Summary
Este estudo centra-se em um modelo em vitro de ferida cura (zero ensaio) como um mecanismo para determinar contaminantes como ambientais tais como migração celular de influência de arsênico. Os resultados demonstram que este ensaio in vitro fornece indicações rápidas e precoce de alterações à migração celular antes da experimentação na vivo .
Abstract
Compreender os mecanismos fisiológicos de cicatrização de feridas tem sido o foco da investigação em curso há muitos anos. Esta pesquisa diretamente se traduz em alterações em padrões clínicos utilizados no tratamento de feridas e diminuir a morbidade e mortalidade para pacientes. Cicatrização de feridas é um processo complexo que requer a função e interação estratégica de célula e tecido. Uma das muitas funções criticamente importantes da cicatrização é individual e coletiva de migração celular. Após lesão, várias células do sangue, em torno de tecidos conjuntivo e epiteliais rapidamente migram para o local da ferida por meio de estímulos químicos e/ou físicos. Esta resposta de migração pode ditar em grande parte os resultados e o sucesso de uma cura ferida. Compreender esta função celular específica é importante para a medicina translacional que pode levar a ferida melhorou os resultados de cura. Aqui, descrevemos um protocolo usado para compreender melhor a migração celular no que tange a cicatrização de feridas, e como as mudanças no ambiente celular podem alterar significativamente este processo. Neste estudo de exemplo, fibroblastos dérmicos foram cultivados em meios suplementados com soro fetal bovino (FBS) como culturas monocamada em frascos de cultura de tecidos. As células foram assepticamente transferidas para placas de cultura de tecidos tratada 12-poços e crescidas a confluência de 100%. Ao atingir a confluência, as células a monocamada foram riscadas verticalmente usando uma ponta da pipeta p200. Arsénio diluído em meio de cultura suplementado com FBS foi adicionado para poços individuais no ambientalmente relevantes doses variando de 0.1-10 M. imagens foram capturadas a cada 4 horas (h) durante um período de 24 h, usando um microscópio invertido observar a migração celular (ferida encerramento). Imagens foram analisadas individualmente usando software de análise de imagem, e por cento ferida encerramento foi calculado. Os resultados demonstram que o arsênico retarda cicatrização de feridas. Esta técnica fornece uma rápida e barata a primeira tela para avaliação dos efeitos dos contaminantes na cicatrização de feridas.
Introduction
Cicatrização de feridas é composto de uma série complexa de sobreposição de etapas que envolvem vários tipos de células, moléculas sinalizadoras e matriz extracelular componentes1. Juntos, esses componentes trabalham em conjunto para alcançar a resolução de ferida ou reparação, que acaba por conduzir à formação de uma cicatriz fibrótica protetora dependendo do grau de trauma1. Para capturar os processos individuais e funções da ferida em uma experiência de cura é difícil; etapas individuais dentro da processo de cicatrização de feridas precisam de ser identificados e testados separadamente. Entre as muitas etapas da cicatrização de feridas, o processo de migração celular foi considerado crítico ao avaliar cura taxas2. Migração celular pode ser observada em todas as fases da cicatrização de feridas e, portanto, necessita de mais compreensão de como alterações a migração celular podem afetar o fechamento da ferida. Por exemplo, migração celular é vista em ambos inflamação fase precoce e tardia, com sangue coagulação e agregação plaquetária ferida local3. Esses eventos evitar perda excessiva de sangue, formando um bloqueio temporário para preencher áreas feridas desprovida de tecido3. Plaquetas na circulação serão sintetizam e segregam vasoativas mediadores junto com Fatores Quimiotáticos, qual sinal junto para migração inflamatória dos leucócitos (glóbulos brancos) no tecido ferido para reparar4. Re-epitelização ocorre dentro de horas de lesão tecidual e envolve cobrindo o local da ferida através de atividade e migração de queratinócitos epiteliais de evitar a contaminação ou invasão de partículas estranhas ao ferimento local2. Estes exemplos capturam somente alguns da migração celular muitas funções associadas com cicatrização de feridas.
O ensaio de zero foi descrito e usado para compreender melhor a migração celular e seus muitos papéis em5,6de cicatrização de feridas. Este ensaio é considerado simplista, proporciona alta produtividade e permite que o investigador coletar dados de migração de células representativas. Ensaios de migração com sucesso têm demonstrado que certos compostos podem acelerar ou retardar a taxa de migração celular6. Além disso, estes resultados de ensaio fornecem translacional informação fisiológica que pode ser usada para formular tratamentos alvo, dosagem de concentrações e genes de interesse antes da experimentação na vivo . O ensaio requer técnicas de cultura de célula básica e suprimentos, uma linha de celular de escolha e tecnologia de imagem para capturar o movimento ao longo do tempo ou movimento em resposta aos tratamentos.
O ensaio pode ser facilmente manipulado ou adaptado para satisfazer as necessidades do investigador. No entanto, existem quatro perguntas básicas a considerar antes da experimentação. Que pergunta geral ou específico (s) é (é) o investigador tentando responder? Isto prende verdadeiro para a maioria das hipóteses conduzido pesquisas; no entanto, é fundamental para este ensaio porque, irá determinar muitos dos parâmetros necessários para precisão e responder completamente as questà µ es. Que linha de células ou linhas de células (se vários) devem ser usados para representar o sistema fisiológico sendo estudado? Por exemplo, em um cutâneo ferida cura estudo de células-tronco8, fibroblastos dérmicos5,6,7, ou queratinócitos epidérmicos9 pode ser considerado para representar populações de células que normalmente são encontradas em abundância na pele tecido10. Alternativamente, os neutrófilos, macrófagos ou outras células inflamatórias poderiam ser avaliadas neste sistema para representar a migração celular dos outros componentes da cicatrização de feridas na pele tecido10. Além disso, identificar a linha de célula específica sendo avaliada ajudará a identificar quais os reagentes são ideais para usar para promover a atividade metabólica celular. Como será a migração celular rastreado/fotografada? Há um número de técnicas utilizadas para observar a migração celular dentro de um balão ou placa. Por exemplo, tingimento ou fluorescente marcação de células e usando fluorescência ou imagem latente confocal para rastrear as células fornecem um contraste forte, o que permite que o investigador definir claramente o celular vs não-celulares locais e movimento celular11 . Outra técnica comum, descrita no presente estudo, é o uso da microscopia de luz invertido com contraste de fase6,7. Esta alternativa aos corantes de célula e fluorescência permite ao usuário viver faixa células sem ter que corrigir terminalmente células antes da imagem e também permite a captura de imagens dos mesmos poços individuais contendo feridas monocamadas de células através de pontos de tempo. As medidas que resultado serão usado para análise? Usando as imagens recolhidas ao longo do estudo, dados podem ser gerados em que alterações em taxas de migração celular podem ser entendidas. Em nosso laboratório, microscópicas imagens capturadas sobre o microscópio invertido são enviadas para o software de análise de imagem e o fechamento da ferida por cento e resumiu a área sob a curva (AUC) são calculados.
Destacaremos o uso específico deste teste para elucidar alterações à migração de fibroblastos dérmicos na presença de um contaminante ambiental conhecido, arsênico. Arsênio é um metaloide ocorre naturalmente encontrado dentro da crosta terrestre. Foram encontrados vários locais com níveis elevados de arsênico, que constitui um risco para os indivíduos que vivem perto desses locais. Como resultado, fontes de alimento e água foram mostradas para ter aumentado os níveis de contaminação de arsênio, que aumenta a probabilidade para que os indivíduos se tornam expostos ao arsênico. Exposição ao arsênico ambiental foi mostrada para ter consequências a longo prazo da saúde nas populações humanas acima ou até mesmo abaixo da atual agência de proteção ambiental dos Estados Unidos (USEPA) Max contaminante nível (MCL) de 10 ppb (10 µ g/L)12, 13. embora a USEPA estabeleceu este MCL e é considerado seguro para limites de consumo, as concentrações de arsénio que exceda esse limite não são incomuns em fontes de água em todo o mundo. Nos Estados Unidos do sudoeste, numerosos solo-água, água de poço e molas foram documentadas para conter sobre níveis de arsênico14. Por exemplo, no Vale Verde, AZ, Montezuma bem contém 210 de arsênico15µ g/L. Águas subterrâneas ao redor do Rio Verde, AZ contém 16 µ g/L de arsênico em média, com valores de pico, atingindo 1,3 mg/L de15,16. Notavelmente, a concentração de arsênio em muitos poços no galpão Rio Verde água excede 50 µ g/L,15,16. Com esse conhecimento, as concentrações de arsénio ambientalmente relevantes foram selecionados que vão abaixo o MCL no 0.1 µM (7,5 ppb), acima do MCL no 10 µM (750 ppb) na atual estudar14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
As informações recolhidas a partir dessas experiências serão usadas como um indicador precoce de potenciais alterações em taxas de migração celular em um na vivo ferida contaminado com arsênico. Depois, sinalização moléculas podem ser selecionadas com base em seu papel em facilitar a cicatrização de feridas e migração celular e futuro polimerase quantitativo reação em cadeia (qPCR) baseado gene expressão experimentos podem ser instituídos após a conclusão da corrente estudos. Se taxas de migração neste ensaio alterar na presença de arsénio, alvos de genes específicos envolvidos na migração celular podem ser o alvo para efeitos deletérios de arsênico e assim podem ser o mecanismo de interrupção.
Protocol
1. preparação de um gabinete de biossegurança II (BSC)
Nota: Os métodos descritos no presente protocolo devem ser realizados com equipamento de proteção pessoal, durante o uso de boas práticas laboratoriais para alcançar uma técnica asséptica.
- Levante o vidro protetor do BSC a altura operacional e ligar ventiladores de fluxo laminar.
- Use 70% solução aquosa de isopropanol para executar um apagamento de saneamento da área de trabalho. Limpe o BSC da parede do fundo e paredes laterais e trabalhar até a placa de base.
- Limpe todos os materiais que serão utilizados no ensaio com 70% de álcool (isopropanol ou EtOH) e colocá-las dentro do BSC.
2. humanos fibroblastos dérmicos semeadura em balão T75
- Obter os frascos com a linha de celular criopreservado desejado (neonatais humanas fibroblastos dérmicos [hDFn], a concentração de células de 500.000 células/frasco e na passagem p3-p5).
- Coloque um tubo de ensaio com células em 1,0 cm de profundidade banho-maria a 37 ° C, para permitir que o descongelamento. Descongele o frasco até que aproximadamente 70% de solução de célula é líquido. Limpe bem o frasco com álcool a 70% e coloque o frasco em rack frasco dentro do BSC.
Nota: Certifique-se de água não entra em contato com tópicos ou tampa do frasco para evitar a contaminação potencial durante a semeadura de célula. Evitar descongelar completa de células na água do banho como a não observância pode causar morte celular não-intencional.
- Coloque um tubo de ensaio com células em 1,0 cm de profundidade banho-maria a 37 ° C, para permitir que o descongelamento. Descongele o frasco até que aproximadamente 70% de solução de célula é líquido. Limpe bem o frasco com álcool a 70% e coloque o frasco em rack frasco dentro do BSC.
- Tirar 10 mL de mídia suplementada com 10% de soro Fetal bovino (FBS). Use uma pipeta automática e a ponta da pipeta de 10 mL para aspirar T75 balão de cultura de tecidos. Permitir que a mídia totalmente saturar a base do frasco, agite suavemente o frasco para a frente e para trás.
- Frasco aberto com solução de estoque e aspirado de célula do frasco, sendo consciente de pipetagem de velocidade, como as membranas celulares estará vulnerável de criopreservação.
- Transferência de células para um balão de tecido T75 com mídia. Ejete célula descongelada para balão de tecido, novamente estar consciente de pipetagem de velocidade.
Nota: Semeando a densidade das células em balão de tecido é aproximada para ser 6.600 células/cm2. Densidade de semeadura pode ser alterado para acomodar o usuário e o tempo desejado de experimentação. - Meça 1 mL de mídia do balão de tecido T75 e transferir volume de volta para o frasco. Transferi o volume do frasco volta para o balão de T75.
Nota: Executar este passo ajuda a maximizar o rendimento da célula do frasco. - Aperte a tampa do frasco de cultura de tecidos e agitar suavemente para dispersar uniformemente as células em suspensão através de toda a superfície. Verifique se há uma distribuição uniforme de células usando um microscópio invertido.
- Balão de rótulo com o tipo de célula, data, iniciais, linhagem e finalidade (por exemplo, hDFn, 11/07/2018, NDC, passagem 4, arsénio Scratch ensaio). Coloque o frasco de cultura do tecido em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5,0% de CO2 por 72 h.
Nota: Meio de crescimento deve ser alterado 12-24 h após a semeadura inicial para remover vestígios de Dimetilsulfóxido (DMSO) cryopreservative e então mudou a cada 48 h após o que, para garantir que as células são adequadamente nutridas. O período de incubação e crescimento dependerá o número estimado de células necessárias para o ensaio de zero. O tempo de duplicação para as células hDFn é normalmente 16-24 h em condições normais. No entanto, duplicação da taxa pode mudar devido à elevação, pH, temperatura, umidade, tipo médio, etc.e deve ser contabilizada no planejamento de experimentos.
3. contagem de células e subcultura em tecido 12-poços cultura placa
- Recupere o frasco de cultura de tecidos de T75 da incubadora. Observar células aderidas, usando um microscópio invertido no objetivo ampliação de 10x (aumento total X 100) e determinar a confluência de célula aproximada.
- Varredura da maioria do frasco de cultura de tecidos quando observar a confluência para garantir a percentagem mais representativa é aproximada. Avalie a morfologia da célula individual para qualquer anormalidade, ou por contaminação bacteriana ou fúngica.
- Monte a pipeta automática com uma ponta de pipeta de 10 mL. Use a pipeta para aspirar todo o volume de mídia da solução T75 e transferir para um contentor de resíduos. Evitar que a ponta da pipeta entrar em contato com a superfície aderente da célula. Descarte a ponta da pipeta em um escaninho de risco biológico.
- Monte a pipeta automática com uma ponta de pipeta de 5 mL. Aspire 5 mL da solução de sal equilibrada, dispense o frasco e agitar suavemente o frasco para lavar o excesso mídia, células mortas e resíduos de produto.
- O volume a retirar o T75 e dispense dentro do recipiente para resíduos. Descarte a ponta da pipeta para o lixo de risco biológico.
- Monte a pipeta automática com um adaptador de pipeta de 5 mL. Aspirar 2 mL de tripsina do estoque, dispense o frasco e agitar suavemente o frasco para dispersar a enzima sobre as células aderidas. Assegure a saturação completa da superfície aderente. Coloca o balão de tecido na incubadora durante 2-3 minutos (min).
Nota: A reação enzima-substrato máxima não deve exceder 10 min. - Observe o balão de tecido sob um microscópio invertido em uma ampliação da lente objetiva de 10x (aumento total X 100). Aplica vibrações suaves para facilitar o desprendimento de células.
- Limpe o frasco T75 com álcool a 70% e coloque dentro do BSC.
- Monte a pipeta automática com uma ponta de pipeta de 5 mL. Aspire 5 mL de mídia do estoque e adicionar no balão de tecido T75 para parar a reação enzima-substrato. A relação da mídia: tripsina deve ser de 3:1. Pipeta acima e abaixo da base do balão de 2 - 3 vezes para enxaguar e certifique-se de que a reação parou. Aspire o volume total de líquido do frasco e transferir para um tubo cônico estéril 15 mL.
- Encha um segundo tubo cônico de 15 mL com um volume idêntico de mídia.
- Coloque ambos os tubos cônico de 15 mL em posição antipodal um ao outro. Aplica 200 g da força centrífuga para min 5 a 25° C, definindo parâmetros de funcionamento do equipamento.
- Limpe o tubo cônico de 15 mL com células peletizadas com álcool a 70% e coloque dentro do BSC.
- Use a pipeta automática com uma ligação de 5 mL com pipeta fora da mídia, deixando para trás cerca de 250 µ l de fluido e célula da pelota. Preste atenção à posição da ponta da pipeta, como o centrifugado deve permanecer intacto. Distribuir o volume coletado em um recipiente de resíduos e descarte a ponta em um escaninho de risco biológico.
- Use um rack de tubo microcentrifuga para executar o fundo do tubo cónico através das ranhuras do frasco, criando uma vibração rápida, para perturbar e ressuspender o centrifugado (às vezes chamado de "bastidor de ajuntar").
Nota: Evite usar um misturador do vortex para executar essa etapa. As forças de gravidade criadas por misturadores de vórtice excederem os limiares de força-g célula e podem causar a Lise. Quando concluída corretamente, a nova solução de célula aparecerá como uma mistura nublada com nenhuma pelota restante. Diligência, executar este passo muitas vezes irá criar uma suspensão única célula, levando a maior precisão, quando a contagem de células. - Adicione 2 mL de mídia a ressuspensão ou das células. Pipetar as células suavemente para baixo do lado do tubo 20 vezes para quebrar qualquer touceiras. Registrar o volume de suspensão celular total e reserve brevemente.
- Pipetar 20 µ l de estoque azul Trypan (0,4%) em um poço vazio de uma placa de 96 poços, usando uma pipeta estéril.
- Misture a solução de estoque celular para gerar uma suspensão uniforme de células antes da transferência. Use uma ponta de pipeta estéril para remover 20 µ l de caldo de célula (evitando tocar as paredes do tubo). Adicione a 20 µ l de solução de azul de Trypan na placa de 96 poços.
- Pipeta suavemente para misturar o conteúdo. Pipeta de 10 µ l da mistura entre a lamínula e a contagem de câmara sobre o hemocytometer.
- Observe as células e a grade sob um objetivo X 10. Observe nove grandes praças dentro do campo de visão. Contar as células apenas no centro e 4 quadrados de canto (total de 5 quadrados).
Nota: Procure uma distribuição uniforme de células em toda a rede inteira para garantir uma contagem exata. - Concordância de todas as células (transparentes e azuis) em 5 quadrados identificados da grade. Calcular separadamente, apenas as células viáveis (azuis) as mesmas 5 quadrados.
- Calcule a contagem de células viáveis usando:
onde x = contagem de células viáveis, um = células totais, b = células não-viáveis - Calcule a densidade de células viáveis usando:
onde x = densidade de células viáveis e y = soma total de células viáveis. - Calcule o totais células viáveis:
onde x = totais células viáveis, y = densidade de células viáveis, f = volume de suspensão de células (mL). - Calcule a viabilidade celular de %:
onde x = viabilidade celular por cento, y = células viáveis que contava com grade, f = totais células contadas na grade.
- Marque uma linha horizontal na parte inferior da placa 12-poços para servir como pontos de referência durante a imagem latente.
- Use a densidade de células viáveis (calculada em 3.3.7) para calcular o volume de mídia para diluir o estoque de célula em para uma placa de cultura de tecido 12-poços de propagação.
Nota: A célula ideal semeando a densidade de células de hDFn é de 5.000 células/cm2. - Diluir o estoque de célula para células/mL 19.000 usando mídia e sementes de cada poço com 1 mL de caldo de célula. Misture o estoque de célula periodicamente para assegurar mesmo célula semeadura em todos os 12 poços.
- Etiquete cada prato com o tipo de célula, a linhagem, as iniciais do usuário e da finalidade. Colocar placas na incubadora conjunto para 37 ° C e 5,0% de CO2. Permitir que as células a crescer até alcançar a confluência de 100% para o ensaio do zero.
- Use a densidade de células viáveis (calculada em 3.3.7) para calcular o volume de mídia para diluir o estoque de célula em para uma placa de cultura de tecido 12-poços de propagação.
4. arsénio (As) soluções estoque e cálculos
- Diluir o Arsenito de sódio (NaAsO2) diretamente em meios de cultura celular com 10% FBS nas concentrações de trabalho de 10, 1,0, 0,1 e 0,01 µM como.
- Para isso, fazer um estoque inicial 1mm como solução diluindo 3,9 mg de Arsenito de sódio em 30 mL de mídia. Serialmente dilua o estoque de 1 mM para as restantes como soluções.
| 1000 µM como estoque Cálculos | Trabalhar ações concentrações de arsénio | M1V1= M2V2 | Volume de solução de arsênico anterior | Volume de mídia | Volume total de arsênico trabalhando Stock |
| NaAsO2 molecular peso: 129.9 g/mol | 10 µM como | (x mL) (1.000 µM) = ()(10 µM) 30 mL x = 0,3 mL | 0,3 mL = 300 µ l de 1mM, como solução | mídia de 29,7 mL | 30 |
| .03 L x.001 mol/L x 130 g/mol = 3,9 mg de arsênico | 1,0 µM como | (x mL) (10 µM) = ()(1 µM) 30 mL x = 3 mL | 3 mL de 10 µM como solução | 27 mL de mídia | 30 |
| Diluir 3,9 mg de Arsenito de sódio em media de 30 mL | 0.1 µM como | (x mL) (1 µM) = ()(0.1 µM) 30 mL x = 3 mL | 3 mL de 1 µM como | 27 mL de mídia | 30 |
| 0,01 µM como | (x mL) (0,1 µM) = ()(0.01 µM) 30 mL x = 3 mL | 3 mL de 0.1 µM como | 27 mL de mídia | 30 |
Tabela 1. Estoques de arsênico e diluições em série. Esta tabela explica os cálculos usados para criar As soluções estoque e trabalhando as soluções para os grupos de tratamento.
5. Raspe a técnica de ensaio e contaminação de arsênio
- Obter uma placa de 12 com células da incubadora. Ver as células em um 10 X ampliação objetiva (ampliação total X 100). Determine a confluência de célula dentro de cada poço.
Nota: Cada indivíduo bem deve chegar a confluência de 100% antes de coçar. Esta etapa crítica garante a consistência dentro do ensaio e ajuda a padronizar protocolos do ensaio através de experimentos. Se qualquer poços não chegaram a confluência de 100%, permitem que as células incubar durante mais tempo, até que todos os poços chegaram a confluência de 100%. Tempo de crescimento adicional em poços que já atingiram 100% confluência não será afetado. Confluentes normalmente se tornará crescimento preso e permanecem como uma cultura de monocamada, permitindo sub confluentes poços atingir 100% de confluência. - Monte uma pipeta automática com uma ponta de pipeta de 10 mL. Aspire a mídia de crescimento fora de todos os poços. Elimine o volume de resíduos líquidos e a ponta da pipeta no caixote do lixo de riscos biológicos.
- Monte uma p200 pipeta com uma ponta de estéril 1-200 µ l. Em cada poço, produzir um arranhão "ferida simulado" deslizando a ponta em toda a superfície da célula de um 12-horas para 6 horas local.
Nota: Três fatores que afetarão extremamente consistência são velocidade, pressão e ângulo de ponta. O risco deve ser realizado rapidamente, com uma pressão constante, enquanto ser consciente do ângulo de ponta ficar perpendicular à base da placa. Coçar muito lentamente fará com linhas tortas, excesso de pressão pode permanentemente marcar superfícies aderente de célula e um ângulo de ponta inferior a 90° vai reduzir a largura zero. Qualquer um desses erros comuns pode resultar em taxas de migração alterada e padrões. - Limpe touceiras de detritos e célula excesso enxaguando com 1 mL de solução salina equilibrada por bem. Rocha, a placa lateral-lateral para facilitar a lavagem. Remover a solução salina equilibrada de poços e descarte em um recipiente de resíduos. Elimine a ponta da pipeta de 5 mL para o lixo de riscos biológicos.
- Monte uma p200 pipeta com uma ponta de estéril 1-200 µ l. Em cada poço, produzir um arranhão "ferida simulado" deslizando a ponta em toda a superfície da célula de um 12-horas para 6 horas local.
Figura 1: representação esquemática do ensaio zero. Todo trabalho é feito dentro de um campo asséptico para diminuir a possibilidade de contaminação. As células são semeadas em uma densidade desejada em frascos de cultura de tecidos e crescidas em uma incubadora definida como humanas condições fisiológicas (5% de CO2, 37 ° C). Ao atingir uma confluência desejada, as células são assepticamente sub cultivadas em placas de cultura de tecidos de 12-poços em uma densidade de semeadura desejada. As células são cultivadas para a confluência de 100% em cada poço da placa 12-poços e riscado com uma ponta de pipeta estéril. Este "zero" cria uma em vitro simulado ferida (indicada pela seta de cabeça dupla), na qual células naturalmente migram para fechar a área aberta. Cada um bem pode ser excepcionalmente condicionado e taxas de migração celular podem ser observadas e quantificadas em resposta às condições de tratamento diferente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Use uma pipeta p1000 com uma ponta de 1.000 µ l para Pipetar 1.000 µ l dos estoques de arsênico em poços que foram atribuídos aleatoriamente com um grupo de tratamento. Use uma nova ponta da pipeta para cada poço para evitar contaminação cruzada. Registre o tempo quando os tratamentos são adicionados. Coloque placas boas 12 em uma incubadora a 37 ° C e 5,0% de CO2.
6. imaging
- Capture imagens de cada poço em 10 X ampliação objetiva cada 4h durante um período de 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 e 24 h). A linha anteriormente desenhada na parte inferior da placa para o mesmo local ao longo do zero dentro de cada poço em pontos de tempo subsequente de imagem de referência.
Nota: É imperativo que os mesmos locais são fotografados em cada ponto de tempo para permitir a análise de imagens precisas e obter dados representativos.
7. análise de imagens
- Upload de imagens capturadas sobre o microscópio invertido para um computador e salvar como uma imagem JPEG com um nome de arquivo detalhado.
- Abra o ImageJ.
- Upload de uma imagem de um micrômetro de palco com distâncias conhecidas para o software para converter pixels em milímetros (mm), quando a medição de imagem arrastando e soltando o arquivo para a janela do software.
Nota: O micrômetro deve ter linhas que delimitam um conhecido de 1 mm de comprimento e a imagem deve ser tomada com a mesma ampliação usada para capturar imagens de células. Por exemplo, neste estudo imagens foram tiradas em 100 X ampliação total, assim, a imagem do micrômetro palco foi tirada em 100 X ampliação total.- Clique nas opções reta, segmentadoou Linhas à mão livre .
- Desenhe uma linha de distância conhecida na imagem micrômetro usando as marcas de escala com um comprimento de associado para cada escala marcas. Desenhar uma linha reta: clique do mouse, segure, arraste o cursor para o local desejado e solte-se do mouse.
- Selecione analisar , em seguida, selecione Definir escala.
- Definir a Distância conhecida para o comprimento conhecido da linha desenhada na etapa anterior.
- Definir a unidade de comprimento para mm.
- Marque a caixa global.
- Selecione Okey para sair do menu.
- Feche a imagem de micrômetro de palco.
- Carregar uma imagem do ensaio zero em ImageJ arrastando e soltando o arquivo de imagem para a janela.
- Desenhe uma linha reta em toda a largura da risque (da esquerda de ponta a ponta direita).
- Pressione a letra M do teclado para registrar a medida da linha reta desenhada. Uma pequena janela de resultados aparecerá imediatamente depois de digitar a letra M. Isto é onde será a medição de largura.
- Repita a etapa 7.4 um total de 10 vezes para obter 10 medições ao longo do comprimento da risque.
Nota: É importante gerar os valores de largura mais representativo do comprimento inteiro da risque. Certifique-se de espaço fora as medições de 10 largura igualmente ao longo do comprimento da risque de cima para baixo. - Crie um arquivo de planilha do ensaio zero para copiar e colar as medições.
- Copie e cole as medições de 10 largura da janela de resultados na coluna apropriada em um arquivo de planilha (tabela 2).
Nota: Quando as medições são copiadas a partir da janela de resultados e coladas em folha de cálculo, haverá estranhas colunas de valores; esses valores devem ser suprimidos, preservando apenas as medições de 10 largura.
- Copie e cole as medições de 10 largura da janela de resultados na coluna apropriada em um arquivo de planilha (tabela 2).
| 10 medidas de largura aleatória | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| Média de 10 medições |
Tabela 2. Medições de largura original formato de tabela. Esta tabela mostra a estrutura organizacional para as crus medidas obtidas.
- Repita os passos acima para o restante das imagens do ensaio zero.
- Calcule a média das 10 medições em cada ponto do tempo (0-24 h) para cada poço.
- Determine por cento encerramento cálculos usando valores da etapa 7,8.
- Criar uma tabela na parte inferior da planilha intitulado "médias de medição de largura" (tabela 3).
- Copiar e colar que a linha Média de 10 medições calculada no passo 7,8 na tabela "medição de largura média".
- Crie outra mesa ao lado a tabela de Médias de medição de largura . Este título de mesa Fechamento de ferida por cento (tabela 4).
Nota: O valor na coluna h 0 para cada poço deve ser 0 porque o zero é 0% fechado na foto inicial h 0 para todos os poços. - Navegue até a próxima coluna sobre (4 h).
- Calcule o fechamento por cento para 4, 8, 12, 16, 20 e pontos de tempo de 24 h:
onde, x = encerramento por cento, eu = largura zero inicial (largura h 0), f = largura zero final (4, 8, 12, 16, 20 ou 24 h largura).
| Bem largura médias | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1B | |||||||
| 2B | |||||||
| 3B | |||||||
| 4B | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabela 3. Medição de largura média de formato de tabela. Esta tabela mostra a estrutura organizacional para as médias de medição de largura calculada utilizando as medições de largura original na tabela 2.
| Bem | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | 0 | ||||||
| 2a | 0 | ||||||
| 3a | 0 | ||||||
| 4a | 0 | ||||||
| 1B | 0 | ||||||
| 2B | 0 | ||||||
| 3B | 0 | ||||||
| 4B | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2c | 0 | ||||||
| 3c | 0 | ||||||
| 4c | 0 |
Tabela 4. Formato de tabela de encerramento da ferida por cento. Esta tabela mostra a estrutura organizacional para os valores de fechamento de ferida por cento calculado usando a medição de largura médias na tabela 3.
- Crie outra mesa ao lado da mesa de Encerramento de ferida por cento . Este título da tabela AUC (tabela 5).
- Calcular o 0-4 h área sob o valor de curva (AUC) no 0-4 coluna h para cada poço:
onde x = 0-4 h valor AUC, um = o valor de fechamento % para h 0, b = valor de encerramento % por 4 h, h = o tempo entre as duas medidas (4 h neste estudo). - Calcule a área de 4-8 h sob o valor de curva (AUC) na coluna 4-8 h para cada poço:
Onde x = valor AUC 4-8 h, um = % valor de encerramento para 4h, b = valor de encerramento % para 8 h, h = o tempo entre as duas medidas (4 h neste estudo).
Nota: Um valor AUC deve ser calculado para cada intervalo de tempo de 4 h, durante o período de 24 h para cada poço. - Soma todos os valores AUC de 0-24 h (calculado em etapas 7.10.1-7.10.2) para obter um valor AUC somado para cada poço. Certifique-se que estes valores são salvos corretamente para análise estatística.
- Calcular o 0-4 h área sob o valor de curva (AUC) no 0-4 coluna h para cada poço:
| Bem | 0-4 h | 4-8 h | 8-12 h | 12-16 h | 16-20 h | 20-24 h | AUC resumiu |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1B | |||||||
| 2B | |||||||
| 3B | |||||||
| 4B | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabela 5. Formato de tabela AUC. Esta tabela mostra a estrutura organizacional para os valores AUC calculado usando o % ferida valores de encerramento na tabela 4.
8. análise estatística
- Determine o método de análise estatística que melhor se adapta o desenho experimental e somados valores AUC obtidas durante o ensaio.
Representative Results
Tamanhos de amostra (n) para todos os grupos de tratamento foi de n = 28. As células foram cultivadas com sucesso seguintes técnicas assépticas e protocolos de laboratório (Figura 1). Uniformes arranhões foram observados em todos os grupos de tratamento com a largura zero média medindo 0,8 mm 0,4 mm (Figura 2). Grupos de controle tinham uma área média resumiu sob o valor de curva de 1,355.83; 0,01 µM como grupos de tratamento teve uma média somada a área sob o valor de curva de 1,366.21; 0.1 µM como grupos de tratamento teve uma média somada a área sob o valor de curva de 1,326.24, 1,0 µM como grupo de tratamento teve uma média somada a área sob o valor de curva de 1,295.10; e finalmente a 10 µM como grupo do tratamento tinha uma área média resumiu sob o valor de curva de 535.12, que foi estatisticamente menor em comparação com todos os outros grupos (p < 0,05) (Figura 3). R-programa para a análise estatística foi usado para executar uma ANOVA One-Way com um ajuste de post hoc de Tukey para determinar diferenças estatísticas entre os grupos de tratamento (p < 0,05).
Figura 2: zero representativo do ensaio imagens ao longo de um período de 20 h. Imagens de A-D representam migração celular de células de controle; imagens E-H representam migração celular de células contaminadas com 1,0 µM como; imagens-L representam migração celular de células contaminadas com 10 µM como. Por essas imagens, é evidente que a migração celular é retardada na presença de arsênico. As imagens de controle mostram um arranhão completamente "curado" depois de 20 h, enquanto os outros dois grupos como tratamento não foram "curados". A 10 µM como tratamento inibiu o encerramento total completamente após 24 h. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Arsênico atrasa a migração celular no ensaio zero. Imagens foram capturadas durante um período de 24 h para observar alterações em taxas de migração celular na presença de diferentes concentrações de arsênico. Imagens RAW foram analisadas utilizando um software automatizado (por exemplo, em MATLAB), qual largura da ferida inicialmente medido, calculado em seguida encerramento por cento e, finalmente, a área sob a curva (AUC). Barras de erro representam o erro padrão da média. A 10 µM como grupo do tratamento estatisticamente diminuiu a migração celular de humanas fibroblastos dérmicos neonatais (hDFn), indicado por um valor AUC estatisticamente inferior, em comparação com todos os outros grupos de tratamento usando uma One-Way ANOVA com um ajuste de post hoc de Tukey (p < 0,05). Diferenças estatísticas são representadas pelas letras "A" e "B", que foram obtidos usando o método de visualização de carta compacto disponível no R-programa. Tratamentos que não compartilham uma carta comum são estatisticamente significantes do outro (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aplicação deste ensaio fornece uma avaliação oportuna e de alta produtividade de migração celular e pode traduzir diretamente para sistemas fisiológicos complexos5,6,7. Por esta razão, o modelo proposto de bancada foi afinado e praticado para avaliar os efeitos de vários agentes terapêuticos e toxinas ambientais na ferida cura6. As concentrações de arsénio, usado no estudo atual foram considerados ambientalmente relevantes através de pesquisa extensa literatura dos níveis de exposição conhecida e de uma revisão retrospectiva de vários dados bases14,15, 16,17,18,19,20,21. Uso este ensaio zero em vitro demonstraram que a exposição a uma concentração de arsênio dentro do alto, mas a gama ambientalmente relevante, atrasar o fechamento da ferida (migração celular).
Este modelo de topo do banco também foi empregado para isolar e estudar uma linhagem de células individuais (fibroblasto) para se perceber como a migração de fibroblastos contribui para ferir os resultados de curativas. Além disso, é difícil de estudar as funções de uma linhagem de células individuais em sistemas complexos na vivo com muitas outras células e tecidos presentes que possam interferir com a análise. Além disso, o ensaio fornece um meio de alcançar dados de encerramento semi-quantitativa por cento ferida que podem ser usados para atingir mecanismos celulares específicos através dos quais compostos podem influenciar a cicatrização de feridas. Por exemplo, células utilizadas no ensaio de risco podem ser coletadas e armazenadas em um reagente desejado e usadas na expressão gênica (sinal do mRNA) ou a expressão da proteína ensaios22. Esta informação pode ser útil ao investigador se eles buscam compreender o que sinais ou proteínas podem ser largamente contribuindo para mudanças na migração celular na presença de diferentes tratamentos (i.e., arsênico)22.
Fibroblastos dérmicos neonatais humanos foram selecionados para este trabalho, com base no seu papel de destaque na cicatrização de feridas. No entanto, este protocolo de ensaio zero foi implementado usando vários tipos de células e para uma variedade de fins de pesquisa. Por exemplo, o ensaio de zero foi adotado no campo da oncologia para estudar a inibição da migração de drogas de quimioterapia23; para a migração de células do músculo esquelético, proliferação e difusão24; para estudar o efeito de extratos vegetais na migração celular25; e para entender como a proliferação e migração de queratinócitos contribuem para ferida cura9. Além disso, um papel anterior por Pinto et al avaliou os efeitos do urânio (U) e plasma rico em plaquetas (PRP) na migração de hDFn usando o ensaio zero6. O objetivo deste trabalho foi compreender a extensão a que este ensaio poderia testar o efeito de um agente pensado para retardar a migração celular (U), bem como um agente pensado para acelerar a migração celular (PRP). Como pode ser visto no trabalho acima mencionado e pesquisa por outros investigadores, aplicação do ensaio zero tem alto potencial para uso em vários modelos experimentais26. Apesar do detalhe fornecido dentro os métodos, a variância deve ser esperada entre investigadores e experimentos. Por exemplo, taxas de migração celular provavelmente irão variar com base na linha de celulares em uso, além dos micronutrientes necessários necessários para tipos exclusivos de célula. Muitas das observações importantes para auxiliar na viabilidade e rendimento de célula são listadas como notas ao longo do presente protocolo. No entanto, é altamente recomendável que os investigadores seguem as recomendações do fabricante para condições de crescimento ideal e para usar esse método como instrução complementar para trabalho de cultura celular geral.
Embora o risco é extremamente versátil para estudo da atividade celular; enviesamentos imprevistos podem surgir em técnicas de medição. Por exemplo, ao usar o ImageJ para traçar manualmente as frentes de migração celular, variação que pode existir entre os usuários, que podem limitar a precisão e a coleta de dados representativos. Também deve ser notado que as frentes de migração devem ser lido cegos para o tratamento para minimizar o viés de usuário. Além disso, manualmente identificar frentes de migração pode resultar em erro de cálculo da distância média percorrida devido à formação de pseudopod por células e a sua capacidade para chegar a adesões de forma focal, que podem ser visualmente enganosas. Da mesma forma, o uso de fluorescentes "rastreador de celular" corantes na superfície de células ou proteínas nucleares para detectar migração involuntariamente podem fixar células resultando em imprecisões ao medir a migração celular ao longo do tempo. É recomendável que os controlos adequados em positivos ou negativos estar matriculado dentro do experimento para avaliar completamente o efeito do tratamento sobre as linhas de célula. Prática deste ensaio deve ser concluída em reconhecimento de suas limitações. Este ensaio não garante que os resultados de migração celular obtidos através da experimentação em vitro diretamente se traduzirá na vivo resultados. Ferida a migração celular e cura em um sistema complexo vivo envolve uma infinidade de tipos de células e sinais moleculares; cada qual tem o potencial para influenciar as respostas de curativas.
Em resumo, o ensaio de zero foi encontrado para fornecer a seleção da elevado-produção de migração celular em resposta às mudanças ambientes6,25. Especificamente utilizamos este protocolo para detectar com sucesso as mudanças na migração celular como resultado de exposição ao arsênico em várias doses ambientalmente relevantes. Estes dados forneceram a justificativa para usar o ensaio de zero para mais estudo e avaliar os caminhos mecanicistas da migração celular neste ensaio e como estes caminhos são alterados por exposição ao arsênico.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional sobre saúde das minorias e as disparidades de saúde do institutos nacionais da saúde sob prêmio número U54MD012388. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
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