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Neuroscience

मिर्गी के एक ज़ेब्राफ़िश मॉडल में व्यवहार और शारीरिक विश्लेषण

Published: October 19, 2021 doi: 10.3791/58837
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 1,2, 1,2
1University Paris Descartes Hospital Necker-Enfants Malades, Institut Imagine, 2Institut du Cerveau et de la Moelle épinière - ICM, Sorbonne Universités Paris, 3Transylvanian Institute of Neuroscience (TINS)
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम DEPDC5 जीन के क्षणिक अवरोध के परिणामस्वरूप मिर्गी के एक ज़ेब्राफ़िश मॉडल के विकास और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

मिर्गी सबसे आम न्यूरोलॉजिकल विकारों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, जो दुनिया भर में अनुमानित 50 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है। आनुवंशिक अनुसंधान में हाल ही में प्रगति मिर्गी के विभिन्न रूपों में फंसाया जीन के एक बड़े स्पेक्ट्रम का पर्दाफाश किया है, इस विकार की विषम प्रकृति पर प्रकाश डाला । मिर्गी में फंसा आनुवंशिक उत्परिवर्तनों द्वारा ट्रिगर किए गए रोग तंत्र की जांच करने और विशेष, लक्षित उपचारों के विकास के लिए उपयुक्त पशु मॉडल आवश्यक हैं। हाल के वर्षों में, जेब्राफिश मिर्गी मॉडलिंग के लिए एक मूल्यवान कशेरुकी जीव के रूप में उभरा है, दोनों आनुवंशिक हेरफेर और ज्ञात मिर्गी दवाओं के संपर्क के साथ, जैसे पेंटीलेनटेट्राजोल (पीटीजेड), उपन्यास विरोधी मिर्गी चिकित्सा की पहचान करने के लिए । mTOR नियामक DEPDC5 में हानिकारक उत्परिवर्तन फोकल मिर्गी के विभिन्न रूपों के साथ जुड़े रहे हैं और जेब्राफिश ऑर्थोलॉग के नॉक-डाउन सहज जब्ती जैसे एपिसोड से जुड़ी अतिसक्रियता का कारण बनता है, साथ ही बढ़ी हुई विद्युत गतिविधि और विशेषता बारी पहिया तैराकी। यहां, हमने डेपडीसी 5 हानि-कार्य मॉडल उत्पन्न करने में शामिल विधि का वर्णन किया और 28 और 48 एच पोस्ट निषेचन (एचपीएफ) में मोटर गतिविधि का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया, साथ ही जेब्राफिश ऑप्टिक टेक्टम में फील्ड गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि। समय के साथ न्यूरोनल गतिविधि पर मिर्गी की दवा पीटीजेड के प्रभाव का एक उदाहरण भी प्रदान किया जाता है।

Introduction

विकास के शुरुआती चरणों में अपने छोटे आकार, अस्पष्ट विकास और पारदर्शिता के कारण, ज़ेब्राफ़िश मानव रोगों को हृदय, कैंसर या तंत्रिका संबंधी विकारों के रूप में विविध मॉडलिंग के लिए एक मूल्यवान कशेरुकी जीव के रूप में उभरा है1,2। ज़ेब्राफ़िश एक कशेरुकी के फायदों को जोड़ती है, जिसमें अंग वास्तुकला और आनुवंशिक कोड का उच्च संरक्षण शामिल है, छोटे आकार और सरल मॉडल जीवों के आनुवंशिक हेरफेर में आसानी के साथ, इसलिए मौलिक अध्ययन और अनुवादात्मक अनुप्रयोगों दोनों को सुविधाजनक बनाता है। विशेष रूप से, सेलुलर प्रक्रियाओं के व्यवहार और फ्लोरोसेंट मार्कर की उच्च-थ्रूपुट स्वचालित स्क्रीनिंग के लिए इसकी उत्तरदायीता ने ज़ेब्राफिश को मिर्गी अनुसंधान के लिए एक विशेष रूप से आकर्षक मॉडल बना दिया है। यह मिर्गी3,4,5 के रासायनिक प्रेरित और/या आनुवंशिक मॉडल की विशेषता वाले प्रकाशनों की संख्या के अंतिम दशक में उच्च वृद्धि से प्रदर्शित किया गया है और हाल ही में, इन मॉडलों6,7,8 में रासायनिक स्क्रीन से प्राप्त आशाजनक चिकित्सा विज्ञान की रिपोर्ट ।

DEPDC5 GATOR1 परिसर का सदस्य है, जो mTOR सिग्नलिंग9 का एक नकारात्मक नियामक है। डेपडीसी 5 जीन में उत्परिवर्तन पहली बार 2013 में ऑटोसोमल प्रमुख फोकल मिर्गी10,11से पीड़ित प्रोबैंड में खोजे गए हैं और इसके बाद से फोकल मिर्गी अभिव्यक्तियों और फोकल कॉर्टिकल डिस्प्लेसिया12से जुड़े कई नैदानिक स्थितियों में सूचित किया गया है। रिपोर्ट किए गए अधिकांश उत्परिवर्तनों से जीन12के नुकसान का कारण बनने की भविष्यवाणी की गई है, और इसे औपचारिक रूप से कई डेपडीसी 5 उत्परिवर्तित टेपों के लिए प्रदर्शित किया गया था, जिन्हें बकवास मध्यस्थता एमआरएनएक्षय 12, 13द्वारा लक्षित कियागयाहै। समझौते में, एंटीसेंस मॉर्फ ओलिगोनियो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एएमओ) का उपयोग करके जेब्राफिश में जीन ऑर्थोलॉग की दस्तक के परिणामस्वरूप कई विशेषताएं होती हैं जो इस जीव में मिर्गी के मॉडल के लिए आम हैं, जिसमें अतिसक्रियता, पहिया की तरह तैराकी, सहज दौरे और बढ़ी हुई न्यूरोनलगतिविधि14,15, 16,17,18शामिल हैं। दिलचस्प बात यह है कि एमटीआर सिग्नलिंग के अवरोधक रैपामाइसिन के साथ उपचार ने इस मॉडल18की व्यवहार विशेषताओं को उलट दिया, इस परिकल्पना का समर्थन करते हुए कि डेपडीसी 5 हानि-कार्य mTOR मार्ग9, 19के गलतीकरण के कारण मिर्गी को ट्रिगर कर सकता है।

मॉर्फोलिनो संशोधन को ले जाने वाले एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके वीवो में जीन अभिव्यक्ति की क्षणिक दस्तक सी/श्नान आधारित तकनीकों के बराबर विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण रहा है । हाल ही में, AMO आधारित रणनीतियों को भी नैदानिक अनुप्रयोगों पाया गया है, एक पहले AMO चिकित्सा २०१६20में Duchenne पेशी शोष के उपचार के लिए एफडीए अनुमोदन प्राप्त करने के साथ । हालांकि यह बताया गया था कि जेब्राफिश में तीव्र एएमओ-आधारित जीन नॉक-डाउन का फेनोटाइप हमेशा संविलियन नॉक आउट मॉडल21के साथ सहसंबंधित नहीं होता है, यह कम से कम कुछ उदाहरणों में संविलियन आनुवंशिक संशोधनों द्वारा पैदा किए गए प्रतिपूरक तंत्र के कारण हो सकताहै। हालांकि, AMO-प्रेरित फेनोटाइप की विशिष्टता का मुद्दा एक निर्विवाद चिंता का विषय है जिसे इसतकनीकका उपयोग करके अध्ययनों में लगन से संबोधित किया जाना चाहिए । AMO-आधारित नॉक-डाउन फेनोटाइप की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए, कई प्रमुख नियंत्रण आवश्यक हैं। इनमें एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र शामिल है जो जीन नॉक-डाउन के लिए प्रभावी एएमओ की सबसे कम खुराक के चयन की अनुमति देता है, आनुवंशिक सामग्री की अधिकता की शुरूआत के कारण समग्र विषाक्तता से बचता है। एक बेमेल AMO का उपयोग जो जीनोम में किसी विशेष क्षेत्र को लक्षित नहीं करता है, एक उपयुक्त खुराक स्थापित करने और एक विशिष्ट फेनोटाइप की पहचान करने के लिए भी आवश्यक है। एक दूसरा AMO जो एक ही जीन के एक अलग क्षेत्र को लक्षित करता है, जैसे कि एक स्प्लिस-अवरुद्ध AMO, इस बात की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है कि फेनोटाइप लक्ष्य जीन के नॉक-डाउन के कारण है । जीन के सीडीएनए के साथ नॉक-डाउन फेनोटाइप का बचाव, या तो मानव ऑर्थोलॉग या जेब्राफिश जीन का एक कोडन-संशोधित संस्करण जिसे एएमओ द्वारा लक्षित नहीं किया जा सकता है, फेनोटाइप विशिष्टता के पक्ष में एक मजबूत तर्क प्रदान करता है। एक ही सीडीएनए के साथ बचाव की कमी जिसमें नुकसान-फ़ंक्शन म्यूटेशन (जैसे कि शुरुआती स्टॉप कोडन की शुरुआत) इस दिशा में एक और सबूत है।

यहां, हम एक ज़ेब्राफ़िश DEPDC5 हानि के कार्य मॉडल और 28 और 48 घंटे पोस्ट निषेचन (एचपीएफ) पर व्यवहार फेनोटाइपिंग के लिए प्रोटोकॉल पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। 28 एचपीएफ में, DEPDC5 हानि-समारोह समग्र अतिसक्रियता का कारण बनता है, जैसा कि कोरियो के भीतर भ्रूण के उन्नत कुंडल और हिल आंदोलनों का सबूत है। प्रति भ्रूण समग्र गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस स्तर पर एक स्वचालित गति का पता लगाने प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है। ४८ एचपीएफ में, जेब्राफिश प्रदर्शनी टकसाली स्पर्श के जवाब में तैराकी बच । DEPDC5की डाउनरेगेटेड अभिव्यक्ति के साथ जेब्राफिश में, तैराकी का प्रक्षेपवक्र नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक कष्टमय है, मछली इस जीव3,4में अन्य रिपोर्ट किए गए मिर्गी मॉडल के समान पैटर्न की तरह "कॉर्क-स्क्रू" या "टर्न-व्हील" का प्रदर्शन करती है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग 4-6 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) के बीच जेब्राफिश लार्वा में ऑप्टिक टेक्टम में प्राप्त की गई थी और DEPDC5 नॉक-डाउन जानवरों में न्यूरोनल गतिविधि में एक आधारभूत वृद्धि दिखाते हैं। इस मॉडल का लाभ यह है कि यह विभिन्न समय बिंदुओं पर कई फेनोटाइपिक विशेषताएं प्रस्तुत करता है, जो विकास के दौरान दवा चिकित्सा की प्रभावकारिता की निगरानी और आकलन में उपयोगी हो सकते हैं।

Protocol

प्रायोगिक प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय और संस्थागत नैतिक समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. ज़ेब्राफिश भ्रूण में DEPDC5 जीन के क्षणिक दस्तक नीचे

  1. उपकरणों की तैयारी:
    1. सिलिकॉन इलास्टोमर-लेपित इंजेक्शन पेट्री व्यंजन तैयार करें: किट के आधार और इलाज एजेंट को 10:1 अनुपात में मिलाएं (सामग्री की तालिकादेखें) । मिश्रण के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश आधे रास्ते भरें। सिलिकॉन का उपयोग करने से पहले कठोर होने की प्रतीक्षा करें (इसमें कई दिन लग सकते हैं)।
    2. एंटीसेंस मॉर्फ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एएमओ; टेबल ऑफ मैटेरियल्सदेखें) के 1.2 mmol/L स्टॉक समाधान तैयार करें। 1.2 mmol/L स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए 300 nmole lyophilized AMO में बाँझ पानी के 250 μL जोड़ें। पूर्ण विघटन के लिए, शीशियों को 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्म करें। भंवर संक्षेप में। एक प्लास्टिक फिल्म के साथ ट्यूब कैप सील (सामग्री की मेजदेखें) ।
    3. नियंत्रण बचाव प्रयोगों के लिए, एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड तैयार करें जिसमें डेपडीसी 5 के मानव सीडीएनए (सामग्री की तालिकादेखें) पीसी 2 रीढ़ या इसी तरह की जेब्राफिश-संगत अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में क्लोन किया जाता है। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक प्रारंभिक स्टॉप कॉडन (p.Arg487 *) के कारण उत्परिवर्तन सीडीएनए में पेश किया गया था।
    4. भ्रूण का पानी तैयार करें: रिवर्स ऑस्मोसिस वॉटर + ०.५ मिलीग्राम/एल मेथिलीन ब्लू में ०.०६ ग्राम/एल एक्वेरियम नमक (सामग्री की टेबलदेखें) ।
    5. इंजेक्शन के दिन, एक पुलर का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्शन बोरोसिलिकेट ग्लास सुई तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)। सुई खींचने वाले पर उचित तापमान सेटिंग्स स्थापित करें। लगभग 1 सेमी की लंबाई के साथ पतली युक्तियों के साथ दो ~ 5 सेमी केशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए 10 सेमी लंबा, 1/0.5 ओडी/आईडी एमएम बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका का उपयोग करें।
    6. यदि सुइयों की नोक बहुत ठीक है, तो समाधान के इंजेक्शन को रोकते हुए, माइक्रोस्कोप के नीचे संदंश का उपयोग करके पतला टिप के अंत को तोड़ें।
    7. इंजेक्शन से ठीक पहले, एएमओ के कामकाजी समाधान तैयार करें। परिणामों की पुनरुत्पाणि सुनिश्चित करने के लिए हमेशा नए समाधान तैयार करें। 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर AMO स्टॉक शीशियों हीट। फास्ट ग्रीन डाई (0.02% अंतिम एकाग्रता, सामग्री की तालिकादेखें) और पानी में काम कर रहे एकाग्रता पर पतला AMO युक्त एक 5 μL इंजेक्शन नमूना तैयार करें।
    8. एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र का उपयोग कर प्रत्येक जीन के लिए अनुभवजन्य AMO की काम एकाग्रता निर्धारित करें । काम एकाग्रता एक एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है जहां AMO नीचे सामांय विषाक्तता, जैसे सकल रूपात्मक दोष के कारण के बिना जीन दस्तक में प्रभावी है । आमतौर पर, AMO काम कर रहे सांद्रता ०.२ mmol/L से 1 mmol/L (०.४ mmol/L की एक सीमा में होगा इस अध्ययन18के लिए प्रभावी एकाग्रता के रूप में निर्धारित किया गया था) । प्रभावी AMO के रूप में एक ही एकाग्रता पर नियंत्रण बेमेल morpholino इंजेक्ट।
    9. भंवर ट्यूबों और अपकेंद्रित्र संक्षेप में ट्यूबों के नीचे करने के लिए बूंदों लाने के लिए।
    10. बचाव प्रयोगों के लिए, काम एकाग्रता पर पतला AMO के साथ एक 5 μL इंजेक्शन नमूना तैयार करें और सीडीएनए अभिव्यक्ति एक अंतिम एकाग्रता के लिए पानी में पतला करने के लिए अनुभवजन्य निर्धारित किया जा सकता है । DEPDC5 और नकारात्मक नियंत्रण प्लाज्मिड की अभिव्यक्ति के लिए, 100 एनजी/μL फेनोटाइपिक बचाव के लिए प्रभावी था।
  2. भ्रूण की तैयारी:
    1. माइक्रोइंजेक्शन से एक दिन पहले, जेब्राफिश संभोग टैंक स्थापित करें। इंजेक्शन की सुबह, डिवाइडर को हटा दें ताकि स्पॉन सक्षम हो सके। एक ठीक छलनी का उपयोग कर भ्रूण के पानी से भरे 100 मिमी पेट्री व्यंजनों में अंडे ले लीजिए। संग्रह से 20-30 मिनट के भीतर इंजेक्ट करें, जबकि अंडे एक सेल चरण में हैं।
    2. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ 60-80 अंडे उठाओ और इंजेक्शन के लिए सिलिकॉन लेपित पेट्री डिश में उन्हें व्यवस्थित करें। सिलिकॉन सतह इंजेक्शन के दौरान अंडे को फिसलने से रोक देगी। भ्रूण के पानी के अधिकांश निकालें, बस अंडे आधे रास्ते को कवर करने के लिए पर्याप्त छोड़ ।
  3. माइक्रोइंजेक्शन:
    1. इंजेक्शन के घोल के साथ एक गिलास सुई भरें। सुई को इंजेक्शन समाधान युक्त ट्यूबों में से एक में खड़ी रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सुई का निचला सिरा समाधान को छू रहा है। रंगीन इंजेक्शन समाधान केशिका से उगता है और सुई की नोक पर दिखाई देता है जब तक कई मिनट रुको।
    2. माइक्रोइंजेक्टर के इंजेक्शन हैंडल पर भरी सुई माउंट करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. एयर कंप्रेसर चालू करें और ~ 2 एनएल के इंजेक्शन की मात्रा उत्पन्न करने के लिए दबाव सेटिंग को समायोजित करें।
    4. इंजेक्शन समाधान की मात्रा की गणना करने के लिए, एक माइक्रोटॉम स्लाइड पर खनिज तेल की एक बूंद रखें। सेट दबाव और समय मापदंडों का उपयोग कर डाई युक्त समाधान इंजेक्ट करें। इंजेक्शन तरल पदार्थ क्षेत्र के व्यास को मापने और फार्मूला मात्रा = 4/3 * π * (d/2)3,जहां डी = इंजेक्शन बोलस के मापा व्यास का उपयोग कर कुल मात्रा की गणना ।
    5. 4X आवर्धन के साथ एक विच्छेदन दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, कोरियोन और जर्दी से गुजरकर एकल सेल चरण में अंडे इंजेक्ट करें, और सीधे सेल के भीतर समाधान पेश करें।
    6. इंजेक्शन भ्रूण को भ्रूण के पानी के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में ले जाएं, डिश को लेबल करें और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    7. सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर तापमान समय के साथ स्थिर है, क्योंकि भ्रूण विकास दर थर्मोसेंसिटिव है। उदाहरण के लिए, उच्च तापमान पर विकास में तेजी आएगी और फेनोटाइप24का उचित आकलन करने के लिए विकास का स्तर महत्वपूर्ण है ।
    8. इंजेक्शन के बाद अंडे की गुणवत्ता 6-8 घंटे की जांच करें और प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके मृत और निषेचित भ्रूण को हटा दें।
    9. अगली सुबह, गिनती और एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ प्रत्येक पकवान में मृत भ्रूण को हटा दें ।

2. व्यवहार विश्लेषण

  1. 28 एचपीएफ में वैश्विक गतिविधि विश्लेषण:
    1. माइक्रोइंजेक्शन (28 एचपीएफ) के बाद दिन की दोपहर को परीक्षण करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि जिस दिन परीक्षण किया जाता है, उसका समय वैध सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए प्रयोगों पर सुसंगत है क्योंकि भ्रूण विकास बहुत तेजी से होता है।
    2. भ्रूण के पानी के साथ एक 35 मिमी पकवान (परीक्षण पकवान) भरें और परीक्षण शुरू करने से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (28 डिग्री सेल्सियस) में गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. परीक्षण पकवान के तल पर, आकार में एक प्लास्टिक जाल ग्रिड (1.2x1.2 मिमी) कटौती रखें।
    4. एक और प्रयोगकर्ता भ्रूण के परीक्षण के आदेश को यादृच्छिक करें और परीक्षण की जाने वाली शर्तों के नामों को मुखौटा करें।
    5. सुनिश्चित करें कि मृत्यु दर स्थितियों के बीच नहीं बदलती है और फेनोटाइप की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए गैर-इंजेक्शन भ्रूण की तुलना में। सभी स्थितियों में मृत भ्रूण का प्रतिशत 10-13%18से अधिक नहीं होगा ।
    6. प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके प्लास्टिक की जाली पर उनके कोरियोन के भीतर अभी भी 10-12 भ्रूण रखें। भ्रूण को जलमग्न रखने के लिए पर्याप्त भ्रूण के पानी के साथ परीक्षण पकवान भरें लेकिन तैरते नहीं हैं। यदि आवश्यक हो, तो भ्रूण को ग्रिड पर रखने के लिए प्लास्टिक टिप का उपयोग करके देखभाल के साथ स्थानांतरित करें।
    7. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप से जुड़े वीडियो कैमरे (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करना, एक निर्धारित समय के लिए सहज कॉइलिंग गतिविधि रिकॉर्ड करें (10-20 मिनट लंबे वीडियो आमतौर पर मात्राकरण के लिए गतिविधि फटने के प्रतिनिधि नमूने प्राप्त करने के लिए पर्याप्त होते हैं)
    8. भ्रूण को उनके संबंधित पकवान में लौटाएं और उन्हें वापस इनक्यूबेटर में डाल दें। प्रत्येक स्थिति के लिए आवश्यक कई भ्रूणों के साथ प्रयोग दोहराएं (जैसा कि 90% बिजली विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया है)।
    9. कुल सहज आंदोलन का विश्लेषण करने के लिए, ज़ेब्रालैब सिस्टम (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। गतिविधि मात्राकरण मॉड्यूल का उपयोग करके, रिकॉर्ड किए गए वीडियो को अपलोड करें और प्रत्येक भ्रूण के चारों ओर ट्रैकिंग एरेनास को उपयुक्त के रूप में डिजाइन करें। फ्रीज सेट और फट दहलीज क्रमशः 10 और ५० के लिए ।
    10. स्वचालित वीडियो विश्लेषण चलाएं, जो प्रत्येक परिभाषित एरेनास के अंदर कुल गतिविधि की मात्रा निर्धारित करता है, फिर डेटा सेट को स्प्रेडशीट के रूप में पुनर्प्राप्त करता है और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण करता है।
  2. टच-पैदा-एस्केप-रिस्पांस (TEER) 48 एचपीएफ पर:
    1. इंजेक्शन (निषेचन के बाद 48 घंटे) के दो दिन बाद सुबह परीक्षण करवाएं।
    2. परीक्षण से पहले कम से कम 2 घंटे, ठीक संदंश का उपयोग कर भ्रूण डिकोरियोनेट। सुनिश्चित करें कि डिकेरेशन और व्यवहार परीक्षण के लिए दिन का समय प्रयोगों पर सुसंगत है।
    3. भ्रूण के पानी के साथ 130 मिमी डिश (टेस्ट डिश) भरें और इसे परीक्षण शुरू करने से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (28 डिग्री सेल्सियस) में गर्म करने की अनुमति दें।
    4. मृत और रूपात्मक रूप से विकृत लार्वा को गिनें और हटा दें। प्रत्येक स्थिति के लिए संख्या रिकॉर्ड करें।
    5. एक और प्रयोगकर्ता आदेश को यादृच्छिक करें और परीक्षण की जाने वाली शर्तों के नाम को संहिताबद्ध करें।
    6. कैमरे माउंट (सामग्री की मेजदेखें) परीक्षण पकवान पर सुनिश्चित करें कि पूरे परीक्षण पकवान देखने के क्षेत्र के भीतर है । एक शासक को देखने के क्षेत्र में रखना दूरी के लिए एक आंतरिक अंशांकन प्रदान करता है।
    7. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ, परीक्षण पकवान के केंद्र में एक भ्रूण डाल दिया और 30 एफपीएस की अधिग्रहण दर का उपयोग कर रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं ।
    8. एक ठीक प्लास्टिक टिप के साथ, एक फ्लिकिंग गति के साथ भ्रूण की पूंछ को थोड़ा स्पर्श करें।
    9. रिकॉर्डिंग बंद करो जब लार्वा ने अपना आंदोलन समाप्त कर दिया है।
    10. भ्रूण को टेस् टी डिश से निकालकर भ्रूण के पानी से भरे नए डिश में रखें। प्रत्येक स्थिति के लिए आवश्यक कई भ्रूणों के साथ परीक्षण दोहराएं (जैसा कि 90% बिजली विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया है)।
    11. भ्रूण को उनके मूल पकवान में लौटाएं और उन्हें वापस इनक्यूबेटर में डाल दें।
    12. तैराकी व्यवहार के मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए, रिकॉर्ड किए गए वीडियो को इमेजजे विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर लोड करें। इमेजजे के मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन डाउनलोड करें और इंस्टॉल करें (सामग्री की तालिकादेखें)। | टूल्स चुनकर प्लगइन लॉन्च प्लगइन | मेनू में मैनुअल ट्रैकिंग।
    13. संवाद खिड़की में, छवि के अंशांकित पैमाने का परिचय दें। कैमरा क्षेत्र में एक शासक सहित पिक्सल के लिए सीएम के रूपांतरण की सुविधा है ।
    14. ट्रैक जोड़ें चुनें और पहले फ्रेम में जेब्राफिश लार्वा की छवि पर क्लिक करके प्रक्षेपवक्र ट्रेसिंग शुरू करें। फ्रेम प्रत्येक बिंदु के साथ स्वचालित रूप से आगे बढ़ते हैं जो ट्रेस में जोड़ा जाता है।
    15. तैराकी प्रकरण के अंत तक आंदोलन का पता लगाने जारी रखें।
    16. ट्रैकिंग विंडो पर एंड ट्रैक का चयन करें, एक्स-वाई निर्देशांक को पुनः प्राप्त करें और कुल दूरी, वेग और टर्निंग एंगल की गणना करें।

3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल एनालिसिस

  1. रिएजेंट और टूल तैयार करना:
    1. भ्रूण के पानी में 1% एगरेस तैयार करें (धारा 1.1.4 देखें)। एलिकोट तरल एगरेग्यूज ट्यूब में उठे और एगरेग को सख्त होने से रोकने के लिए इन्हें 42 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग ब्लॉक पर रखें।
    2. रिकॉर्डिंग समाधान तैयार करें (mmol/L में): एनएसीएल 134, केसीएल 2.9, CaCl2 2.1, MgCl2 1.2, ग्लूकोज 10, HEPES 10, पीएच 7.8.
    3. 1.5-2 माइक्रोम (5-6मिमी2 ·किलोग्राम − 3)के टिप खोलने के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास माइक्रोपिपेट्स खींचें एक−2 प्रतिरोध) बिना पॉलिश किया गया।
  2. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए जेब्राफिश लार्वा की तैयारी:
    1. मछली को ग्लास-बॉटम पेट्री डिश (सामग्री की टेबलदेखें) में रखें और अतिरिक्त बाहुलीय मीडिया को हटा दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मछली को कवर स्लिप के करीब लाया जाए।
    2. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, लार्वा पर और उसके आसपास गर्म तरल एग्रामी जोड़ें। मछली को कवर करने के लिए बस पर्याप्त agarose का उपयोग करें। जबकि एगरेग्नेस कठोर हो जाता है, मछली को सीधे स्थिति में उन्मुख करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें, वेंट्रल साइड डाउन, डिश के केंद्र में।
    3. न्यूरोमस्कुलर ट्रांसमिशन को ब्लॉक करने के लिए 10 माइक्रोन पनक्यूनियम ब्रोमाइड (सामग्री की टेबलदेखें) वाले रिकॉर्डिंग समाधान का 2 एमएल जोड़ें। रिकॉर्डिंग के दौरान छोटी हरकतों के कारण कलाकृतियों को खत्म करने के लिए लकवा ग्रस्त होना जरूरी है।
  3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग
    1. रिकॉर्डिंग समाधान के साथ माइक्रोपिपेट भरें।
    2. वोल्टेज क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन में पैच क्लैम्प एम्पलीफायर (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ, इसके सही मूल्य की पुष्टि करने के लिए स्नान में इलेक्ट्रोड प्रतिरोध को मापें।
    3. 20x उद्देश्य का उपयोग करके, देखने के केंद्रीय क्षेत्र में लार्वा के सिर की स्थिति और ऑप्टिक टेक्टम के भीतर मस्तिष्क में रिकॉर्डिंग स्थिति तक पहुंचने के लिए माइक्रोपिपेट को कम करें।
    4. पैच क्लैंप एम्पलीफायर को वर्तमान क्लैंप पर स्विच करें और होल्डिंग करंट को 0 एमए तक ठीक करें।
    5. 1 kHz के कम पास फिल्टर, 1 kHz की अधिग्रहण दर और 10 के डिजिटल लाभ का उपयोग करना, बेसलाइन गतिविधि के स्तर का निर्धारण करने के लिए 60 मिनट के लिए सहज गतिविधि रिकॉर्ड करें।
    6. बेसलाइन रिकॉर्डिंग के 1 घंटे के बाद, 20 mmol/L PTZ की अंतिम एकाग्रता के लिए स्नान करने के लिए 200 μL पेंटीलेन्ट्राज़ोल (पीटीजेड, टेबल ऑफ मैटेरियल्स)समाधान 300 mmol/L जोड़ें।
    7. एक और 120 मिनट के लिए पीटीजेड में न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्ड करें।
  4. ध्रुवीकरण घटना निर्धारण
    1. फ़ील्ड रिकॉर्डिंग घटनाओं में बहुत धीमी गतिशीलता होती है (ब्याज की आवृत्तियां 0.005-0.2 एस-1की सीमा में हैं)। इसलिए, उपनाम से बचने के लिए कम पास (बटरवर्थ 5 वें ऑर्डर एलपीएफ 100 एस-1पर) के साथ सिग्नल को फ़िल्टर करें। अधिग्रहण फ्रेम दर से रिकॉर्ड किए गए वोल्टेज डेटा (इस मामले में, 1 ks-1)नीचे 250 एस-1 (रॉ सिग्नल) से सुसमाल।
    2. प्रत्येक डीपोलराइजेशन इवेंट के लिए टाइमस्टैंप की पहचान करने के लिए, डिटेक्शन सिग्नल का उपयोग करें, जो रिकॉर्ड किए गए सिग्नल का एक उच्च-पास फ़िल्टर संस्करण है (0.01 एस-1पर बटरवर्थ 1 ऑर्डर एचपीएफ)।
    3. कम आवृत्ति घटकों को नष्ट करके, एक सरल थ्रेसिंग विधि का उपयोग करके डीपोलराइजेशन घटनाओं का पता लगाया जा सकता है। शोर उन्मूलन और घटना का पता लगाने के लिए एक निश्चित सीमा का उपयोग करें (0.3 एमवी इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था)।
    4. 4 एस से छोटे अंतराल पर होने वाले थ्रेसहोल्ड क्रॉसिंग की एक श्रृंखला द्वारा डीपोलराइजेशन घटना की विशेषता है। दहलीज क्रॉसिंग के लगातार दृश्यों से निर्धारित के रूप में शुरू और depolarization घटना के अंत की गणना करें। 40 से कम एमएस होने वाली घटनाओं को शोर के रूप में छोड़ा जा सकता है।
    5. घटना के शिखर पर कम पास फ़िल्टरिंग के प्रभाव के कारण त्रुटियों को खत्म करने के लिए अनफ़िल्टर्ड (रॉ सिग्नल) में घटनाओं के आयाम की गणना करें। फ़िल्टर किए गए सिग्नल में निर्धारित टाइमस्टैंप का उपयोग करके कच्चे सिग्नल से डीपोलराइजेशन वेवलेट का चयन करें। कच्चे संकेत से चयनित तरंग के अधिकतम और न्यूनतम मूल्यों के बीच अंतर के रूप में आयाम को मापें।
      नोट: चरण 3.4 - डीपोलराइजेशन इवेंट निर्धारण करने के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइलें - और चित्रा 1 प्राप्त करने के लिए इस लेख से जुड़ी पूरक फ़ाइल के रूप में प्रदान की जाती हैं।

Representative Results

चित्रा 1 दो आनुवंशिक स्थितियों के मामले में 4-6 डीपीएफ जेब्राफिश लार्वा असाधारण क्षेत्र रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि वोल्टेज निशान दिखाता है: बेमेल नियंत्रण और DEPDC5 नॉक-डाउन। रिकॉर्डिंग की बेसलाइन अवधि में, DEPDC5 नॉक-डाउन सहज घटनाओं की एक उच्च घटना को दर्शाता है, जबकि बेमेल नियंत्रण बहुत कम उतार-चढ़ाव प्रदर्शित करता है। ये गतिविधि पैटर्न डेपडीसी 5के नुकसान के कारण न्यूरोनल गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि के प्रतिनिधि हैं, जैसा कि हमने पहले18रिपोर्ट किया है। पीटीजेड आवेदन के बाद, बेमेल नियंत्रण और DEPDC5 नॉक-डाउन दोनों ही डीपोलराइजेशन की घटनाओं की बढ़ी हुई संख्या दिखाते हैं। पीटीजेड आवेदन (10 - 60 मिनट) के बाद पहली अवधि के दौरान, बेमेल नियंत्रण और डेपडीसी 5 नॉक-डाउन दोनों में प्रति मिनट 0.8 घटनाओं की दर देखी जाती है, जहां अधिकांश घटनाएं उच्च आयाम (>1 एमवी) की होती हैं। उत्तरार्द्ध प्रतिक्रिया अवधि (पीटीजेड आवेदन के बाद 60 - 120 मिनट) के दौरान, डीपोलराइजेशन घटनाओं की दर प्रति मिनट लगभग 1 घटना तक बढ़ जाती है, और अधिकांश घटनाएं कम आयाम (≤1 एमवी) की होती हैं।

Figure 1
चित्रा 1:जेब्राफिश लार्वा मस्तिष्क में क्षेत्र रिकॉर्डिंग के उदाहरण निशान। (A)बेमेल नियंत्रण लार्वा और एक DEPDC5 नॉक-डाउन के लिए 180 मिनट रिकॉर्डिंग का अवलोकन। सबसे पहले, सहज बेसलाइन गतिविधि दर्ज की गई थी, फिर पीटीजेड को स्नान (लाल पट्टी) में लागू किया गया था। (ख)पेरी-उत्तेजना समय बेमेल नियंत्रण और DEPDC5 नॉक-डाउन के लिए depolarization घटनाओं के हिस्टोग्राम । घटनाओं को उच्च आयाम (>1 एमवी - नीला) और कम आयाम (≤1 एमवी - काला) के रूप में वर्गीकृत किया गया था। (C-E) रिकॉर्डिंग की विभिन्न अवधियों के उदाहरण निशान:(सी)सहज गतिविधि,(डी)पीटीजेड आवेदन के बाद पहली अवधि के दौरान उच्च आयाम घटनाओं,(ई)पीटीजेड आवेदन के बाद बाद की अवधि के दौरान कम आयाम घटनाओं । ध्यान दें कि इन आंकड़ों को प्राप्त करने के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइलें अनुपूरक फाइलके रूप में प्रदान की जाती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फ़ाइल: चरण 3.4 के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइलें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

मिर्गी एक जटिल न्यूरोलॉजिकल बीमारी है, जिसमें कई तरह की इटियोलॉजी की विशेषता हैजो आनुवंशिक अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों25, 26,27के आगमन के साथ स्पष्ट होना शुरू हो रही है। बहुमुखी पशु मॉडल एक कुशल अनुवाद रणनीति के लिए आवश्यक हैं जो आनुवंशिक रूप से जुड़े मिर्गी के रोग तंत्र में दोनों अंतर्दृष्टि प्राप्त करेंगे, साथ ही इस स्थिति के विशिष्ट रूपों के लिए लक्षित उपचार भी होंगे। ज़ेब्राफ़िश मॉडल मिर्गी की प्रमुख विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करने और मिर्गी रोधी दवा स्क्रीनिंग5,28के लिए विश्वसनीय रीडआउट प्रदान करने में बहुत प्रभावी रहे हैं। इन मॉडलों में आनुवांशिक रूप से संशोधित जेब्राफिश15,29,30,31 और न्यूरोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण में सहज दौरे का पता लगाया जा सकता है28 ने मिर्गी जैसे व्यवहार के न्यूरोनल आधार की पुष्टि की है32,33. छोटे आकार के जेब्राफिश लार्वा सरल व्यवहार का स्वचालित पता लगाने का उपयोग करके 96-अच्छी प्रारूप में रासायनिक स्क्रीन के लिए उत्तरदायी हैं, जैसे सहज तैराकी, जो संभावित चिकित्सीय का तेजी से पता लगाने की अनुमति देता है।

यहां प्रस्तुत DEPDC5 नॉक-डाउन मॉडल को विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति को अवरुद्ध करने के लिए जेब्राफिश भ्रूण में एएमओ के इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जाता है । यह मॉडल लार्वा विकास के विभिन्न समय बिंदुओं के दौरान कई कीस्टोन फेनोटाइपिक विशेषताएं प्रस्तुत करता है, जिसका उपयोग रासायनिक या आनुवंशिक स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के दौरान चिकित्सा दक्षता के संकेतक के रूप में किया जा सकता है। AMO मध्यस्थता जीन नॉक-डाउन एक शक्तिशाली तकनीक है, जो रासायनिक रूप से प्रेरित जब्ती मॉडल पर लाभ प्रदर्शित करती है, क्योंकि यह विशेष रूप से ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति को लक्षित करती है, इस प्रकार आनुवंशिक उत्परिवर्तन द्वारा ट्रिगर अंतर्निहित रोगजनक तंत्र की पहचान की अनुमति देती है। रासायनिक प्रेरकों, जो फिर भी दवा स्क्रीनिंग के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं, कई सेलुलर रास्तों के माध्यम से कार्य कर सकते हैं जो हमेशा अध्ययन के तहत आनुवंशिक उत्परिवर्तन के लिए प्रासंगिक नहीं हो सकते हैं। जबकि AMO इंजेक्शन अपने आप में एक सरल तकनीक है जब प्रयोगकर्ता द्वारा महारत हासिल है, यह भी सीमाओं के एक नंबर प्रस्तुत करता है । इंजेक्शन एक सेल चरण भ्रूण पर किया जाना है; हमारे हाथों में, बाद के चरणों में इंजेक्शन ने फेनोटाइप की परिवर्तनशीलता को बहुत बढ़ा दिया। यह इंजेक्शन के लिए उपलब्ध समय को सीमित करता है; इसलिए, एक समय अनुक्रम में इंजेक्शन के लिए अंडे पैदा करने की रणनीति उपयोगी है। हम नियमित रूप से 4-5 क्रॉस का उपयोग करते हैं जो हम 15-20 मिनट के अंतराल पर खोलते हैं, जिससे अगले एक क्लच प्राप्त करने से पहले एक क्लच का इंजेक्शन लगता है। इसके अलावा, विभिन्न प्रयोगों के बीच एक ही समय बिंदुओं पर फेनोटाइप का आकलन करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि विकास के पहले दिनों के दौरान टकसाली व्यवहार तेजी से विकसित होते हैं। एएमओ की मात्रा और एकाग्रता को भी सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए, क्योंकि अत्यधिक मात्रा में इंजेक्शन लगाने के कारण सामान्य विषाक्तता विशिष्ट फेनोटाइप को मुखौटा करेगी। परिचय में प्रस्तुत विभिन्न नियंत्रण सही इंजेक्शन खुराक और इसी फेनोटाइप का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हैं।

लार्वा ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क की फील्ड रिकॉर्डिंग वैश्विक न्यूरोनल गतिविधि34पर विभिन्न मस्तिष्क विकारों में शामिल आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के हानिकारक प्रभावों की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। इन प्रायोगिक परिस्थितियों में देखी गई क्षयारण घटनाएं विभिन्न मिर्गी की स्थितियों में औषधियों के विद्युत भौतिक प्रभावों का आकलन करने के लिए एक स्थापित विधि है15,35. हालांकि, इन प्रभावों का आकलन ज्यादातर मात्रात्मक रूप से गुणात्मक रूप से किया गया है, और विश्लेषण में एक अभिनेता के रूप में एक व्यक्तिपरक पर्यवेक्षक है । यहां, हम एक स्वचालित पता लगाने की रणनीति विकसित करते हैं जो निष्पक्ष रूप से depolarizations, उनके आयाम और अवधि की दर की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं, और समय भर में इन मापदंडों की प्रगति का मूल्यांकन कर सकते हैं, या विभिन्न आनुवंशिक या फार्माकोलॉजिक हस्तक्षेपों के साथ ।

यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम 4-6 डीपीएफ जेब्राफिश में बेमेल नियंत्रण की तुलना में DEPDC5 नॉक-डाउन जेनेटिक मॉडल की अपेक्षित क्षेत्र गतिविधि को दिखाते हैं, पीटीजेड के आवेदन से पहले और बाद में मिर्गी की तरह विद्युतीकृत गतिविधि शुरू करने के लिए । इससे पहले, हमने डेपडीसी 5 नॉकडाउन कंडीशन18की बेसल गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई है। यहां, हम बताते हैं कि पीटीजेड, एक रासायनिक मिर्गी गतिविधि प्रेरक के लिए इन दो शर्तों की प्रतिक्रिया में समय में एक समान प्रक्षेपवक्र होता है, जो अपेक्षाकृत कम आवृत्ति, उच्च आयाम depolarization घटनाओं की अवधि के साथ शुरू होता है और उच्च आवृत्ति, कम आयाम depolarization घटनाओं की अवधि के साथ जारी रखता है। फ़ील्ड रिकॉर्डिंग घटनाओं में धीमी गतिशीलता होती है (ब्याज की आवृत्तियां 0.005-0.2एस-1की सीमा में होती हैं), इसलिए ब्याज की घटनाओं को अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल में कम-पास और उच्च-पास फ़िल्टर दोनों का उपयोग किया जाता है। कम आवृत्ति शोर को नष्ट करने के बाद, एक साधारण सीमा का उपयोग करके डीपोलराइजेशन घटनाओं का पता लगाया जाता है। चूंकि सिग्नल के आंकड़े डीपोलराइजेशन की घटनाओं की उपस्थिति से बहुत प्रभावित होते हैं, इसलिए हम इस सीमा को निर्धारित करने के लिए कुल संकेत के मानक विचलन का उपयोग नहीं कर सकते थे। डेटासेट में मानक विचलन के मूल्य की परिवर्तनशीलता मनाया रिकॉर्डिंग शोर के स्तर से अधिक था । इसलिए, निशान के दृश्य निरीक्षण के बाद, हमने 0.3 एमवी की दहलीज के एक निश्चित मूल्य का उपयोग किया, ताकि डीपोलराइजेशन गतिविधि के विभिन्न स्तरों से प्रेरित पूर्वाग्रह से बचा जा सके।

वर्णित प्रोटोकॉल मोटर व्यवहार और न्यूरोनल फील्ड गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए एक मानकीकृत और सरल विधि प्रदान करता है, एक्सपेरिमेंटल करंट क्लैंप वोल्टेज रिकॉर्डिंग के माध्यम से ऑप्टिक टेक्टम में डीपोलराइजेशन घटनाओं का स्वचालित पता लगाने के साथ, जेब्राफिश मॉडल में मिर्गी की तरह फेनोटाइप की विशेषता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम आईसीएम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्लेटफॉर्म के कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे जहां न्यूरोफिजियोलॉजी प्रयोग किए गए । हम तकनीकी मदद के लिए Anca मैरिएन को भी धन्यवाद देते हैं। SC को ट्रैम्पोलिन ग्रांट #21488 का समर्थन मिला । EK को एएफएम ग्रांट #18469 और ईआरसी कंसोलिडेटर ग्रांट (एएलएस-नेटवर्क्स) द्वारा समर्थित किया गया था । एचसी को पीएचडी पुरस्कारों द्वारा प्रियतम डालना ला रेचेचे मेडिडेल (पीएलपी20141031462) और एआरएसएलए से समर्थन मिला था। विज्ञापन और आरएम के लिए, इस काम को रोमानियाई राष्ट्रीय वैज्ञानिक अनुसंधान और नवाचार प्राधिकरण, सीएनसीएस-यूईएफआईएससीडीआई (परियोजना संख्या पीएन-III-P4-ID-PCE-2016-0010, पीएन-III-P2-2.1-PED-2016-0007, से तीन अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था। और COFUND-न्यूरॉन-एनएमदार-पीएसवाई), यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा अनुदान - अनुदान समझौता संख्या 668863-सिबिल-एए, और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान एनएसएफ-आईओएस-1656830 अमेरिकी सरकार द्वारा वित्त पोषित।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich, France A9539
Aquarium salt  Instant Ocean, Blacksburg, VA SS15-10
Borosilicate glass with filament Sutter Instruments BF100-50-10 OD: 1.5mm, ID: 0.5 mm
CaCl2 Sigma-Aldrich, France C1016
Depdc5-atg antisense morpholino GeneTools, OR, USA N/A sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ 
Depdc5-mis antisense morpholino GeneTools, OR, USA N/A sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ 
Depdc5-splice antisense morpholino GeneTools, OR, USA N/A sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’
Digitizer Molecular Devices, CA, USA Digidata 1550
Fast Green Dye Sigma-Aldrich, France F7258 Stock solution of 0.2%
Glass-bottom petri dishes Ibidi, Germany 81218
Glucose Sigma-Aldrich, France 68270
Grasshopper 2 camera FLIR, BC, Canada GRAS-03K2M-C formerly Point Grey Research
HEPES Sigma-Aldrich, France H3375
Human wild-type DEPDC5 cDNA Dharmacon, France NM_001242897.1  Accession: BC144291 Clone ID 905
ImageJ software NIH, USA N/A
KCl Sigma-Aldrich, France P9333 
Matlab software MathWorks, MA, USA N/A
MgCl2 Sigma-Aldrich, France M2670
NaCl Sigma-Aldrich, France S7653 
NaOH Sigma-Aldrich, France 71687
Pancuronium bromide  Alomone Labs P-130 Stock solution of 60 mM in water
Parafilm Sigma-Aldrich, France P7793
Patch clamp amplifier Molecular Devices, CA, USA MultiClamp 700B Computer-controled patch clamp amplifier
pClamp10 acquisition software Molecular Devices N/A
Pentylenetetrazol (PTZ) Sigma-Aldrich, France P6500 Stock solution of 300 mM (dissolved in recording solution)
Pipette puller Narishige, Japan PC-10
Pneumatic PicoPump  WPI, France PV 820
Sylgard 184 kit Sigma-Aldrich Intl. 761036
Transfer plastic pipettes Sigma-Aldrich, France Z350605
Zebralab Viewpoint, France N/A

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References

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de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy. J. Vis. Exp. (176), e58837, doi:10.3791/58837 (2021).

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