Summary
Bu çalışmada bir vitro modeli (arsenik etkisi hücresel geçiş gibi nasıl çevre kirletici maddeleri belirlemek için yara iyileşme sıfırdan testin) bir mekanizma olarak odaklanır. Bu içinde vitro tahlil değişiklikleri için in vivo deneyler önce hücresel göç hızlı ve erken belirtileri sağlar sonuçlar gösterilmektedir.
Abstract
Yara iyileşmesi fizyolojik mekanizmaları anlama uzun yıllar devam eden araştırma odağı olmuştur. Bu araştırma doğrudan yaraları tedavi ve hastalar için azalan morbidite ve mortalite için kullanılan klinik standartlar değişimler dönüştürecektir. Yara iyileşmesi stratejik hücre ve doku etkileşimi ve işlev gerektiren karmaşık bir süreçtir. Yara iyileşmesi pek çok kritik düzeyde önemli işlevlerinden biri, bireysel ve kolektif hücresel geçiş değil. Yaralanma çeşitli hücreler kandan bağ ve epitel doku hızla çevreleyen kimyasal ve/veya fiziksel uyaranlara yoluyla yara bölgesine göç eder. Bu geçiş yanıt büyük ölçüde sonuçları ve başarı bir şifa yara dikte edebilirsiniz. Bu belirli hücresel işlev anlama sonuçları şifa geliştirilmiş yara açabilir translasyonel tıp için önemlidir. Burada, biz gibi yara iyileşmesi ve nasıl hücresel ortamındaki değişiklikleri önemli ölçüde bu işlem değiştirebilir ilgilidir hücresel geçiş daha iyi anlamak için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu örnek çalışmada, dermal fibroblastlar fetal sığır serum (FBS) ile desteklenen medya doku kültürü şişeler kültürlerde monolayer olarak yetiştirilmiştir. Hücreleri aseptik doku kültürü tedavi 12-şey kalıplara aktarılır ve % 100 izdiham için büyüdü. İzdiham ulaşan üzerine monolayer hücrelerde dikey p200 damlalıklı ucu kullanarak çizik. Kültür FBS ile desteklenen medya seyreltilmiş arsenik bireysel wells çevre 0.1-10 M. görüntüler arasında değişen uygun doz her 4 saatte (s) hücresel geçiş gözlemlemek için (yara bir ters ışık mikroskobu kullanılarak bir 24 Saat süre içinde ele geçirildi eklendi kapanış). Görüntüleri tek tek görüntü analiz yazılımı kullanarak analiz ve yüzde yara kapatma hesaplanmıştır. Arsenik yara iyileşmesi aşağı yavaşlatır sonuçlar gösterilmektedir. Bu teknik, yara iyileşmesi üzerinde kirletici etkilerinin için hızlı ve ucuz ilk ekran sağlar.
Introduction
Yara iyileşmesi çeşitli hücre tipleri, sinyal molekülleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin1ilgili adımları çakışan karmaşık bir dizi oluşur. Birlikte, bu bileşenler konserinde yara çözünürlük veya onarım, sonuçta travma1derecesine bağlı olarak koruyucu bir fibrotik yara oluşumuna yol açan elde etmek için çalışır. Bireysel süreçleri ve fonksiyonlar yara yakalamak için bir deneyde şifa zordur; bireysel adım süreci şifa yara içinde tanımlanan ve ayrı ayrı test gerekir. Yara iyileşmesi birçok adımları arasında hücresel geçiş sürecinin iyileşme oranları2değerlendirirken kritik olarak kabul edilmiştir. Hücresel geçiş yara iyileşme tüm aşamalarında dikkat edilmesi ve böylece daha fazla hücre geçiş için değişiklik yara kapatma nasıl etkileyebilir anlayış gerektirir. Örneğin, hücresel geçiş kan pıhtılaşması ve trombosit toplama yara sitesi3ile hem erken ve geç faz iltihabı görülmektedir. Bu olaylar yoksun doku3yaralı alanları doldurmak için geçici bir tıkanma oluşturarak aşırı kan kaybını önlemek. Trombosit dolaşımda sentez ve kemotaktik faktör, birlikte hangi sinyal inflamatuar lökosit göç (beyaz kan hücreleri) için yaralı doku tamir4ile birlikte vazoaktif arabulucu salgılar. Yeniden epithelialization doku yaralanması saat içinde oluşur ve yara site üzerinden etkinlik ve daha fazla kirlenmesini önlemek için epitel keratinositler geçirilmesi veya yara site2yabancı parçacıklar işgali kapsayan içerir. Yaranın normal iyileşmesi birkaç işlevleri ile ilişkili birçok hücre göç sadece bu örnekler yakalamak.
Kazı-kazan tahlil açıklanan ve hücre göç ve5,6şifa yara içinde birçok rolleri daha iyi anlamak için kullanılır. Bu tahlil basit olarak kabul edilir, yüksek üretilen iş sağlar ve temsilcisi hücre göç veri toplamak için Dedektif sağlar. Geçiş deneyleri başarılı bir şekilde bazı bileşikler hücresel geçiş6oranı yavaşlatmak veya hızlandırmak olabilir gösterdi. Ayrıca, bu tahlil sonuçlar hedef tedaviler, konsantrasyonları ve genler vivo içinde deneme önce ilgi dozaj formüle için kullanılan translasyonel fizyolojik bilgi sağlar. Tahlil gerektiren temel hücre kültürü teknikleri ve malzemeleri, seçim ve görüntüleme teknolojisi zamana veya hareket tedavilere yanıt hareketi yakalamak için bir hücre satırı.
Tahlil kolayca manipüle veya araştırmacı gereksinimlerine uyacak şekilde özel olarak tasarlanmış. Ancak, önce deneme dikkate dört temel soru vardır. Ne genel veya belirli soru (lar) olduğundan/cevap vermeye investigator(s) misin? Bu araştırma odaklı çoğu hipotezler için geçerlidir; Ancak, birçok parametreleri doğru gerekiyordu ve tamamen cevap soru (lar) belirleyecek çünkü bu tahlil için kritik öyle. Ne hücre satırı veya satırları (birden fazla) hücresinde okudu olmak fizyolojik sistemini temsil için kullanılmalıdır? Kutanöz bir yara Örneğin, şifa çalışması, dermal fibroblast5,6,7, kök hücre8veya epidermal keratinosit9 normalde bulunan hücre popülasyonlarının temsil etmek için kabul edilebilir Cilt doku10bolluk içinde. Alternatif olarak, nötrofiller, makrofajlar veya diğer inflamatuar hücre hücre göç cilt doku10içinde yara iyileşmesi bir diğer bileşenleri temsil etmek için bu sistemde değerlendirilmiş. Ayrıca, değerlendirilen belirli hücre kültürünü tanıtan hangi reaktifler hücre metabolik aktivite tanıtmak için kullanılacak en uygun alanları tespit etmek için yardımcı olacaktır. Nasıl hücre göç izlenen/yansıma olacak mı? Hücre geçiş bir tabak ya da cep şişesi içinde gözlemlemek için kullanılan teknikler vardır. Örneğin, boyama veya fluorescently hücreleri etiketleme ve hücre izlemek için floresan veya confocal Imaging kullanarak hücresel vs hücresel olmayan yerleri ve hücresel hareketi11 açıkça tanımlamak için Dedektif sağlar güçlü bir kontrast sağlar . Bu çalışmada, açıklanan başka bir ortak teknik faz kontrast6,7ile ters ışık mikroskobu kullanmaktır. Hücre boyalar ve floresan bu alternatif ölümcül hücreleri görüntüleme önce düzeltmek zorunda kalmadan parça hücreleri yaşamak kullanıcı ve ayrıca bireysel wells zaman puan arasında yaralı monolayers hücre içeren aynı görüntüleri yakalamak için izin verir. Ne sonuç ölçer çözümlemesi için kullanılan? Görüntüleri kullanarak, çalışma, veri değişiklikleri hücresel geçiş oranları için anlaşılabilir oluşturulabilir toplandı. Laboratuarımıza ters ışık mikroskobunun yakalanan mikroskobik görüntüleri görüntü analiz yazılımı için yüklenir ve yüzde yaranın kapanması ve eğri (AUC) altındaki Toplam alan hesaplanır.
Biz özel kullanım dermal fibroblast geçiş bilinen çevre kirletici, arsenik huzurunda yapılan değişiklikler aydınlatmak için bu testin vurgular. Arsenik Yerkabuğu içinde bulunan doğal olarak meydana gelen bir madene var. Çeşitli yerlerde bu konumlar yaşayan bireyler için riski arsenik düzeyleri ile tespit edilmiştir. Sonuç olarak, yiyecek ve su kaynakları için arsenik maruz olur bireyler için olasılığını artırır arsenik kirlenme düzeyleri artmıştır gösterilmiştir. Çevre arsenik maruz kalma insan nüfusu yukarıda veya bile aşağıda mevcut ABD Çevre Koruma Ajansı (USEPA) Max geçen madde düzeyi (MCL) 10 app (10 µg/L)12, içinde uzun vadeli sağlık sonuçları için gösterilen 13. USEPA bu MCL ayarla ve sınırları içmek için güvenli olarak kabul rağmen bu sınırı aşmasına arsenik konsantrasyonu Su kaynaklarında dünya çapında nadir değildir. Güneybatı Amerika Birleşik Devletleri'nde çok sayıda toprak-su, kuyu suyu ve yaylar arsenik14düzeyde ile ilgili içeren için belgelenmiştir. Örneğin, Verde Valley, AZ, Montezuma iyi 210 µg/L arsenik15içerir. Yeraltı suyu Verde River, AZ çevresinde 16 µg/L arsenik ortalama 1.3 mg/L15,16ulaşan en yüksek değerlerle içerir. Özellikle, birçok Wells Verde nehir su döken arsenik konsantrasyonu 50 µg/L15,16uzun. Bu bilgiyle, çevre ilgili arsenik konsantrasyonu edildi14,15,16 MCL 10 µM (750 App) mevcut, yukarıda çalışmaya o Aralık MCL 0,1 µM (7,5 App), yönü aşağıdan seçerek , 17 , 18 , 19 , 20 .
Bu deneylerden toplanan bilgiler arsenik ile kontamine yara bir vivo içinde hücresel geçiş oranları için olası değişiklikler erken bir göstergesi olarak kullanılacaktır. Daha sonra yara iyileşmesi ve hücresel geçiş kolaylaştıran rollerini temel sinyal molekülleri seçilebilir ve geçerli tamamlandıktan sonra gelecek nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) dayalı gen ifade deneyler ayarlanabilir çalışmalar. Bu tahlil geçiş oranları huzurunda arsenik değiştirirseniz, hücresel geçişinde belirli bir gen düşman hedefi arsenik zararlı etkileri için hedef olabilir ve böylece bozulma mekanizması olabilir.
Protocol
1. bir biyogüvenlik II kabine (BSC) hazırlanması
Not: Bu protokol için açıklanan yöntemleri aseptik teknik elde etmek için iyi laboratuar uygulamaları kullanırken kişisel koruyucu ekipman ile yapılmalıdır.
- Çalışma yüksekliği BSC koruyucu cam asansör ve laminar akış taraftarlara açın.
- Çalışma alanının bir sıhhi tesisat Temizleme gerçekleştirmek için % 70 isopropanol sulu çözüm kullanın. BSC arka duvarı ve yan duvarlar silin ve taban plakası aşağı çalışır.
- % 70 alkol (isopropanol veya alkol) ile tahlil kullanılan ve yer onları içinde lisans tüm malzemeleri Sil.
2. insan Dermal fibroblastlar bir T75 şişesi tohumlama
- Şişeleri istenen cryopreserved hücre kültürünü (yenidoğan insan dermal fibroblastlar [hDFn], 500.000 hücreler/flakon hücre konsantrasyonu ve geçiş p3-p5) ile elde edilir.
- Bir şişe hücrelerle 1.0 cm derin su banyosu 37 ° C'de çözdürme izin vermek için yerleştirin. Hücre çözümü yaklaşık % 70'i sıvı kadar şişe çözülme. % 70 alkol ile şişe aşağı silin ve şişe şişe raf BSC içine yerleştirin.
Not: su ile temas konu veya tohum hücre sırasında olası kontaminasyonu önlemek için şişe kapağı gelmez olun. Tam hücre suda çözdürme önlemek banyo gibi aksi halde kasıtsız hücre ölümüne neden olabilir.
- Bir şişe hücrelerle 1.0 cm derin su banyosu 37 ° C'de çözdürme izin vermek için yerleştirin. Hücre çözümü yaklaşık % 70'i sıvı kadar şişe çözülme. % 70 alkol ile şişe aşağı silin ve şişe şişe raf BSC içine yerleştirin.
- 10 mL % 10 ile desteklenen medya dışarı Fetal sığır Serum (FBS) çizin. Bir otomatik pipettor ve 10 mL pipet ucu T75 doku kültürü şişesi Aspire için kullanın. Medya tamamen şişeye Bankası yavaşça ileri geri şişeye rock yaparak emdirmek izin.
- Hücre hücre zarlarında pipetting hızına, dikkatli olmak şişe, hisse senedi ve Aspire edin çözümden ile açık şişe dondurma etkilenebilir.
- Hücreleri bir T75 doku şişesi ile kitle iletişim araçları aktarın. Çözdürülen hücre doku şişesi tekrar pipetting hızını dikkatli olmak dışarı atmak.
Not: yoğunluğu hücre doku şişesi içinde tohum 6.600 hücreler/cm2olmak yaklaşık olarak. Yoğunluk tohum kullanıcı ve deneme istediğiniz zamanlama sağlamak üzere değiştirilebilir. - 1 mL T75 doku şişesi ortamdan dışarı ölçmek ve birim şişeyi aktarın. Cilt şişe geri T75 şişesi aktarın.
Not: Bu adımı gerçekleştirmek hücre verim şişeyi üzerinden en üst düzeye yardımcı olur. - Doku kültürü şişesi kap sıkın ve hafifçe düzgün süspansiyon hücrelerde tüm yüzeyi boyunca dağıtmak için rock. Ters bir mikroskop kullanarak hücreleri eşit dağılımı için kontrol edin.
- Etiket şişesi hücre tipi, Tarih, baş harfleri, soy ve amaç (örneğin, hDFn, 07/11/2018, NDC, Bölüm 4, arsenik sıfırdan tahlil). 37 ° C ve % 5.0 CO2 oksijen bir kuluçka 72 h için doku kültürü şişeye koyun.
Not: Büyüme orta değişen 12-24 h ilk eser miktarda Dimetil sülfoksit (DMSO) cryopreservative Ekim tarihi sonra olmalı ve sonra her 48 saat ondan sonra hücrelerin düzgün beslenmesini sağlamak için değişti. Kuluçka ve büyüme dönemi kazı-kazan tayini için gerekli hücreleri hesaplanan sayısına bağlı olacaktır. Katlama hDFn hücreleri genellikle 16-24 h normal şartlar altında zamanı. Ancak, katlama oranı yükselmesi, pH, sıcaklık, nem, ortam türü, vbnedeniyle değişebilir ve için deneyler planlarken muhasebesi gerekir.
3. Hücre sayımı ve 12-iyi doku içine alt kültür kültür plaka
- T75 doku kültürü şişeye kuluçka almak. Yapıştırılan hücre 10 X objektif büyütme oranında (100 X toplam büyütme) ters bir mikroskop kullanarak gözlemlemek ve yaklaşık hücre izdiham belirlemek.
- En iyi temsil eden yüzde sağlamak için izdiham gözlemleyerek yaklaşık olarak doku kültürü şişeye çoğunluğu tarayacak. Tek hücre morfolojisi bakteriyel ve/veya mantar kirlenme veya herhangi bir anormallik için değerlendirin.
- Otomatik pipettor 10 mL pipet ucu ile bir araya getirin. T75 ve transfer çözümden medyaya bir atık konteyner tam hacmi Aspire için pipettor kullanın. Damlalıklı ipucu hücre yapışan yüzeyine temas önlemek. Pipet ucu bir biohazard depo gözündeki atmak.
- Otomatik pipettor 5 mL pipet ucu ile bir araya getirin. 5 mL dengeli tuz solüsyonu de Aspire edin, şişeye dağıtmak ve yavaşça aşırı medya, ölü hücreleri ve atık ürün durulama şişeye rock.
- T75 ses çizmek ve atık konteyner içine dağıtmak. Pipet ucu biohazard çöp kutusuna atın.
- 5 mL pipet bağdaştırıcımda otomatik pipettor bir araya getirin. Tripsin stoktan 2 mL Aspire edin, şişeye dağıtmak ve yavaşça enzim yapıştırılan hücrenin üzerine dağıtmak için balonun rock. Tam doygunluk yapisan yüzey olun. Yer 2-3 dakika (en az) için kuluçka doku şişeye.
Not: En fazla enzim-substrat reaksiyon 10 dk aşmaması gerekir. - Doku şişeye 10 X objektif lens büyütmede (100 X toplam büyütme) ters bir mikroskop altında gözlemlemek. Hücre dekolmanı kolaylaştırmak için nazik titreşimler uygulanır.
- % 70 alkol ve BSC içinde yer T75 şişeye silin.
- Otomatik pipettor 5 mL pipet ucu ile bir araya getirin. 5 mL stok medyadan de Aspire edin ve enzim-substrat reaksiyon durdurmak için T75 doku şişeye ekleyin. Medya: tripsin oranı 3:1 olmalıdır. Damlalıklı şişeye tabanı yukarı ve aşağı 2 - 3 kez durulayın ve reaksiyon durdurdu emin olmak için. Tam birimin şişesi ve transfer steril 15 mL konik tüp içine sıvı Aspire edin.
- İkinci bir 15 mL konik tüp özdeş bir medya hacmi ile doldurun.
- Her iki 15 mL konik tüpler bir başka tersi bir konuma yerleştirin. Merkezkaç kuvveti 25 ° C'de 5 min için 200 gr malzemeler çalışan parametreleri ayarlayarak uygulayın.
- % 70 alkol ile pelleted hücrelerle 15 mL konik tüp silin ve BSC yerleştirin.
- Damlalıklı medya, sıvı ve hücre Pelet yaklaşık 250 µL bırakarak kapalı 5 mL bağlanma ile otomatik pipettor kullanın. Hücre Pelet bozulmamış kalması gerektiğini damlalıklı uç konumuna dikkat. Birimin bir atık konteyner içine toplanan dağıtmak ve biohazard bin ipucunda atın.
- Microcentrifuge tüp raf konik tüp alt rahatsız ve ("yan yatan raf" de denir) hücre Pelet yeniden askıya almak için hızlı bir titreşim oluşturma şişe Yuvaları çalıştırmak için kullanın.
Not: Bu adımı gerçekleştirmek için bir girdap Mikser kullanmaktan kaçının. Girdap karıştırıcılar tarafından oluşturulan yerçekimi Kuvvetleri hücre g-force eşikleri aşıyor ve lysing neden olabilir. Düzgün tamamlandığında, yeni hücre çözümü yok kalan Pelet ile bulutlu bir karışımı olarak görünecektir. Bu adımı gerçekleştirmek gerekli özen oftentimes hücre sayım sırasında yüksek doğruluk için önde gelen bir tek hücre süspansiyon oluşturur. - Medya 2 mL hücre hisse senedi veya resuspension ekleyin. Damlalıklı hücreleri nazikçe aşağı tüp 20 yan kez herhangi bir kümeleri kadar kırmak için. Toplam hücre süspansiyon ses kayıt ve bir kenara koyun kısaca.
- Damlalıklı 20 µL Trypan mavi stok (% 0,4) 96-şey plaka boş bir kuyunun içine steril damlalıklı kullanarak.
- Bir tek tip hücre süspansiyon transferi önce oluşturmak için hisse senedi hücre çözümü karıştırın. Steril damlalıklı ipucu (tüp duvarlara dokunmadan kaçınarak) hücre stokunun 20 µL kaldırmak için kullanın. Trypan mavi çözüm 96-şey plaka 20 µL ekleyin.
- Damlalıklı içeriği karışımı yavaşça. Damlalıklı 10 µL coverslip ve sayım arasındaki karışımı odası üzerinde hemasitometre.
- Hücreleri ve kılavuz 10 X amaç altında gözlemlemek. Görüş alanı içinde dokuz büyük kareler gözlemlemek. Merkezi ve 4 köşe kareler (Toplam 5 kare) hücreleri saymak.
Not: hücreleri bir tekdüze dağılım için doğru bir sayacı emin olmak için tüm ızgara üzerinde bakın. - Tüm hücreleri (şeffaf ve mavi) kılavuzunun 5 tanımlanan meydanlarda taksitli. Ayrı ayrı, aynı 5 kare nonviable (mavi) hücrelerde taksitli.
- Geçerli hücre sayısı kullanarak hesaplama:
nerede x geçerli hücre sayısı, bir = toplam hücreleri, b = sigara-hücrelerin = - Geçerli hücre yoğunluğu kullanarak hesaplama:
nerede x geçerli hücre yoğunluğu ve y = toplam hücrelerin toplamı =. - Toplam hücrelerin Hesapla:
nerede x toplam hücrelerin, y = geçerli hücre yoğunluğu, f = hücre süspansiyon hacmi (mL) =. - % Hücre canlılığı Hesapla:
nerede x yüzde hücre canlılığı, y = hücrelerin kılavuz, f sayılan = = toplam hücre kılavuz üzerinde sayılır.
- Alt görüntüleme sırasında başvuru işaretleri hizmet için 12-şey plaka arasında yatay bir çizgi işareti.
- Geçerli hücre yoğunluğu (3.3.7 içinde hesaplanan) 12-iyi doku kültürü plaka tohum için hücre stokta sulandırmak için medya hacmi hesaplamak için kullanın.
Not: yoğunluk hDFn hücreler için tohum en iyi 5. 000 hücre/cm2hücredir. - Hücre stok 19.000 hücre/ml seyreltik medya kullanarak ve her şey cep stokunun 1 mL ile temel olarak belirler. Düzenli olarak karşıdan karşıya tüm 12 kuyu tohum bile hücre sağlamak için hücre stok karıştırın.
- Her plaka hücre tipi, soy, kullanıcı adının baş harfleri ve amacı ile etiketleyin. Yer kaplamalar kuluçka 37 ° C ve % 5.0 CO2olarak ayarlayın. Hücreleri % 100 izdiham sıfırdan tahlil için elde kadar büyümeye izin.
- Geçerli hücre yoğunluğu (3.3.7 içinde hesaplanan) 12-iyi doku kültürü plaka tohum için hücre stokta sulandırmak için medya hacmi hesaplamak için kullanın.
4. arsenik (As) hisse senedi çözümleri ve hesaplamalar
- Sodyum arsenite (NaAsO2) doğrudan hücre kültür medya % 10 oranında seyreltin FBS 10, 1.0, 0,1 ve 0,01 µM olarak çalışma konsantrasyonlarda.
- Bunun için çözüm olarak medya 30 mL sodyum arsenite 3,9 mg sulandrarak bir ilk 1 mM stok yapmak. Seri olarak çözümler olarak kalan için 1 mM hisse oranında seyreltin.
| 1000 µM hisse senedi olarak Hesaplamalar | Hisse senedi konsantrasyonları çalışma arsenik | M1V1M2V2 = | Önceki arsenik çözüm hacmi | Medya hacmi | Arsenik hisse senedi çalışma hacmi |
| NaAsO2 molekül ağırlığı: 129.9 g/mol | 10 µM olarak | (x mL) (1000 µM) = (30 mL)(10 µM) x 0.3 mL = | 0.3 mL = 300 µL çözüm olarak 1 mm | 29,7 mL medya | 30 |
| .03 L x *.001 mol/L x 130 g/mol arsenik 3,9 mg = | 1.0 µM olarak | (x mL) (10 µM) = (30 mL)(1 µM) x 3 mL = | çözüm olarak 10 µM 3 mL | medya 27 mL | 30 |
| Sodyum arsenite 3,9 mg 30 mL medya içine sulandırmak | 0,1 µM olarak | (x mL) (1 µM) = (30 mL)(0.1 µM) x 3 mL = | 3 mL 1 µM | medya 27 mL | 30 |
| 0,01 µM olarak | (x mL) (0,1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) x 3 mL = | 3 mL 0,1 µM | medya 27 mL | 30 |
Tablo 1. Arsenik hisse senetleri ve seri dilutions. Bu tablo As hisse senedi çözümleri ve tedavi grupları için hisse senedi çözümleri çalışma oluşturmak için kullanılan hesaplamaları açıklar.
5. tahlil tekniği ve arsenik kirlenme kazı kazan
- 12-şey plaka hücrelerle kuluçka makinesi elde etmek. Hücreleri bir 10 X objektif büyütme (100 X toplam büyütme) görüntüleyin. Hücre izdiham içinde her şey belirlemek.
Not: %100 izdiham tırmalamak önce ulaşmak her bireysel iyi gerekir . Bu kritik adım tahlil içinde tutarlılık sağlar ve tahlil protokolleri deneyler standartlaştırmak yardımcı olur. Herhangi bir kuyu % 100 izdiham ulaşmış olamaz, bütün wells % 100 izdiham gelinceye ek süre kuluçkaya hücrelere izin. Ek büyüme zaman zaten % 100 izdiham ulaştınız Wells etkilenmez. Konfluent hücreleri genellikle büyüme tutuklandı olmak ve % 100 izdiham ulaşmak alt Konfluent wells izin verirken bir monolayer kültür olarak kalır. - Otomatik bir pipettor 10 mL pipet ucu ile bir araya getirin. Bütün wells büyüme medyadan Aspire edin. Sıvı atık hacmindeki ve biyolojik Kutusu'ndaki pipet ucu atın.
- P200 pipettor 1-200 µL steril ucu ile bir araya getirin. Her şey, bir çizik bile "sahte yara" ucu hücre yüzey üzerinde bir saat 12-' 06: 00 konuma kayma tarafından üretmek.
Not: tutarlılık büyük ölçüde etkileyen üç hız, basınç ve uç açısı faktörlerdir. Çizik hızla, plaka tabanına dik kalan uç açısı dikkatli olmak süre sabit bir basınç ile yapılmalıdır. Çok yavaş tırmalamak eğri çizgiler neden olur, o aşırı basınç kalıcı olarak hücre yapışan yüzeylerin ve bir uç açısı 90 ° sıfırdan genişliği daralır daha az. Herhangi bir bu ortak hataları değişmiş geçiş oranları ve desenleri neden olabilir. - Uzak aşırı enkaz ve hücre kümeleri ile 1 mL dengeli tuz solüsyonu başına iyi durulama temizleyin. Rock plaka için yıkama kolaylaştırmak için yan. Dengeli tuz solüsyonu kuyulardan kaldırmak ve atık bir kapta atmayın. 5 mL pipet ucu biyolojik çöp kutusuna atın.
- P200 pipettor 1-200 µL steril ucu ile bir araya getirin. Her şey, bir çizik bile "sahte yara" ucu hücre yüzey üzerinde bir saat 12-' 06: 00 konuma kayma tarafından üretmek.
Şekil 1: sıfırdan testin şematik gösterim. Tüm iş bulaşma olasılığını azaltmak için aseptik bir alan içinde yapılır. Hücre, doku kültürü şişeler istenen dansitesi tohumlari ve insan fizyolojik koşullar (%5 CO2, 37 ° C) ayarla bir kuluçka yetiştirilen. İstenen bir izdiham ulaştıktan sonra hücre aseptik istenen bir tohumlama yoğunluk itibariyle 12-iyi doku kültürü tabak içine alt kültürlü. Hücreler 12-şey plaka ve çizilmiş bir steril damlalıklı ucu kullanarak her şey % 100 izdiham için yetiştirilmektedir. Bu "scratch" hangi hücrelerin doğal olarak açık alanını kapatmak için geçiş (çift başlı ok tarafından belirtilir) bir vitro sahte yara, oluşturur. Her şey benzersiz olarak şartına ve hücresel geçiş oranları gözlenen ve farklı tedavi koşulları karşılık olarak sayılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- P1000 pipettor 1000 µL ucu ile tedavi grubu ile rasgele atanmış olan kuyu içine arsenik stokları damlalıklı 1.000 µL için kullanın. Her şey için yeni bir damlalıklı ipucu çapraz kontaminasyonu önlemek için kullanın. Tedaviler eklendiğinde zaman kaydetmek. 12-şey plakaları 37 ° C ve % 5.0 CO2adlı ayarla bir kuluçka yerleştirin.
6. görüntüleme
- Yakalama yansımaları her 10 X büyütme objektif bir 24 Saat süre içinde (0, 4, 8, 12, 16, 20 ve 24 s) her 4 h iyi. Daha önce alt plaka çizik içinde sonraki zaman puan her kuyuda boyunca aynı konuma resim çizilen çizgi başvuru.
Not: aynı yerlerde her zaman noktada doğru görüntü analizi için izin vermek için ve temsilcisi verileri elde etmek için fotoğraflandı zorunludur.
7. görüntü analizi
- Bir bilgisayara ters ışık mikroskobu üzerinde yakalanan görüntüleri yüklemek ve detaylı dosya adıyla bir JPEG görüntüsü olarak kaydedin.
- ImageJ açın.
- Bir sahne mikrometre ile bilinen mesafeler görüntüsünü piksel görüntü ölçümler dosya yazılım penceresinin içine bırakarak çekerken milimetre (mm) dönüştürmek için yazılım yüklemek.
Not: Görüntü hücre görüntüleri yakalamak için kullanılan aynı büyütme oranında alınmalıdır ve mikrometre bilinen 1 mm uzunluğu tirelemeye çizgiye sahip olmalıdır. Örneğin, 100 X toplam büyütme görüntüleri alındı bu çalışmada, böylece 100 X toplam büyütme sahne mikrometre görüntüsünü almıştır.- Düz, Segmentedveya Serbest çizgiler seçenekleri'ni tıklatın.
- Bir bilinen mesafe mikrometre görüntü uzunluğu her kene ilişkili onay işaretleri kullanarak çizgiyi işaretleri. Düz bir çizgi çizmek için: fare tıklatın, tutun, imleci istenen konuma sürükleyin ve sonra fare bırak.
- Analiz ardından Ölçeği ayarlaseçin.
- Mesafe bilinen bilinen önceki adımda çizilen çizgi uzunluğunu ayarlayın.
- Birim uzunluğu mmiçin ayarlayın.
- Küresel kutuyu kontrol et.
- Menünün dışına çıkmak için Tamam ' ı seçin.
- Sahne alanı mikrometre görüntü dışarı kapatın.
- Bir kazı-kazan tahlil resim ImageJ sürükleyip bırakarak görüntü dosyası penceresine yüklemek.
- (Dan doğru öncü için sol öncü) çizik genişliği boyunca düz bir çizgi çizmek.
- A harfi çizilmiş düz çizgi ölçümü kaydetmek için klavyede basın. Küçük bir sonuçlar pencere hemen aharfi yazdıktan sonra görünür. Genişlik ölçüm nerede olacak.
- 7.4 toplam 10 ölçümleri çizik uzunluğu boyunca elde etmek için 10 kez yineleyin.
Not: En temsili genişlik değerleri çizik tüm uzunluğu aşağı oluşturmak önemlidir. 10 Genişlik ölçüleri eşit üst sıfırdan yukarıdan aşağıya doğru uzunluğu boyunca dışarı uzay emin olun. - Kopyala Yapıştır ölçümleri için sıfırdan tahlil elektronik tablo dosyası oluşturun.
- Kopyala Yapıştır 10 Genişlik ölçüm sonuçları penceresinden uygun sütun elektronik tablo dosyasındaki (Tablo 2).
Not: ölçüm sonuçları penceresinden kopyalanır ve elektronik tabloya yapıştırılan zaman, orada olacak yabancı sütunlarının değerleri; Bu değerler, yalnızca 10 Genişlik ölçüleri koruyarak silinmesi gerekir.
- Kopyala Yapıştır 10 Genişlik ölçüm sonuçları penceresinden uygun sütun elektronik tablo dosyasındaki (Tablo 2).
| 10 rasgele genişlik ölçüleri | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| Ortalama 10 ölçümler |
Tablo 2. Ham genişlik ölçüleri biçimi masa. Bu tablo elde edilen ham ölçümleri kuruluş yapısını gösterir.
- Kazı-kazan tahlil görüntüleri geri kalanı için yukarıdaki adımı yineleyin.
- Her şey için her zaman noktası (0-24 h) 10 ölçülerde ortalamasını hesaplamak.
- Yüzde değerleri adım 7,8 kullanarak hesaplamalar kapanış belirlemek.
- Elektronik tablo "Genişlik ölçüm Ortalamalar" başlıklı alt kısmında bir tablo (Tablo 3).
- Kopyala ve Yapıştır Ortalama olarak 10 ölçümleri satır hesaplanabilir 7,8 "Genişlik ölçüm ortalamasını alır" tabloya adım.
- Genişlik ölçüm Ortalamalar tablosunun yanındaki başka bir tablo oluşturun. Bu başlık Yüzde yara kapatma (Tablo 4) masa.
Not: ilk 0 h fotoğraf bütün kuyuları için kapalı % 0 sıyrık çünkü her şey için 0 h sütunundaki değeri 0 olmalıdır. - Sonraki sütuna (4 h) gidin.
- 4, 8, 12, 16, 20 ve 24 h zaman puan için yüzde kapatma Hesapla:
nerede, x = yüzde kapatılması, ben ilk karalama genişliği (0 h genişlik) = f son kazı-kazan genişliği (4, 8, 12, 16, 20, 24 s genişlik) =.
| De genişlik ortalamalar | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | |||||||
| 2A | |||||||
| 3A | |||||||
| 4A | |||||||
| 1B | |||||||
| 2B | |||||||
| 3B | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tablo 3. Genişlik ölçüm ortalamasını alır tablo biçiminde. Bu tablo Tablo 2' de ham genişlik ölçüleri kullanılarak hesaplanan genişlik ölçüm Ortalamalar kuruluş yapısını gösterir.
| İyi | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | 0 | ||||||
| 2A | 0 | ||||||
| 3A | 0 | ||||||
| 4A | 0 | ||||||
| 1B | 0 | ||||||
| 2B | 0 | ||||||
| 3B | 0 | ||||||
| 4b | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2c | 0 | ||||||
| 3c | 0 | ||||||
| 4c | 0 |
Tablo 4. Yüzde kapatma tablo biçiminde yara. Genişlik ölçüm kullanarak Tablo 3' te ortalama yüzde yara kapatma değerleri hesaplanan organizasyon yapısı bu tablo gösterir.
- Yüzde yara kapatma tablosunun yanındaki başka bir tablo oluşturun. Bu başlık masa AUC (Tablo 5).
- 0-4 hesaplamak s alanı altında eğrisi (AUC) değeri 0-4 s sütun her şey için:
nerede x = 0-4 s AUC değeri, bir % kapanış değeri 0 h, b = % kapanış değeri 4 h, h = iki önlem (Bu çalışmada 4 h) arasındaki süre =. - 4-8 h alanı altında her şey için 4-8 h sütununda eğrisi (AUC) değerini Hesapla:
Nerede x 4-8 h AUC değeri, bir = % kapanış değeri 4 h, b = % kapanış değeri 8 h, h = iki önlem (Bu çalışmada 4 h) arasındaki süre =.
Not: Bir AUC değeri her 4 h zaman aralığının her şey için 24 Saat süre içinde hesaplanan. - Tüm AUC değerleri 0-24 h (adımları 7.10.1-7.10.2 hesaplanır) her şey için toplanan AUC değer almak için toplamak. Bu değerler düzgün istatistiksel analiz için kaydedilir sağlamak.
- 0-4 hesaplamak s alanı altında eğrisi (AUC) değeri 0-4 s sütun her şey için:
| İyi | 0-4 h | 4-8 h | 8-12 h | 12-16 saat | 16-20 h | 20-24 h | Toplanan AUC |
| 1a | |||||||
| 2A | |||||||
| 3A | |||||||
| 4A | |||||||
| 1B | |||||||
| 2B | |||||||
| 3B | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tablo 5. AUC tablo biçiminde. AUC değerleri Tablo 4' te yara kapatma değerleri yüzdesini kullanarak hesaplanan organizasyon yapısı bu tablo gösterir.
8. istatistiksel analiz
- En iyi deneysel tasarım ve tahlil sırasında elde edilen toplam AUC değerleri uygun istatistiksel analiz yöntemini belirleyin.
Representative Results
Örneklerin boyutu (n) tüm tedavi grupları oldu n = 28. Hücreleri başarıyla kültürlü aşağıdaki aseptik teknikler ve laboratuvar protokolleri (şekil 1) idi. Tek tip çizik tüm tedavi gruplarında ölçülür 0.8 mm 0.4 mm (Şekil 2) ortalama sıfırdan genişliği ile tespit edildi. Kontrol grubu bir ortalama toplam alanı 1,355.83 eğrisi değerinin altında vardı; Tedavi grupları olarak 0,01 µM vardı ortalama alan 1,366.21; eğri değerinin altında toplanır Tedavi grupları olarak 0,1 µM ortalama alanı 1,326.24 eğrisi değerinin altında toplanır, tedavi grubunda olarak 1.0 µM vardı ortalama alan 1,295.10; eğri değerinin altında toplanır ve son olarak tedavi grubunda istatistiksel olarak daha düşük 535.12, eğri değeri ortalama bir toplam alanında olduğu gibi tüm diğer gruplar için (p < 0,05) 10 µM karşılaştırıldığında (şekil 3). R-program istatistiksel analiz için bir tek yönlü ANOVA ile tedavi grupları (p < 0,05) arasında istatistiksel farkları belirlemek için Tukey post hoc tadil çalıştırmak için kullanılan.
Şekil 2: temsilcisi çizik tahlil görüntüleri bir 20 h dönemdeki. Görüntüleri A-D kontrol hücreleri hücresel geçişini temsil eder; görüntüleri E-H 1.0 µM kontamine hücre hücresel geçiş temsil eder; Resim ı-L 10 µM kontamine hücre hücresel geçişi temsil eder. Bu görüntülerden hücresel geçiş arsenik huzurunda yavaşladı açıktır. Diğer iki tedavi olarak grup değil "iyileşmiş vardı" kontrol görüntüleri tamamen "iyileşmiş" sıfırdan 20 h sonra gösterir. 10 µM tedavi olarak inhibe tamamen kapanmayla 24 h sonra tamamen Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: arsenik sıfırdan tahlil hücresel geçiş yavaşlatır. Görüntüleri hücresel geçiş oranları değişen arsenik konsantrasyonları huzurunda yapılan değişiklikleri gözlemlemek için 24 Saat süre içinde ele geçirildi. Pişmemiş imge (örneğin, MATLAB içinde), hangi başlangıçta ölçülen yaranın genişliği sonra hesaplanan yüzde kapanması ve son olarak (AUC) eğri altındaki alan otomatik bir yazılım kullanarak analiz edildi. Hata çubukları standart hata ortalamaya temsil eder. 10 µM olarak tedavi grubunda istatistiksel olarak bir tek yönlü ANOVA bir Tukey post hoc ayarlama ile (p kullanarak diğer tüm tedavi grupları karşılaştırıldığında istatistiksel olarak daha düşük bir AUC değer tarafından gösterilen insan dermal fibroblastlar yenidoğan (hDFn), hücresel göç yavaşladı < 0,05). İstatistiksel farklar harf "A" ve "B", R-programda mevcut kompakt mektup görüntüleme yöntemi kullanarak aracılığıyla elde edildi tarafından temsil edilir. Ortak bir mektup paylaşmayın tedaviler birbirinden istatistiksel olarak anlamlı (p < 0,05). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu testin uygulama hücresel geçiş yüksek üretilen iş ve zamanında bir değerlendirme sağlar ve doğrudan karmaşık fizyolojik sistemleri5,6,7' ye çevirmek. Bu nedenle, önerilen tezgah üstü model ayarlı ve6şifa yara çeşitli terapötik ajanlar ve çevresel toksinler etkilerini değerlendirmek için çalışmıştır. Mevcut çalışmada kullanılan arsenik konsantrasyonu çevre bilinen maruz kalma seviyeleri geniş edebiyat arama ile ilgili kabul edildi ve çeşitli veri retrospektif incelenmesi14,15, üsleri 16,17,18,19,20,21. Bu vitro sıfırdan tahlil kullanımı bu maruz kalma bir arsenik konsantrasyonu yüksek, ama çevre ilgili aralığı içinde gösterdi, gecikmiş yara kapatma (hücresel geçiş).
Bu tezgah üst model ayrıca yalıtmak ve daha fibroblast geçiş şifa sonuçları yara nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için bir tek hücre satırı (fibroblast) çalışma için istihdam edildi. Ayrıca, bu analizi ile engelleyebilir bir tek hücre satır karmaşık vivo içinde sistemleri ile diğer birçok hücre ve dokulara mevcut işlevleri çalışma zordur. Ayrıca, tahlil hangi aracılığıyla yara iyileşmesi bileşikler etkileyebilecek belirli hücresel mekanizmaları hedef için kullanılan yarı kantitatif yüzde yara kapatma verileri elde etmek için bir yol sağlar. Örneğin, sıfırdan assay olarak kullanılan hücre toplanan ve istenen bir reaktif saklanabilir ve gen ifadesinde kullanılan (mRNA sinyal) veya protein ifade deneyleri22. Bu bilgi ne sinyalleri veya proteinler büyük ölçüde değişik tedaviler (Yani, arsenik)22huzurunda hücresel geçiş değişikliklere katkı olabilir anlamak aradıkları araştırmacı için yararlı olabilir.
İnsan yenidoğan dermal fibroblastlar yara iyileşmesinde önemli rollerine dayanarak bu iş için seçildi. Ancak, bu karalama tahlil protokolü kullanarak çeşitli hücre tiplerinin uygulamaya konmuştur ve araştırma amaçlı bir dizi için. Örneğin, sıfırdan tahlil türleri çalışmak için göç inhibisyonu kemoterapi ilaçları23Onkoloji alanında içine kabul edilmiştir; iskelet kas hücre göç, yayılması ve Difüzyon24için; hücresel geçiş25bitki özleri etkisini incelemek için; ve anlamak için nasıl keratinosit geçiş ve nükleer silahların yayılmasına karşı şifa9yara katkıda bulunur. Ayrıca, Pinto ve ark. tarafından önceki bir kağıt uranyum (U) ve trombosit açısından zengin plazma (PRP) sıfırdan tahlil6kullanarak hDFn geçişi olarak etkileri değerlendirilir. Bu çalışmanın amacı için bu tahlil hücresel geçiş (U) yavaş düşünülen bir ajan gibi hücresel göç (PRP) kadar hızlandırmak için düşündüm bir ajan etkisini test olabilir ölçüde anlamak oldu. Olarak anılan çalışmalarında görülebilir ve araştırma diğer müfettişler, kazı-kazan testin uygulama tarafından çeşitli modeller26yılında kullanım için yüksek potansiyele sahiptir. Yöntemleri içinde sağlanan ayrıntı rağmen müfettişler ve deneyler farkı beklenmelidir. Örneğin, hücresel geçiş oranları büyük olasılıkla bağlı hücre kültürünü benzersiz hücre türleri için gerekli gerekli mikro ek olarak kullanımda olarak dalgalanma olacaktır. Birçok hücre verim ve canlılığı ve yardım için önemli gözlemler bu protokolü notlar olarak listelenir. Ancak, müfettişler en uygun büyüme koşulları için ve bu yöntemi takıma giren öğretim genel hücre kültür iş için kullanmak için üreticinin önerilerini izleyin önerilir.
Kazı-kazan tahlil hücresel hareketlilik çalışma için son derece çok yönlü olmasına rağmen; beklenmedik önyargıları ölçme teknikleri ortaya çıkabilir. Örneğin, ImageJ el ile hücre göç cephede izlemek için kullanırken, varyasyon doğruluk ve temsilcisi veri toplama sınırlayabilirsiniz kullanıcıları arasında var olabilir. Ayrıca geçiş cephede kör kullanıcı önyargı en aza indirmek için tedavi için okumanız gereken dikkat edilmelidir. Ayrıca, el ile geçiş cephede tanımlayan hesap hatası hücreleri ve görsel olarak yanıltıcı olabilir form odak yapışıklıklar için ulaşmak için yeteneklerini tarafından pseudopod oluşumu nedeniyle seyahat ortalama mesafe neden olabilir. Gibi bir şekilde, floresan "hücre izci" kullanımı hücre yüzeyine boya veya geçiş algılamak için nükleer proteinler istemeden hücreler zamanla hücresel geçiş ölçerken yanlışlıklar kaynaklanan giderebilir. Bu uygun olumlu ve/veya negatif kontrolleri tamamen eşek için deneme içinde kayıtlı önerilir hücre satırlarındaki tedavinin etkisi. Bu testin uygulama sınırları tanınması tamamlanması gerekir. Bu tahlil içinde vitro deneyler elde edilen hücresel geçiş sonuçlarını doğrudan vivo sonuçları. tercüme edecek garanti etmez Yara iyileştirici ve hücresel geçiş karmaşık canlı bir sistem içinde hücre tipleri ve moleküler sinyaller çok sayıda içerir; her biri şifa yanıt etkileme potansiyeline sahip.
Özet olarak, kazı-kazan tahlil hücresel geçiş yanıt ortamlar6,25değişen yüksek üretilen iş tarama sağlamak için bulundu. Biz özellikle başarıyla hücresel geçiş işleminin çeşitli çevre ilgili dozda arsenik maruz kalma sonucu olarak yapılan değişiklikleri algılamak için bu iletişim kuralı kullanıldığında. Bu veriler çalışma daha fazla ve bu tahlil ve nasıl bu yollar arsenik poz tarafından değiştirilmiş hücresel geçişinde mekanik yollar değerlendirmek için sıfırdan tahlil kullanmak için gerekçe hazırladık.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırma azınlık sağlık ve sağlık eşitsizliklerin Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası U54MD012388 altında Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Water Bath | Precision | Model 182 | |
| Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
| CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
| Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
| Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipette | Gilson | ||
| p20 Pipette | Gilson | ||
| Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
| T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
| 15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
| 5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Tissue Marker | Securline | 92167 | |
| Wipes | Kintech | 34155 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
| Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Great Value | 220-04 | |
| 96-well | Falcon | 353915 | |
| Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
| Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
| 12-well plate | Corning | 3598 | |
| Waste Beaker | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
| Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |
References
- Diegelmann, R., Evans, M. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).
- Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. Novel insights into wound healing sequence of events. Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).
- Michelson, A. Platelets. , 3rd edition, Waltham, Massachusetts. (2013).
- Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations. American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).
- Liang, C., Park, A., Guan, J. In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. , 329-333 (2007).
- Pinto, B., et al. A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied. In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).
- Pinto, B., et al. Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model. Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).
- Roubelakis, M., et al. Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).
- Shibata, S., et al. Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway. Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).
- Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. Cellular aspects of wound healing. Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).
- Gentry, P. R., Clewell, H. J. III, Greene, T. B., et al. The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).
- Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media. International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).
- Robertson, F. N. Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States. Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).
- Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA. Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).
- Uhlman, K. Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , The University of Arizona. Tucson, AZ. Arizona Cooperative Extension, AZ 1453 (2008).
- Agusa, T., et al. Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam. Science of the Total Environment. , 488-489, 562-569 (2014).
- Ayotte, J. D., et al. Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States. Science of the Total Environment. , (2014).
- Dummer, T. J., et al. Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada. Science of the Total Environment. , (2014).
- Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations. Water Research. 48, 156-169 (2014).
- Beamer, P. I., et al. Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).
- Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).
- Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).
- Harishkumar, M., et al. Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract. BioMed Research International. 13, Article ID 963457, 8 pages (2013).
- Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay? Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).
