Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Одновременного измерения внутриклеточного кальция и мембранный потенциал в свеже изолированных и нетронутыми мыши мозгового эндотелия

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University

Summary

Протоколы изоляции (1) свеже нетронутыми церебральный эндотелиальных «трубы» и (2) одновременных измерений эндотелиальной кальция и мембранного потенциала во время эндотелий производные гиперполяризации продемонстрировали здесь. Кроме того эти методы позволяют для фармакологической тюнинг эндотелиальных клеток кальция и электрической сигнализации как индивидуальных или интерактивные экспериментальные переменные.

Abstract

Церебральных артерий и их соответствующих микроциркуляции доставить кислород и питательные вещества в мозг через регулирование стока крови. Эндотелиальные клетки линии просвета кровеносных сосудов и изменения в сосудистой диаметр команд, необходимых для удовлетворения спроса метаболизма нейронов. Первичной эндотелия зависимые сигнальные пути гиперполяризации мембранного потенциала (Vm) и оксида азота обычно работают параллельно с посредником вазодилатацию и тем самым увеличить поток крови. Хотя неотъемлемой частью координации вазодилатация на несколько миллиметров сосудистой длины, компоненты эндотелий производные гиперполяризации (EDH) были исторически, трудно измерить. Эти компоненты EDH влекут за собой внутриклеточных Ca2 + [Ca2 +]я увеличивается и последующей активации малых - и средней проводимости Ca2 +-активированный K+ (SKCa/IKCa) каналы.

Здесь мы представляем упрощенная схема изоляции свежие эндотелий от мыши церебральных артерий; одновременное измерение эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно; и непрерывного superfusion солевых растворов и фармакологических агентов в физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Задней мозговой артерии от круг Уиллис удаляются без задней общения и базилярной артерии. Ферментативный пищеварения уборка задней церебральной артериальной сегментов и последующие Тритурация облегчает удаление адвентиции, периваскулярной нервов и гладких мышечных клеток. Результате задняя церебральной артериальной эндотелиальной «трубы» затем закреплены под микроскопом и изучены с помощью камеры, фотоэлектронный умножитель трубки, и одного-двух электрометры под непрерывной superfusion. Коллективно этот метод может одновременно измерять изменения в эндотелиальных [Ca2 +]я и Vm в дискретных сотовой местах, помимо распространения EDH через разрыв соединения до миллиметра расстояния вдоль нетронутыми эндотелий. Ожидается, что этот метод высок объём анализ церебральный эндотелиальных функций, лежащих в основе механизмов регулирования потока крови в мозге, нормального и больными.

Introduction

Поток крови в мозг регулируется координации вазодилатация среди церебральных артерий и артериол в сосудистой сети1. Эндотелиальных клеток, выстилающих мозгового сопротивление артерий команды изменения сосудов диаметром по мере необходимости для удовлетворения спроса метаболизма нейронов1,2,3. В частности, во время эндотелий производные гиперполяризации (широко известный как EDH) внутриклеточный Ca2 + ([Ca2 +]я) и электрической сигнализации в эндотелиальных клеток координат вазодилатация среди эндотелиальных клеток и их окружающие гладкомышечные клетки через разрыв соединения для расслабления артериальной4. Физиологического возбуждения EDH последовательно влечет за собой стимуляции Gq-сочетании рецепторов (GPCR), увеличение [Ca2 +]яи активации эндотелиальной малого и среднего Ca2 +-активированный K+ (SKCa/IKCa) каналы для hyperpolarize церебральный эндотелиальных мембранный потенциал (Vm)5,6,7. Таким образом интимные отношения эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm является неотъемлемой частью регулирование потока крови и незаменимым для кардио - и цереброваскулярные функции6,8. На протяжении более широких литературы многочисленные исследования сообщили ассоциации сосудистых эндотелиальной дисфункции с развития хронических заболеваний (например, гипертония, диабет, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, хронической почечной недостаточности, заболевания периферических артерий)9,10, указав значение изучения функции эндотелия в как физиологические, так и патологических условиях.

Эндотелия является неотъемлемой частью производства гиперполяризации, вазодилатацию и перфузии тканей и таким образом, изучение его родной сотовой свойств имеет решающее значение. Как модель общего исследования подготовка модели мыши артериальной эндотелиальной трубка была опубликована до скелетных мышц11,12,13кишки, легких14и недавно для мозга6. В частности исследования одновременных [Ca2 +]я и Vm измерений были опубликованы для скелетной мускулатуры артериальных эндотелия15,16 , а также лимфатический сосуд эндотелия17. Помимо первичного исследования с использованием эндотелиальной трубки подход всеобъемлющий обзор его преимущества и недостатки8 можно ознакомиться для определения, если это экспериментальный инструмент подходит для конкретного исследования. Короче говоря, преимуществом является то, что сохраняются основные физиологические компоненты функции эндотелиальных клеток (например,, Ca2 + приток и внутриклеточных релиз, гиперполяризации Vm до Нернста потенциал для K+ через SKCa/IKCa активации и эндотелиальных межклеточные соединения через разрыв соединения) без привходящих факторов, таких как периваскулярной нерва ввода, гладких мышц напряжения закрытого канала функции и сократительную способность, циркуляция крови и гормональных влияний8. В отличие от широко используемых ячеек культуры подходов ввести значительные изменения в морфологии18 и ионного канала выражение19 в манере, которая значительно может запутывать сравнений физиологических наблюдений определяется ex vivo или в естественных условиях. Ограничения включают в себя отсутствие интеграции с другими важными компонентами для регулирования потока крови, таких как гладких мышц и ограничения гибкости в экспериментальный график, как эта модель оптимально протестирован в течение 4 ч нетронутыми сосудистой сегмент изоляции от животного.

Строительство от предыдущих видео-протокол автором Соча и Сегал12 и последние экспериментальные разработки в промежуточный6,,1516, мы настоящим продемонстрировать изоляции свежие эндотелий от задней мозговой артерии и одновременного измерения эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно. Кроме того этот эксперимент предполагает непрерывное superfusion солевых растворов и фармакологических агентов при физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Мы выбрали задней мозговой артерии, как он дает изолированных эндотелия с структурной целостности (клеток, Соединенных через разрыв соединения) и достаточные размеры (ширина ≥50 мкм, длина ≥300 мкм) поддаются интра - и межклеточной сигнализации вдоль и среди эндотелиальные клетки. Кроме того исследования грызунов задней мозговой артерии существенно представлены в литературе и охватывать изучение фундаментальных эндотелиальной сигнальных механизмов, развития сосудистой/старения и патологии20, 21 , 22. это экспериментальное приложение ожидается высок объём анализ мозговой функции эндотелия (и дисфункции) и тем самым позволит обеспечить значительный прогресс в понимании регулирования потока крови на протяжении старение и развитие нейродегенеративных заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

До проведения следующих экспериментов, обеспечить использование всех животных ухода и протоколы одобрен институциональный уход за животными и использовать Комитет (IACUC) и осуществляется в соответствии с Национальным Советом исследований »руководство для ухода и использования Лабораторных животных» (8-й издание, 2011) и руководящими принципами прибытия. IACUC Лома Линда университета одобрил все протоколы, используемые для этой рукописи для мужского и женского мышей C57BL/6 (возраст: 3 до 30 мес).

1. оборудование и материалы

Примечание: Подробная информация о материалы, необходимые для вступления протокола можно найти в Таблице материалов, реагентови руководства или веб-сайты, связанные с соответствующими поставщиками.

  1. Палата потока
    1. Закрепите superfusion камеры с дном coverslip стекла в платформу из анодированного алюминия. Безопасность платформы с камерой в компактный алюминиевый сцену.
    2. Установите микроманипулятор на каждом конце платформы на сцене алюминия для проведения закрепления пипеткой.
      Примечание: Как практичный вариант Используйте этот аппарат переводные стадии с блоком камеры потока, обеспеченные для содействия переходу от изоляции эндотелиальной трубки к производительности экспериментов.
  2. Микроскопы
    1. Использование стереомикроскопов (5 x 50 x увеличение диапазона) оснащены волоконно оптические источники света для макро - и микро рассечение процедур.
    2. Для приготовления эндотелиальной трубок используйте инвертированным микроскопом, оснащенных контраст или дифференциальное вмешательства контраст (DIC) совместимые цели (10 x 20 x и 40 x) и этапа алюминиевые подмости.
    3. Чтобы изолировать эндотелиальной трубы от частично переваренной кровеносных сосудов, разместите контроллер насоса microsyringe рядом с эндотелиальной трубки подготовки аппарат.
    4. Для экспериментальной аппаратуры используйте инвертированным микроскопом, оснащенных Объективы стандартные (4 x и 10 x) Кроме флуоресцентный цели (20 x и 40 x, числовая апертура 0,75) и ручной алюминиевые подмости на столе изоляции вибрации.
  3. Внутриклеточные записывающее оборудование
    1. Для записи Vm эндотелиальных клеток в изолированных труб эндотелия, подключите электрометр к совместимый headstage. При необходимости подключите к электрометр для экспериментов, которые требуют текущего инъекции функции генератора или стимулятор.
    2. Соедините выходы усилителя системы сбора данных, звуковой базовые мониторы и осциллографа. Закрепите электрод сравнения (Ag/AgCl Пелле) возле выхода камеры потока во время экспериментов.
    3. Использование фотометрической системы с интегрированные компоненты флуоресценции системы интерфейс, высокой интенсивности дуговая лампа и мощности питания, hyperswitch, фотоэлектронный умножитель трубки (или PMT) и камеры для измерения [Ca2 +]я в эндотелиальных клетках.
    4. Используйте контроллер температуры с встроенный обогреватель для повышения и поддержания физиологических температура (37 ° C) на протяжении всего эксперимента.
    5. Использование платформы шести водохранилище подключен к контроллеру клапан с клапаном управления встроенного контроля доставки соответствующих решений на эндотелиальных трубу, обеспеченных в камере.
  4. Micropipettes и острыми электродов
    Примечание: Для изготовления пипетки для Тритурация и механической стабилизации изолированных труб эндотелия, использовать электронные съемник для натягивая пипетки и микро Кузница ломать и огонь полировки.
    1. Чтобы отделить адвентиции, гладких мышц и эндотелиальных трубки от частично переваренной артериального сегмента, подготовить Тритурация пипетки (каждый с внутренней наконечник диаметром 80-120 мкм) в соответствующих случаях, с использованием капиллярной трубки боросиликатное стекло и огонь Польский совет.
    2. Для обеспечения эндотелиальной трубки против нижней палаты superfusion, используйте закрепление пипетки с затупленными, сферические конца (тепло полированная, ОД 100 — 150 мкм; готовится из боросиликатного стекла тонкостенных труб).
    3. Чтобы записатьm V эндотелиальных клеток, подготовить резкое электроды с кончика сопротивление ~ 150 ± 30 MΩ из стеклянных капиллярных трубок с помощью электронных съемник.

2. Подготовка решений и наркотиков

  1. Физиологический раствор соли (PSS)
    1. Для одного эксперимента с лекарственных препаратов, подготовить как минимум 1 Л с помощью PSS: 140 мм NaCl, 5 мм KCl, 2 мм CaCl2, 1 мм MgCl глюкозы2, 10 мм N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic кислоты (HEPES) и 10 мм.
    2. Подготовить необходимые решения для вскрытия, изоляции мозговой артерии и подготовка эндотелиальной трубки, подготовить PSS хватает CaCl2 (нулевой Ca2 + PSS).
    3. Подготовить все решения в сверхчистого дейонизированной H2O, скорректировать рН 7,4, стерилизовать их через фильтр (размером пор 0,22 мкм) и убедитесь, что между 290 и 300 мОсм осмоляльность решений.
      Примечание: Решения могут храниться при температуре 4 ° C для примерно двух недель.
  2. 10% бычьим сывороточным альбумином (БСА)
    1. Для приготовления 10% BSA, Растворите 1 г лиофилизированный порошок в стакан 10 мл 0 Ca2 + PSS.
    2. Накрыть стакан с парафином фильм и в течение нескольких часов, чтобы пройти с медленное перемешивание для БСА Растворить.
    3. Фильтр окончательное решение, используя шприц 10 мл плюс 0,22 мкм фильтром и сделать 1 мл аликвоты храниться при температуре-20 ° C.
  3. Рассечение решение
    1. Подготовить 50 мл раствора рассечение, добавьте 500 мкл BSA (10%) 49.5 мл нулевой Ca2 + PSS.
    2. Сразу же после подготовки передачи этот рассечение решения в чашке Петри для артериальной рассечение.
  4. Диссоциация решение
    1. Для приготовления 50 мл раствора диссоциации, добавить 5 мкл CaCl2 (1 М) и 500 мкл до 49,5 мл нулевой Ca2 + PSS БСА (10%). Дайте раствору сидеть при комнатной температуре (RT).
  5. Ферменты
    1. Для частичного пищеварения артериальных сегментов Подготовьте 1 мл раствора пищеварения с 0,31 мг/мл папаин, 0.5 мг/мл dithioerythritol, коллагеназа 0,75 мг/мл (тип H смесь) и эластаза 0,13 мг/мл.
      Примечание: Ферментативной активности может варьироваться; Однако, для нашего успешного протоколов, коммерчески предоставленного ферментативной активности были использованы следующим образом: папаин ≥10 единиц/мг; коллагеназы ≥1 единиц/мг, N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala или FALGPA субстрата оборот; и эластаза ≥ 5 единиц/мг.
  6. Подготовка фура-2 и фармакологических агентов
    1. Подготовка запасов концентрации (1 мм) фура-2 AM красителя в ДМСО. Подготовьте рабочие концентрации (10 мкм), добавив 5 мкл запасов до 495 мкл PSS для загрузки.
    2. Подготовьте ≥50 мл рабочей концентрации фармакологических агентов (например, АТФ) в PSS при необходимости.
  7. Проведение решение
    1. Подготовка проведения раствор, 2 M KCl, путем растворения KCl в дейонизированной H2O (7.455 г KCl в 50 мл H2O).
    2. Фильтр решение через фильтр шприц 0,22 мкм до закапывания резкое электродов.
  8. Пропидий йодидом (0.1%)
    1. Растворите 10 мг лиофилизированных пропидий йодидом в 10 мл 2 м KCl.
    2. Хорошо перемешать и хранить в рт.

3. Вскрытие и изоляции мозговой артерии

Примечание: Все рассечение процедуры требуют увеличения образца (до 50 x) через стереомикроскопов и освещения, предоставляемые волоконно оптические источники света. Для выполнения процедур вскрытия для изоляции мозга и артерии, используйте инструменты заостренный рассечение. Microdissection инструменты для изоляции и очистить артерии включают заостренный штраф наконечником щипцы и беззаботными стиль Рассечение ножницами (3 до 9,5 мм лезвия).

  1. Изоляция мозга мыши
    1. Анестезировать C57BL/6 мышь (3-30 месяцев старый, мужчина или женщина) через вдыхание изофлюрановая (3% для 2-3 мин), а затем обезглавить животное, сразу же после завершения индукции анестезии. Установите головку в чашке Петри (диаметр 10 см, глубина 1,5 см) содержащий холодной (4 ° C) нулевой Ca2 + PSS под стереомикроскопом.
    2. Просмотр через микроскоп, удалите кожи и волос над черепа и чрезмерной крови с холодной нулевой Ca2 + PSS. Сделайте надрез, используя только советы стандартных Рассечение ножницами (например, лезвие 24 мм), начиная с затылочной кости и вверх через носовой кости черепа.
    3. Откройте черепа внимательно вдоль разреза с помощью грубой наконечником щипцы и отдельной соединительной ткани изолировать мозга с нетронутыми круг Уиллис.
      Примечание: Кроме того щипцами кости резки Littauer может использоваться для открытия черепа и подвергнуть мозг.
    4. Осторожно промойте изолированных мозга с холодной нулевой Ca2 + PSS в стакан для удаления крови. Место вентральной стороне мозга вверх в камере, содержащей холодной рассечение решение для изоляции церебральных артерий (рис. 1A).
  2. Изоляция церебральных артерий
    Примечание: Задней мозговой артерии был выбран в качестве представителя цереброваскулярные исследование эндотелиальной модель для этого протокола.
    1. Обеспечить изолированное мозга в холодной рассечение решения с использованием нержавеющей стали (диаметром 0,2 мм, длина ~ 11 – 12 мм) вставляется в древесный уголь проникнуты кремния полимерное покрытие нижней (глубина ≥50 см) стекла Петри.
    2. Для поддержания охлажденной температуры PSS во время вскрытия, используйте рассечение палате охлаждаются хладагента непрерывно Велоспорт водой 1:1-этилен гликоль смеси. Кроме того рассечение может выполняться на свежий лед.
    3. Хирургически изолируйте задней мозговой артерии (~0.3 до 0,5 см сегменты, не осевая) от задней общения и базилярной артерии, с помощью инструментов microdissection беззаботными стиль ножницы и заточенные штраф наконечником щипцы (Рисунок 1B ). Использование нержавеющей стали (диаметром 0,1 мм, длина ~ 13 – 14 мм) безопасные и изолированные задней мозговой артерии в решении рассечение в Петри (рис. 1 c).
    4. Тщательно очистите изолированное задней мозговой артерии, удалив соединительной ткани, используя заостренный штраф наконечником щипцы (рис. 1 d). Нарезать сегменты нетронутыми артерий (длина 1 – 2 мм) для ферментативного пищеварения (рис. 1 d; врезные).

4. Подготовка эндотелиальной трубы и Superfusion

Примечание: Эндотелиальной трубка готовится, как описано ранее,12модификаций для мозговой артерии6.

  1. Подготовьте Тритурация аппарат, с помощью микроскопа с целями (10 x 20 x и 40 x), камеры и алюминиевые подмости, держа камеру и микроманипуляторов. Безопасный microsyringe с контроллером насоса, прилегающих к сцене и образца (рис. 2A).
  2. Полностью засыпки Тритурация Пипетка с минеральным маслом и закрепите его на микро Шприц поршневой. Затем, используя микро шприц с контроллер насоса, снять диссоциации решение в дозатор (~ 130 nl) поверх минерального масла, обеспечивая отсутствие воздушных пузырьков в пипетку.
  3. Место нетронутыми артериальных сегментов в 1 мл раствора диссоциации в 10 мл стеклянной трубки (рис. 2B), содержащие папаин 0,31 мг/мл, 0.5 мг/мл dithioerythritol, 0,75 мг/мл коллагеназы и эластаза 0,13 мг/мл. Инкубируйте на 34 ° C для 10-12 мин для частичной пищеварение.
  4. После переваривания замените фермента решение ~ 5 мл раствора свежие диссоциации. С помощью пипетки 1 мл, перевести один сегмент в камеру, содержащую решение диссоциация на RT.
  5. Поместите дозатор в раствор диссоциации в камере и расположите его рядом с одного конца переваренной судна. Установите скорость в диапазоне от 2 до 5 nL/s на контроллер насоса для нежный Тритурация (рис. 2 c; врезные).
  6. Во время просмотра через 100 x 200 x увеличение, снять и извлечь артериального сегмента не присоединяться гладкомышечные клетки при производстве эндотелиальной трубки. При необходимости, осторожно используйте штраф наконечником щипцы для разделения диссоциированных адвентиции и внутренней упругой пластинки от эндотелия трубки. Убедитесь, что все гладкомышечные клетки отделить и что только эндотелиальных клеток остаются нетронутыми «трубки» (рис. 2 c).
  7. С помощью микроманипуляторов, обеспечить каждого конца эндотелиальной трубки на стекла Крышка выскальзования superfusion камеры с использованием боросиликатного стекла, закрепление пипетки (Рисунок 2D).
  8. Вымывание отделить адвентиции и гладкомышечные клетки от камеры и заменить диссоциации решение с 2 мм CaCl2 PSS. Передачи мобильной платформы с обеспеченным эндотелиальной трубу на Микроскоп superfusion и экспериментальные установки.
  9. Использование 6 резервуаров чистой 50 мл (Рисунок 3А) для непрерывной доставки PSS и решений соответствующих наркотиков во время эксперимента, в случае необходимости. Используйте встроенный клапан контроля вручную установить скорость потока во всем согласуется с ламинарным потоком во время сопоставления потока корма для вакуумного всасывания. Доставлять PSS камеры (рис. 3B) для superfusion эндотелиальная трубки для ≥ 5 мин до запись исходных данных и загрузки красителя.

5. краска нагрузки, вымывание и температурные режимы

  1. Включите все компоненты системы фотометрии для измерения [Ca2 +]я. Для просмотра эндотелиальной трубки на 400 x увеличение и внимание на клетки в окне фотометрических, используя набор программного обеспечения системы фотометрии используйте Микроскоп на экспериментальном стенде (рис. 3 c).
  2. Измерьте диаметр эндотелиальной трубки и записывать значения Аутофлюоресценция фона в согласии с 510 нм выбросов во время альтернативных возбуждения на 340 и 380 Нм (≥10 Гц).
  3. Для измерения [Ca2 +]я ответы, нагрузки эндотелиальной трубка с фура-2 AM красителя (конечная концентрация 10 мкм) на RT и позволяют ~ 30-40 мин при отсутствии света.
  4. Перезагрузите superfusion эндотелиальная трубки с свежими PSS для ~ 30 – 40 мин до вымывания избыточного красителя и позволяют внутриклеточных фура-2 AM к де эстерифицировать. В период вымывания поднять температуру постепенно от комнатной до 37 ° C, используя регулятор температуры (рис. 3A) с встроенным обогревателем, а затем сохранить при 37 ° C на протяжении всего эксперимента.
    Примечание: Рекомендуется добавочного перехода между RT до 37 ° C влечет за собой три шага (например, 5 ° C) с ≥5 мин время уравновешивания на каждом шагу.

6. одновременное измерение [Ca2 +]я и Vm

  1. Включите все другое оборудование и электрометр набор программного обеспечения для измерения Vм (см. рис. 3, рис. 4). Отрегулируйте скорость сбора данных соответственно (≥10 Гц).
  2. Потяните резко электрода и обратной засыпки с 2 М KCl. Для исследования межклеточных муфты переводом красителя, засыпки микроэлектродов с 0.1% пропидий йодидом растворяют в 2 М KCl.
  3. Закрепите электрода серебряной проволоки с хлорид в держателе пипетки, придает электрометр главный этап, обеспеченные микроманипулятор покрытием. Используйте микроманипулятор для кратко Расположите наконечник электрода в пропуская PSS в зале во время просмотра через цели 4 x.
  4. Установите покоя Vm 0 в соответствии с заземлением Ванна потенциал. Расположите наконечник электрода чуть больше клеток эндотелия трубки. При необходимости, используйте звуковой базовых мониторов, связанных с электрометры связываемый с потенциальными записи звука поле.
  5. Увеличить масштаб до 400 x с использованием 40 x цель и повторно установите наконечник электрода при необходимости. Измените фотометрические окно, с помощью программного обеспечения фотометрии сосредоточиться на эндотелиальных клеток ~ 50 – 80.
  6. Осторожно поместите электрода в одной из клеток эндотелия трубки с помощью микроманипулятор и ждать ≥2 мин для отдыха Vm для стабилизации. Аналогичным образом вставьте второй электрод в другой ячейке (расстояние ≥100 мкм) из первой ячейки пронзил с первым электродом.
  7. После того, как отдыхает Vm является стабильным на уровне его ожидаемые значения (-30 -40 МВ)6, включите ПМТ на интерфейсе флуоресценции в отсутствие света и начать приобретение внутриклеточных [Ca2 +]я захватывающие фура-2 попеременно (10 Гц) в 340 и 380 Нм при сборе флуоресценции выбросов на 510 нм.
    Примечание: Для тестирования межклеточных электрические муфты, текущий (± 0,5-3 nA, длительность импульса ~ 20 s) могут быть доставлены через один электрометр «Сайт 1», и изменения Vm могут быть записаны с другой электрометр как «сайт 2» (расстояние ≥100 мкм).
  8. После создания одновременных измерений Vm и [Ca2 +]я , позволяют ~ 5 мин для superfusion эндотелиальная трубки с PSS со скоростью постоянной ламинарного потока перед применением наркотиков.
  9. Примените препарат (например, АТФ), подготовленный в PSS в superfusion палату с постоянной скоростью потока. После ~ 3 мин (или период времени для кинетика препарата) мыть с PSS до Vm и соотношение 380/f F340вернуться в их исходных условий. Марк соответствующих записей как височно синхронизированные через фотометр и электрометр комплекты программного обеспечения при каждом переходе решений.
  10. После этого эксперимента, снять электрод из ячейки с помощью микроманипулятор и заметить Vm ~ 0 mV как ссылается Ванна электрода. Остановить соответствующие записи Vm и [Ca2 +]я и сохранить записи файла для анализа данных.

7. Визуализация муфта к ячейке

  1. Для визуализации ячеек для сцепления через пропидий йодидом, используйте x 40 или 60 x флуоресцентные цель с относительно высокой числовой апертуры (например, 0,95) и набор фильтров родамин с твердотельного освещения, Камера высокого разрешения (например, 16- мегапикселей) и набор изображений программного обеспечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схематические демонстрации протокола, описанные выше показан на вложенные фигуры. Мозг, изолированных от молодых взрослых мужчины C57BL/6Н мышь (5 месяцев) показан на рисунке 1A. Задней мозговой артерии, тщательно изолированы от круг Уиллис, удалены без соединительной ткани и нарезать сегменты (рис. 1B-D). Частично переваренной артериальных сегментов нетронутыми эндотелиальной труба производится и закрепляться на стекла Крышка выскальзования, с помощью закрепления пипетки. Нежный механическое растяжение применяется с помощью двух закрепляющий пипетки для приблизительное линейное в естественных условиях длина без корабля извилистость. Это далее уточнены в рукописи (рисунок 2A-D). Эндотелиальные трубы, изолированные от задней мозговой артерии, ~ 90 – 100 мкм в ширину и ≥300 мкм в длину. Трубка загружается с фура-2 AM следуют вымывание с PSS. Одновременное измерение [Ca2 +]я и Vm в эндотелиальных трубке осуществляется Ca2 + фотометрии, а также острые электрода электрофизиологии (экспериментальная Рог, показано на рис. 3 и рис. 4).

Функциональная оценка эндотелиальной трубки производится путем применения классической эндотелиальной GPCR агонист например АТФ в камеру потока в физиологических условиях. Как показано на рисунке 5, [Ca2 +]я и Vm записываются одновременно в ответ СПС (100 мкм). Значительное гиперполяризации Vm (≥5 mV) происходит одновременно с внутриклеточных [Ca2 +]я увеличение, указав, что рост [Ca2 +]я активирует SKCa/IKCa каналы и тем самым позволяет измеряем K+ через плазматическую мембрану производить EDH. Доказательства межклеточные соединения с использованием текущих инъекций (± 0,5 до 3 nA, ~ 20 s импульсов) можно найти в нашей недавно опубликованной работе (ссылка6, рис. 1). Обратите внимание, что пропидий йодидом имеет массу да ~ 668 со ссылкой на второй посыльных, известный для прохождения через разрыв соединения например инозитол trisphosphate (IP3, да ~ 420), циклический аденозинмонофосфат (лагерь, да ~ 329).

Figure 1
Рисунок 1 : Изоляция мозговой артерии мозга. (A) мозг изолированных с нетронутыми артерий (белая стрелка указывает задней мозговой артерии) в dessection растворе. (B) Magnified взгляд на задней мозговой артерии (белая стрелка; ~ 3 x против. Группа A). (C) изолированные задней мозговой артерии обеспеченных с контактами из нержавеющей стали в образец блюдо. (D) задней мозговой артерии, после удаления соединительной ткани. Врезные показывает вырезать сегменты артерий; Шкалы бар = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Подготовка церебральный эндотелиальных трубки. (A) оборудование, используемое для истирание частично переваренной артериальных сегментов; = микроманипулятор, b = камеры для подготовки труб, c = алюминиевые подмости, d = microsyringe, e = микроскопа, f = microsyringe контроллер насоса. (B) артериального сегментов (белые стрелки) в растворе для ферментативного пищеварения. (C) эндотелиальной трубы, подготовленный Тритурация; = Тритурация пипетки, b = нетронутыми эндотелиальной трубки. Врезные показывает Тритурация процесс удаления адвентиции и гладкомышечные клетки; Шкалы бар = 100 µm. (D) нетронутыми эндотелиальной трубки закреплены на стекла покрытие скольжения с закрепления пипетку; = закрепление пипетки, b = нетронутыми эндотелиальной трубки диаметром ~ 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Оборудование для superfusion и одновременно [Ca2 +] я и V m измерения. (A) оборудование для superfusion эндотелиальная трубки и контроля температуры, = высокой интенсивности ДУГОВАЯ лампа питания, b = флуоресценции интерфейс системы, c = регулятор температуры, d = 6 резервуары superfusion системы, e = волоконно-оптический свет источники, f = контроллер, g = hyperswitch [Ca2 +]я фотометрии системы. (B) Superfusion камеры аппарата; и b = headstages, c = земли электрода, d = inline нагреватель, e = superfusion труб, f = вакуумного всасывания, g = superfusion камеры, h = алюминиевые подмости, держа камеру. (C) экспериментальной платформы на столе изоляции вибрации; = ячейка обрамление адаптер с камерой, b = Микроскоп свет, c = микроскопа, d = алюминиевые подмости, e = микроманипулятор для headstage управления, f = таблица изоляции вибрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Оборудование для эксплуатации электрофизиологии и запись данных. = Осциллограф, b = функции генератора, c = звуковой базовый монитор, d = фильтр помех 50/60 Гц, e и f = электрометры, g = система сбора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Одновременный [Ca2 +] я и V m записей. (A) дифференциальной помехи контраст изображения (400 x) мыши церебральной артериальной эндотелиальной трубки скорректирована для эксперимента в фотометрических окно используя цели 40 x. Резкое электрода помещается в ячейку, как показано в верхней части изображения (белая стрелка). (B) Raw следы для одновременного измерения F340/f380 коэффициент (вверху) и Vm (внизу) в ответ на СПС (100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В свете недавних событий6,,1516,17мы теперь продемонстрировать метод, чтобы изолировать мыши церебральной артериальной эндотелия в подготовке для одновременного измерения [Ca2 +] i и Vm лежащие в основе EDH последовательно в течение ~ 2 ч при 37 ° C. Хотя технически сложной, мы можем измерить ячеек также муфты (см. ссылку6, рис. 1). Таким образом мы можем измерить дискретных и проведенных сигнализации события одновременно. За счет общих задач, стоящих перед при изоляции мыши артериальной эндотелия проконсультироваться ссылок11,12. Мы подчеркиваем, что важные шаги для изоляции мыши церебральных артерий, наши частности измерения эндотелиальной [Ca2 +]я и Vм, по устранению неполадок и соображений для альтернативных методов в свете экспериментальный сильные/слабые стороны ниже.

Задней мозговой артерии требует тщательной изоляции от круг Уиллис и соединительной ткани без ущерба для гладких мышц и эндотелиальных клеток. Хирургические инструменты (ножницы и щипцы) должны быть пригодны для мыши микроциркуляции рассечение процедуры при сохранении с чистой, острыми краями. Относительно скелетных мышц12, мы сократили период времени для ферментативного инкубации на две трети и концентрации и папаин, коллагеназа, dithioerythritol наполовину при добавлении использования эмпирически оптимизированной концентрации эластазы. Для последовательного успеха в изоляции церебральной артериальной эндотелиальной трубы важно для заказа ферментов в пакетах (2-4 флакона) от авторитетных поставщиков с последовательной производственной практики в соответствии с частотой использования и срок годности. Даже с потенциалом для изменения активности ферментов из одной партии фермента к следующему предполагается, что концентрации фермента поддерживаться во время оптимизации время пищеварения в течение 10-12 мин. Стоит отметить, что ни пола, ни возраст животного (3 до 30 месяцев) был существенным барьером к подготовке изолированных эндотелия из мозговых артерий в нашем опыте. Таким образом рекомендуется, что в состав фермента коктейль и время пищеварения энзима остаются теми же, в исследованиях по возрасту и полу.

Как подчеркнул, осторожность требуется при изоляции из адвентиции и веретеновидной формы гладкомышечные клетки эндотелия и нежный Тритурация для того, чтобы избежать повреждения эндотелиальных клеток12. Тритурация шага вязких нефтепродуктов служит средство гидравлических между поршень микро шприц и водный PSS для того, чтобы снять или извлечь судно сегментов, купались в PSS. Следует отметить, что если судно сегмент контакты минерального масла, этот шаг необходимо повторить с помощью чистой Тритурация пипетки с последовательным закапывания минерального масла и PSS. Перед эксперимент рекомендуется восстановить длиной приблизительно линейной в естественных условиях на эндотелиальных трубу, насколько это возможно, whereby индивидуальные клетки себя «квартира», продольные морфологии (например, диаметр ~ 5 мкм; длина ~ 100 мкм; толщина ~0.5 мкм)8. Однако, осевые напряжения не должны применяться в степени, где клетки по краям образца потянув от под соответствующими закрепляющий пипетки и тем самым снижения механической стабильности для надежной сотовой измерений во время эксперимент.

Фотометрические [Ca2 +]я измерительной системы, используемые в этой технике подходит для непрерывных измерений эндотелиальной [Ca2 +]i с помощью ratiometric фура-2 красителя. Отдельные протоколы могут обычно длятся ≥10 мин без значительных Фотообесцвечивание. Кроме того мы широко использовать этот подход для измерения [Ca2 +]я , потому что это поддаются своевременной паузы в частые движения целей микроскопа при необходимости обеспечить резкий электроды для измеренияm V и сбора данных. Обратите внимание, что это фотометрических подход, который захватывает только глобальной, среднем [Ca2 +]я среди нескольких ячеек. В целом для [Ca2 +]я измерений, мы рекомендуем фотометрии для первоначального описания эндотелиальных клеток ответов на фармакологических агентов (например, время курс пик и плато фазы) при одновременном обеспечении планы перейти к quantitate сигнализации событий с помощью стандарта конфокальный или multiphoton микроскопии12,23microdomain.

Электрофизиологии подход резко электрода поддается для комплексной Vm записей в физиологических многоклеточных препаратов. Измерения внутриклеточного Vm является, на сегодняшний день наиболее технически сложных с многочисленные важные шаги, которые можно облегчить или уничтожить успех измерений. Во-первых, экспериментатор должен определить оптимальную программу условия на стекло съемник для последовательно производства резко электроды с кончика сопротивление ~ 150 ± 30 MΩ. С помощью накаливания тепла рамп теста чтения как ссылка, рекомендуется что экспериментатору определить параметры эмпирически, особенно в том, что касается различия в параметре «тепло», максимизируя время тянуть. Далее, Механическая стабильность микроманипуляторы, headstages, Держатели пипетки и образца является абсолютно критическим. Помимо очевидной необходимость для таблицы изоляции вибрации экспериментатор необходимо будет обеспечить что все фитинги безопасны и что сценическая площадка вокруг и под манипуляторов чист. Идеально, посторонний шум должны быть сокращены в той мере, в какой резолюции резкое электрода записей находится в пределах 1 МВ. По нашему опыту наиболее распространенным источником шума является Серебряная проволока, обеспеченных в держателе пипетку, что нуждается в достаточно хлорид покрытие или замена вообще. Если присутствует общий шум 50/60 Гц, «Хум глушителей» технология может использоваться и поставляется с современной электрометр. Если шум появляется полностью неуправляемым, проверьте, есть ли утечка в ванне или переполнения где PSS будут соприкасаться резисторы для контроля температуры. Если осложнения остаются с приобретением стабильный сигналm V, проверьте целостность электрические шнуры и t коннекторы.

Вообще если создание резкий электрода записи завершается неудачно, это обычно вызваны неуместным электрода, механические нестабильности или плохое здоровье клеток. Кроме того экспериментатор могут также хотеть рассматривать конфигурацию патч зажим техники на отдельных, электрически центровку клетки, где можно получить информацию о клеточных течений и одного ионного канала записи. Несмотря на общие вызовы с помощью флуоресцентного красителя (например, гетерогенных внутриклеточных погрузки, отбеливание, калибровка с помощью ionophores, скромный обнаружения резолюции), напряжение чувствительных красители, такие как ди-8-ANEPPS, также коммерчески доступных.

Наше понимание эндотелия в регулирование потока крови и по всему мозгу важно с быстрыми темпами старения населения и увеличением числа случаев хронических сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. Таким образом мы предоставляем метод для изоляции нетронутыми эндотелий от жизненно важных мозговой артерии, которые могут быть адаптированы для других сосудистых структур головного мозга. Кроме того мы показываем полезным подходом для одновременного измерения базового [Ca2 +]я и Vм. Наконец используя двойной внутриклеточных электродов, ячеек соединения через разрыв соединения может также оцениваться. С тщательно спланированной фармакологических и/или генетического вмешательства текущий протокол разумно и количественно охватывает исследование мозгового эндотелиальной функции в своей родной форме. Мы надеемся, что экспериментаторов будет строить от и адаптировать эту информацию для продвижения сосудистой биологии и неврологии в целом. В частности было бы удовлетворительным см общей экспериментальной борется с электрических измерений, к минимуму вообще. Хотя этот протокол не отдельный набор методов любыми средствами, он может использоваться как дополнительный подход для определения именно как эндотелиальные биофизических детерминанты перевести на изменения сосудистого сопротивления и как они настроить регулирование потока крови относительно условий представитель здравоохранения против. болезнь.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Чарльз Хьюитт за отличную техническую помощь при создании оборудования и предметов снабжения, необходимых для текущей протоколов. Мы благодарим Drs. Шон м. Уилсон и Кристофер г. Вильсон, от ЛСУ центр перинатальной биологии, за предоставление нам с дополнительным инвертированным микроскопом и электрометр, соответственно. Это исследование был поддержан национальными институтами здравоохранения грант R00-AG047198 (EJB) и лома Линда медицинской школы университета новый факультет начальных средств. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).

Tags

Биология выпуск 143 микроциркуляции головного мозга эндотелиальных гиперполяризации G-протеин рецепторов Ca2 +-активированный K+ каналы фура-2 фотометрии внутриклеточный микроэлектродов межклеточные соединения
Одновременного измерения внутриклеточного кальция и мембранный потенциал в свеже изолированных и нетронутыми мыши мозгового эндотелия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hakim, M. A., Behringer, E. J.… More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter