Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lipid tolagede eksperimenter med kontakt boble dobbeltlag for Patch-Clampers

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for dannelsen af lipid dobbeltlag ved hjælp af en kontakt boble tolagede metode. En vand boble er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel, hvorved en éncellelag dannes på grænsefladen vand-olie. To pipetter er manipuleret til at forankre boblerne til at danne en tolagede.

Abstract

Lipid dobbeltlag giver en unik eksperimentelle platform for funktionelle studier af Ionkanaler, giver undersøgelsen af kanal-membran interaktioner under forskellige membran lipid kompositioner. Blandt dem, har droplet interface tolagede vundet popularitet; dog hindrer den store membran størrelse optagelsen af lav elektriske baggrundsstøj. Vi har etableret en kontakt boble tolagede (CBB) metode, der kombinerer fordelene ved planar lipid tolagede og patch-clamp metoder, såsom evnen til at variere lipid sammensætning og manipulere tolagede mekanik, henholdsvis. Ved hjælp af setup for konventionelle patch-clamp eksperimenter, kan CBB-baserede eksperimenter let udføres. Kort sagt, en elektrolyt opløsning i et glas pipette er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel fase (hexadecane), og pipette trykket opretholdes til at opnå en stabil boblestørrelse. Boblen er spontant foret med et lipid éncellelag (ren lipider eller blandet lipider), som er leveret fra Liposomer i boblerne. Næste, de to éncellelag-foret bobler (~ 50 µm i diameter) på spidsen af glas pipetter er forankret til tolagede dannelse. Indførelsen af kanal-rekonstitueres Liposomer i boblen fører til inddragelsen af kanaler i tolagede, giver mulighed for single-channel nuværende optagelse med et signal / støj-forhold sammenlignes med patch-clamp optagelser. CBBs med en asymmetrisk lipid sammensætning der let dannes. CBB er fornyet gentagne gange af blæser ud de foregående bobler og danner nye. Forskellige kemiske og fysiske forstyrrelser (fx, membran perfusion og tolagede spænding) kan pålægges CBBs. Herein, præsenterer vi den grundlæggende procedure for CBB dannelse.

Introduction

For Ionkanaler er cellemembranen ikke blot en understøttende materiale, men en partner til at generere ion flux. Funktionelt, membranen er en elektrisk isolator som ion kanaler er integreret, og alle cellemembraner er formidles med en hvilende membran potentiale. Konventionelt, blev en vilkårlig membran potentiale indført fra et eksternt kredsløb som elektrisk strøm gennem kanalerne blev målt. Denne kvantitative evaluering af ion flux på forskellige membran potentialer afslørede de molekylære egenskaber af disse kanaler, såsom deres ion-selektiv gennemtrængning og gating funktioner1,2. Membran-platform for funktionelle studier af Ionkanaler er enten cellemembranen eller lipid tolagede membran. Historisk, enkanalet elektriske aktuelle optagelser blev uropført i lipid dobbeltlag3,4, og de relevante teknikker blev udviklet for cellemembraner, som metoden patch-klemme (figur 1A )5,6. Siden da har disse to teknikker har udviklet sig separat til forskellige formål (figur 1)7,8.

Membran lipider og tolagede membraner er i øjeblikket genstand for forskning for deres roller i støtte struktur og funktion af proteiner, kanal. Derfor er klar tilgængeligheden af metoder til at variere lipid sammensætning i dobbeltlag i høj efterspørgsel. Lipid tolagede dannelse metoder såsom planar lipid tolagede (PLB)8,9,10,11, vand-i-olie droplet tolagede12og slipværktøj interface tolagede (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikker (figur 1) er fælles valg, give mulighed for at undersøge funktionen kanal under varierende lipid kompositioner20. Selv om DIB er teknisk meget lettere at producere end de konventionelle PLB, den store størrelse af DIB'EN har skabt en hæmsko for patch-clampers til at anvende det til at studere enkanalet aktuelle optagelser med sædvanlige mellemstore ledningsevne (< 100 pS).

For at omgå baggrundsstøjen, skal området tolagede minimeres. Denne sag minder om gentagelser af historie i udvikle elektrofysiologiske teknikker for lipid dobbeltlag (figur 1). I de tidlige dage, blev en små tolagede (1-30 µm i diameter) dannet på spidsen af en pipette (tip-dip metode; Figur 1 C) 21 , 22 , 23, fremfor at bruge et fritstående tolagede (~ 100 µm i diameter) på en hydrofobe septum i et kammer (figur 1B). Tip-dip metode tilladt for elektriske målinger med meget lavere baggrund støj24. Vores erfaringer med PLB-25,26, tip-dip22,23,27og patch-clamp28,29,30, 31 metoder førte os til en roman idé med at danne lipid dobbeltlag ved hjælp af principperne om vand i olie tolagede. Vi har nævnt dette som kontakt boble tolagede (CBB) metode20,32. I denne metode, i stedet for at hænge vanddråber i en olie fase (fig. 1D), en vand boble er sprunget fra et glas pipette (med tip diameter af ca. 30 µm) ind i olie fase (figur 1E og 2), hvor den boble bevares ved at anvende en konstant pres. En éncellelag former spontant på grænsefladen vand-olie på overfladen af boble. Derefter to bobler er forankret gennem manipulation af to glas pipetter, og tolagede er dannet da de to encellelag nærmer sig hinanden, giver en ligevægt tolagede område. Størrelsen af boblen er kontrolleret af de intra-boble pres (holding pres), og ligeledes tolagede størrelse. En gennemsnitlig diameter på 50 µm bruges ofte. Selv om mængden af boblen er lille (< 100 pL), den er forbundet til den større mængde af den pipette løsning, der er i området microliter, der udgør hovedparten elektrolyt fase.

Der er mange fordele ved at bruge metoden CBB (tabel 1). Som en lipid tolagede dannelse teknik, membraner i forskellige lipid kompositioner kan produceres og asymmetriske membraner er mere let dannede32 end er dem af de konventionelle folde metode33. Tolagede kan manipuleres mekanisk, i modsætning til de konventionelle PLB, der kun kan være bøjet med en hydrostatisk tryk forskel34,35. Ved at ændre bedrift pres, boblerne enten udvide eller formindske, fører til øget eller nedsat membran spænding32. Tolagede er mekanisk aftagelig i encellelag, svarende til fryse-fraktur teknik36,37 af membraner i morfologiske undersøgelser, men med CBB, en manøvre giver mulighed for gentagne løsrive og vedhæfte cyklusser32 . Den lille mængde af elektrolytten løsning inden boblen giver mulighed for effektiv fusion af kanal-rekonstitueres Liposomer til tolagede, og sandsynligheden for at få kanal optagelser er meget højere end med de konventionelle PLB teknik. Lille boble volumen tillader også hurtig perfusion (inden for ~ 20 ms) en gang en anden injektion pipette er indsat i enten af boblerne. I modsætning til metoden patch-klemme når brudt, en CBB membran er re-formes straks og gentagne gange og pipetter kan bruges flere gange om dagen. Ved at integrere fordelene patch-clamp og PLB metoder, giver CBB en alsidig platform for at variere de fysisk-kemiske betingelser af membran, giver mulighed for hidtil uset undersøgelser af kanal-membran interaktioner.

Forelægge en detaljeret protokol af CBB dannelsen processen, er fysisk-kemiske baggrunden af tolagede dannelsen præsenteret første, som vil være nyttige for patch-clampers at løse eksperimentelle problemer vedrørende membran dannelse der er stødt på.

CBB eksperimenter give lektioner af overfladekemi videnskab38. CBB ligner en sæbeboble, blæst fra en halm i luften, hvor ligeledes en vand boble er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel. Man vil bemærke, at en vand boble næppe er oppustet når membran lipider ikke er inkluderet i vand boblen eller den organisk opløsningsmiddel. I mangel af amphipathic lipider, overfladespænding på en vand-olie interface er høj, og intra-boble presset til at blæse en boble vil være høj. Dette er en erkendelse af Laplace ligning (Δp = 2 γ/R, hvor Δp er intra-boble pres, γ er overfladespænding, og R er boble radius). Når koncentrationen af lipider i enten den organiske fase eller elektrolyt opløsning er høj, tætheden af lipider i éncellelag stiger, da dikteres af Gibbs adsorption isoterm (-dγ = Γjeg dµjeg, hvor Γ,jeg er den overflade overskydende af sammensatte jeg, og µ,jeg er den kemiske potentiale af komponent jeg)39, fører til en lavere overfladespænding og lethed af boble dannelse. I CBB, tolagede kan ses fra en tangential vinkel (figur 2), og kontakt vinklen mellem éncellelag og tolagede er målelige. Denne vinkel repræsenterer en ligevægt mellem surface tensions af éncellelag og tolagede (unge ligning: γbi = γmo cos(θ), hvor γbi er tolagede spændinger, γmo er éncellelag spænding og θ er den kontakte vinkel). Ændringer i den kontaktperson vinkel angiver ændringer i tolagede spænding, da der éncellelag spændinger er vurderes ud fra ændringer i den kontaktperson vinkel som en funktion af membran potentiale (Young-Lippmann ligning: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), hvor Cm er membran kapacitans, V er membran potentiale, og θ0 og θv er de kontakt vinkler på 0 og V mV, henholdsvis)40,41 ,42. Når to bobler er tæt nok, nærmer de hinanden spontant. Dette er på grund af van der Waals kraft, og vi kan visuelt observere denne dynamiske proces i CBB dannelse.

Et CBB system består af særskilte faser: nemlig en bulk olie fase, vand bobler belagt med en éncellelag og en kontakte tolagede (figur 3). Disse er minder om flere faser observeret i en PLB, såsom en opløsningsmiddel-holdige torus omkring den tolagede og en tynd organiske fase klemt af to encellelag43,44. I CBB, éncellelag fasen er løbende med tolagede folder og lipid molekyler diffuse let mellem éncellelag og indlægssedlen. Éncellelag fasen dækker det meste af den boble overflade, der udgør den store fase, der fungerer som et lipid reservoir. Fordi den hydrofobe hale af lipider i éncellelag udvider udad til bulk olie fase, åbner kraterets tolagede eller den hydrofobe core til bulk olie fase. En hydrofobe stof sprøjtes ind i olie fase tæt på tolagede er således let adgang kraterets tolagede. Dette er den membran perfusion teknik vi havde udviklet for nylig45, hvorved lipid sammensætning i tolagede ændres hurtigt (inden for et sekund) under single-channel nuværende optagelser. Vi fandt, at kolesterol indhold i tolagede reversibelt kunne kontrolleres ved at skifte kolesterol perfusion og slukker45. I tilfælde af, at koncentrationen af det pågældende stof i éncellelag og tolagede adskiller sig, opløses koncentration graduering af det relevante stof straks gennem diffusion, der er kendt som Marangoni effekt46, 47. på den anden side flip-flops på tværs af encellelag er langsom48,49,50.

Ved hjælp af metoden CBB, tolagede dannes under alsidig fysisk-kemiske forhold, såsom en elektrolyt pH så lavt som 1 51, salt (K+, Na+, osv.) koncentration op til 3 M, en membran potentiale så højt som ±400 mV og et system temperatur på op til 60 ° C.

Der er flere muligheder for dannelsen af CBB og indarbejdelse af kanal molekyler deri. For dannelsen af éncellelag på grænsefladen vand-olie, er lipider tilføjet enten i et organisk opløsningsmiddel (lipid-out metode; Figur 4 A, 4 C) eller i en boble som Liposomer (lipid-i metode; Figur 4 B, 4 D). Navnlig, lipid-i metode giver mulighed for dannelse af asymmetriske membraner15,32. Kanal molekyler opløseligt i vandig opløsning (fx, kanal-dannende peptider) tilføjes direkte ind i den boble (figur 4A, B)52,53, hvorimod kanal proteiner er fremstillet i Liposomer, der tilføjes derefter ind i boblen (figur 4C, D). Heri, dannelsen af CBBs af lipid-i-metoden til enten en kanal peptid (polytheonamide B (pTB); Figur 4 A) eller et protein (KcsA kalium kanal, figur 4C) er vist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered Liposomer

  1. Sprede fosfolipider (f.eks, 10 mg pulveriserede) i kloroform ved en ønskede koncentration (f.eks, 10 mg/mL).
  2. Fordampe chloroform.
    1. Sted phospholipid løsning i en runde-bunden kolbe og sæt den på en roterende fordamper (Se Tabel af materialer) tilsluttet en N2 gas cylinder. Rotere kolben under N2 flow ved stuetemperatur, indtil en tynd phospholipid film vises (efter ~ 30 min).
    2. Åben kolben i en ekssikkator, der er forbundet med en vakuumpumpe. Brug af vakuumpumpe, Aspirér inde i ekssikkator i flere timer til at fjerne chloroform grundigt.
  3. Tilsættes en passende mængde af en elektrolyt opløsning til kolben og suspendere phospholipid for at få en 2 mg/mL phospholipid suspension.
  4. Der sonikeres suspension for snesevis af sekunder ved hjælp af et badekar sonikator (Se Tabel af materialer) at opnå en flerlaget vesikel (MLV) suspension.
  5. Til forberedelse af proteoliposomes, der indeholder ion-kanal proteiner, tilføje en protein løsning (med proteiner oploeses ved hjælp af passende vaske-og rengøringsmidler; 2% volumen er maksimalt) til MLV suspension og Læg instrumenterne i ultralydsbad i flere sekunder ved hjælp af Bad sonikator.

2. klargør store-Bore glas pipetter

  1. Sat et glas kapillær til en pipette aftrækker og fabrikere Mikropipetter med en fin tilspidset spids gennem to-trins trække.
  2. Sæt mikropipette på en microforge og kontakt spids af mikropipette til en platin glødetråd på den koniske del med en diameter på 30 til 50 µm.
  3. Varme glødetråden kort (5 s) og straks slå det fra.
    Bemærk: Denne manipulation former et knæk på varmen punkt, hvor spidsen af mikropipette er afskåret, forlader en bred boring med en diameter på 30 til 50 µm.

3. behandle overfladen af glas dias med en lavvandet konkave brønd (Siliconization for en vandafvisende overflade)

  1. Rengøre overfladen på glas dias med en lavvandet godt med destilleret vand og ethanol.
  2. Anvende en passende mængde (fx, 100 µL) en siliconizing reagens (vandafvisende) på hul dias glas.
  3. Kemisk reagens helt i luften.
  4. Placer glas dias på scenen i en inverteret mikroskop.

4. udgør CBB og udføre elektrofysiologiske målinger

  1. Tilføj 100 µL af hexadecane i lavvandede brønden Silikoniseret hul dias glas.
    Bemærk: For metoden lipid-out fosfolipider er spredt i hexadecane (20 mg/mL) på forhånd.
  2. Fylde elektrolyt opløsning op til halvdelen af længden af mikropipette, ved hjælp af en tuberkulin sprøjte.
  3. Indstille mikropipette mikropipette holderen med en presset port, så Ag/AgCl wire elektrode til at suge ind i pipette elektrolytten løsning til.
  4. Tilsluttes en mikropipette indehavere af hoved scenen af en patch-clamp forstærker og den anden til elektriske jorden.
  5. Tilslut et microinjector pres-port mikropipette indehaveren.
  6. Angiv mikropipette til en passende position over scenen i en inverteret mikroskop ved at manipulere micromanipulator.
  7. Justere forskydningen af elektrode potentielle.
    1. Sted 1 µL af den samme elektrolytten løsning bruges til at fylde mikropipette på den flade del omkring den lavvandede godt hul dias glas, oprettelse af en elektrolyt dome.
    2. Suge spids af begge Mikropipetter ind i elektrolytten dome ved at manipulere micromanipulator.
    3. Justere elektrode offset potentiale af patch-clamp forstærker.
    4. Bekræfte den korrekte forskydning i slutningen af eksperimenter ved at bryde CBB via anvendelse af en høj membran potentiale (elektriske opdeling, ved hjælp af Zap på forstærkeren), forårsager to bobler for at være smeltet ind i en (boble fusion).
    5. Rette flydende junction potentielle54 i de tilfaelde, hvor asymmetriske elektrolyt løsninger anvendes, således at den beregnede værdi føjes til den anvendte membran potentiale for den sande membran potentiale.
      Bemærk: Flydende krydset potentielle beregnes ved hjælp af programmet JPCalc55.
  8. Tegne Liposom løsning fra spidsen.
    Bemærk: Når vandopløselige kanaler undersøges ved hjælp af metoden lipid-out, sugning af Liposom løsning er ikke nødvendigt.
    1. Sted 1 µL af Liposom løsning på den flade del omkring den lavvandede godt hul dias glas (Liposom-holdige dome).
    2. Manipulere micromanipulator og Indsæt spidsen af mikropipette i Liposom-holdige kuplen.
    3. Opsug den Liposom-holdige løsning ved at sænke trykket inde mikropipette indehaveren ved hjælp af microinjector.
    4. Gentag proceduren for de andre pipette.
  9. Manipulere micromanipulator og dyppe spidsen af mikropipette i hexadecane i den lavvandede godt.
  10. Blæse en vand boble langsomt ved at øge trykket indtil boblen når den ønskede størrelse (fx, 50 µm i diameter) og bevare det samme pres derefter.
  11. Kassér boblerne ved at passere spidsen gennem grænsefladen olie-luft, hvis det er svært at holde størrelsen på boblerne stabil.
  12. Gentag trin 4.8 til 4,9 indtil stabil bobler er dannet.
  13. Manipulere boblerne til at tillade kontakt mellem dem (figur 5).
    Bemærk: Nogle gange, boblerne nærmer sig hinanden spontant for at danne CBB. I andre tilfælde, boblerne er tæt men kontakte ikke hinanden. I dette tilfælde skubbe boblerne hinanden mekanisk.
  14. Finjustere presset for at opretholde boblestørrelse, fordi størrelsen kan gradvist ændre selv på konstant intra-boble pres.
  15. Indstille membranen potentiale til den relevante værdi ved hjælp af patch-clamp forstærker og vente på den kanal nuværende at dukke op (figur 6).

5. foranstaltning tolagede kapacitans

  1. Måle tolagede elektriske kapacitans (Cel) ved at anvende en rampe potentielle.
    Bemærk: Når spænding ændringen i kommandoen rampen er 10 mV/10 ms (eller 1 V/s) efterfulgt af-10 mV/10 ms, amplituden af den nuværende spring ved ændringer i skrænten svarer til læsning af værdien membrane'scapacitance (f.eks. 100 pA → 100 pF).
  2. Evaluere tolagede område af to bobler stablet på den anden og fokusere mikroskop på tolagede plan at se kanten af tolagede (figur 6).
    NOTE: Figuren tolagede er for det meste cirkulære, og området er beregnet ud fra radius.
  3. Beregne den specifikke membran kapacitans (Csp) ved at dividere den elektriske kapacitans af området tolagede (Csp = Cel/A).
  4. Beregne tolagede tykkelse (tykkelse af den hydrofobe core) ved hjælp af Dc = (εrε0) /Csp (hvor εRasmussen og ε0 repræsenterer Permittivitet tolagede hydrofobe regionen og Permittivitet af et vakuum, henholdsvis).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En typisk CBB havde en diameter på 50 µm (figur 56) og den specifikke membran kapacitans i hexadecane var 0,65 µF/cm2. Boble størrelsen var vilkårligt kontrolleret af intra-boble pres. Når små bobler er nødvendige for støjsvage optagelser, skal tip diameter være tilsvarende mindre. For eksempel, for en boble størrelsen af 50 µm i diameter, skal tip diameter være 30 µm.

Når CBB havde dannet, var kanal molekyler i vandig opløsning eller i Liposom spontant indsat i tolagede inden for et tidsrum af et par til snesevis af minutter. Indsættelse af kanalerne blev bekræftet af en trinvis forøgelse af nuværende amplitude (figur 7) under den anvendte membran potentiale. Området mindre membran (< 1000 µm2) i forhold til konventionelle PLB og DIB systemer væsentligt forbedret det elektriske signal / støj-forhold.

Aktuelle optagelser kunne fortsættes, indtil membranen blev afbrudt, og de to bobler fusioneret. Nye bobler var blæst og CBB dannet straks og gentagne gange. Pipetten kan bruges flere gange inden for en dag.

Pligt cyklus af vedhæfte og løsrive. En tolagede dannet af metoden CBB kan være opløst i to monolag. Fjern-vedhæfte af CBB kan gentages ved at manipulere de to bobler (normeret maksimalydelse på detach-attach). Denne proces blev overvåget af udseendet af kanal nuværende af pTB, en peptid kanal fra en marine svamp, som det var let indsat i lipid tolagede til at danne en monovalent kation-selektiv pore52,56. PTB kanal nuværende opstået umiddelbart efter montering af to encellelag, og nuværende blev større område med kontakt øget (figur 8). Amplituden af aktuelt var synkroniseret med detach-vedhæfte manipulation af CBB.

Single-channel målinger af KcsA kanal. KcsA kalium kanal er pH følsomme, der aktiveres af sure intracellulære pH57. Således blev elektrolytten løsning sat til at være asymmetrisk58,59,60. I trin 4.2 i CBB dannelse, blev pipette løsning af venstre side sat på pH 4, i højre side var fastsat til pH 7,525. Taktfast 4.7.1 blev en proteoliposome suspension, snarere end Liposom suspension, placeret på dias glas for aspiration i den venstre pipette. Derfor blev KcsA kanal orienteret i membranen med sit cytoplasmatisk domæne står venstre boblen. Liposomer med protein: lipid vægt-forhold på 1: 2000 er velegnet til single-channel nuværende optagelse, og dem med en 1:10 ratio er for makroskopisk nuværende optagelse.

Asymmetriske membran. En asymmetrisk lipid tolagede kan dannes ved hjælp af forskellige Liposom suspensioner for hver boble (lipid-i)15,32. Orientering af KcsA kanalen i membranen blev reguleret ved at angive en asymmetrisk løsning pH (pH 4i/pH 7ud), fører til dets cytoplasmatiske side at være mod venstre side. I overensstemmelse hermed, i venstre side var tildelt som "i" paa højre side blev tildelt som "out." For at undersøge lipid afhængighed gating KcsA kanalen, blev fire typer af CBB (herunder en asymmetrisk CBB) brugt; nemlig, PGi/PGud, PGi/PCud, PCi/PGud, og PCi/PCud (PG: phosphatidylglycerol) (figur 9). KcsA kanal udstillet stor åben sandsynlighed (> 90%) kun i PGi/PGud og PGi/PCud membraner. KcsA kanal kræver eksistensen af anioniske fosfolipider i den indre folder af membranen for en stor åben sandsynlighed26.

Figure 1
Figur 1 : Lipid tolagede og patch-clamp metoder. Forskellige metoder er blevet udviklet for at danne lipid tolagede. (A) Patch-clamp metode. B konventionelle planar lipid tolagede metode, som giver en fritstående, primært vertikalt, tolagede på et lille hul. (C) Tip-dip metode. En éncellelag på luft-vand-grænseflade er placeret på spidsen af et glas elektrode. Forskellige modifikationer er blevet udviklet. (D) droplet tolagede grænseflademetode. (E) kontakt boble tolagede metode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2 : Kontakt boble tolagede dannelse. Som en boble er blæst ind i en olie fase, overføre lipid molekyler spontant til grænsefladen vand-olie. Forskellige typer af lipider som Liposomer er inkluderet i hver boble (lipid-i), og encellelag er dannet udelukkende af de relevante lipider. Docking to encellelag genererer en asymmetrisk tolagede membran. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 : Distinct faser i kontakt boble tolagede, og dynamikken i lipider deri. Lipider foring boblen udgør en fase, hvor de hører til enten en éncellelag eller en tolagede. Flip-flop af lipider i hele tolagede er sjældne, og de asymmetriske membran bevares i lang tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4 : Levere lipider lipid-out eller lipid-i metoden. Lipider er tilføjet enten i et organisk opløsningsmiddel (lipid-out; A og C) eller i vandig opløsning som Liposomer (lipid-i; B og D). I metoden lipid-i er en asymmetrisk membran dannet. Kanal-dannende stoffer, der er opløseligt i vandig opløsning (blå), såsom peptider, føjes til en af boblerne og spontant indsat i tolagede. I metoden lipid-i er en del af kanalerne indsat i Liposomer, som er derefter smeltet til tolagede. Kanal proteiner (rød) er fremstillet i Liposomer i enten lipid-out eller lipid-i metoden, som derefter føjes ind i en af boblerne og spontant smeltet til tolagede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 5
Figur 5 : Dannelse og mikroskopisk billede af kontaktpersonen boble tolagede. Tolagede er observeret fra en tangential retning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 6
Figur 6 : Observation af tolagede til måling af området tolagede. To bobler er stablet et på den anden gennem pipette manipulation, og mikroskop er fokuseret på niveau med kontakt boble tolagede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 7
Figur 7 : Trinvis indsættelse af KcsA kanalen i kontakt boble tolagede membran. E71A mutant KcsA Channel blev brugt til at vise den øjeblikkelig afsløring af de indsatte kanaler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 8
Figur 8 : Detach-vedhæfte monolag og svar af kanaler. Et peptid kanal, polytheonamide B, blev tilføjet til en af de bobler, som blev derefter spontant indarbejdet i membranen. Når parcelhus, kanaler i membranen trak men blev bevaret på membran folder af den kanal-tilføjet side. Ved udlæg, blev kanalerne indsat i membranen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 9
Figur 9 : Dannelse af en asymmetrisk membran og kanal aktivitet afhængig af sammensætningen af indlægssedlen. KcsA kanal reguleres af sure lipider, såsom PG, i den indre folder af membranen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Konventionelle PLB Liposom patch DIB CBB
Succes rate1 høj lav meget høj meget høj
Øjeblikkelig reformability2 Ja Nej mellemliggende Ja
Asymmetriske membran Ja Nej Ja Ja
Løsning exchange langsom meget hurtig langsom hurtig
S/N-forhold3 lav høj lav høj
Membran deformation Nej Nej Nej Ja4
Mekanisk manipulation Nej Ja5 Ja Ja
Membran perfusion Nej Nej Ja Ja
Lipid kompositioner forskelligartede begrænset6 forskelligartede forskelligartede
1 Succesrate med at danne stabile lipid tolagede pr. forsøg.
2 Dannelsen af en ny membran hurtigt efter pause ned af en membran. Også er membran dannet gentagne gange.
3 Signal-støj (S/N) forhold repræsenterer den elektriske baggrund støj primære genereret fra membran kapacitans.
4 Konkave eller konvekse membran kan dannes ved at anvende forskellige indre pres mellem to bobler.
5 Kun øget membranen spændinger.
6 Fosfolipider, der kan danne giant unilamellar vesikler er gældende, men giga-seal kan ikke nås.

Tabel 1: Karakteristik af forskellige lipid tolagede membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden CBB af lipid tolagede dannelse er baseret på princippet om en vand-i-olie droplet foret af en éncellelag20. Teknisk, procedurer for at danne CBBs er let, især for patch-clamp forskere, der er dygtige i manipulere glas Mikropipetter. Den elektrofysiologiske setup nemlig den lappe klemme bruges let i CBB, når to pipette manipulatorer med microinjectors er tilgængelige. På den anden side fordi CBB er en efterfølger til den konventionelle PLB, for hvilke en stor mængde af fysisk-kemiske viden er akkumuleret8, denne baggrund samt viden om overfladekemi38 er nyttigt for driften og manipulere CBBs. CBB serverer en alsidig platform for at studere kanal-membran interplays med sin evne til ændring af kemiske sammensætning og fysiske status61. I CBB, lipider foring boblen kan diffuse frit på tværs af grænsen i den éncellelag fase og folder af tolagede, og vi har udviklet teknikker såsom tolagede Tilslut-Fjern og membran perfusion metoder45. Vi har udvidet CBBs for in vitro- kanal proteinsyntese, hvor kanal syntese blev udført i boblen, og nyligt syntetiserede kanal proteiner blev udsat for spontan overførsel til tolagede under anvendelse af en membran potentiale hvor spirende kanal funktioner af KcsA kanal var spores fra tid til at indlede omskrivning/oversættelsen af KcsA DNA62.

Blandt trinene i protokollen, opretholde boblestørrelse er kritisk. Boblerne kan langsomt svulme eller krympe spontant fordi lipid overførsel til grænsefladen er langsom og éncellelag spænding er tilbøjelige til at ændre. Især den første boble oppustet lige efter suge af Liposom løsning (trin 4.8.3 og 4.10) er svære at vedligeholde fordi éncellelag spændinger er sænket af Liposomer akkumuleret på spidsen af en pipette. Kassere de oprindelige bobler og efterfølgende dannelsen af boblerne give den stabile CBB. Visuel sporing af boble størrelsen og finjustering af pres er nødvendigt.

Der er eksperimenterende begrænsninger til metoden CBB. Selvom CBB er designet til elektrofysiologiske målinger, den elektriske modstand af tolagede for visse lipid kompositioner kan ikke være høj nok (f.eks.100 GΩ) for single-channel optagelser. For eksempel, dioleoyl fosfatidylcholin bruges ofte til Liposomer, men det danner elektrisk utætte CBBs på 25 ° C63. CBBs kan ikke selv være dannet med lipid arter hvis fase overgang temperaturen er over optagelse temperatur. CBB dannelse var svært med phosphatidylethanolamindipalmitoyl phosphatidylcholin ved stuetemperatur, men at hæve temperaturen Tm omgået problem64. I disse eksperimenter var Temperaturstyret ved hjælp af en gennemsigtig varme plade (Se Tabel af materialer) vises under diasset glas62. Fase overgang temperatur af ofte anvendte lipid diphytanoyl fosfatidylcholin er under 0 ° C og 65, og CBBs er let dannede32,45,51 i et bredt temperaturområde.

Fosfolipider af vand-olie interface leveres fra enten den lipid- og lipid metode, hvor overførelshastighed er relativt langsommere i lipid-ud end i lipid-i metode63. Derudover ukendte årsager er den elektriske modstand af tolagede membran relativt mindre med lipid-out metode end med lipid-i metode.

I protokollen (trin 4.8), en løsning af Liposomer og kanal-rekonstitueres Liposomer (1 µL) er indlæst fra spidsen af pipetten (trin 4.9 og 4.10), og resten af pipetten indeholder den tidligere fyldte elektrolytten løsning. Dette er blot for at bevare materialer, såsom lipider og kanal molekyler. Derfor, Liposomer diffuse gradvist mod den øvre pipette løsning, og efter et stykke tid, lipid koncentration på spidsen af pipetten bliver utilstrækkelig til form lipid monolag. I dette tilfælde bør frisk Liposom løsning være indsugning fra spids (trin 4.8). Denne tidsmæssige koncentrationsændring kan omgås, når det hele pipette er fyldt med den løsning, der indeholder lipider og kanal molekyler, der henviser til, at Liposomer gradvist slå sig ned i boblerne. I dette tilfælde er bobler fornyet.

Electrophysiologically, er CBB størrelse større end den i den patch klemme, hvilket giver en større membran kapacitans. Men serien modstand (den elektriske modstand i en serie af membran modstand) er meget lavere (~ 100 kΩ) end for den patch klemme (pipette modstand > 1 MΩ), hvilket accelererer hastigheden af spænding klemme og dæmper baggrundsstøjen og serien modstand fejl i spænding-fastspændt membran potentialer66,67,68. Baggrundsstøjen er en funktion af membran kapacitans og serie modstand, hvor en lav serie modstand supplerer en høj membran kapacitans, hvilket resulterer i lav baggrund støj9.

Som regel af lipid tolagede eksperimenter, bør vaske-og rengøringsmidler ikke anvendes til at vaske glas. Endnu et spor mængde vaskemiddel perturbs integriteten af tolagede. Organiske opløsningsmidler som chloroform/methanol og ethanol bør anvendes med henblik på rengøring i stedet.

Alt i alt integrerer CBB fordelene ved både patch klemmen (fx, mekanisk manipulation af membranen) og PLB (fx, evnen til at ændre lipid sammensætning af membranen). Forskellige typer af kanal-dannende stoffer og kanal proteiner har været studeret52,53,69,70. Udviklingen af denne metode er belejligt, da stadig flere forskere fokuserer på kanal-membran samspil, og CBB giver en alsidig platform for forskellige eksperimenter. Yderligere forventes eksperimentel udvikling i metoden CBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har nogen interessekonflikt at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Mariko Yamatake og Masako Takashima for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet i en del af KAKENHI grant numre 16H 00759 og 17 H 04017 (så).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer Associates Inc. Sunderland. (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. New York. (2009).
  8. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer. New York. (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. Tokyo. 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033 (2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a, Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110 (2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , Springer. New York. (2003).
  39. Butt, H. -J., Kappl, M. Surface and Interfacial Forces. , Wiley-VCH. Weinheim. (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. Miller, C. , Springer. New York. 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857 (2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , Springer. (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. Biochemistry. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. Biochemistry. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782 (2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, Suppl. 1 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochemistry. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it's a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , In Press (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 143 Lipid tolagede Patch Clamp vand-i-olie dråbe éncellelag Ion-kanal Elektrofysiologi overfladekemi
Lipid tolagede eksperimenter med kontakt boble dobbeltlag for Patch-Clampers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter