Summary
여기, 선물이 연락처 거품 bilayer 메서드를 사용 하 여 지질 bilayers의 대형을 위한 프로토콜. 물 거품 물-오일 인터페이스에는 단층은 형성 하는 그것에 의하여, 유기 용 매에 불어 진다. 두 펫은 bilayer를 형성 하기 위하여 거품을 도킹 하려면 조작 됩니다.
Abstract
지질 bilayers 수 있도록 다양 한 멤브레인에서 채널 막 상호 작용의 시험 지질 구성 하는 이온 채널의 기능 연구에 대 한 독특한 실험 플랫폼을 제공 합니다. 그 중 물방울 인터페이스 bilayer; 인기를 얻고 있다 그러나, 큰 막 크기 낮은 전기 잡음의 녹음 방해. 우리는 평면 지질 bilayer의 이점을 결합 하는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드 및 패치 클램프 방법, 지질 구성 변경 하 고 각각 bilayer 기계를 조작 하는 등 설립. 기존의 패치 클램프 실험에 대 한 설치 프로그램을 사용 하 여, CBB 기반 실험 수 쉽게 수행. 간단히, 유리 피 펫에서 전해질 솔루션 단계로 유기 용 매 (hexadecane), 날 려 및 피 펫 압력은 안정 되어 있는 거품 크기를 유지 하 고 있다. 거품은 거품에 리에서 제공 되는 지질 단층 (순수 지질 또는 혼합된 지질), 자발적으로 늘어서 있다. 다음, 두 개의 단층 늘어선 거품 (~ 50 µ m 직경에서) 유리 펫의 팁에서 bilayer 형성에 대 한 도킹 됩니다. 거품으로 채널 재구성 리의 소개 채널 신호 대 잡음 비율 단일 채널 현재 녹음 패치 클램프 기록의 비교를 허용 하는 bilayer의 이끌어 낸다. Cbb는 비대칭 지질 성분과 쉽게 형성 된다. CBB는 이전 거품 밖으로 하 고 새로운 것 들을 형성 하 여 반복적으로 갱신 됩니다. 다양 한 화학 및 물리적 섭 (예를 들어, 막 관류와 bilayer 긴장) Cbb 여기에 부과 될 수 있습니다, 그리고 선물이 CBB 형성에 대 한 기본 절차.
Introduction
이온 채널, 세포 막 하지만 되지 않습니다 단순히 지원 자료 파트너 이온 플럭스를 생성 하기 위한. 기능적으로, 막은 이온 채널 포함, 전기 절연체 이며 모든 세포 막 휴식 막 잠재력으로 헤어 하지 않습니다. 전통적으로, 임의의 막 잠재적인 채널을 통해 전기 전류를 측정 하는 외부 회로에서 부과 되었다. 다른 막 잠재력에 이온 플럭스의 양적 평가이 그들의 이온 선택 투과 등 제어 기능1,2채널, 분자 속성을 밝혔다. 이온 채널의 기능 연구에 대 한 막 플랫폼 세포 막 또는 지질 bilayer 막입니다. 역사적으로, 단일 채널 전기 현재 녹음 지질 bilayers3,4에 초연 했다 그리고 패치 클램프 방법 (그림 1A 와 같이 세포 막에 대 한 관련 기술 개발 ),56. 그 이후,이 두 가지 기술을 다른 목적 (그림 1)7,8별도로 진화 했습니다.
막 지질 bilayer 막 하 고 현재 채널 단백질의 기능과 구조를 지 원하는 그들의 역할에 대 한 연구의 초점입니다. 따라서, bilayers에 지질 구성을 변경 하는 방법의 준비 여부 수요가입니다. 평면 지질 bilayer (첨 두 부하)8,,910,11, 물에서 기름 방울 bilayer12, 드롭릿 인터페이스 bilayer (DIB)13, 등 지질 bilayer 형성 방법 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 기술 (그림 1) 일반적인 선택, 다양 한 지질 구성20에서 채널 기능을 조사 하기 위한 기회를 제공 하는. DIB는 기술적으로 훨씬 쉽게 기존의 첨 두 부하 보다 생산 하는 DIB의 대형 패치-clampers 단일 채널 현재 녹음 일반적인 크기의 전도도와 공부에 대 한 적용에 대 한 억제 만들었습니다 (< 100 pS).
배경 잡음을 회피, bilayer 영역을 최소화 해야 합니다. 이 문제는 electrophysiological 지질 bilayers (그림 1) 기술 개발 역사의 반복 회상 합니다. 초기에, 소형 bilayer (1-30 µ m 직경에서) 피 펫 (팁-딥 방법;의 끝에 형성 되었다 그림 1 C) 21 , 22 , 23, 보다는 (그림 1B) 챔버에 소수 성 심장에 독립형 bilayer (~ 100 µ m 직경에서)를 사용 하 여. 팁-딥 방법 훨씬 낮은 배경 잡음24전기 측정에 대 한 허용. 우리의 경험 첨 두 부하25,26, 팁-딥22,,2327, 및 패치 클램프28,,2930, 31 방법 이끌어 냈다 우리 물에서 기름 bilayer의 원리를 사용 하 여 형성 하는 지질 bilayers의 소설을 생각. 우리는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드20,32라고이. 이 방법에서는, 석유 단계 (그림 1D), 물방울 거 보다 물 거품은 날 려 (팁 약 30 µ m의 직경)와 유리 피 펫에서(그림 1와 2), 기름 단계로 어디에 거품은 지속적인 압력을 적용 하 여 유지 됩니다. 거품의 표면에 물-오일 인터페이스에 저절로 단층 양식. 다음, 두 거품 두 유리 펫의 조작을 통해 도킹 하 고 두 monolayers 접근, 서로 평형 bilayer 지역 양보는 bilayer 형성 됩니다. 거품의 크기는 내부 거품 압력 (압력을 들고), 그리고 마찬가지로 bilayer 크기에 의해 제어 됩니다. 50 µ m의 평균 직경은 자주 사용 됩니다. 거품의 볼륨은 작은 (< 100 pL), 대량 전해질 단계 구성 microliter 범위 내에 있는 피 펫 솔루션의 더 큰 볼륨에 연결 된다.
CBB 방법 (표 1)를 사용 하 여 많은 이득이 있다. 지질 bilayer 형성 기술, 다양 한 지질 성분의 세포 막 생성 될 수 있다, 그리고 비대칭 막 더 쉽게 형성된32 보다 그 기존의 접는 방법33. bilayer 조작할 수 있습니다 기계적으로, 액체 정역학 압력 차이34,35으로 구부러진 수 있습니다 기존의 첨 두 부하와는 달리. 지주 압력을 변경 하 여 거품을 확장 하거나 축소, 증가 또는 감소 막 긴장32로 이어지는. bilayer monolayers, 유사한 형태학 연구, 세포 막의 고정-골절 기법36,37 에 기계적으로 분리 하지만, CBB 책략 수 반복 분리 하 고 사이클32 연결에 대 한 . 거품 내 전해질 솔루션의 작은 볼륨 bilayer로 리 채널 재구성의 효율적인 융합 있으며 채널 녹음을 얻기의 확율은 기존의 첨 두 부하 기술 보다 훨씬 높다. 작은 거품 볼륨도 수 (~ 20 ms) 이내 빠른 관류 한번 다른 주입 피펫은 거품 중 하나에 삽입 됩니다. 패치 클램프 방법 달리 즉시 그리고 되풀이 하 여, CBB 막 다시 형성, 일단 하 고 펫 하루에 여러 번 사용할 수 있습니다. 패치 클램프 및 첨 두 부하 방법의 혜택을 통합 하 여는 CBB 제공 하는 막의 물리 화학적 조건을 변경 하는 다양 한 플랫폼 채널 막 상호 작용의 전례 없는 연구에 대 한.
CBB 형성 과정의 상세한 프로토콜을 제시 하기 전에 bilayer 형성의 물리 화학적 배경 막 형성에 관한 실험 어려움을 해결 하기 위해 패치-clampers에 대 한 도움이 될 것입니다 먼저 제시 그는 발생 했습니다.
CBB 실험 표면 화학 과학38의 교훈을 르 친다. CBB는 비누 거품 어디 마찬가지로, 물 거품은 날 려 유기 용 매에는 공중으로 빨 대에서 날 려와 비슷합니다. 한 때 막 지질 물 거품 또는 유기 용 매에 포함 되지 않습니다 물 거품 거의 비정상적 알아차릴 것 이다. Amphipathic 지질의 부재, 물-오일 인터페이스에 표면 장력, 높은 이며 거품 부 대 내 거품 압력 높을 것 이다. 이것은 라플라스 방정식의 실현 (ΔP = 2 γ/R, 어디 ΔP 내부 거품 압력 γ 표면 장력은 이며, R은 거품형 반지름). 유기 단계 또는 전해질 용액에 지질 농도가 높은 경우는 단층에 lipids의 밀도 증가, 깁스 흡착 등온선에 의해 규정 (-dγ = Γ나 dµ나, Γ나 가 표면 초과 화합물의, 그리고 μi 은 부품의 화학 잠재력 i)39, 낮은 표면 장력 및 거품 형성의 용이성. CBB는 bilayer 탄젠트 각도 (그림 2)에서 관찰 될 수 있다 고 단층 bilayer 사이의 접촉 각 측정은. 이 각도 단층의 surface tensions와 bilayer 사이 평형 나타냅니다 (젊은 방정식: γbi = γ모 cos(θ), 어디 γbi bilayer 긴장, γ모 단층 긴장 이며 θ 이다 접촉 각). 단층 긴장에 따른 접촉 각 잠재적인 막의 기능으로 평가 되는 접촉 각의 변화 bilayer 긴장에 있는 변화를 나타냅니다 (영 Lippmann 방정식: γ모 = Cm V2 /4 (cos (θ0)-cos (θv)), 어디 Cm 막 용량, V 막 잠재력, 이며 θ0 θv 는 각각 0과 V mV에서 연락처 각도)40,41 ,42. 두 거품은 충분히 가까이, 그들은 접근 서로 자발적으로. 이것은 반 데르 발스 힘 그리고 우리 시각 CBB 형성에서이 동적 과정을 관찰할 수 있다.
CBB 시스템 가지 고유 단계로 구성 됩니다: 즉, 대량 기름 단계는 단층 및 접촉 bilayer (그림 3)으로 거품을 물. 이들은 여러 단계 첨 두 부하, bilayer 단계와 두 개의 monolayers43,44여 끼여 얇은 유기 단계 용 매 포함 된 토 러 스 등에서 관찰의 연상. CBB에서 단층 단계 bilayer 전단지와 연속 이며 지질 분자 사이는 단층 및 전단지 쉽게 확산. 단층 단계 거품 표면, 지질 저수지 역할 주요 단계 구성의 대부분을 다루고 있습니다. 지질은 단층에서의 소수 성 꼬리 대량 기름 단계에 밖으로 확장, 때문에 bilayer 내부 또는 소수 핵심 대량 기름 단계로 열립니다. 따라서, 소수 성 물질은 bilayer 가까운 석유 단계에 주입 bilayer 인테리어에 쉽게 액세스할 수 있다. 이것은 우리가 개발 했다 최근45, 여는 bilayer의 지질 조성 변경 빠르게 (1 초) 이내 단일 채널 현재 녹음 중 막 관류 기술. 우리는 bilayer에 콜레스테롤 내용 역 켜고45콜레스테롤 관류를 전환 하 여 통제 될 수 발견. 관련 물질의 농도 기온 변화도 연수 효과46, 로 알려져 있는 유포를 통해 즉시 해산 단층 bilayer에 관련 된 물질의 농도 차이가, 그 47. 다른 한편으로는 monolayers에 걸쳐 플립플롭은 느린48,,4950.
CBB 메서드를 사용 하는 bilayer 1 낮은 전해질 pH 등 다양 한 물리 화학적 조건 형성은 51, 3 M까지 (+K, Na+)소금 농도, ±400 mV, 높은 막 잠재력 및 시스템 최대 60 ° c.의 온도
있다는 CBB의 형성에 대 한 몇 가지 옵션 및 채널 분자의 거기에. 물-오일 인터페이스에서 단층의 형성, 대 한 지질 (지질-아웃 방법; 유기 용 매에 추가 됩니다. 그림 4 A, 4 C) 또는 리 (지질에 방법;으로 거품 그림 4 B, 4 D)입니다. 특히, 지질에서 메서드는 비대칭 막15,32의 형성에 대 한 수 있습니다. 채널 단백질으로 재구성 되는 반면 채널 분자 (예를 들어, 채널을 형성 하는 펩 티 드) 수성 해결책에서 녹는 거품 (그림 4A, B)52,53에 직접 추가 리 거품 (그림 4C, D)에 추가 됩니다. 여기, 채널 펩타이드 (polytheonamide B (pTB); 지질 방법에 의해 Cbb의 형성 그림 4 A) 또는 단백질 (KcsA 칼륨 채널, 그림 4C) 표시 됩니다.
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Protocol
1. 리 준비
- 원하는 농도 (예를 들어, 10 mg/mL)에 클로 프롬에 인지질 (예를 들어, 가루에 10 mg)을 분산.
- 클로 프롬을 증발.
- 장소는 둥근 바닥 플라스 크 및 회전 하는 증발 기에는 N2 가스 실린더에 연결 ( 테이블의 자료를 참조) 설정에서 인지질 솔루션. 상 온에서 N2 흐름 아래 플라스 크를 돌려 얇은 인지질 영화 (~ 30 분) 후 나타납니다.
- 진공 펌프에 연결 된 desiccator에 열려있는 플라스 크를 놓습니다. 진공 펌프를 사용 하는 클로 프롬을 철저 하 게 제거 하는 몇 시간 동안 desiccator 내부 발음.
- 플라스 크에는 전해질 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 인지질 정지 2 mg/mL를 인지질을 일시 중단.
- 초 목욕 sonicator를 사용 하 여 여러 가지 수만 대 한 정지를 sonicate ( 재료의 표참조) 다층된 소포 (MLV) 정지를.
- 이온 채널 단백질을 포함 하는 proteoliposomes의 준비에 대 한 추가 단백질 해결책 (solubilized; 적절 한 세제를 사용 하 여 단백질 2% 볼륨은 최대) MLV 정지 하 고 목욕 sonicator를 사용 하 여 몇 초 동안 sonicate.
2. 큰 구멍 유리 펫 준비
- 피 펫 끌어당기는 사람에 유리 모 세관을 설정 하 고 micropipettes 당기 하는 2 단계를 통해 좋은 테이퍼 팁과 조작.
- microforge에는 micropipette를 설정 하 고 30 ~ 50 µ m의 직경을 가진 테이퍼 부분에 백 금 필 라 멘 트에 micropipette 팁 문의.
- 짧게는 필 라 멘 트가 열 (5 s) 즉시 그것을 해제.
참고: 난방에 균열 지점, 약자는 micropipette의 끝은 잘라, 30 ~ 50 µ m의 직경을 가진 넓은 구멍을 떠나이 조작 형태.
3. 얕은 오목 잘 (물 마무리에 대 한 Siliconization) 유리 슬라이드의 표면 처리
- 증류수와 에탄올 얕은 잘 유리 슬라이드 표면 청소.
- 구멍 슬라이드 유리에 siliconizing 시 (물)의 (예를 들어, 100 µ L) 적절 한 볼륨을 적용 합니다.
- 건조 한 공기에 완전히 시.
- 유리 슬라이드는 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 배치 합니다.
4. 형태는 CBB와 Electrophysiological 측정 수행
- 시 홀 슬라이드 글라스의 얕은 우물에 hexadecane의 100 µ L를 추가 합니다.
참고: 지질-아웃 방법 인지질은 분산 hexadecane (20 mg/mL)에서 미리. - Micropipette, 투베르쿨린 주사기를 사용 하 여의 절반 길이 전해질 용액을 채우십시오.
- Ag/AgCl 와이어 전극 피 펫 전해질 용액에 담가 허용 압력 포트와 micropipette 홀더에 micropipette를 설정 합니다.
- 패치 클램프 증폭기와 전기 지상에 다른 것의 머리 단계로 micropipette 소유자 중 하나를 연결 합니다.
- microinjector micropipette 소유자의 압력 포트에 연결 합니다.
- micromanipulator 조작 하 여는 micropipette는 거꾸로 한 현미경의 스테이지 위에 적절 한 위치를 설정 합니다.
- 잠재적인 전극 간격 조정.
- 전해질 돔 만드는 구멍 슬라이드 유리의 얕은 우물 주위 평평한 표면에 micropipette를 채우는 데 사용 되는 동일한 전해질 솔루션의 장소 1 µ L.
- micromanipulator 조작 하 여 전해질 돔에 모두 micropipettes의 끝을 담가.
- 패치 클램프 증폭기의 전극 오프셋된 전위를 조정 합니다.
- CBB는을 위반 하 여 실험의 끝에 올바른 오프셋을 확인 (거품 융해)을 하나로 융합 하 거품 두를 일으키는 응용 프로그램을 통해 높은 막 잠재력의 (전기 고장, 앰프에 전기 충격 기를 사용 하 여).
- 진정한 막 잠재력에 대 한 잠재적인 적용된 막을 계산 된 값이 추가 되도록 비대칭 전해질 솔루션 사용 하는 경우에 액체 접합 잠재적인54 를 수정 합니다.
참고: 액체 접합 잠재적인 프로그램 JPCalc55를 사용 하 여 계산 됩니다.
- 팁에서 liposome 솔루션을 그립니다.
참고: 때 수용 성 채널은 지질 아웃 방법을 사용 하 여, suctioning liposome 솔루션의 필요는 없습니다.- Liposome 솔루션의 1 µ L 구멍 슬라이드 유리 (liposome 포함 된 돔)의 얕은 우물 주위 평평한 표면에 놓습니다.
- micromanipulator 조작 하 고 liposome 포함 된 돔에는 micropipette의 끝을 삽입 합니다.
- Micropipette 홀더는 microinjector를 사용 하 여 내부 압력을 낮추어 liposome 포함 된 솔루션을 발음.
- 다른 피 펫에 대 한 절차를 반복 합니다.
- micromanipulator 조작 하 고 얕은 우물에서 hexadecane에는 micropipette 끝을 찍어.
- 거품 (예를 들어, 50 µ m 직경에서) 원하는 크기에 도달할 때까지 압력을 증가 시켜 천천히 물 거품을 날 려 버릴 하 고 그 후 동일한 압력을 유지.
- 안정 되어 있는 거품의 크기를 유지 하기 어려운 경우 오일에 어 인터페이스를 통해 팁을 전달 하 여 거품을 삭제 합니다.
- 4.8 4.9 단계를 반복 하 여 안정적인 거품이 형성 된다.
- (그림 5) 사이 접촉을 허용 하는 거품을 조작 합니다.
참고: 때때로, 거품은 CBB를 자발적으로 서로 접근 한다. 다른 경우에, 거품 가까이 있지만 서로 연락 하지 않습니다. 이 경우에, 밀어 거품 서로 기계적으로. - 크기는 지속적인 내부 거품 압력 에서도 점차적으로 변경 될 수 있습니다 때문에 거품 크기를 유지 하기 위해 압력을 미세 조정할.
- 막 패치 클램프 증폭기를 사용 하 여 적절 한 값을 잠재적인 설정 하 고 (그림 6) 등장에 현재 채널에 대 한 기다립니다.
5. 측정 Bilayer 커패시턴스
- 잠재적인 램프를 적용 하 여 bilayer 전기 커패시턴스 (C엘)를 측정 합니다.
참고: 때 램프 명령에서 전압 변화의 속도 10 mV/10 ms (1 V/s) 뒤에-10 mV/10 ms, 기울기의 변화에 따라 현재 점프의 진폭에 해당 membrane'scapacitance 값 (예: 읽기 100 pA → 100 pF). - 두 bilayer 영역 평가 거품 다른 하나를 스택 및 초점 bilayer (그림 6)의 가장자리를 보려면 bilayer 수준에서 현미경.
참고: bilayer 형태는 주로 원형, 그리고 지역 반지름에서 계산 됩니다. - Bilayer 지역 전기 용량을 나누어 특정 막 커패시턴스 (Csp) 계산 (Csp = C엘/A).
- Bilayer 두께 (소수 성 코어의 두께)를 계산 Dc 를 사용 하 여 (여기서 εr 과 ε0 대표는 bilayer의 소수 성 영역의 유전율과 고 유전율 (εrε0) /Csp = 진공의 각각).
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Representative Results
전형적인 CBB (그림 56) 50 µ m의 직경 졌고 hexadecane에 특정 막 커패시턴스 0.65 μ F/c m2했다. 거품 크기는 임의로 내부 거품 압력에 의해 제어 됩니다. 작은 거품은 저 잡음 기록에 필요한 팁 직경 대응 하 게 작은 되어야 합니다. 예를 들어 직경에서 50 µ m의 거품 크기, 팁 직경 30 µ m 이어야 합니다.
CBB는 형성 했다, 일단 채널 분자는 liposome 또는 수성 해결책에서 자연스럽 게 몇 수십 분의 경 간 내의 bilayer에 삽입 되었다. 채널 삽입 적용된 막 잠재적인 아래 현재 진폭 (그림 7)의 단계적 증가 의해 확인 되었다. 작은 막 지역 (< 1000 µ m2) 기존의 첨 두 부하와 DIB를 기준으로 시스템 실질적으로 전기 신호 대 잡음 비율 개선.
현재 녹음 막 중단 되었다 고 두 거품 병합 될 때까지 계속 될 수 있습니다. 새로운 거품을 날 려 했다는 CBB 즉시 반복적으로 형성. 피펫으로 하루 반복적으로 사용할 수 수 있습니다.
듀티 연결의 주기와 분리입니다. CBB 방법에 의해 형성 된 bilayer 두 monolayers로 사라졌습니다 될 수 있습니다. CBB의 분리-연결 하는 것은 두 거품 (detach-attach의 듀티 사이클)를 조작 하 여 반복할 수 있습니다. 그것은 쉽게 여러차례 양이온 선택적인 공52,56를 지질 bilayer를 삽입 했다이 과정 pTB, 해양 스폰지에서 펩 티 드 채널의 채널 전류의 모양으로 모니터링 했다. 현재 pTB 채널 두 monolayers 연결 직후 등장 하 고 현재 접촉 증가 (그림 8)의 지역으로 더 크게 되었다. 전류의 진폭은 분리와 동기화-첨부는 CBB의 조작.
KcsA 채널의 단일 채널 측정. KcsA 칼륨 채널은 pH 과민 한, 산 성 세포내 pH57에 의해 활성화 되 고 있습니다. 따라서, 전해질 솔루션 비대칭58,,5960설정 했다. CBB 형성 단계 4.2에서에서 왼쪽의 피 펫 솔루션 오른쪽의 pH 7.525에 설정 하는 반면 pH 4에서 설정 했다. 4.7.1 단계, liposome 정지, 보다는 오히려 proteoliposome 서 스 펜 션, 왼쪽된 피 펫으로 포부에 대 한 슬라이드 유리에 배치 했다. 따라서, KcsA 채널 막에서 왼쪽된 거품을 직면 하 고 그것의 세포질 도메인 지향 했다. 단백질: 지질 무게 비율 1: 2000의 리는 단일 채널 현재 녹음, 그리고 그는 1:10 비율 거시적인 현재 녹음에 대 한 적합 합니다.
비대칭 막. 비대칭 지질 bilayer 각 거품 (지질에)15,32에 대 한 다른 liposome 정지를 사용 하 여 형성 될 수 있다. KcsA 채널 멤브레인의 방향은 비대칭 솔루션 산도 (pH 4에서/pH 7개), 왼쪽으로 되 고 그것의 세포질 측에 지도 설정 하 여 규제 했다. 오른쪽 "밖으로."으로 할당 된 반면 왼쪽으로 "," 할당 된 따라, KcsA 채널의 게이팅 의존도 지질 검사, CBB (를 포함 하 여 비대칭 CBB)의 4 종류 사용 되었다; 즉, PG에/PG밖으로, PG에서/PC밖으로, PC에/PG밖으로, 그리고 PC에서/PC밖으로 (PG: phosphatidylglycerol) (그림 9). KcsA 채널 전시 높은 오픈 확률 (> 90%)만에 PG에/PG밖으로 PG에서/PC밖으로 막. KcsA 채널 높은 오픈 확률26막의 내부 전단지에 음이온 인지질의 존재를 요구 한다.
그림 1 : 지질 bilayer 및 패치 클램프 방법. 다양 한 방법은 형성 하는 지질 bilayer에 대 한 개발 되었습니다. (A) 패치 클램프 방법입니다. (B) 기존의 평면 지질 bilayer 메서드 작은 구멍에 서 있는, 주로 수직 bilayer를 제공 합니다. (C) 팁-딥 방법입니다. 공기-물 인터페이스에서 단층 유리 전극의 끝에 배치 됩니다. 다양 한 수정 개발 되었습니다. (D) 방울 인터페이스 bilayer 방법입니다. (E) 거품 bilayer 방법 문의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 버블 bilayer 형성 문의. 거품은 기름 위상으로 날 려로 지질 분자 물-오일 인터페이스에 자발적으로 전송 합니다. 다른 유형의 지질 리 각에 포함 되어 있습니다 (지질-에 있는 거품), 그리고 monolayers 관련 된 지질에 의해 독점적으로 형성 된다. 두 개의 monolayers 도킹 비대칭 bilayer 막을 생성 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 분명 거기에 연락처 거품 bilayer와 지질 역학에 단계. 지질 거품 안 대기는 단층 또는 bilayer에 속한 단계를 구성 합니다. 지질 bilayer는 전역의 플립플롭은 자주, 그리고 비대칭 막이 오랜 시간 동안 유지 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 지질 지질 아웃 또는 지질 방법 제공. 지질은 유기 용 매 (지질-아웃;에 추가 A와 C) 또는 (지질에; 리와 수성 솔루션에 B 그리고 D)입니다. 지질-방법에서 비대칭 막이 형성 된다. 펩 티 드, 등 (파란색), 수성 해결책에서 녹는 채널 형성 물질 거품 중 하나에 추가 하 고 저절로 bilayer에 삽입 됩니다. 지질에 방법에는 채널의 일부는 bilayer에 융합 다음 리에 삽입 됩니다. 채널 단백질 (레드) 재구성 리 지질 아웃 또는 지질에 방법에,에 있는 다음 거품 중 하나에 추가 되 고 저절로 bilayer에 융합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 형성 및 연락처의 미세한 이미지 거품 bilayer. bilayer 접선 방향에서 관찰 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : Bilayer 영역을 측정 하기 위한 bilayer의 관찰. 두 거품 피펫은 조작을 통해 다른에 쌓여있다 고 현미경 연락처 거품 bilayer의 수준에 초점을 맞추고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 연락처 거품 bilayer 막으로 KcsA 채널의 stepwise 삽입. KcsA 채널의 E71A 돌연변이 삽입된 채널의 즉각적인 탐지 표시 데 사용 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : Monolayers 및 채널의 분리 연결. 펩 티 드 채널, polytheonamide B, 다음 저절로 막으로 통합 되었다 거품 중 하나에 추가 되었습니다. 분리 막에 채널 철회 하지만 채널 추가 측의 막 전단지에 유지 했다. 첨부 파일, 따라 채널 막으로 삽입 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9 : 는 전단의 구성에 따라 비대칭 막 및 채널 활동의 형성. KcsA 채널 막의 내부 전단지에 페이지, 등 산 성 지질에 의해 통제 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 기존의 첨 두 부하 | Liposome 패치 | DIB | CBB | |
| 성공 속도1 | 높은 | 낮은 | 매우 높은 | 매우 높은 |
| 즉각적인 reformability2 | 예 | 아니요 | 중간 | 예 |
| 비대칭 막 | 예 | 아니요 | 예 | 예 |
| 솔루션 교환 | 천천히 | 매우 빠른 | 천천히 | 빠른 |
| S/N 비율3 | 낮은 | 높은 | 낮은 | 높은 |
| 막 변형 | 아니요 | 아니요 | 아니요 | 예4 |
| 기계 조작 | 아니요 | 예5 | 예 | 예 |
| 막 관류 | 아니요 | 아니요 | 예 | 예 |
| 지질 구성 | 다양 한 | 제한 된6 | 다양 한 | 다양 한 |
| 1 안정적인 지질 bilayer 재판 당 형성의 성공률. | ||||
| 2 막의 고장 후 신속 하 게 새로운 막의 형성. 또한, 막 반복 해 서 형성 된다. | ||||
| 3 신호 대 잡음 (S/N) 비율 막 커패시턴스에서 생성 된 전기 배경 잡음 주를 나타냅니다. | ||||
| 4 오목 또는 볼록 막 두 거품 사이 다른 내부 압력을 적용 하 여 형성 될 수 있다. | ||||
| 5 만 막 장력 증가. | ||||
| 6 거 대 한 unilamellar 소포를 형성할 수 있는 인지질, 하지만 기가 봉인 하지 달성 될 수 있습니다. | ||||
표 1: 다양 한 지질 bilayer 막의 특성.
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Discussion
지질 bilayer 형성의 CBB 메서드 단층20줄지어 물에 기름 방울의 원리를 기반으로 합니다. 기술적으로, Cbb 형성에 대 한 절차는 쉽게, 특히 패치 클램프 연구자, 유리 micropipettes 조작에 능숙 합니다. Microinjectors와 함께 두 개의 피 펫 조작자 사용할 수 있을 때 패치 클램프에 대 한 electrophysiological 설치 쉽게는 CBB에 사용 됩니다. 다른 한편으로는 CBB 기존의 첨 두 부하의 후임은, 때문에 많은 양의 물리 기술 이었던 누적된8,이 배경으로 표면 화학의 지식에 대 한38 유용 운영에 대 한 고 Cbb 조작 CBB 채널 막 interplays 화학 성분 및 물리적 상태61수정 능력으로 공부에 대 한 다양 한 플랫폼을 제공 합니다. 거품 안 대기 지질 단층 위상 및 전단지는 bilayer의 국경을 넘어 자유롭게 확산 수는 CBB에 그리고 우리는 bilayer 연결 분리와 같은 개발된 기술을 막 관류 방법45. 우리는 생체 외에서 채널 단백질 합성, 어디 채널 합성 거품에서 수행한 새로 합성된 채널 단백질 bilayer 막 잠재력의 응용 프로그램 아래에 자발적인 전송 대상이 됐다 Cbb 연장 어디 KcsA 채널의 초기 채널 기능 KcsA DNA62의 전사/번역 시작의 시간에서 추적 했다.
프로토콜의 단계 중 거품 크기를 유지 중요 하다. 거품이 팽창 또는 축소 저절로 지질 전송 인터페이스는 느린 단층 긴장 하는 경향이 변경 때문에 천천히 있습니다. 특히, 첫 번째 거품 팽창 직후 liposome 솔루션 (단계 4.8.3 4.10)의 흡입 단층 긴장은에 리에 의해 하향 조정 하기 때문에 유지 하기 어렵다는 피 펫의 끝에 축적. 안정적인 CBB 제공 초기 거품과 거품의 후속 형성 삭제. 거품 크기의 시각적 추적 및 압력의 미세 조정 필요 하다.
CBB 메서드에 실험 한계가 있다. 컴포지션의 특정 지질 bilayer의 전기 저항 하지 않을 수 있습니다는 CBB electrophysiological 측정을 위해 설계 되었습니다, 하지만 충분히 높은 (예를 들어, 100 GΩ) 단일 채널 녹음에 대 한. 예를 들어 dioleoyl phosphatidylcholine은 리, 자주 사용 하지만 그것은 25 ° C63에 전기 새 Cbb 형성. Cbb는 지질 종 그 위상 전이 온도 기록 온도 이상도 형성 수 없습니다. 실제로, CBB 형성 했다 dipalmitoyl phosphatidylcholine 실내 온도에, 어려운 하지만 문제64를 피할 Tm 위의 온도 높여. 이 실험에서 온도 투명 한 열 접시를 사용 하 여 통제 되었다 ( 재료의 표참조) 슬라이드 아래 유리62. 자주 사용된 지질 diphytanoyl phosphatidylcholine의 위상 전이 온도 0 ° C 65, 아래이 고 Cbb는 광범위 한 온도 범위에 쉽게 형성된32,45,51 .
물-오일 인터페이스의 인지질 중 지질 또는 지질 아웃 메서드에서 전송 속도가 상대적으로 느린 지질-밖 보다 지질 방법63에 제공 됩니다. 또한, 알 수 없는 이유로 bilayer 막의 전기 저항은 지질에 방법으로 보다 지질-아웃 방법으로 상대적으로 작습니다.
프로토콜 (단계 4.8)에 리와 리 채널 재구성 (1 µ L) 솔루션 (4.9 단계와 단계 4.10), 피 펫의 끝에서 로드 되 고는 피 펫의 나머지 이전 가득된 전해질 솔루션이 포함 되어 있습니다. 이것은 단지 지질 및 채널 분자 등 자료 보존에 대 한입니다. 따라서,는 리 위 피 펫 솔루션으로 점차 확산 하 고 잠시 후,는 피 펫의 끝에 지질 농도 양식 지질 monolayers 부족 한 된다. 신선한 liposome 솔루션 팁 (단계 4.8)에서 발음 해야 하는 경우에, 반면 리 거품으로 점차 정착 전체 피펫으로 지질 및 채널 분자를 포함 하는 솔루션으로 채워질 때이 시간 농도 변화를 피할 수 있습니다. 이 경우 거품 갱신 됩니다.
Electrophysiologically, CBB 크기의 따라서 저조한 큰 막 커패시턴스 패치 클램프 보다 큽니다. 그러나, 직렬 저항 (저항 막의 일련의 전기 저항)은 많은 (~ 100 k ω)는 전압 클램프의 속도 가속화 하 고 배경 잡음 약화 패치 클램프 (피 펫 저항 > 1 m ω), 보다 낮은 그리고 전압 고정 막 잠재력66,,6768에서 시리즈 저항 오류. 배경 잡음 낮은 직렬 저항 낮은 배경 잡음9결과 높은 막 커패시턴스를 보완 막 커패시턴스와 직렬 저항의 기능입니다.
지질 bilayer 실험의 규칙, 유리 세척 하지 세제를 사용 해야 합니다. 세제의 양을 추적도는 bilayer의 무결성 perturbs. 클로 프롬/메탄올과 에탄올 등 유기 용 매 대신 같은 청소 목적을 위해 사용 되어야 한다.
전반적으로는 CBB 패치 클램프 (예를 들어, 막의 기계적 조작)와 첨 두 부하 (예를 들어, 막의 지질 구성을 수정 하는 기능)의 혜택을 통합 합니다. 다양 한 유형의 채널 형성 물질 및 채널 단백질 공부52,53,,6970되었습니다. 이 방법의 개발은 이후 점점 더 많은 연구자 채널 막 상호 작용에 초점을 맞추고 있다 그리고 다양 한 실험에 대 한 다양 한 플랫폼을 제공 하는 있는 CBB 적절. 더 CBB 방식에서 실험 개발이 예상 된다.
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Disclosures
저자는 공개 충돌의 관심 있다.
Acknowledgments
저자 마 리코 Yamatake와 마사코 다카시마 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 지원 부분에서 KAKENHI에 의해 부여 번호 16 H 00759 및 17 H 04017 (SO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) | Sigma-Aldrich | P3644 | |
| A/D Converter | Molecular Divices | Digidata1550A | |
| Ag/AgCl electrode | Warner Instruments | 64-1317 | |
| Bath Sonicator | Branson | M1800H-J | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Glass Capillary | Harvard Apparatus | 30-0062 | |
| Hepes | Dojindo | 342-01375 | |
| Hole Slideglass | Matsunami Glass | S339929 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX73 | |
| Isolation Table | Herz | TDI-86LA(Y)2 | |
| Micro Injenctor | Narishige | IM-11-2 | |
| Micro Manipulator | Narishige | EMM | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micropipette holder | |||
| n-Hexadecane | Nacalai | 07819-32 | |
| Patch-Clamp Amplifier | HEKA | EPC800 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-87 | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
| POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine ) |
Avanti Polar Lipids | 850757 | |
| POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) | Avanti Polar Lipids | 840457 | |
| Potassium Chloride | Nacalai | 28514-75 | |
| Rotary Evapolator | Iwaki | REN-1000 | |
| Succinic Acid | Nacalai | 32402-05 | |
| Vacuum Pump | Buchi | V-100 |
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