanho de poros de 0,22 µm) e certifique-se de que a pressão osmótica das soluções é entre 290 e 300 mOsm.
      Nota: Soluções podem ser armazenadas a 4 ° C por aproximadamente duas semanas.
  2. 10% albumina de soro bovino (BSA)
    1. Para preparar 10% BSA, dissolva 1 g de pó liofilizado em um béquer de 10 mL zero Ca2 + PSS.
    2. Cobrir o béquer com filme de parafina e permitir um período de várias horas para passar, com agitação lenta para a BSA dissolver.
    3. Filtrar a solução final, utilizando uma seringa de 10 mL além de um filtro de 0,22 µm e fazer alíquotas de 1 mL para ser armazenado a-20 ° C.
  3. Solução de dissecação
    1. Para preparar 50 mL de solução de dissecação, adicione 500 µ l de BSA (10%) a 49,5 mL de zero Ca2 + PSS.
    2. Imediatamente após o preparo, transferi esta solução de dissecação em uma placa de Petri para dissecção arterial.
  4. Solução de dissociação
    1. Para preparar 50 mL de solução de dissociação, adicione 5 µ l de CaCl2 (1 M) e 500 µ l de BSA (10%) a 49,5 mL de zero Ca2 + PSS. Permitir que a solução sentar-se à temperatura ambiente (RT).
  5. Enzimas
    1. Para a digestão parcial dos segmentos arteriais, prepare-se 1 mL de solução de digestão com papaína 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, colagenase 0,75 mg/mL (mistura de tipo H) e elastase 0,13 mg/mL.
      Nota: Actividades enzimáticas podem variar; no entanto, para nossos bem sucedidos protocolos, actividades enzimáticas fornecido comercialmente têm sido utilizadas como segue: papaína ≥ 10 unidades/mg; colagenase ≥ 1 unidades/mg, para o volume de substrato de N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala ou FALGPA; e elastase ≥ 5 unidades/mg.
  6. Preparação de Fura-2 e agentes farmacológicos
    1. Preparar a concentração das ações (1mm) de Fura-2 corante AM em DMSO. Prepare uma concentração de trabalho (10 µM), acrescentando 5 µ l de estoque a 495 µ l de PSS para o carregamento.
    2. Prepare ≥ 50 mL de concentrações de agentes farmacológicos (por exemplo, ATP) a trabalhar no PSS, conforme apropriado.
  7. Realização de solução
    1. Preparar a realização de uma solução, 2m KCl, dissolvendo KCl em desionizada H2O (g 7,455 KCl em 50 mL de H2O).
    2. Filtre a solução através de um filtro de seringa 0,22 µm antes de aterrar os eléctrodos afiados.
  8. Iodeto de propidium (0,1%)
    1. Dissolva 10 mg de iodeto de propidium liofilizado em 10 mL de 2m KCl.
    2. Misture bem e guarde em RT

3. dissecção e o isolamento da artéria Cerebral

Nota: Todos os procedimentos de dissecação requerem ampliação espécime (até 50 x) através de duas oculares e iluminação fornecida por fontes de luz de fibra óptica. Para executar os procedimentos de dissecação para isolamento do cérebro e as artérias, use instrumentos de dissecção afiada. Microdissection ferramentas para isolar e limpar as artérias incluem pinças de ponta fina afiadas e Vannas para dissecação estilo (lâminas de 3 a 9,5 mm).

  1. Isolamento de cérebro de rato
    1. Anestesiar uma C57BL/6 rato (3-30 meses velhos; masculinos ou femininos) através de inalação de isoflurano (3% para 2-3 min) e, em seguida, decapitar o animal imediatamente após completa da indução da anestesia. Coloque a cabeça em uma placa de Petri (diâmetro 10 cm, profundidade de 1,5 cm) contendo a frio (4 ° C) zero Ca2 + PSS sob um estereomicroscópio.
    2. Visualização através do microscópio, retire a pele e os cabelos sobre o crânio e remover sangue excessiva com frio zero Ca2 + PSS. Fazer uma incisão utilizando apenas as pontas da tesoura padrão de dissecação (por exemplo, lâmina de 24 milímetros), começando com o osso occipital e estendendo-se através do osso nasal do crânio.
    3. Abra o crânio cuidadosamente ao longo da incisão utilizando pinças de ponta grossa e separada do tecido conjuntivo para isolar o cérebro com um círculo de Willis intacta.
      Nota: Alternativamente, fórceps de Littauer osso-corte pode ser usado para abrir o crânio e expor o cérebro.
    4. Lave delicadamente o cérebro isolado com frio zero Ca2 + PSS num copo para remover sangue. Coloque o lado ventral do cérebro virado para cima em uma câmara contendo solução fria de dissecação para isolamento de artérias cerebrais (figura 1A).
  2. Isolamento de artérias cerebrais
    Nota: A artéria cerebral posterior foi selecionada como um modelo de estudo endotelial vascular representativa para este protocolo.
    1. Proteger o cérebro isolado na solução fria de dissecação usando pinos de aço inoxidável (diâmetro de 0,2 mm, comprimento ~ 11 – 12 mm) para ser inserido em um polímero de silicone de carvão-infundido revestimento do fundo (profundidade ≥ 50 cm) de uma placa de Petri de vidro.
    2. Para manter uma temperatura refrigerada de PSS durante a dissecção, use uma câmara de dissecação resfriada por um sistema refrigerante continuamente ciclismo uma mistura de 1:1 água-etileno glicol. Alternativamente, poderá efectuar-se a dissecação no gelo fresco.
    3. Cirurgicamente, isolar a artéria cerebral posterior (~0.3 aos segmentos de 0,5 cm, sem tensão axial) da comunicação posterior e artérias basilar usando microdissection instrumentos Vannas estilo tesoura e pinça de ponta fina afiada (figura 1B ). Usar os pinos de aço inoxidável (diâmetro de 0,1 mm, comprimento ~ 13 – 14 mm) seguro ambos isolaram artérias cerebrais posteriores na solução de dissecação na prato de Petri (Figura 1).
    4. Limpa as artérias cerebrais posteriores isoladas cuidadosamente, removendo tecido conjuntivo usando pinças de ponta fina afiadas (Figura 1). Corte as artérias intactas em segmentos (comprimento 1-2 mm) para digestão enzimática (Figura 1; inserir).

4. preparação do tubo endotelial e Superfusion

Nota: O tubo endotelial é preparado conforme descrito anteriormente,12, com as modificações para a artéria cerebral6.

  1. Prepare o equipamento de trituração usando um microscópio equipado com objetivos (10x, 20x e 40x), uma câmera e um palco de alumínio segurando uma câmara e Micromanipuladores. Fixe uma micro-seringa com um controlador da bomba ao lado do palco e a amostra (Figura 2A).
  2. Completamente uma trituração de aterramento pipetar com óleo mineral e fixá-lo sobre o êmbolo da seringa. Em seguida, usando a microseringa com controlador da bomba, retirar solução de dissociação para a pipeta (~ 130 nl) em cima do óleo mineral, garantindo a ausência de bolhas de ar na pipeta.
  3. Coloque intactos segmentos arteriais em 1 mL de solução de dissociação em um tubo de vidro de 10 mL (Figura 2B), contendo papaína 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioerythritol, colagenase 0,75 mg/mL e elastase 0,13 mg/mL. Incube a 34 ° C por 10 – 12 min para a digestão parcial.
  4. Após a digestão, substitua a solução de enzima ~ 5 mL de solução fresca de dissociação. Utilizando uma pipeta de 1 mL, transferir um segmento em uma câmara que contém a solução de dissociação no RT
  5. Colocar a pipeta na solução de dissociação na câmara e posicioná-lo perto de uma extremidade do navio digerido. Defina uma taxa dentro do intervalo de 2 a 5 nL/s no controlador de bomba para trituração suave (Figura 2; inserir).
  6. Enquanto a visualização através de 100x para ampliação de 200x, retirar e ejetar o segmento arterial para dissociar as células do músculo liso ao produzir um tubo endotelial. Se necessário, use cuidadosamente pinças de ponta fina para separar o tubo endotelial adventícia dissociada e lâmina elástica interna. Confirme que todas as células do músculo liso são dissociadas e que as células endoteliais só permanecem como um tubo"intacto" (Figura 2).
  7. Usando Micromanipuladores, prenda cada extremidade do tubo endotelial sobre a lamela de vidro da câmara superfusion usando o vidro de borosilicato fixando pipetas (Figura 2D).
  8. Wash-out dissociou adventícia e células musculares lisas da sala e a substituir a solução de dissociação com 2 mM CaCl2 PSS. Transferi a plataforma móvel com tubo endotelial segura sobre o microscópio de equipamento experimental e superfusion.
  9. Use 6 reservatórios de 50ml limpo (Figura 3A) para a entrega contínua de PSS e respectivas drogas soluções durante o experimento, conforme apropriado. Use a válvula de controle de fluxo inline para definir manualmente a taxa de fluxo ao longo como consistente com fluxo laminar enquanto correspondência fluxo alimentar de sucção à vácuo. Entrega o PSS para a câmara (Figura 3B) para a superfusion do tubo endotelial para ≥ 5 min antes de gravar os dados de fundo e tintura de carregamento.

5. corante carga, Wash-Out e ajustes de temperatura

  1. Liga todos os componentes do sistema de medição [Ca2 +]eude fotometria. Use o microscópio na plataforma experimental (Figura 3) para exibir o tubo endotelial em 400 x de ampliação e foco em células na janela fotométrica usando a suite de software de sistema de fotometria.
  2. Medir o diâmetro do tubo endotelial e gravar valores de autofluorescência de fundo de acordo com a emissão de nm 510 durante a excitação alternativa em 340 e 380 nm (≥ 10 Hz).
  3. Para medir [Ca2 +]eu respostas, carga o tubo endotelial com Fura-2 vou tingir (concentração final de 10 µM) em RT e permitir ~ 30 – 40 min na ausência de luz.
  4. Reiniciar superfusion do tubo endotelial com PSS fresco para ~ 30-40 min para lavagem-para fora o excesso de corante e permitir intracelular Fura-2 estou a eliminação esterificar. Durante o período de lavagem, elevar a temperatura gradualmente de RT a 37 ° C, usando o controlador de temperatura (Figura 3A), com um aquecedor embutido e, em seguida, manter a 37 ° C durante todo o experimento.
    Nota: A transição incremental recomendada entre RT a 37 ° C envolve três etapas (por exemplo, de 5 ° C) com um tempo de equilibração ≥ 5 min em cada etapa.

6. medida simultânea de [Ca2 +]eu e Vm

  1. Ligue todos os outros equipamentos e a suíte de softwares eletrômetro para medir Vm (ver Figura 3, Figura 4). Ajustar de acordo com a taxa de aquisição de dados (≥ 10 Hz).
  2. Puxe um eletrodo afiado e aterramento com 2m KCl. Para estudos de intercelular acoplamento através de transferência de tinta, aterramento de microeletrodos com iodeto de propidium 0,1% dissolvido em 2m KCl.
  3. Fixe o eletrodo ao longo de um fio de prata revestido com cloreto no porta-pipetas anexado a um estágio de cabeça eletrômetro protegido com um micromanipulador. Use o micromanipulador para brevemente, posicione a ponta do eletrodo para o PSS fluindo na câmara durante a visualização através do objectivo de 4x.
  4. Como o descanso Vm 0 como consistente com banho de terra potencial. Posicione a ponta do eletrodo, pouco mais de uma célula do tubo endotelial. Se desejar, use monitores audível de base ligados à Electrómetros para associar som campo potenciais gravações.
  5. Amplie a 400 x usando o objectivo de 40 x e re-Posicione a ponta do eletrodo, conforme necessário. Ajuste a janela fotométrica usando o software de fotometria para concentrar-se em células endoteliais ~ 50 a 80.
  6. Cuidadosamente coloque o eletrodo em uma das células do tubo endotelial usando o micromanipulador e esperar ≥2 min para o descanso de Vm estabilizar. Da mesma forma, inserir um segundo eletrodo em outra célula (distância ≥100 µm) da primeira célula empalada com primeiro eletrodo.
  7. Uma vez descansar Vm é estável em seus valores esperados (-30 a -40 mV)6, ligue o pgto na interface de fluorescência na ausência de luz e começar a aquisição de intracelular [Ca2 +]eu por emocionante Fura-2 alternadamente (10 Hz) no 340 e 380 nm enquanto coleta de emissão de fluorescência em 510 nm.
    Nota: Para testar o acoplamento elétrico intercelular, atual (± 0.5-3 at, duração do pulso de ~ 20 s) podem ser entregues através de um eletrômetro como "Site 1", e mudanças de Vm podem ser gravadas com outro eletrômetro como "Site 2" (distância ≥100 µm).
  8. Uma vez estabelecidas medições simultâneas de Vm e [Ca2 +]eu , permita ~ 5 min para superfusion do tubo endotelial com PSS a uma taxa constante de fluxo laminar, antes da aplicação de drogas.
  9. Aplica a droga (por exemplo, ATP) preparada no PSS para a câmara de superfusion com a taxa de fluxo constante. Depois de ~ 3 min (ou um período de tempo adequado para a cinética da droga), lavagem com PSS até Vm e o rácio de380 F/f de340retornam às suas condições de linha de base. Marca respectivas gravações como temporalmente sincronizados através do fotômetro e eletrômetro suites de software durante cada transição de soluções.
  10. Uma vez feito o experimento, retirar o eletrodo da célula usando o micromanipulador e observe Vm ~ 0 mV como referenciado pelo eléctrodo de banho. Parar as respectivas gravações de Vm e [Ca2 +]eu e salvar os registros no arquivo para análise de dados.

7. visualização de acoplamento de célula para célula

  1. Para visualizar o acoplamento de célula para célula através do iodeto de propidium, use um x 40 ou 60 objetivo fluorescente de x com uma abertura numérica relativamente alta (por exemplo, 0,95) e rodamina filtro definido com iluminação de estado sólida, uma câmera de alta resolução (por exemplo, 16- megapixels) e um pacote de software de imagem.

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Representative Results

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A demonstração esquemática do protocolo descrito acima é mostrada nas figuras anexadas. Um cérebro isolado de um jovem macho C57BL/6N rato adulto (5 meses) é mostrado na figura 1A. Artérias cerebrais posteriores são cuidadosamente isoladas do círculo de Willis, removido sem tecido conjuntivo e cortado em segmentos (figura 1B-D). De segmentos arteriais parcialmente digeridos, o tubo endotelial intacto é produzido e garantido na lamínula vidro usando pipetas de fixação. Estiramento mecânico suave é aplicado usando duas pipetas fixando a aproximação linear comprimento in vivo sem tortuosidade do navio. Isto tem sido clarificado no manuscrito (Fig. 2A-D). Tubos endoteliais isolados da artéria cerebral posterior são ~ 90 – 100 µm de largura e ≥300 µm de comprimento. O tubo é carregado com Fura-2 estou seguido de lavagem-para fora com o PSS. Medição simultânea de [Ca2 +]eu e Vm no tubo endotelial é realizada por fotometria de Ca2 + , bem como afiada eletrofisiologia eletrodo (equipamento experimental mostrado na Figura 3 e Figura 4).

Avaliação funcional do tubo endotelial é realizada através da aplicação de uma clássica agonista GPCR endotelial como o ATP para a câmara de fluxo sob condições fisiológicas. Como mostrado na Figura 5, [Ca2 +]eu e Vm ... são registrados simultaneamente em resposta a ATP (100 µM). Uma hiperpolarização significativa de Vm (≥ 5 mV) ocorre concomitantemente com intracelular [Ca2 +]eu aumento, indicando que um aumento de [Ca2 +]eu ativa SKCacomo canais deCa e desse modo permite o efluxo de K+ através da membrana de plasma para produzir EDH. Provas de acoplamento intercelular usando injeção atual (± 0,5 a 3 ND, pulsos de s ~ 20) podem ser encontrados em nosso trabalho recentemente publicado (referência6, Figura 1). Observe que iodeto de propidium tem uma massa de ~ 668 Da referência segundo mensageiros conhecido por passagem junções tais como o triphosphate do inositol (IP3, ~ 420 Da), adenosina monofosfato cíclica (cAMP, Da ~ 329).

Figure 1
Figura 1 : Isolamento da artéria cerebral do cérebro. (A) cérebro isolado com artérias intactas (a seta branca indica a artéria cerebral posterior) na solução de dessection. (B) Magnified Ver os da artéria cerebral posterior (seta branca; ~ 3 x vs. Painel A). (C) isolado posteriores artérias cerebrais fixadas com pinos de aço inoxidável no prato do espécime. (D) Posterior artérias cerebrais, após a remoção dos tecidos conjuntivos. Baixo-relevo mostra cortados segmentos de artérias; Barra de escala = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Preparação do tubo endotelial cerebral. (A) equipamento usado para moer os segmentos arteriais parcialmente digeridos; um = micromanipulador, b = câmara para a preparação de tubo, c = fase de alumínio, d = microsseringa, e = microscópio, f = micro-seringa controlador de bomba. (B) segmentos arteriais (setas brancas) em solução de digestão enzimática. (C) tubos endoteliais preparados pela trituração; um = trituração pipeta, b = tubo endotelial intacto. Baixo-relevo mostra o processo de trituração para remover adventícia e células de músculo liso; Barra de escala = 100 µm. (D) um tubo endotelial intacto acondicionados sobre a lamela de vidro com pipeta de fixação; um = fixação pipeta, b = tubo endotelial intacto com diâmetro de ~ 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Equipamento para superfusion e simultânea [Ca2 +] eu e V m medições. (A) equipamento de superfusion do tubo endotelial e controle de temperatura, um = lâmpada de arco de alimentação, de alta intensidade b = interface de sistema de fluorescência, c = controlador de temperatura, d = 6-reservatórios do sistema superfusion, e = luz da fibra óptica fontes, f = controlador de válvula, g = hyperswitch [Ca2 +]eu fotometria sistema. Aparelhos de câmara Superfusion (B); um e b = headstages, c = o eléctrodo de terra, d = inline aquecedor, e = superfusion tubulação, f = vácuo sucção, g = superfusion câmara, h = fase de alumínio segurando a câmara. (C) plataforma Experimental em uma tabela de isolamento de vibração; um adaptador de enquadramento = celular com câmera, b = c luz, microscópio = microscópio, d = fase de alumínio, e = micromanipulador para controle de headstage, f = tabela de isolamento de vibração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Equipamento para funcionamento eletrofisiologia e gravação de dados. um osciloscópio, de = b = gerador de função, c = audível de base monitor, d = filtro de ruído de 50/60 Hz, e e f = electrómetros, g = sistema de aquisição de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Simultânea [Ca2 +] eu e V m gravações. (A) imagem de contraste de interferência diferencial (400 x) de um tubo endotelial cerebral arterial de rato ajustado para experimento em janela fotométrico usando um objectivo de 40x. Um eletrodo afiado é colocado em uma célula, conforme mostrado na parte superior da imagem (seta branca). (B) vestígios de Raw para medição simultânea de F340/f380 ratio (topo) e Vm (fundo) em resposta a ATP (100 µM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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À luz dos recentes desenvolvimentos6,15,16,17, demonstraremos agora o método para isolar o endotélio arterial cerebral de rato em preparação para a medida simultânea de [Ca2 +] eu e o Vm subjacentes EDH consistentemente para ~ 2 h a 37 ° C. Embora tecnicamente difícil, podemos medir a-celular acoplamento também (veja referência6, Figura 1). Desta forma, podemos medir discreta e conduzido de sinalização eventos simultaneamente. Para uma conta dos desafios gerais ao mesmo tempo isolando endotélio arterial de rato consulte referências11,12. Nós emfatizamos passos críticos para isolar a artéria cerebral do rato, nossas medições particulares de endotelial [Ca2 +]eu e Vm, sugestões para solução de problemas e considerações para métodos alternativos à luz das experimentais pontos fortes/pontos fracos abaixo.

A artéria cerebral posterior requer cuidadoso isolamento do círculo de Willis e tecido conjuntivo, sem danos ao músculo liso e células endoteliais. Instrumentos cirúrgicos (pinças e tesouras) devem ser apropriados para procedimentos de dissecação de microcirculação do mouse enquanto mantida com bordas afiadas, limpas. Relativo ao músculo esquelético12, reduzimos o período de tempo para incubação enzimática em dois terços e as concentrações de papaína e colagenase dithioerythritol pela metade, acrescentando o uso de uma concentração empiricamente otimizado de elastase. Para o sucesso consistente no isolamento de tubos endoteliais arteriais cerebrais, é importante para enzimas de ordem em lotes (2 a 4 ampolas) de um fornecedor altamente respeitável com práticas de produção consistente de acordo com a frequência de uso e conservação. Mesmo com o potencial de variação na atividade enzimática de um monte de enzima para a próxima, sugere-se que as concentrações de enzima ser mantida, otimizando o tempo de digestão dentro de 10 a 12 min. É interessante notar que nem o sexo nem a idade do animal (3 a 30 meses) tem sido uma barreira significativa para a preparação do endotélio isolado desde as artérias cerebrais em nossa experiência. Assim, recomenda-se que a composição da enzima coquetel e tempo de digestão enzimática permanecem os mesmos em estudos sobre idade e gênero.

Como enfatizado, cautela é necessária durante a trituração suave e isolamento do endotélio da adventícia e células fusiformes liso músculo a fim de evitar danos à células endoteliais12. Para a etapa de trituração, o óleo mineral viscoso serve como meio hidráulico entre o pistão da microseringa e o PSS aquosa para retirar ou ejetar segmentos navio banhados no PSS. Note-se que se o segmento de embarcação entra em contato com o óleo mineral, este passo deve ser repetido com uma pipeta de trituração limpo com o aterramento sequencial de óleo mineral e PSS. Antes de um experimento, é recomendável que um comprimento de aproximadamente linear na vivo será restituído o tubo endotelial na medida do possível, pelo qual as células individuais assumem uma morfologia "plana", longitudinal (por exemplo, µm de diâmetro ~ 5; Comprimento ~ 100 µm; espessura ~0.5 µm)8. No entanto, a tensão axial não deve ser aplicado até o ponto onde células nas bordas da amostra estão puxando longe debaixo de pipetas de fixação respectivas e, assim, comprometer estabilidade mecânica para medições correctas de celulares durante o experimento.

O fotométrico [Ca2 +]eu sistema usado nesta técnica de medição é adequado para medições contínuas de endotelial [Ca2 +]i usando o ratiometric tintura de Fura-2. Protocolos individuais podem geralmente duram ≥ 10 min sem fotobranqueamento significativo. Além disso, usamos comumente esta abordagem de medição [Ca2 +]eu porque é passível de pausas oportunas em aquisição de dados e movimento frequente de objetivos microscópio conforme necessário para fixar eletrodos afiados para medições dem V. Note que esta é uma abordagem fotométrica que apenas captura global, em média [Ca2 +]eu entre várias células. Em geral, para [Ca2 +]eu medições, recomendamos a fotometria para a caracterização inicial das respostas de células endoteliais de agentes farmacológicos (por exemplo,, tempo curso de fases de pico e platô) mantendo planos para Prossiga para dosar microdomain sinalização eventos usando microscopia confocal ou do multiphoton padrão12,23.

A abordagem de eletrofisiologia do eletrodo afiada é favorável para gravações dem V integradas em preparações multicelulares fisiológicas. A medição de intracelular Vm é de longe o mais tecnicamente desafiador com numerosos passos críticos que podem facilitar ou obliterar o sucesso das medições. Primeiro, o experimentador precisa determinar as condições do programa ideal em um puxador de vidro de fabricação consistentemente nítidos eletrodos com resistência de ponta de ~ 150 ± 30 MΩ. Usando um teste de rampa de calor do filamento ler como uma referência, é recomendável que o experimentador determinar parâmetros empiricamente, especialmente com relação a variação no cenário de "calor", maximizando o tempo de puxar. Estabilidade próxima, mecânica do Micromanipuladores, headstages, titulares de pipeta e espécime é absolutamente crítica. Além da óbvia necessidade para uma tabela de isolamento de vibração, o experimentador vai precisar para assegurar que todos os encaixes sejam seguros e que a área do palco ao redor e por baixo os manipuladores é limpa. Idealmente, ruídos estranhos devem ser reduzido na medida em que a resolução de gravações de eletrodo afiada é dentro de 1 mV. Em nossa experiência, a fonte mais comum de ruído é o fio de prata fixado no suporte pipeta que precisa de um revestimento de cloreto suficiente ou substituição por completo. Se houver ruído comum de 50/60 Hz, tecnologia "sussurram silenciar" pode ser usada e vem padrão com um moderno eletrômetro. Se o ruído aparece completamente incontrolável, verificar se há um vazamento no banho ou estouro onde PSS irá entrar em contacto com resistores para controle de temperatura. Se complicações permanecem com a aquisição de um sinal dem V estável, verifique a integridade do t-conectores e cabos elétricos.

No total, se estabelecendo que uma gravação afiada eletrodo não for bem sucedida, é comumente devido a um eletrodo inadequado, instabilidade mecânica ou pobre saúde celular. Alternativamente, o experimentador também pode querer considerar uma configuração da técnica patch-clamp em células individuais, desacopladas eletricamente, onde podem ser obtidas informações sobre correntes de células inteiras e gravações de canal único íon. Embora confrontado com os desafios gerais do uso de um corante fluorescente (por exemplo,, de carregamento intracelular heterogêneo, branqueamento, calibração usando ionóforos, resolução de deteção modesto), sensíveis à voltagem corantes tais como Di-8-ANEPPS também são comercialmente disponíveis.

Nossa compreensão do endotélio no Regulamento do fluxo de sangue para e em todo o cérebro é crucial com um rápido envelhecimento populacional e a crescente incidência de doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Assim, nós fornecemos um método para isolar o endotélio intacto de uma artéria cerebral vital, que pode ser adaptado para outras estruturas vasculares no cérebro. Além disso, mostramos uma abordagem útil para as medições simultâneas de subjacente [Ca2 +]eu e Vm. Finalmente, usando eletrodos intracelulares duas, acoplamento através de junções célula a célula pode também ser avaliada. Com intervenções farmacológicas e/ou genéticas cuidadosamente planejadas, o atual protocolo razoavelmente e quantitativamente engloba estudo da função endotelial cerebral em sua forma nativa. Nossa expectativa é que experimentadores irão construir a partir e adaptar esta informação para avançar a biologia vascular e neurociência em geral. Em particular, seria satisfatório ver lutas experimentais comuns envolvido com medições elétricas minimizadas por completo. Embora este protocolo não é um conjunto independente de técnicas por qualquer meio, pode ser usada como uma abordagem complementar para determinar precisamente como endoteliais determinantes biofísicos traduzem em alterações na resistência vascular e como eles afinar o Regulamento do fluxo de sangue em relação a condições representativas de saúde doença vs. .

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Disclosures

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Acknowledgments

Agradecemos Charles Hewitt excelente assistência técnica, enquanto estabelecendo e equipamentos necessários para os protocolos atuais. Agradecemos os Drs Sean M. Wilson e Christopher G. Wilson, do centro para a biologia Perinatal, LLU fornecendo-nos com um microscópio invertido adicional e eletrômetro, respectivamente. Esta pesquisa foi apoiada pela National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) e fundos de start-up da faculdade novos Loma Linda University School of Medicine. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

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References

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Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta
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Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

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