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생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치

Published: February 23, 2019 doi: 10.3791/58838

Summary

이 연구는 상처 치유 (스크래치 분석 결과의) 메커니즘으로 비소 영향 세포 마이그레이션 등 어떻게 환경 오염 물질을 결정 하기 위한 생체 외에서 모델에 중점을 둡니다. 결과이 체 외 분석 결과 제공 신속 하 고 초기 징후 vivo에서 실험 전에 셀룰러 마이그레이션에 대 한 변경 하는 방법을 보여 줍니다.

Abstract

상처 치유의 생리 적인 메커니즘을 이해 몇 년 동안 지속적인 연구의 초점 되었습니다. 이 연구는 직접 임상 표준 상처 치료 및 환자에 대 한 병 적 상태와 사망률 감소에 대 한 사용에 변화를 변환 합니다. 상처 치유 전략적 세포 및 조직 상호 작용 및 기능을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 상처 치료의 많은 매우 중요 한 기능 중 하나는 개인 및 집단 셀룰러 마이그레이션입니다. 부상 시 빠르게 연결, 그리고 상피 조직 주변 혈액에서 다양 한 세포 화학 및 물리적 자극을 통해 상처 사이트에 마이그레이션합니다. 이 마이그레이션 응답 결과 상처를 치유의 성공에 크게 지시 수 있습니다. 이 특정 세포 기능을 이해 하는 것은 변환 약 치료 결과 향상 된 상처로 이어질 수 있는 중요 합니다. 여기, 우리는 상처 치유, 그리고 어떻게 세포 환경에 변경 내용을 크게이 과정을 변경에 관련 된 세포 마이그레이션 이해 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 예제에서는 연구, 피부 섬유 아 세포 단층 문화 조직 배양 플라스 크에로 미디어 소 태아 혈 청 (FBS)와 보충에서 성장 했다. 셀 aseptically 취급 하는 조직 문화 12-잘 접시로 전송 되었고 100% 합류로 성장. 합류에 도달, p200 피펫으로 팁을 사용 하 여 셀은 단층에 긁힌 수직으로 했다. 비소 문화 미디어 FBS와 보완에 희석에 추가 되었습니다 개별 우물에서 환경 관련 복용량 0.1-10 M. 이미지까지 거꾸로 가벼운 현미경 관찰 셀룰러 마이그레이션 (상처를 사용 하 여 24 시간 기간 동안 모든 4 시간 (h)를 점령 했다 폐쇄)입니다. 이미지, 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 개별적으로 되었다 및 % 상처 폐쇄 계산 했다. 결과 비소 상처 치유 감속 하는 방법을 보여 줍니다. 이 기술은 상처 치유에 오염 물질의 효과의 평가 대 한 신속 하 고 저렴 한 첫 번째 화면을 제공합니다.

Introduction

상처 치유 단계를 포함 하는 다양 한 세포 유형, 신호 분자 및 세포 외 매트릭스 구성 요소1중복의 복잡 한 일련의 구성 됩니다. 함께, 이러한 구성 요소는 상처 해상도 또는 외상1의 정도 따라 보호 fibrotic 흉터의 형성에 이르게 궁극적으로 복구를 달성 하기 위해 콘서트에서 작동. 개별 프로세스와 상처의 기능을 하나의 실험에서 치유 어렵습니다; 상처 치유 과정에서 각 단계 확인을 별도로 테스트 해야 합니다. 상처 치유의 여러 단계 중 세포 마이그레이션 프로세스 간주 되었습니다 중요 한 치유 속도2를 평가할 때. 세포질 마이그레이션 상처 치유의 모든 단계에서 관찰 될 수 있다 하 고 따라서 더 셀 마이그레이션 변경 상처 폐쇄 영향을 미칠 수 어떻게의 이해를 필요로. 예를 들어 셀룰러 마이그레이션 모두 초기 및 늦은 단계 염증, 상처 사이트3에서 혈액 응고와 혈소판 집합에에서 표시 됩니다. 이 이벤트는 조직3없는 부 상자 영역을 채우기 위해 임시 방해를 형성 하 여 과도 한 혈액 손실 방지. 순환에서 혈소판 합성 하 고 분 비 혈 요인, 마이그레이션용 염증 성 백혈구 (백혈구)에 대 한 상처 조직에는 함께 신호 수리4함께 vasoactive 중재자. 다시 epithelialization 조직 부상의 시간 이내 발생 하 고 취재 활동 및 더 오염을 방지 하기 위하여 상피 keratinocytes의 마이그레이션 또는 상처 사이트2외국 입자의 침공을 통해 상처 사이트 포함. 이러한 예제는 많은 셀 마이그레이션 기능 관련 된 몇 가지 상처 치유만 캡처.

스크래치 분석 결과 설명 되었고 셀 마이그레이션 및 상처 치유5,6에 그것의 많은 역할을 더 잘 이해 하는 데 사용. 이 분석 결과 단순한 것으로 간주 됩니다, 높은 처리량을 제공 하 고 대표 셀 마이그레이션 데이터를 수집 조사 수 있습니다. 마이그레이션 분석 실험은 특정 화합물 가속 수 있습니다 또는 셀룰러 마이그레이션6의 속도 느리게에 성공적으로 설명 했다. 또한, 이러한 분석 결과 농도, vivo에서 실험 전에 관심의 유전자를 주입 하는 대상 치료를 공식화 하는 데 사용할 수 있는 변환 생리 정보를 제공 합니다. 분석 결과 기본적인 세포 문화 기술 및 용품, 선택, 및 이미징 기술을 운동 시간이 나 운동 치료에 대 한 응답에서을 통해 캡처의 셀 라인 필요 합니다.

분석 결과 쉽게 조작 하거나 탐정의 요구에 맞게 맞춤 될 수 있습니다. 그러나, 실험 하기 전에 고려해 야 할 4 개의 기본적인 질문 있습니다. 어떤 일반 또는 특정 질문은 /는 외관이 대답 하려고? 이 연구를 주도 대부분 가설에 대 한 진정한 보유 하 그러나,이 분석 결과에 중요 한 때문에 이다 그것은 결정할 것입니다 많은 매개 변수에 정확 하 게 하는 데 필요한 완전히는 질문 대답 무슨 선 세포 또는 (해당 되는 경우 여러) 라인 셀 공부 되 고 생리 시스템을 표현 하기 위해 사용 해야 합니까? 예를 들어 치유 연구, 피부 섬유 아 세포5,,67,8, 줄기 세포 피부에 상처 또는 표 피 keratinocyte9 일반적으로 발견 되는 세포 인구를 대표 하는으로 간주 될 수도 에 피부 조직10에서 풍부. 또는, 호 중구, 대 식 세포 또는 다른 염증 세포 수 평가 셀 마이그레이션 상처 치유 피부 조직10의 다른 구성 요소를 나타내는 데이 시스템. 또한,는 시 약은 세포 신진 대사 활동을 촉진 하는 데 사용할 최적의 식별 하는 데 도움이 됩니다 평가 특정 셀 라인을 식별. 어떻게 셀 이동 추적/몇 군데 있을 것인가? 셀 마이그레이션 접시 또는 플라스 크 내에서 관찰 하는 데 사용 하는 기술도 많습니다. 염색 또는 붙일 셀 태그를 사용 하 여 형광 또는 confocal 이미징 셀 추적 세포 세포 비 위치 및 세포질 운동11 명확 하 게 정의 하는 탐정을 수 있는 강한 대조를 제공 하는 예를 들어 . 이 연구에서 설명 하는 또 다른 일반적인 기술은 위상 대비6,7거꾸로 가벼운 현미경의 사용 이다. 셀 염료 및 형광이이 대안 말기 이미징 이전 셀을 수정 하지 않고 트랙 셀 사는 사용자 허용 하 고 개별 우물 시간 지점에서 셀의 부상된 monolayers를 포함 하는 동일의 이미지를 캡처 수 있습니다. 어떤 결과 측정 하는 것은 분석에 사용할 수 것입니다? 연구를 통해 모여 이미지를 사용 하 여 셀룰러 마이그레이션 속도 변화를 이해할 수 있는 데이터를 생성할 수 있습니다. 우리 실험실에서 현미경 이미지 반전된 가벼운 현미경에서 캡처한 이미지 분석 소프트웨어를 업로드 하 고 백분율 상처 폐쇄 및 곡선 (AUC) 아래 요약된 영역 계산 됩니다.

우리는 알려진된 환경 오염 물질, 비소의 피부 섬유 마이그레이션 변경 내용을 명료 하이 분석 결과의 구체적인 사용 강조 표시 됩니다. 비소는 자연스럽 게 발생 준금속 지구의 표면에서 발견. 다양 한 위치 비소, 이러한 위치 근처에 사는 개인에 게 위험이 높은 수준의 발견 되었습니다. 결과적으로, 음식과 물 소스 비소 오염, 비소에 노출 되는 개인에 대 한 가능성을 증가의 레벨을 증가 표시 되었습니다. 환경 비소 노출 위 또는 심지어 아래 현재 미국 환경 보호 기구 (USEPA) 최대 오염 물질 수준 (MCL) 10 ppb (10 µ g/L)12, 의 인구에 장기 건강 결과가지고 표시 되었습니다. 13.이 제한을 초과 하는 비소 농도 USEPA는이 MCL을 설정 하 고 그것을 마시는 한계에 대 한 안전한 것으로 간주, 비록 전세계 물 소스에 흔히 되지 않습니다. 남서 미국에 수많은 지 하 수, 우물 물, 그리고 스프링 비소14의 수준에 관한 포함 하도록 문서화 되었습니다. 예를 들어 베르데 밸리, AZ, 몬테 주 마 잘 비소15의 210 µ g/L를 포함합니다. 베르데 강, AZ 주위 지 하 수는 1.3 mg/L15,16를 도달 하는 피크 값 평균, 비소의 16 µ g/L를 포함 합니다. 특히, 베르데 강 물 창 고에 많은 스에서 비소 농도 초과 50 µ g/L15,16. 이 지식으로, 환경 관련 비소 농도 했다 10 µ M (750 ppb) 현재에에 MCL 위에 연구14,,1516 MCL 0.1 µ M (7.5 ppb)에 그 범위를 선정 , 17 , 18 , 19 , 20 .

이 실험에서 수집한 정보 비소로 오염 된 셀룰러 마이그레이션 속도는 비보에 상처에서 잠재적인 변화의 초기 표시기로 사용 됩니다. 그 후, 상처 치유와 세포 이동 촉진의 역할에 따라 신호 분자를 선택할 수 있습니다. 그리고 미래의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 기반 유전자 식 실험 전류에의 완료에 따라 설정할 수 있습니다. 연구입니다. 이 분석 결과에서 마이그레이션 속도 변경 비소의 존재, 특정 유전자 목표 세포 마이그레이션에 관련 된 비소의 해로운 효과 대 한 대상 수 있으며 따라서 장애의 메커니즘을 수 있습니다.

Protocol

1. 2 차 Biosafety 내각 (BSC)의 준비

참고:이 프로토콜에서 설명 하는 방법 무 균 기술을 달성 하기 좋은 연구실 관행을 사용 하는 동안 개인 보호 장비와 함께 실시 한다.

  1. BSC 보호 유리 운영 높이를 들어올린 층 류 팬 들을 켭니다.
    1. 70% 소 프로 파 놀 용액을 사용 하 여 작업 영역의 위생 닦아 수행. 뒤쪽 벽 및 측 벽에서 BSC를 닦 고 기본 격판덮개로 작동.
    2. 모든 자료를 70% 알코올 (소 프로 파 놀 또는 EtOH) 분석 결과에서 사용 될 것 이다 하 고 BSC 안으로 넣어 닦아.

2. 인간 피부 섬유 아 세포 T75 플라스 크에 뿌리기

  1. 원하는 cryopreserved 셀 라인 (신생아 인간 피부 섬유 아 세포 [hDFn], 500, 000 셀/유리병, 셀 농도 통로 p3-p5) 튜브를 얻을.
    1. 셀과 유리병 녹고 있도록 37 ° C에서 1.0 cm 깊은 물 욕조에 배치 합니다. 유리병을 녹여 셀 솔루션의 약 70% 액체 때까지. 70% 알코올로 유리병 아래로 닦 고 유리병 랙 BSC 내부에서 유리병을 배치.
      주: 물 않는 스레드 또는 시드 셀 동안 잠재적인 오염을 방지 하기 위해 유리병의 뚜껑 접촉 하지 확인 하십시오. 물에 셀의 완전 한 녹고 방지 목욕으로 이렇게 하지 않으면 의도 하지 않은 세포 죽음을 발생할 수 있습니다.
  2. 미디어의 10 mL에 밖으로 그리기 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS). 사용 하 여 자동 pipettor 10 mL 피 펫 팁 T75 조직 배양 플라스 크로 발음을. 미디어 완전히 부드럽게 앞뒤로 플라스 크를 흔들어 하 여 플라스 크의 포화를 허용 합니다.
    1. 세포 막으로 되는 pipetting 속도 유리병에서 셀 주식 및 aspirate 솔루션 오픈 유리병 cryopreservation 취약 될 것입니다.
    2. 미디어 T75 조직 플라스 크에 세포를 전송. 다시 되는 pipetting 속도 조직 플라스 크에 해 동된 셀을 꺼냅니다.
      참고: 6600 셀/c m2로 직선 근사 줄은 시드 조직 플라스 크에 세포의 밀도. 밀도 시드 사용자와 실험의 원하는 타이밍에 맞게 변경할 수 있습니다.
    3. T75 조직 플라스 크에서 미디어의 1 mL에 밖으로 측정 하 고 다시 유리병에 볼륨을 전송. T75 플라스 크에 다시 유리병에서 볼륨을 전송.
      참고: 유리병에서 셀 수확량을 확대 하는 데 도움이 됩니다이 단계를 수행.
    4. 조직 배양 플라스 크 모자를 강화 하 고 부드럽게 전체 표면에 걸쳐 균일 하 게 분산 된 셀 서 스 펜 션에 바위. 거꾸로 현미경을 사용 하 여 셀의 분배를 확인 합니다.
  3. 셀 유형, 날짜와, 이니셜, 혈통, 목적 플라스 크 레이블 (예:hDFn, 07/11/2018, 국방, 통로 4, 비소 스크래치 분석 결과). 72 h에 대 한 37 ° C와 5.0% CO2 습도 인큐베이터에 조직 배양 플라스 크를 배치 합니다.
    참고: 성장 매체 변경된 12 24 h 후 초기 시드 cryopreservative, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 상당량을 제거 하 고 셀 영양 제대로 되도록 그 후 모든 48 h를 변경. 부 화와 성장 기간 스크래치 시험에 필요한 셀의 계산된 수에 따라 달라 집니다. HDFn 셀에 대 한 복제에 일반적으로 정상적인 조건 하에서 16-24 h. 그러나, 두 배로 속도 상승, pH, 온도, 습도, 중간 유형, 으로 인해 변경 될 수 있습니다 및 실험을 계획할 때 설명 되어야 합니다.

3. 셀 계산 및 12 음 조직으로 하위 문화 접시

  1. 인큐베이터에서 T75 조직 배양 플라스 크를 검색 합니다. 10 배 목표 확대 (100 X 총 확대)에 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 준수 세포를 관찰 하 고 대략적인 셀 합류를 결정.
    1. 접근은 관찰 하는 가장 대표적인 비율을 보장 하기 위해 합류 하는 때 조직 배양 플라스 크의 대부분을 검사 합니다. 개별 셀 형태학 어떤 이상이 나 세균 및 곰 팡이 오염에 대 한 평가.
  2. 10 mL 피 펫 팁 자동 pipettor 조립. Pipettor를 사용 하 여 폐기물 컨테이너 T75 및 전송 솔루션에서 미디어의 전체 볼륨을 발음. 세포 접착 표면 접촉에서 피펫으로 팁을 방지 합니다. 생물 학적 빈에서 피 펫 팁을 버리십시오.
    1. 5 mL 피 펫 팁 자동 pipettor 조립. 균형된 소금 솔루션의 5 mL을 발음, 플라스 크에 분배 하 고 부드럽게 초과 미디어, 죽은 세포, 및 폐기물 제품 린스를 플라스 크 락.
    2. 볼륨은 T75에서 그리고 폐기물 콘테이너로 분배. 생물 학적 빈으로 피 펫 팁을 삭제 합니다.
    3. 5 mL 피 펫 어댑터 자동 pipettor 조립. 재고에서 트립 신 2 mL를 발음, 플라스 크에 분배 하 고 부드럽게 준수 셀 동안 효소를 분산 플라스 크 락. 부착 표면의 완전 한 채도 확인 합니다. 2-3 분 (분) 동안 인큐베이터에 조직 플라스 크를 놓습니다.
      참고: 최대 효소-기질 반응 10 분 초과 하지 않아야 합니다.
    4. 10 X 렌즈 배율 (100 배 총 확대)에 거꾸로 현미경 조직 플라스 크를 관찰 합니다. 부드러운 진동 세포 분리를 촉진 하기 위해 적용 됩니다.
    5. 70% 알코올 및 BSC 내부 장소 T75 플라스 크를 닦아냅니다.
    6. 5 mL 피 펫 팁 자동 pipettor 조립. 주식에서 미디어의 5 mL을 발음 하 고 효소-기질 반응을 중지 하 T75 조직 플라스 크에 추가 합니다. 미디어: 트립 신 비율 3:1 이어야 한다. 플라스 크의 위아래로 피펫으로 2-3 회 린스와 반응 중지 되었습니다 확인 하십시오. 플라스 크를 살 균 15 mL 원뿔 튜브로 전송 액체의 완전 한 볼륨 발음
    7. 두 번째 15 mL 원뿔 튜브를 미디어의 동일한 볼륨을 채우십시오.
    8. 서로 대척점 위치에 모두 15 mL 원뿔 튜브를 배치 합니다. 25 ° C에서 5 분 동안 원심력의 200 g 장비의 실행 매개 변수를 설정 하 여 적용 됩니다.
    9. 15 mL 원뿔 튜브 수송과 세포 70% 알코올로 닦 고 BSC 안으로 배치.
    10. 자동 pipettor를 사용 하 여 미디어, 액체 및 셀 펠 릿의 약 250 µ L을 남겨두고 떨어져 피펫으로에 5 mL 첨부. 피펫으로 팁의 위치에 주의 셀 펠 릿은 그대로 유지 됩니다. 폐기물 용기에 수집 하는 볼륨을 분배 하 고 생물 빈에서 팁 삭제.
    11. Microcentrifuge 튜브 랙을 사용 하 여 방해 하 고 다시 셀 펠 릿 ("긁어 랙"이 라고도 함)을 일시 중지를 빠른 진동 만드는 유리병 슬롯에 걸쳐 원뿔 튜브의 하단 실행.
      참고:이 단계를 수행 하는 소용돌이 믹서를 사용 하지 마십시오. 중력 힘 소용돌이 믹서에 의해 만들어진 셀 g-포스 임계값을 초과 하 고 lysing 발생할 수 있습니다. 올바르게 완료 되 면 새로운 셀 솔루션 없이 나머지 펠 릿으로 흐린 혼합으로 표시 됩니다. 이 단계를 수행 하는 실사 자주 단일 세포 현 탁 액을, 셀을 계산 하는 경우 높은 정확도로 이어지는 만들어집니다.
    12. 셀 주식 또는 물의 resuspension 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다. 피펫으로 튜브 20의 측면 아래로 부드럽게 셀 모든 대단히 짧은 시간을 휴식 시간. 총 셀 서 스 펜 션 볼륨을 기록 하 고 정해 짧게.
  3. 피펫으로 20 µ L Trypan 블루 재고 (0.4%) 96 잘 접시의 빈 우물에 살 균 피펫으로 사용 하 여.
    1. 전송 전에 균일 한 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 재고 셀 솔루션을 믹스. 피펫으로 멸 균 팁을 사용 하 여 셀 주식 (튜브 벽을 만지고 피)의 20 µ L를 제거. Trypan 블루 솔루션 96 잘 접시에서의 20 µ L를 추가 합니다.
    2. 피펫으로 내용을 혼합을 부드럽게입니다. 피펫으로 10 µ L는 coverslip 세기 사이 혼합물의 챔버는 hemocytometer에.
    3. 전지와 10 X 목표 아래 표를 준수 합니다. 보기의 필드 내에서 9 개의 큰 사각형을 관찰 합니다. 중앙에 4 모서리 사각형 (5 사각형의 총)만 셀을 계산 합니다.
      참고: 셀의 균일 한 분포에 대 한 정확한 조사를 위해 전체 그리드에 걸쳐 보세요.
    4. 집계에 5 확인 된 사각형 모눈의 모든 셀 (투명 하 고 청색). 별도로, 같은 5 사각형에 미달 (파란색) 셀만 집계.
    5. 계산 가능한 셀 수를 사용 하 여:Equation 1
      여기서 x = 실행 가능한 세포 수, 총 세포, b = = 비 가능한 셀
    6. 사용 하 여 실행 가능한 세포 밀도 계산.Equation 2
      여기서 x = 가능한 셀 밀도 y 가능한 셀의 총 합계 =.
    7. 총 실행 가능한 세포를 계산.Equation 3
      여기서 x 총 가능한 셀, y = 가능한 세포 밀도, f = = 셀 서 스 펜 션 볼륨 (mL).
    8. % 세포 생존 능력 계산:Equation 4
      어디 x % 세포 생존 능력, y = = 그리드, f 에 계산 가능한 셀 = 총 셀 격자 계산.
  4. 아래쪽 이미징 동안 참고 표 역할을 12-잘 접시의 가로줄을 표시 합니다.
    1. (3.3.7 계산) 가능한 셀 밀도 사용 하 여 계산 시드의 12 음 조직 문화 접시에 셀 주식 희석 미디어의 볼륨.
      참고: 최적의 셀 hDFn 셀 밀도 시드 5000 셀/c m2입니다.
    2. 19000 셀/mL을 셀 주식 희석 미디어를 사용 하 고 셀의 1 mL와 잘 모든 씨앗. 주기적으로 모든 12 우물에서 시드도 셀 수 있도록 셀 주식 혼합.
    3. 셀 타입, 혈통, 사용자 이니셜 및 목적 각 접시를 레이블. 37 ° C와 5.0% CO2로 설정 하는 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 셀 100% 합류 스크래치 분석 결과 대 한 달성 될 때까지 성장 하는 것을 허용 한다.

4. 비소 (로) 재고 솔루션 및 계산

  1. 나트륨 arsenite (NaAsO2) 10% 셀 문화 미디어에 직접 희석 작업 10, 1.0, 0.1, 0.01 µ M으로의 농도에서 FBS.
  2. 이 위해 미디어의 30 mL에 나트륨 arsenite의 3.9 mg를 diluting 하 여 초기 1 m m 재고 솔루션으로 확인 합니다. 직렬 솔루션으로 나머지 1 m m 재고 희석.
주식으로 1000 µ m 계산 작업 사진 농도 비소 M1V1= M2V2 이전 비소 솔루션의 볼륨 미디어의 볼륨 사진 작업 하는 비소의 총 볼륨
NaAsO2 분자량: 129.9 g/mol 10 µ M로 (mL) x (1000 µ M) = (30 mL)(10 µM) x = 0.3 mL 솔루션으로 1 m m의 0.3 mL = 300 µ L 29.7 mL 미디어 30
.03 L x.001 x 130 mol/L g/mol = 비소의 3.9 mg 1.0 µ M로 (mL) x (10 µ M) = (30 mL)(1 µM) x = 3 mL 솔루션으로 10 µ M의 3 mL 미디어의 27 mL 30
30 mL 미디어로 3.9 m g 나트륨 arsenite의 희석 0.1 µ M로 (mL) x (1 µ M) = (30 mL)(0.1 µM) x = 3 mL 으로 1 µ M의 3 mL 미디어의 27 mL 30
0.01 µ M로 (mL) x (0.1 µ M) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL 3 mL로 0.1 µ M의 미디어의 27 mL 30

표 1입니다. 비소 주식 그리고 직렬 희석입니다. 이 테이블 계산으로 재고 솔루션 및 치료 그룹에 대 한 재고 솔루션을 작업을 만드는 데 사용에 대해 설명 합니다.

5. 스크래치 시험 기술 및 비소 오염

  1. 인큐베이터에서 셀 12-잘 접시를 가져옵니다. 객관적인 확대 (100 X 총 확대) X 10에 세포를 볼. 각 잘 내 셀 합류를 결정 합니다.
    참고: 각 개별 잘 해야 도착 긁 적 전에 100% 합류. 이 중요 한 단계 분석 결과 내에서 일관성을 보장 하 고 실험을 통해 분석 결과 프로토콜을 표준화 하는 데 도움이. 어떤 우물에 100% 합류에 도달 하지 않은 경우 추가 시간 모든 우물에는 100% 합류에 도달 했습니다 때까지 품 어를 셀 수 있습니다. 이미 100% 합류에 우물에 추가 성장 시간 영향을 받지 않습니다. Confluent 세포 성장 체포 될 일반적으로 되며 하위 confluent 웰 스 100% 합류에 도달 하면서 단층 문화로 남아 있다.
  2. 10 mL 피 펫 팁 자동 pipettor 조립. 모든 우물에서 성장 미디어 발음 액체 폐기물에서 볼륨 및 생물 학적 빈에서 피 펫 팁 삭제 합니다.
    1. 1-200 µ L 멸 균 팁과 p200 pipettor 조립. 각 잘에서 글 라이 딩 팁 셀 표면에 걸쳐는 12-시에서 6 시 위치에 의해 처음 "모의 상처"를 생성 합니다.
      참고: 일관성에 크게 영향을 미칠 것입니다 3 요소는 속도, 압력, 및 팁 각도입니다. 스크래치를 신속 하 게, 일정 한 압력으로 체재 하는 접시의 베이스에 수직 팁 각도의 생각 되는 동안 수행 되어야 합니다. 너무 천천히 긁 적 비뚤어진된 라인 하면, 초과 압력 수 영구적으로 점수 셀 접착 표면 및 팁 각도 90 ° 스크래치 폭을 좁힐 것 이다 보다는 더 적은. 이러한 일반적인 실수 중 하나는 변경 된 마이그레이션 속도 패턴을 발생할 수 있습니다.
    2. 잘 당 균형된 소금 솔루션의 1 mL와 rinsing 여 멀리 초과 파편과 세포 덩어리 취소 합니다. 바위는 접시 사이드-투-사이드 세척을 촉진 하기 위하여. 우물에서 균형된 소금 솔루션을 제거 하 고 폐기물 컨테이너에 처분. 생물 학적 빈에 5 mL 피 펫 팁의 처분.

Figure 1
그림 1: 스크래치 분석 결과의 도식 대표. 모든 작업은 오염의 기회를 감소 하는 무 균 필드 내에서 수행 됩니다. 세포 조직 배양 플라스 크에 원하는 밀도에 씨를 뿌리고 있으며 인간의 생리 조건 (5% CO2, 37 ° C)로 설정 하는 인큐베이터에서 성장. 도달 되 면 원하는 합류, 셀 aseptically 하위 교양 원하는 시드 밀도에서 12 음 조직 문화 접시에. 셀은 100 %12-잘 접시 및 살 균 피펫으로 팁을 사용 하 여 긁힌 각 우물에 합류에 성장 된다. 이 "처음" 생체 외에서 모의 상처를 (두 배 이끌린 화살표로 표시 됨), 있는 세포는 자연스럽 게 열려있는 영역을 마이그레이션할 만듭니다. 각 잘 수 있는 유일 하 게 단련 하 고 셀룰러 이동 요금을 관찰 하 고 다른 치료 조건에서 측정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 사용 하 여 p1000 pipettor 1000 µ L 팁 피펫으로 1000 µ L 비소 주식에서 치료 그룹으로 무작위로 할당 된 우물에. 각 잘 새로운 피펫으로 팁을 사용 하 여 교차 오염을 방지 하기 위해. 치료 추가 때 시간을 기록 합니다. 37 ° C와 5.0% CO2에서 설정 하는 인큐베이터에서 12-잘 접시를 놓습니다.

6입니다. 영상

  1. (0, 4, 8, 12, 16, 20, 및 24 h) 24 h 동안 객관적인 확대 모든 4 h X 10 각의 이미지를 캡처하십시오. 이전 이후의 시간 지점에서 각 잘 내 스크래치 함께 같은 위치 이미지를 접시의 바닥에 그려진 라인을 참조 합니다.
    참고: 동일한 위치 정확한 이미지 분석을 허용 하 고 대표 데이터를 얻기 위해 각 시간 지점에서 촬영은 필수적 이다.

7. 이미지 분석

  1. 컴퓨터를 거꾸로 가벼운 현미경에 캡처한 이미지를 업로드 하 고 자세한 파일 이름 가진 JPEG 이미지 저장.
  2. ImageJ를 엽니다.
  3. 변환할 픽셀 밀리미터 (mm) 끌어서 소프트웨어 창에 파일을 삭제 하 여 이미지를 측정 하는 경우 소프트웨어에 알려진 거리 무대 마이크로미터의 이미지를 업로드.
    참고:는 마이크로 미터 라인 알려진된 1 m m 길이 정해 고 이미지 셀의 이미지를 캡처하는 데 사용 하는 동일한 배율에서 촬영 해야 합니다. 예를 들어 이미지 총 확대 100x에서 찍은이 연구에 따라서 스테이지 마이크로미터의 이미지 찍은 총 확대 100x에.
    1. 직선, 세그먼트또는 자유형 선 옵션을 클릭 합니다.
    2. 각 눈금에 관련 된 길이 눈금을 사용 하 여 알려진된 거리의 라인 마이크로미터 이미지에 그릴 자국. 직선을 그리려면: 마우스 클릭, 잡고, 원하는 위치에 커서를 끌어 다음 마우스의 가자.
    3. 분석 을 선택 다음 비율 설정을 선택 합니다.
    4. 이전 단계에서 그린 라인의 알려진된 길이에 알려진 거리 를 설정 합니다.
    5. Mm 길이의 단위 를 설정 합니다.
    6. 글로벌 상자를 확인 합니다.
    7. 확인 메뉴에서 종료를 선택 합니다.
    8. 무대 마이크로미터 이미지를 닫습니다.
  4. 드래그 앤 드롭 이미지 파일 창에 여 ImageJ로 하나의 스크래치 분석 결과 이미지를 업로드 합니다.
    1. (오른쪽 앞 가장자리를 왼쪽된 앞 가장자리)에서 스크래치의 너비에 걸쳐 직선을 그립니다.
    2. 그려진 직선의 측정을 기록 하는 키보드에 문자 M 을 누릅니다. 작은 결과 창 문자 M을 입력 한 후 즉시 나타납니다. 이것은 폭 측정 될 것입니다.
  5. 단계 7.4 총 스크래치의 길이 따라 10 측정을 10 회 반복 합니다.
    참고: 그것은 스크래치의 전체 길이 아래로 가장 표현 폭 값을 생성 하는 것이 중요입니다. 아래로 위에서 처음의 길이 따라 동일 하 게 10 폭 측정 밖으로 공간을 확인 하십시오.
  6. 복사 하 여 붙여 측정 스크래치 분석 결과 스프레드시트 파일을 만듭니다.
    1. 복사 하 고 결과 창에서 10 폭 측정 (표 2) 스프레드시트 파일에서 적절 한 열에.
      참고: 때 측정 결과 창에서 복사 되 고 스프레드시트에 붙여, 거기 있을 것입니다 값;의 외부 열 이러한 값을 삭제 해야, 10 폭 측정만 보존.
10 임의의 폭 측정 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
10 측정의 평균

표 2입니다. 원시 폭 측정 테이블 형식. 이 표에서 얻은 원시 측정에 대 한 조직 구조를 보여 줍니다.

  1. 스크래치 분석 결과 이미지의 나머지 부분에 대 한 위의 단계를 반복 합니다.
  2. 각 점에서 시간 (0-24 h) 모든 잘 10 측정의 평균을 계산 합니다.
  3. % 폐쇄 단계 7.8에서에서 값을 사용 하 여 계산을 결정 합니다.
    1. 스프레드시트 "폭 측정 평균" 제목 아래에 테이블을 만듭니다 (표 3).
    2. 복사 및 붙여넣기 10 측정의 평균 행 계산 "폭 측정 평균" 테이블에 7.8 단계.
    3. 폭 측정 평균 테이블 옆에 있는 다른 테이블을 만듭니다. 이 제목 테이블 % 상처 폐쇄 (표 4).
      참고: 각 잘 0 h 열에서 값 때문에 스크래치는 초기 0 h 사진 모든 우물에 0 %0 이어야 합니다.
    4. (4 h) 동안 다음 열으로 이동 합니다.
    5. 4, 8, 12, 16, 20, 및 24 시간 포인트에 대 한 백분율 폐쇄 계산:
      Equation 1
      어디, x % 폐쇄, = 나 = 초기 스크래치 너비 (0 h 폭), f = 최종 스크래치 너비 (4, 8, 12, 16, 20, 또는 24 h 폭).
음 폭 평균 0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3b
4b
1 c
2 c
3 c
4 c

테이블 3입니다. 폭 측정 평균 테이블 형식. 이 테이블 폭 측정 평균 표 2에서 원시 폭 측정을 사용 하 여 계산에 대 한 조직 구조를 보여 줍니다.

0 h 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h
1a 0
2a 0
3a 0
4a 0
1b 0
2b 0
3b 0
4b 0
1 c 0
2 c 0
3 c 0
4 c 0

표 4입니다. % 상처 폐쇄 테이블 형식. 이 테이블 백분율 상처 폐쇄 값은 표 3에 평균 폭 측정을 사용 하 여 계산에 대 한 조직 구조를 보여 줍니다.

  1. % 상처 폐쇄 테이블 옆에 있는 다른 테이블을 만듭니다. 이 제목 테이블 AUC (표 5).
    1. 0-4 계산 곡선 (AUC) 값 0-4에서에서 h 지역 각 잘 h 열:
      Equation 1
      여기서 x = 0-4 h AUC 값, % 폐쇄 값 0 h, b = % 폐쇄 값 4 h, h = = (이 연구에서 4 h) 두 측정 사이의 시간.
    2. 각 잘 한 4-8 h 열 곡선 (AUC) 값에서 4-8 h 면적을 계산:
      Equation 1
      여기서 x = 4-8 h AUC 값은 % 폐쇄 값 4 h, b = % 폐쇄 값 8 h, h = = (이 연구에서 4 h) 두 측정 사이의 시간.
      참고: 하나의 AUC 값 한다 산출 될 각 4 h 시간 간격에 대 한 각 우물에 대 한 24 시간 기간 동안.
    3. 각 잘 요약된 AUC 값을 모두 0-24 h (단계 7.10.1-7.10.2에서 계산)에서 AUC 값의 합계. 이러한 값을 제대로 통계 분석을 위해 저장 확인 하십시오.
0-4 h 4-8 h 8-12 h 12-16 h 16-20 h 20-24 h 요약된 AUC
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3b
4b
1 c
2 c
3 c
4 c

표 5입니다. AUC 테이블 형식입니다. 이 테이블 AUC 값은 표 4에서 폐쇄 값 상처는 %를 사용 하 여 계산에 대 한 조직 구조를 보여 줍니다.

8. 통계 분석

  1. 실험 설계와 분석 결과 중 얻은 총계 AUC 값에 가장 적합 하는 통계 분석 방법을 결정 합니다.

Representative Results

모든 치료 그룹에 대 한 샘플 크기 (n)은 n = 28. 셀 했다 성공적으로 경작된 다음과 같은 무 균 기술 및 실험실 프로토콜 (그림 1). 균일 한 흠집 의미 스크래치 폭 0.8 m m 0.4 m m (그림 2)를 측정 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다. 제어 그룹 했다 1,355.83;의 커브 값에서 평균 요약된 영역 치료 그룹으로 0.01 µ M 평균 했다 1,366.21; 곡선 값 아래에 있는 영역을 표현 치료 그룹으로 0.1 µ M 평균 1,326.24의 곡선 값 아래에 있는 영역을 표현 했다, 치료 그룹으로 1.0 µ M 평균 했다 1,295.10; 곡선 값 아래에 있는 영역을 표현 그리고 마지막으로 10 µ M 치료 그룹 했다 통계적으로 낮은 535.12의 커브 값에서 평균 총계 지역에 비해 다른 모든 그룹 (p < 0.05) (그림 3). 통계 분석 연구-프로그램 치료 그룹 (p < 0.05) 간의 통계적 차이 확인 하려면 Tukey 특별 게시 조정 일방통행 ANOVA를 실행 사용 되었다.

Figure 2
그림 2: 20 h 기간 동안 대표 스크래치 시험의 이미지. 이미지 A-D 대표 세포 이동 제어 셀; 이미지 E H 대표; 1.0 µ M으로 오염 하는 세포의 세포질 마이그레이션 이미지 L로 10 µ M으로 오염 하는 세포의 세포질 마이그레이션을 나타냅니다. 이 이미지에서 셀룰러 마이그레이션 비소의 둔화는 분명 하다.입니다. 다른 두 처리로 서 그룹 하지 "치유 했다" 하는 동안 컨트롤 이미지 20 h 후 완전히 "치유" 스크래치를 표시 합니다. 치료로 10 µ M 저해 완전 한 폐쇄 후 24 h. 전부 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 비소 스크래치 분석 결과에서 셀룰러 이동 속도가 느려집니다. 이미지 관찰 셀룰러 마이그레이션 속도 비소의 다양 한 농도의 변화를 24 시간 동안 체포 했다. Raw 이미지는 자동화 된 소프트웨어 (예를 들면, MATLAB에서), 어떤 처음 측정된 상처 폭 계산 % 폐쇄 그리고 마지막으로 (AUC) 곡선 아래의 영역을 사용 하 여 분석 되었다. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 치료 그룹으로 10 µ M는 통계적으로 인간 피부 섬유 아 세포 신생아 (hDFn) Tukey 특별 게시 조정 (p 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 다른 모든 치료 그룹에 비해 통계적으로 낮은 AUC 값 표시의 셀룰러 이동 둔화 < 0.05). 통계적 인 차이 편지 "A"와 "B", R 프로그램에서 사용할 수 있는 소형 문자 표시 방법을 사용 하 여 통해 가져온으로 표시 됩니다. 일반적인 편지를 공유 하지 않는 치료는 서로에서 통계적으로 유의 한 (p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 분석 결과의 응용 프로그램 셀룰러 이동의 높은 처리량 및 적절 한 평가 제공 하 고 복잡 한 생리 시스템5,,67직접 번역할 수 있습니다. 이런 이유로 제안 된 벤치 탑 모델 조정 되어과 상처 치유6에 다양 한 치료제 및 환경 독 소의 효과 평가 하기 위해 연습. 현재 연구에 사용 된 비소의 농도의 알려진된 노출 수준, 광범위 한 문학 검색을 통해 환경 관련 지었다 그리고 다양 한 데이터의 회고전 검토에서 기초14,15, 16,17,,1819,,2021. 이 생체 외에서 스크래치 분석 결과의 사용 시연 내 환경 관련 범위 하지만 높은 비소 농도에 노출, 지연 상처 폐쇄 (셀룰러 마이그레이션).

이 벤치 톱 모델 또한 격리 하 고 더욱 구와 마이그레이션 상처 치유 결과에 기여 하는 방법을 이해 하는 개별 셀 라인 (fibroblast) 공부 고용 되었다. 또한, 분석을 방해할 수 있는 복잡 한 생체 내에서 시스템에서 다른 많은 세포와 조직 현재 개별 셀 라인의 기능을 공부 하기 어렵습니다. 또한, 분석 결과 반 양적 % 상처 폐쇄 데이터 대상으로 특정 세포 메커니즘을 통해 화합물 영향을 미칠 수 상처 치유 하는 데 사용할 수를 달성 하는 수단을 제공 합니다. 예를 들어 스크래치 시험에 사용 되는 셀 수집 및 저장 원하는 시에 하 수 유전자 발현에 사용 (신호 mRNA) 또는 단백질 표정 분석 실험22. 그들은 어떤 신호 또는 단백질 대부분에 기여 수 있습니다 다양 한 트리 트 먼 트 (즉, 비소)22존재 세포질 마이그레이션에 변화 이해를 추구 하는 경우이 정보 조사에 유용 수 있습니다.

인간의 신생아 피부 섬유 아 세포는 상처 치유에 있는 그들의 저명한 역할에 따라이 작품에 대 한 선정 됐다. 그러나,이 스크래치 시험 프로토콜 구현 되었습니다 사용 하 여 다양 한 세포 유형 및 다양 한 연구 목적에 대 한. 예를 들어 스크래치 분석 결과 마이그레이션 억제 화학요법 약23;의 공부에 대 한 종양학 분야에 채택 되었습니다. 골격 근육 세포 이동, 확산, 고 확산24; 세포질 마이그레이션25;에 식물 추출 물의 효과 연구 하 그리고 이해를 어떻게 keratinocyte 마이그레이션 및 확산에 기여할 상처 치유9. 또한, 핀 토 에 의해 이전 종이 스크래치 분석 결과6을 사용 하 여 hDFn 마이그레이션에 우라늄 (U) 및 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)의 효과 평가 합니다. 이 작품의 목적은 정도는이 분석 결과 속도 셀룰러 마이그레이션 (PRP)를 생각 하는 에이전트 및 셀룰러 마이그레이션 (U), 천천히 생각 하는 에이전트의 효과 테스트할 수를 이해 하는 것 이었다. 앞서 언급 한 작품에서 볼 수 있듯이 고 다른 수 사관, 스크래치 분석 결과의 응용 연구 잠재력이 높은 사용에 대 한 다양 한 실험 모델26에. 메서드 내에서 제공 하는 세부 사항에도 불구 하 고 조사와 실험 사이 차이 예상 한다. 예를 들어 셀룰러 마이그레이션 속도 사용, 독특한 셀 형식에 필요한 필수 미 량 영양소 뿐만 아니라 셀 라인에 따라 변동 가능성이 것입니다. 셀 생산량 및 생존에 도움이 중요 한 관측의 많은이 프로토콜을 통해 노트 로 표시 됩니다. 그러나, 조사 일반 셀 문화 작품 보충 지시로이 메서드를 사용 하 고 최적의 성장 조건에 대 한 제조업체의 권장 사항을 따라 하는 것이 좋습니다.

스크래치 분석 결과 세포 활동의 연구에 대 한 매우 다양 한 뜻하지 않은 편견 측정 기술에서 발생할 수 있습니다. 예를 들어 ImageJ를 사용 하 여 수동으로 셀 마이그레이션 전선 추적을 변형 정확도 및 대표 데이터 수집을 제한할 수 있는 사용자 간에 존재할 수 있습니다. 또한는 마이그레이션 전선 읽어야 장 님 사용자 바이어스를 최소화 하기 위해 치료에 주목 한다. 또한, 수동으로 마이그레이션 전선 식별 pseudopod 형성으로 인해 세포와 그들의 능력을 시각적으로 오해의 소지가 될 수 있는 형태 초점 유착에 밖으로 도달 하 여 여행 평균 거리의 오산 발생할 수 있습니다. 방식 처럼, 세포 표면에 형광 "셀 추적기"를 사용 하 여 염료 또는 마이그레이션 감지 하 핵 단백질 실수로 시간이 지남에 셀룰러 마이그레이션 측정할 때 부정확의 결과로 세포를 해결할 수 있습니다. 적절 한 긍정적인 또는 부정적인 컨트롤 완전히 엉덩이를 실험에 내에서 등록 하는 것이 좋습니다 셀 라인에 치료의 효과. 이 분석 결과의 실천의 한계 인식 완료 되어야 합니다. 이 분석 결과 체 외 실험에서 얻은 세포 마이그레이션 결과 vivo에서 결과. 을 직접 번역 것입니다 보장 하지 않습니다. 복잡 한 생활 시스템에서 상처 치료 및 세포 마이그레이션 포함 다양 한 세포 유형 및 분자 신호; 각각의 치료 응답에 영향을 미칠 가능성이 있다.

요약 하자면, 스크래치 분석 결과 환경6,25변화 하는 응답에 세포질 이동의 높은 처리량 검열 제공 발견 되었습니다. 우리는 특히 성공적으로 다양 한 환경 관련 복용량에서 비소 노출의 결과로 세포 마이그레이션에 변화를 감지 하이 프로토콜 활용. 이러한 데이터를 사용 하 여 스크래치 분석 결과 연구를 추가 하 고이 분석 결과에 이러한 경로 비소 노출에 의해 변경 되는 방법을 세포 이동의 기계적 경로 평가 정당화 제공.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 간행물에서 보고 된 연구는 소수 보건 및 보건 불균형의 보너스 번호 U54MD012388에서 건강의 국가 학회에 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II A/B3 Biological Safety Cabinet Forma Scientific 15201-816
Nitrile Gloves Kimberly-Clark 55082
Water Bath Precision Model 182
Inverted Microscope Leica Q080318
CPR Centrifuge Beckman 349702
Analytical Scale Ohaus I093 1125062111P
Weighting paper VWR H351125781212A
Biohazard bags Fisherbran 01-830A
Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 309739-31053
Hanks Balanced Salt Solution Gibco 14175-095
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 10566-016
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079
Automatic Pipettor Drummond 140685
p200 Pipette Gilson
p20 Pipette Gilson
Denominator Fisher Scientific D59707
Trypan Blue Stain Gibco 15250-061
T75 tissue flask Corning 430725U
15 mL Conical Tube Fisherbrand 05-539-5
50 mL Conical Tube VWR 21008-178
5 mL Pipette Fisherbrand 13-678-11D
10 mL Pipette Fisherbrand 13-678-11E
Tissue Marker Securline 92167
Wipes Kintech 34155
70% Ethanol Fisher 63-67-0
Non-Filter Pipet Tips Fisherbrand 16160210
Bleach Great Value 220-04
96-well Falcon 353915
Cryovial Rack Nalgene 5030-0505
Hemacytometer Gizmo Supply B00SCOGY56
TrypLE Express Gibco 12605-028
Conical Tube Rack n/a n/a
12-well plate Corning 3598
Waste Beaker n/a n/a
1 mL Pipette Fisherbrand 13-678-11B
Straight Edge Ruler n/a n/a
Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) lot: 1734, 2902 106-05n
Rstudio Statistical Software ver: 3.5.1
Image J NIH ver: 1.8.0_112

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References

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Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. More

Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration. J. Vis. Exp. (144), e58838, doi:10.3791/58838 (2019).

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