Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lipid Bilayer eksperimenter med kontakt boble Bilayers for oppdateringen-Clampers

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Her presenterer vi en protokoll for dannelsen av lipid bilayers med en kontakt boble bilayer metode. En vann boble er blåst inn en organisk løsemiddel, der et monolayer er dannet på vann-olje grensesnittet. To Pipetter manipulert for å forankre bobler å danne en bilayer.

Abstract

Lipid bilayers gir en unik eksperimentelle plattform for funksjonell studier av ionekanaler, som tillater undersøkelse av kanal-membran interaksjoner under ulike membran lipid komposisjoner. Blant dem, har slippverktøy grensesnittet bilayer vunnet popularitet; men hindrer stort membran størrelsen innspillingen av lav elektrisk bakgrunnsstøy. Vi har etablert en kontakt boble bilayer (CBB) metode som kombinerer fordelene med planar lipid bilayer og patch-klemme metoder, for eksempel muligheten til å variere lipid sammensetningen og manipulere bilayer mekanikk, henholdsvis. Bruker oppsettet for konvensjonelle patch-klemme eksperimenter, kan CBB-baserte eksperimenter lett utføres. I korte trekk, en elektrolytt-løsning i en glass pipette er blåst inn i en organisk løsemiddel fase (hexadecane), og pipette trykket opprettholdes for å få en stabil boblestørrelse. Boblen er spontant foret med en lipid monolayer (ren lipider eller blandet lipider), som tilbys fra liposomer i bobler. Deretter forankres to monolayer-lined bobler (~ 50 µm i diameter) på spissen av glass Pipetter for bilayer-formasjonen. Innføring av kanal-rekonstituert liposomer i boblen fører til inkorporering av kanaler i bilayer, tillater én kanal stemmeopptaket med signal-til-støy forholdet sammenlignes med patch-klemme innspillinger. CBBs med en asymmetrisk lipid sammensetning dannes lett. CBB er fornyet gjentatte ganger av blåser ut tidligere bobler og danner nye. Ulike kjemiske og fysiske forstyrrelser (f.eks, membran perfusjon og bilayer spenning) kan bli pålagt CBBs. Herein, presenterer vi den grunnleggende prosedyren for CBB formasjon.

Introduction

Ionekanaler er cellemembranen ikke bare en støtte materiale, men en partner for å generere ion fluks. Funksjonelt, membranen er en elektrisk isolator i som ion kanaler er innebygd, og alle cellemembraner formidles med en hvile membran potensial. Konvensjonelt, ble en vilkårlig membran potensial innført fra en ekstern krets som elektrisk strøm gjennom kanaler ble målt. Dette kvantitativ vurdering av ion fluks på ulike membran potensialer avslørte molekylær egenskapene til disse kanalene, som deres ion-selektiv gjennomtrengning og gating funksjoner1,2. Membran plattformen for funksjonell studier av ionekanaler er cellen membran eller lipid bilayer membranen. Historisk enkanals elektrisk gjeldende innspillinger ble først fremført i lipid bilayers3,4, og relevante teknikker ble utviklet for celle membraner, som metoden patch-klemme (figur 1A )5,6. Siden da disse to teknikker har utviklet seg separat for ulike formål (figur 1)7,8.

Membran lipider og bilayer membraner er fokus for forskning for sine roller i å støtte struktur og funksjon av kanalen proteiner. Derfor er klar tilgjengeligheten av metoder å variere lipid sammensetningen i bilayers i høy etterspørsel. Lipid bilayer formasjon metoder som planar lipid bilayer (PLB)8,9,10,11, vann-i-olje dråpe bilayer12og slippverktøy grensesnittet bilayer (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikker (figur 1) er vanlig valg, gir en mulighet for å undersøke funksjonen kanalen under varierende lipid komposisjoner20. Tross av DIB er teknisk lettere å produsere enn den konvensjonelle PLB, den store størrelsen på DIB har skapt en disincentive for patch-clampers å bruke den for å studere enkanals gjeldende opptak med vanlig størrelse konduktans (< 100 hk).

For å omgå bakgrunnsstøy, minimeres bilayer området. Dette problemet minnes repetisjoner historie i utvikle elektrofysiologiske teknikker for lipid bilayers (figur 1). I begynnelsen, ble et lite bilayer (1-30 µm i diameter) dannet på spissen av en pipette (tips-dip-metoden. Figur 1 C) 21 , 22 , 23, snarere enn benytter en frittstående bilayer (~ 100 µm i diameter) på en hydrofobe septum i et kammer (figur 1B). Tips-dip metoden tillatt for elektriske målinger med mye lavere bakgrunn støy24. Våre erfaringer med PLB25,26, tips-dip22,23,27og patch-klemme28,29,30, 31 metoder ledet oss til en ny idé å danne lipid bilayers ved hjelp av prinsippene for vann-i-olje-bilayer. Vi har referert til dette som kontakt boble bilayer (CBB) metoden20,32. I denne metoden henger vanndråpene i en olje fase (figur 1D), en vann boble er blåst fra en glass pipette (med tuppens diameter på ca 30 µm) i olje fasen (figur 1E og 2), hvor den boble vedlikeholdes ved å bruke en jevn trykk. En monolayer former spontant på vann-olje grensesnittet på overflaten av boble. Deretter to bobler forankres gjennom manipulering av to glass Pipetter og bilayer er dannet som de to monolayers nærme hverandre, gir en likevekt bilayer området. Størrelsen på boblen styres av intra-boble trykket (holder press), og likeledes bilayer størrelsen. En gjennomsnittlig diameter på 50 µm brukes ofte. Selv om volumet av boblen er liten (< 100 pL), den er koblet til større volumet av pipette løsning i mikroliter området, utgjør elektrolytt bulklading.

Det er mange fordeler med å bruke metoden CBB (tabell 1). Som en lipid bilayer formasjon teknikk, membraner av ulike lipid komposisjoner kan produseres, og asymmetriske membraner er lettere dannet32 enn de av de konvensjonelle folding metode33. Bilayer kan være mekanisk manipulert, i motsetning til konvensjonelle PLB som kan bare være bøyd med en hydrostatisk trykk forskjellen34,35. Endrer holde trykket, bobler enten utvides eller krymper, fører til økt eller redusert membran spenning32. Bilayer er mekanisk avtakbar i monolayers, ligner på fryse-brudd teknikk36,37 av membraner i morfologiske studier, men med CBB, en manøver tillater for gjentatte koble fra og koble sykluser32 . Liten volumet av electrolyte løsning i boble kan effektiv blanding av kanal-rekonstituert liposomer i bilayer, og sannsynligheten for å få kanalen opptak er mye høyere enn med konvensjonelle PLB teknikken. Liten boble volumet kan også rask perfusjon (innen ~ 20 ms) når en annen injeksjon pipette settes inn i en av bobler. I motsetning til metoden patch-klemme når brutt, en CBB membran dannes re umiddelbart og gjentatte ganger, og Pipetter kan brukes flere ganger om dagen. Ved å integrere fordeler av oppdateringen-klemme og PLB metodene, gir CBB en allsidig plattform for å variere mekanisk-betingelsene av membranen, slik at for enestående studier av kanal-membran interaksjoner.

Før presentere detaljert protokollen CBB formasjon prosessen, er mekanisk-bakgrunn av bilayer dannelsen presentert første, som vil være nyttig for patch-clampers å løse eksperimentelle problemer knyttet til membran dannelse som er oppstått.

CBB eksperimenter formidle lærdom overflatekjemi vitenskap38. CBB ligner en såpeboble blåst fra et strå i luften, der likeledes en vann boble er blåst inn en organisk løsemiddel. En vil merke at en vann boble er neppe oppblåst når membran lipider ikke inkluderes i vann boble eller organisk løsemiddel. I fravær av amphipathic lipider, overflatespenning på en vann-olje-grensesnitt er høy og intra-boble presset til å blåse en boble vil være høy. Dette er en realisering av Laplace likning (ΔP = 2 γ/R, der ΔP er intra-boble trykket γ er overflatespenningen og R er radius boble). Når konsentrasjonen av lipider i organisk fasen eller elektrolytt-løsning er høy, tetthet av lipider i monolayer øker, så diktert av Gibbs adsorpsjon isotherm (-dγ = Γjeg dµjeg, hvor Γjeg er overflate overflødig sammensatte jeg, og µjeg er den kjemiske potensialet av komponenten jeg)39, fører til en lavere overflatespenning og brukervennlighet boble formasjon. CBB, bilayer kan observeres fra en tangentiell vinkel (figur 2) og kontakt vinkelen mellom monolayer og bilayer er målbare. Denne vinkelen representerer en likevekt mellom surface tensions av monolayer og bilayer (unge ligningen: γbi = γmo cos(θ), der den blebi er bilayer spenningen γmo er monolayer spenningen og θ er kontakt vinkelen). Endringene i kontakt vinkel angir endringer i bilayer spenningen, gitt at monolayer spenningen vurderes av endringer i kontakt vinkelen som en funksjon av membran potensial (Young-Lippmann ligningen: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), der Cm er membran kapasitans, V er membran potensial og θ0 og θv er kontakt vinkler på 0 og V mV, henholdsvis)40,41 ,42. Når to bobler er nær nok, tilnærming de andre spontant. Dette skyldes van der Waals kraft, og vi kan visuelt observere denne dynamiske prosessen i CBB formasjonen.

En CBB system består av forskjellige faser: nemlig en bulk olje fasen, vann bobler belagt med en monolayer og en kontakte bilayer (Figur 3). Dette er minner om flere faser i en PLB, for eksempel en løsemiddel inneholder torus rundt bilayer fasen og en tynn organisk fase klemt av to monolayers43,44. CBB, monolayer fasen går bilayer brosjyren og lipid molekyler diffus lett mellom monolayer og heftet. Monolayer fasen dekker det meste av boble overflaten, utgjør den viktigste fasen som fungerer som en lipid-reservoaret. Fordi hydrofobe halen av lipider i monolayer strekker seg utover til olje bulklading, åpnes bilayer interiøret eller hydrofobe kjernen til olje bulklading. Dermed er en hydrofobe stoffet injiseres olje fasen nær bilayer lett tilgang bilayer interiøret. Dette er membran perfusjon teknikken vi hadde nylig utviklet45, som lipid sammensetningen i bilayer endres raskt (innen andre) under én kanal gjeldende innspillinger. Vi fant at kolesterol innholdet i bilayer reversibel kan kontrolleres ved å bytte kolesterol perfusjon og på45. Som konsentrasjonen av aktuelle stoffet i monolayer og bilayer er forskjellig, oppløses konsentrasjon gradient av aktuelle stoffet umiddelbart gjennom diffusjon, som er kjent som Marangoni effekt46, 47. derimot, flip-flops over monolayers er treg48,49,50.

Med metoden CBB bilayer er dannet under allsidig mekanisk-forhold, som en elektrolytt pH så lavt som 1 51, en salt (K+Na+, osv.) konsentrasjon til 3 M, en membran potensial så høyt som ±400 mV og et system temperaturen på opp til 60 ° C.

Det finnes flere alternativer for dannelsen av CBB og innlemmelse av kanalen molekyler deri. For dannelsen av monolayer på vann-olje grensesnittet legges lipider i en organisk løsemiddel (lipid-out-metoden. Figur 4 A, 4 C) eller boblediagrammer som liposomer (lipid-i metoden. Figur 4 B, 4 D). Spesielt tillater metoden lipid-i dannelse av asymmetrisk membraner15,32. Kanal molekyler løselig i vandig løsning (f.eks, kanal-forming peptider) legges direkte inn i boble (Figur 4A, B)52,53, mens kanalen proteiner er rekonstituert til liposomer, som legges deretter inn boble (Figur 4C, D). Her, dannelsen av CBBs av lipid-i metoden for enten en kanal peptid (polytheonamide B (pTB); Figur 4 A) eller et protein (KcsA kalium kanal, Figur 4C) vises.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. klargjør liposomer

  1. Spre fosfolipider (f.eks, 10 mg i pulver) i kloroform i en ønsket konsentrasjon (f.eks, 10 mg/mL).
  2. Fordampe kloroform.
    1. Sted phospholipid løsningen i en runde bunn kolbe og setter den på en roterende fordamperen (se Tabell for materiale) koblet til en N2 gass-sylinder. Rotere kolbe under N2 flyt ved romtemperatur til en tynn phospholipid film vises (etter ~ 30 min).
    2. Plass åpne flasken i en desiccator som er koblet til en vakuumpumpe. Bruke vakuumpumpen, Sug opp innsiden av desiccator i flere timer å fjerne kloroform grundig.
  3. Legge til en riktig volum på en elektrolytt-løsning i flasken og suspendere phospholipid for å få en 2 mg/mL phospholipid suspensjon.
  4. Sonicate suspensjon for flere titalls sekunder med en bad sonicator (se Tabell for materiale) å få en flerlags vesicle (MLV) suspensjon.
  5. For utarbeidelse av proteoliposomes som inneholder ion kanal proteiner, legger du til en protein-løsning (med proteiner solubilized bruker riktig rengjøringsmidler; 2% volum er maksimalt) til MLV suspensjon og sonicate i flere sekunder med bad sonicator.

2. Forbered stor bar Glass Pipetter

  1. Sett et glass kapillær til en pipette avtrekker og dikte Mikropipetter med en fin konisk tips gjennom totrinns trekke.
  2. Angi brønnene på en microforge og kontakt spissen av brønnene til en platina filament konisk havn med en diameter på 30-50 µm.
  3. Varme filament kort (5 s) og umiddelbart slå den av.
    Merk: Dette manipulasjon danner en sprekk på oppvarming punkt, der spissen av brønnene er kuttet av, forlate en bred bar med en diameter på 30-50 µm.

3. behandle overflaten av Glass lysbilde med en grunne konkave godt (Siliconization for en vannavstøtende Finish)

  1. Rengjør overflaten av glass lysbildet med en grunne brønn med destillert vann og etanol.
  2. Bruke et riktig volum (f.eks, 100 µL) for en siliconizing reagens (vannavstøtende) på hullet lysbildet glasset.
  3. Tørr reagensen helt i luften.
  4. Sett av objektglass på scenen av en invertert mikroskop.

4. danne CBB og utføre elektrofysiologiske måling

  1. Legg 100 µL av hexadecane i grunne brønnen silikoniserte hull skyve glass.
    Merk: For metoden lipid ut fosfolipider er spredt i hexadecane (20 mg/mL) på forhånd.
  2. Fylle electrolyte løsning til halvparten lengden på brønnene, bruker en tuberkulin sprøyte.
  3. Angi brønnene på brønnene holderen med en trykk-port, slik at den Ag/AgCl wire elektroden å suge inn pipette electrolyte løsning.
  4. Koble én av brønnene innehaverne til hodet scenen av en patch-klemme forsterker og den andre elektrisk bakken.
  5. Koble en microinjector til press porten av brønnene holderen.
  6. Angi brønnene til riktig posisjon over scenen av en invertert mikroskopet ved å manipulere micromanipulator.
  7. Justere forskyvningen av elektroden potensielle.
    1. Sted 1 µL av samme elektrolytt løsningen brukes til å fylle brønnene på flate overflaten rundt grunne godt av hull lysbildet glasset, opprette en elektrolytt kuppel.
    2. Nyt spissen av både Mikropipetter i elektrolytt kuppelen ved å manipulere micromanipulator.
    3. Justere elektrode offset potensialet i patch-klemme forsterkeren.
    4. Bekrefte riktig forskyvningen på slutten av eksperimenter ved å bryte CBB via anvendelse av en høy membran potensial (elektrisk sammenbrudd, bruke zappe på forsterkeren), forårsaker to bobler å være smeltet sammen til én (boble fusion).
    5. Rette de flytende kryss potensielle54 i tilfeller der brukes asymmetrisk elektrolytt-løsninger, slik at den beregnede verdien legges til anvendt membran potensial for den sanne membranen potensial.
      Merk: Flytende krysset potensielle beregnes ved hjelp av programmet JPCalc55.
  8. Tegne liposome løsningen fra spissen.
    Merk: Når vannløselige kanaler er undersøkt med metoden lipid-out, utsuging av liposome løsningen er ikke nødvendig.
    1. Plass 1 µL av liposome løsning på den flate overflaten rundt den grunne brønnen av hull lysbildet glasset (liposome inneholder dome).
    2. Endre micromanipulator og stikk av brønnene i liposome inneholder kuppelen.
    3. Sug opp liposome inneholder løsningen ved å senke trykket i brønnene holderen ved hjelp av microinjector.
    4. Gjenta for de andre pipette.
  9. Endre micromanipulator og dyppe spissen av brønnene i hexadecane i grunne godt.
  10. Blåse en vann boble langsomt ved å øke trykket til boblen når ønsket størrelse (f.eks, 50 µm i diameter) og opprettholde samme trykk deretter.
  11. Kast bobler av passerer spissen av olje-luft-grensesnittet hvis det er vanskelig å holde størrelsen på boblene stabil.
  12. Gjenta trinn 4.8 til 4.9 til stabile bobler dannes.
  13. Manipulere bobler å tillate kontakt mellom dem (figur 5).
    Merk: Noen ganger bobler tilnærming andre spontant å danne CBB. I andre tilfeller bobler er nær, men kontakt ikke med hverandre. I dette tilfellet, trykk bobler hverandre mekanisk.
  14. Finjustere press for å opprettholde boblestørrelsen, fordi størrelsen kan gradvis endres selv ved konstant intra-boble trykket.
  15. Angi membranen potensielle til den riktige verdien bruker oppdateringen-klemme forsterkeren og vente på kanalen gjeldende å dukke opp (figur 6).

5. tiltak Bilayer kapasitans

  1. Måle bilayer elektriske kapasitans (Cel) ved å bruke en rampe potensielle.
    Merk: Når spenning endringen i kommandoen rampen er 10 mV/10 ms (eller 1 V/s) etterfulgt av-10 mV/10 ms, amplituden til gjeldende hopp på endringer i skråningen tilsvarer lese membrane'scapacitance verdien (f.eks 100 pA → 100 pF).
  2. Evaluere bilayer området to bobler stablet en på andre og fokusere mikroskopet på bilayer nivå vise kanten av bilayer (figur 6).
    Merk: Bilayer formen er mest sirkulær området beregnes fra radius.
  3. Beregne den bestemte membran kapasitans (Csp) ved å dele den elektriske kapasitans av bilayer området (Csp = Cel/A).
  4. Beregne bilayer tykkelsen (tykkelse av hydrofobe kjernen) bruke Dc = (εrε0) /Csp (der εr og ε0 representerer permittivity hydrofobe regionen i bilayer og permittivity i et vakuum, henholdsvis).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En typisk CBB hadde en diameter på 50 µm (figur 56) og bestemte membran kapasitans i hexadecane var 0,65 µF/cm2. Boblestørrelsen var tilfeldig kontrollert av intra-boble trykket. Når små bobler er nødvendig for støyfri opptak, skal tuppens diameter være tilsvarende liten. For eksempel for en boblestørrelse på 50 µm i diameter, bør tuppens diameter være 30 µm.

Når CBB hadde dannet, ble spontant kanal molekylene i vandig løsning eller liposome satt inn i bilayer innen en span av noen til dusinvis av minutter. Innsetting av kanalene bekrefter gradvis økning av gjeldende amplituden (figur 7) under den anvendt membranen potensial. Mindre membran området (< 1000 µm2) i forhold i konvensjonelle PLB og DIB systemer betydelig bedre elektrisk signal-til-støy-forhold.

Gjeldende opptak kan videreføres til membranen forstyrret og to bobler flettes. Nye bobler var blåst og CBB dannet umiddelbart og gjentatte ganger. Pipette kan brukes gjentatte ganger i døgnet.

Plikt syklus av fest og koble. En bilayer dannet av metoden CBB kan bli oppløst i to monolayers. Koble-fest av CBB kan gjentas ved å manipulere to bobler (driftssyklus på detach-attach). Denne prosessen ble overvåket av utseendet på den kanal nåværende pTB, et peptid kanalen fra en marine svamp, som det var lett inn i lipid-bilayer til en monovalent kasjon-selektiv pore52,56. PTB kanalen gjeldende dukket opp umiddelbart etter at de to monolayers, og gjeldende ble større som området kontakt økt (Figur 8). Amplituden til gjeldende ble synkronisert med koble-fest manipulering av CBB.

Enkanals målinger av KcsA kanalen. KcsA kalium kanalen er pH følsom, aktiveres av surt intracellulær pH57. Dermed ble elektrolytt løsningen satt til å være asymmetrisk58,59,60. I trinn 4.2 CBB formasjonen, ble pipette løsningen på venstre side satt på pH 4, mens det av høyre side ble satt på pH 7.525. I trinn 4.7.1, ble en proteoliposome suspensjon, snarere enn liposome suspensjon, plassert på lysbildet glasset for aspirasjon i den venstre pipette. Følgelig ble KcsA kanalen orientert i membranen med its cytoplasmatiske domenet mot venstre boblen. Liposomer med protein: lipid vektforholdet mellom 1:2000 er egnet for én kanal stemmeopptaket, og de med en 1:10 forholdet er for makroskopisk stemmeopptaket.

Asymmetrisk membran. En asymmetrisk lipid bilayer kan dannes ved bruk av forskjellige liposome suspensjoner hver boble (lipid-in)15,32. Retningen på KcsA kanalen i membranen ble regulert ved å angi en asymmetrisk løsningen pH (pH 4i/pH 7ut), fører til cytoplasmatiske siden å være mot venstre. Følgelig ble venstre side tildelt som "i", mens høyre side ble tildelt som "ut." For å undersøke lipid avhengighet av gating av KcsA kanalen, ble fire typer CBB (inkludert en asymmetrisk CBB) brukt; nemlig, PGi/PGut, PGi/PCut, PCi/PGutog PCi/PCut (PG: phosphatidylglycerol) (figur 9). KcsA kanalen utstilt høy åpne sannsynlighet (> 90%) bare i PGi/PGut og PGi/PCut membraner. KcsA kanalen krever eksistensen av anionic fosfolipider i indre heftet av membranen for en stor åpen sannsynlighet26.

Figure 1
Figur 1 : Lipid bilayer og patch-klemme metoder. Ulike metoder har blitt utviklet for å danne lipid-bilayer. (A) Patch-klemme metode. (B) konvensjonelle planar lipid bilayer metoden, som gir en frittstående, mest loddrette, bilayer på et lite hull. (C) tips-dip metode. En monolayer i luft-vann-grensesnittet er plassert på spissen av en glass elektrode. Ulike endringer har blitt utviklet. (D) dråpe bilayer grensesnittmetode. (E) kontakt boble bilayer metoden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 2
Figur 2 : Kontakt boble bilayer formasjon. Som en boble blir blåst inn i et olje-fase, overføre lipid molekyler spontant i vann-olje-grensesnittet. Ulike typer lipider liposomer er inkludert i hver boble (lipid-i), og monolayers er dannet av de relevante lipider. Docking to monolayers genererer en asymmetrisk bilayer membran. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 : Distinkte faser i kontakt boble-bilayer og dynamikk av lipider deri. Lipider fôr boblen utgjør en fase hvor de tilhører en monolayer eller en bilayer. Flip-flop av lipider over bilayer er sjeldne, og asymmetriske membranen beholdes i lang tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 4
Figur 4 : Levere lipider med metoden lipid-ut eller et lipid. Lipider legges i en organisk løsemiddel (lipid-out; A og C) eller i vandig løsning som liposomer (lipid-i; B og D). I metoden lipid-i er en asymmetrisk membran dannet. Kanal-forming stoffer som er løselig i vandig løsning (blått), som peptider, er lagt til en av bobler og spontant inn i bilayer. I metoden lipid-i en del av kanalene er satt inn i liposomer, som deretter er del av bilayer. Kanal proteiner (rød) er rekonstituert i liposomer i enten lipid-ut eller lipid-i metoden, som er så lagt til en av bobler og spontant del av bilayer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 5
Figur 5 : Formasjon og mikroskopiske bildet av kontakten boble bilayer. Bilayer er observert fra en tangentiell retning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 6
Figur 6 : Observasjon av bilayer for å måle området bilayer. To bobler er stablet på gjennom pipette manipulasjon og mikroskopet er fokusert på nivå med kontakt boble-bilayer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 7
Figur 7 : Gradvis innsetting av KcsA kanalen kontakt boble bilayer membranen. E71A mutant av KcsA kanalen ble brukt til å vise umiddelbar gjenkjenning av innsatte kanalene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 8
Figur 8 : Koble tilkobling av monolayers og svar kanaler. Et peptid kanal, polytheonamide B, ble lagt i en av bobler, som ble deretter spontant innlemmet i membranen. Når enebolig, kanaler i membranen trakk men ble beholdt på membran brosjyren til kanal-lagt til side. På vedlegg, ble kanalene satt inn i membranen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 9
Figur 9 : Dannelsen av en asymmetrisk membran og kanal aktivitet avhengig av sammensetningen av brosjyren. KcsA kanalen er regulert av Sure lipider, som PG, i indre heftet av membranen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Konvensjonelle PLB Liposome oppdateringen DIB CBB
Suksess rate1 høy lav svært høy svært høy
Umiddelbar reformability2 ja nei mellomliggende ja
Asymmetrisk membran ja nei ja ja
Løsning exchange langsom veldig rask langsom rask
S/N forholdet3 lav høy lav høy
Membran deformasjon nei nei nei Ja4
Mekanisk manipulasjon nei Ja5 ja ja
Membran perfusjon nei nei ja ja
Lipid komposisjoner ulike begrenset6 ulike ulike
1 Suksessrate på danner stabile lipid bilayer per rettssaken.
2 Dannelsen av en ny membran raskt etter pause ned på en membran. Også dannes membran gjentatte ganger.
3 Signal-å-bråk (S/N) forholdet representerer den elektriske bakgrunn støy primært generert fra membranen kapasitans.
4 Konkav eller konveks membranen kan dannes ved å bruke ulike indre trykket mellom to bobler.
5 Bare øke membran spenningen.
6 Fosfolipider som kan danne gigantiske unilamellar blemmer gjelder, men giga-forseglingen kan ikke oppnås.

Tabell 1: Karakteristika av ulike lipid bilayer membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CBB metoden av lipid bilayer formasjon er basert på prinsippet om en vann-i-olje dråpe omgitt av en monolayer20. Teknisk, prosedyrene for å danne CBBs er enkel, spesielt for patch-klemme forskere, som er dyktige i å manipulere glass Mikropipetter. Elektrofysiologiske oppsettet for oppdateringen klemmen brukes lett CBB når to pipette manipulators med microinjectors er tilgjengelige. På den annen side, fordi CBB er en etterfølger av den konvensjonelle PLB, som mye mekanisk-kunnskap er akkumulert8, denne bakgrunnen samt kunnskap om overflatekjemi38 er nyttig for drift og manipulere CBBs. CBB serverer en allsidig plattform for å studere kanal-membran interplays med sin evne til å endre kjemiske sammensetning og fysiske status61. I CBB, lipider fôr boblen kan diffus fritt over grensen monolayer fase og brosjyre av bilayer, og vi har utviklet teknikker som bilayer fest-koble membran perfusjon metoder45. Vi har utvidet CBBs for i vitro kanal proteinsyntese, der kanalen syntese ble utført i boblen, og nylig syntetisert kanal proteiner ble utsatt for spontane overføring til bilayer under bruk av en membran potensial hvor begynnende kanal funksjoner KcsA kanalen ble sporet fra tidspunktet for initiering transkripsjon/oversettelsen av KcsA DNA62.

Blant trinnene av protokollen, opprettholde boblestørrelsen er avgjørende. Bobler kan sakte svelle eller krympe spontant fordi lipid overføring til grensesnittet er langsom og monolayer spenningen er utsatt for endring. Spesielt den første boblen oppblåst etter sugekraft liposome løsningen (trinn 4.8.3 og 4.10) er vanskelig å opprettholde, fordi monolayer spenningen senkes med i liposomer samlet på spissen av pipette. Forkaster den første bobler og påfølgende dannelsen av bobler gir stabil CBB. Visuell sporing av boblestørrelsen og finjustering av trykket er nødvendig.

Det er eksperimentell begrensninger for metoden CBB. Selv om CBB er utformet for elektrofysiologiske målinger, motstand av bilayer for visse lipid komposisjoner kan ikke høy nok (f.eks100 GΩ) for én kanal innspillinger. For eksempel dioleoyl phosphatidylcholine brukes ofte til liposomer, men utgjør elektrisk leaky CBBs på 25 ° C63. CBBs kan ikke selv være dannet med lipid arter som fase overgangen er opptak temperaturen. Faktisk CBB formasjon var vanskelig med dipalmitoyl phosphatidylcholine ved romtemperatur, men øke temperaturen over Tm omgås det problem64. I disse eksperimentene, temperaturen var kontrollert ved å bruke en gjennomsiktig varme plate (se Tabell for materiale) under lysbildet glass62. Fase overgang temperaturen på brukte lipid diphytanoyl phosphatidylcholine er under 0 ° C 65CBBs er lett dannet32,45,51 på et bredt temperaturområde.

Fosfolipider av vann-olje grensesnittet tilbys fra enten lipid-in eller lipid ut metoden, der overføringshastigheten er relativt lavere i lipid-out enn i lipid-i metoden63. I tillegg for ukjente grunner er motstand av bilayer membranen relativt mindre med metoden lipid ut enn med metoden lipid-i.

Protokollen (trinn 4.8), liposomer og kanal-rekonstituert liposomer (1 µL) er lastet fra spissen av Pipetter (trinn 4.9 og 4.10), og resten av pipette inneholder tidligere fylt elektrolytt-løsning. Dette er bare for å bevare materialer som lipider og kanal molekyler. Derfor liposomer diffus gradvis mot øvre pipette-løsning, og etter en stund, lipid konsentrasjonen på spissen av pipette blir nok til skjemaet lipid monolayers. I dette tilfellet bør frisk liposome løsning være aspirated fra spissen (trinn 4.8). Denne timelige konsentrasjon endring kan omgås når det hele pipette er fylt med løsningen inneholder lipider og kanal molekyler, mens liposomer gradvis bosette seg i bobler. I dette tilfellet er bobler fornyet.

Electrophysiologically, er CBB større enn oppdateringen klemmen, dermed gir en større membran kapasitans. Men serien motstand (motstand i en rekke membran motstand) er mye lavere (~ 100 kΩ) enn for oppdateringen klemmen (pipette motstand > 1 MΩ), som akselererer hastigheten av spenning klemmen og demper bakgrunnsstøyen og serien motstand feil i spenning-festet membran potensialer66,67,68. Bakgrunnsstøy er en funksjon av membran kapasitans og serien motstanden, der en lav serien motstand utfyller en høy membran kapasitans, noe som resulterer i lav bakgrunn støy9.

Som regel lipid bilayer eksperimenter bør vaskemidler ikke brukes til å vaske glass. Enda et spor beløp av vaskemiddel perturbs integriteten til bilayer. Organiske løsemidler som kloroform/metanol og etanol skal brukes til slike rengjøring formål i stedet.

Samlet integrerer CBB fordelene med både oppdateringen klemmen (f.eks, mekanisk manipulering av membranen) og PLB (f.eks, endre lipid sammensetningen av membranen). Ulike typer kanal-forming stoffer og kanal proteiner har vært studert52,53,69,70. Utviklingen av denne metoden er beleilig siden stadig mer forskere fokuserer på kanal-membran samspillet og CBB gir en allsidig plattform for forskjellige eksperimenter. Videre er eksperimentell utviklingen i metoden CBB forventet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har noen interessekonflikt avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Mariko Yamatake og Masako Takashima for teknisk assistanse. Dette arbeidet var støttes delvis av KAKENHI gi nummer 16H 00759 og 17 H 04017 (SO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer Associates Inc. Sunderland. (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. New York. (2009).
  8. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer. New York. (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. Tokyo. 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033 (2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a, Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110 (2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , Springer. New York. (2003).
  39. Butt, H. -J., Kappl, M. Surface and Interfacial Forces. , Wiley-VCH. Weinheim. (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. Miller, C. , Springer. New York. 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857 (2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , Springer. (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. Biochemistry. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. Biochemistry. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782 (2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, Suppl. 1 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochemistry. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it's a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , In Press (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Tags

Nevrovitenskap problemet 143 Lipid Bilayer Patch klemme vann-i-olje dråpe Monolayer Ion kanal elektrofysiologi overflatekjemi
Lipid Bilayer eksperimenter med kontakt boble Bilayers for oppdateringen-Clampers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter