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Neuroscience

Lípidos bicapa experimentos con bicapas de burbuja contacto para parche-abrazaderas

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la formación de bicapas lipídicas soportadas utilizando un método de contacto burbuja bicapa. Se sopla una burbuja de agua en un solvente orgánico, por el que se forma una monocapa en la interfase agua-aceite. Dos pipetas son manipulados para acoplar las burbujas para formar una bicapa.

Abstract

Bicapas de lípidos proporcionan una plataforma experimental única para estudios funcionales de los canales iónicos, permitiendo el examen de las interacciones membrana-canal bajo membrana varias composiciones de lípidos. Entre ellos, la bicapa de la interfaz de gota ha ganado popularidad; sin embargo, el tamaño grande de la membrana impide la grabación de bajo ruido eléctrico. Hemos establecido un método de contacto burbuja bicapa (CBB) que combina los beneficios de la bicapa lipídica planar y métodos de la abrazadera del remiendo, como la capacidad para variar la composición de lípidos y de manipular a los mecánicos de la bicapa, respectivamente. Usando la configuración para los experimentos de patch-clamp convencionales, experimentos basados en el CBB se pueden fácilmente realizar. En Resumen, la solución de un electrolito en una pipeta de vidrio está fundida en una fase solvente orgánica (hexadecano), y la presión de la pipeta se mantiene para conseguir un tamaño de burbuja estable. La burbuja está llena espontáneamente de una monocapa de lípidos (lípidos puros o mezcla de lípidos), que se proporciona de liposomas en las burbujas. A continuación, se acoplan las dos burbujas revestimiento de monocapa (~ 50 μm de diámetro) en la punta de las pipetas de vidrio para la formación de la bicapa. Introducción de liposomas canal reconstituido en la burbuja conduce a la incorporación de canales en la bicapa, lo que permite un canal grabación actuales con una relación señal a ruido comparable a la de grabaciones de patch-clamp. CBB con una composición asimétrica de los lípidos se forma fácilmente. El enganche se renueva varias veces soplar las burbujas anteriores y formando otras nuevas. Diversas perturbaciones químicas y físicas (e.g., perfusión de membrana y la bicapa tensión) pueden ser impuestas en el CBB. adjunto, presentamos el procedimiento básico para la formación del CBB.

Introduction

De canales iónicos de la membrana celular no es simplemente un material de apoyo sino un socio para generar el flujo de iones. Funcionalmente, la membrana es un aislador eléctrico en que ion canales están integrados, y todas las membranas celulares son impartidas con un potencial de membrana de reposo. Convencionalmente, se impuso una potencial arbitrario de la membrana de un circuito externo por el cual se midió la corriente eléctrica a través de los canales. Esta evaluación cuantitativa del flujo de iones en potenciales de membrana diferentes reveló las propiedades moleculares de estos canales, como su permeabilidad ion selectivo y bloquea funciones1,2. La plataforma para estudios funcionales de los canales iónicos de membrana es la membrana celular o la membrana de bicapa lipídica. Históricamente, solo canal eléctricas actuales grabaciones se realizaron primero en bicapas de lípidos3,4, y las técnicas relevantes fueron desarrolladas para las membranas celulares, como el método de patch-clamp (figura 1A )5,6. Desde entonces, estas dos técnicas han evolucionado por separado para diferentes propósitos (figura 1)7,8.

Lípidos de membrana y membranas bicapa son actualmente el foco de investigación para su papel en el apoyo a la estructura y función de proteínas de canal. Por lo tanto, la disponibilidad inmediata de los métodos para variar la composición de lípido en bicapas está en alta demanda. Lípidos bicapa formación métodos, como la plana lípidos bicapa (PLB)8,9,10,11, gota de agua en aceite bicapa12y gota interfaz bicapa (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 técnicas (figura 1) son opciones comunes, proporcionando una oportunidad para examinar la función de canal en diferentes composiciones de lípidos20. Aunque el DIB es técnicamente mucho más fácil de producir que la PLB convencional, el gran tamaño de la DIB ha creado un desincentivo para abrazaderas de parche aplicar para el estudio de grabaciones actuales monocanal con conductancia generalmente tamaño (< 100 pS).

Para evitar el ruido de fondo, debe minimizarse el área de la bicapa. Este tema recuerda las repeticiones de la historia en el desarrollo de técnicas electrofisiológicas para bicapas de lípidos (figura 1). En los primeros días, una bicapa de pequeño tamaño (1-30 μm de diámetro) se formó en la punta de una pipeta (método de inmersión en punta; Figura 1 C) 21 , 22 , 23, en lugar de usar una bicapa independiente (~ 100 μm de diámetro) en un tabique hidrofóbico en una cámara (figura 1B). El método de inmersión en punta para mediciones eléctricas con mucho más bajo de ruido de fondo24. Nuestras experiencias con25,26de PLB, punta-dip22,23,27y abrazadera del remiendo28,29,30, 31 métodos nos llevaron a una idea novedosa de formar bicapas de lípidos mediante el uso de los principios de la bicapa de agua en aceite. Nos hemos referido a esto como la burbuja contacto método bicapa (CBB)20,32. En este método, en lugar de colgar las gotitas de agua en una fase de aceite (figura 1D), una burbuja de agua está fundida de una pipeta de vidrio (con diámetro de punta de aproximadamente 30 μm) en la fase de aceite (figura 1E y 2), donde el la burbuja se mantiene mediante la aplicación de una presión constante. Una forma de capa monomolecular espontáneamente en la interfase agua-aceite en la superficie de la burbuja. A continuación, dos burbujas se acoplan a través de la manipulación de dos pipetas de vidrio y la bicapa está formada como las dos monocapas aproximan, dando un área de bicapa de equilibrio. El tamaño de la burbuja es controlado por la presión intra-burbuja (con presión) y además el tamaño de la bicapa. Con frecuencia se utiliza un diámetro promedio de 50 μm. Aunque el volumen de la burbuja es pequeño (< 100 pL), está conectado con el mayor volumen de la solución de la pipeta que está en la gama de microlitro, constituyendo la fase de electrólito a granel.

Hay muchos beneficios al utilizar el método de enganche (tabla 1). Como una técnica de formación de bicapa lipídica, pueden producir membranas de varias composiciones de lípidos y membranas asimétricas son más fácilmente formada32 que son los del método plegable convencional33. La bicapa se puede manipularse mecánicamente, a diferencia de la PLB convencional que sólo se puede doblar con una diferencia de presión hidrostática34,35. Cambiando la presión de la tenencia, las burbujas expansión o encogen, conduciendo a aumento o disminución de la membrana de tensión32. La bicapa es mecánicamente desmontable en monocapas, similares a la congelación de la fractura técnica36,37 de membranas en estudios morfológicos, pero con el enganche, una maniobra permite separar y fijar ciclos32 repetidos . El pequeño volumen de la solución electrolítica dentro de la burbuja permite eficiente fusión de liposomas canal reconstituido en la bicapa, y la probabilidad de obtener grabaciones de canal es mucho mayor que con la técnica convencional de la PLB. El volumen de la burbuja pequeña también permite perfusión rápida (dentro de ~ 20 ms) inyección una vez otra pipeta se introduce en cualquiera de las burbujas. A diferencia del método de la abrazadera del remiendo, una vez roto, una membrana CBB nuevamente se forma inmediatamente y en varias ocasiones, y pipetas pueden utilizarse varias veces al día. Mediante la integración de beneficios de los métodos de la PLB y abrazadera del remiendo, el enganche esférico proporciona una plataforma versátil para variar las condiciones fisicoquímicas de la membrana, permitiendo estudios sin precedentes de las interacciones membrana-canal.

Antes de presentar un protocolo detallado del proceso de formación de CBB, el fondo fisicoquímico de la formación de la bicapa se presenta primero, que será útil para parche-abrazaderas resolver las dificultades experimentales relativos a la formación de la membrana se encuentran.

Experimentos CBB imparten lecciones de química superficial ciencia38. El CBB es similar a una burbuja de jabón soplada de una pajita en el aire, donde además, se sopla una burbuja de agua en un solvente orgánico. Uno notará que una burbuja de agua apenas se infla cuando lípidos de membrana no están incluidos en la burbuja de agua o en solvente orgánico. En la ausencia de lípidos anfipáticos, la tensión superficial en una interfase agua-aceite es alta y la presión intra-burbujas para soplar una burbuja será alta. Se trata de una realización de la ecuación de Laplace (ΔP = γ/R 2, donde ΔP es la presión intra-burbuja, γ es la tensión superficial y R es el radio de la burbuja). Cuando la concentración de lípidos en la fase orgánica o en la solución de electrolitos es alta, aumenta la densidad de los lípidos en la monocapa, dictadas por el isoterma de adsorción de Gibbs (-dγ = Γ, donde Γ es el exceso de superficie del compuesto i y μ es el potencial químico del componente i)39, conduce a una baja tensión superficial y facilitar la formación de burbujas. En el enganche, la bicapa puede ser observada desde un ángulo tangencial (figura 2), y el ángulo de contacto entre el monocapa y bicapa es mensurable. Este ángulo representa un equilibrio entre la surface tensions de la monocapa y bicapa (ecuación joven: γbi = γmo cos(θ), donde γbi es la tensión de la bicapa,mo γ es la tensión de la monocapa, y θ es el ángulo de contacto). Los cambios en el ángulo de contacto indican cambios en la tensión de la bicapa, ya que la tensión de la monocapa se evalúa de los cambios en el ángulo de contacto en función de la membrana potencial (ecuación Young-Lippmann: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), donde Cm es la capacitancia de la membrana, V es el potencial de membrana y θ0 y θv son los ángulos de contacto 0 y V mV, respectivamente)40,41 ,42. Cuando dos burbujas se encuentra lo suficientemente cercanas, se acercan entre sí espontáneamente. Esto es debido a las fuerzas de van der Waals, y visualmente podemos observar este proceso dinámico de formación de CBB.

Un sistema CBB consta de distintas fases: a saber, una fase de aceite a granel, agua burbujas recubiertas con una capa monomolecular y una bicapa contacto (figura 3). Estos son una reminiscencias de las múltiples fases observadas en un PLB, como un toro que contiene el solvente en la fase de la bicapa y una fase orgánica fina intercalada por dos monocapas43,44. En el enganche, la fase de monocapa es continua con el folleto de la bicapa, y moléculas de lípidos fácilmente difusión entre el monocapa y el folleto. La fase de monocapa cubre la mayor parte de la superficie de la burbuja, que constituye la fase principal que sirve como un reservorio de lípidos. Ya que la cola hidrofóbica de los lípidos en la monocapa se extiende hacia afuera a la fase de aceite a granel, el interior de la bicapa o el núcleo hidrofóbico se abre a la fase de aceite a granel. Así, una sustancia hidrofóbica que inyecta en la fase de aceite cerca de la bicapa es capaz de acceder fácilmente al interior de la bicapa. Esta es la técnica de perfusión de membrana que habíamos desarrollado recientemente45, por la que la composición de lípidos de la bicapa se cambia rápidamente (dentro de un segundo) durante grabaciones actuales de un canal. Encontramos que el contenido de colesterol en la bicapa puede ser reversible controlado por conectar/desconectar la perfusión de colesterol45. En caso de que la concentración de la sustancia en la monocapa y bicapa difiere, el gradiente de la concentración de la sustancia se disuelve inmediatamente a través de la difusión, que se conoce como el efecto de Marangoni46, 47. por otra parte, flip-flop a través de los monocapas son lento48,49,50.

Usando el método de enganche, la bicapa está formada bajo condiciones fisicoquímicas versátiles, como un pH del electrolito como 1 51, una concentración de sal (K+, Na+, etcetera.) hasta 3 M, un tan alta como ±400 mV del potencial de la membrana y un sistema de temperatura de 60 ° C.

Hay varias opciones para la formación de la CBB y la incorporación de moléculas de canal en el mismo. Para la formación de la monocapa en la interfase agua-aceite, se añaden lípidos en un disolvente orgánico (método de lípidos; Figura 4 A, C 4) o en una burbuja como liposomas (método de lípidos; Figura 4 B, 4 D). En particular, el método de lípidos permite la formación de membranas asimétricas15,32. Moléculas de canal solubles en solución acuosa(por ejemplo, el canal formando péptidos) se agregan directamente en la burbuja (figura 4A, B)52,53, mientras que las proteínas de canal son reconstituidas en liposomas, que se añaden en la burbuja (figura 4C, D). En este documento, la formación de CBB por el método de lípidos para un péptido canal (polytheonamide B (pTB); Figura 4 A) o una proteína (canal de potasio de la emisora KcsA, figura 4C).

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Protocol

1. preparar liposomas

  1. Dispersar los fosfolípidos (por ejemplo, 10 mg en polvo) en cloroformo a una concentración deseada (p. ej., 10 mg/mL).
  2. Evaporar el cloroformo.
    1. Lugar la solución de fosfolípidos en un matraz de fondo redondo y el conjunto en un evaporador rotatorio (véase Tabla de materiales) conectado a un cilindro de gas N2 . Gire el frasco bajo el flujo de N2 a temperatura ambiente hasta que aparezca una película fina de fosfolípido (después de ~ 30 min).
    2. Coloque el frasco abierto en un desecador que está conectado a una bomba de vacío. Usando la bomba de vacío, aspirar dentro del desecador durante varias horas para eliminar completamente el cloroformo.
  3. Añadir un volumen adecuado de la solución de un electrolito al matraz y suspender el fosfolípido para obtener un 2 mg/mL suspensión de fosfolípidos.
  4. Someter a ultrasonidos la suspensión de varias decenas de segundos, utilizando un sonicador de baño (véase Tabla de materiales) para obtener una suspensión de varias capas vesícula (MLV).
  5. Para la preparación de proteoliposomes que contienen proteínas de canal del ion, agregar una solución de proteína (con las proteínas solubilizadas con detergentes adecuados; 2% del volumen es el máximo) a la suspensión MLV y someter a ultrasonidos durante varios segundos con el sonicador de baño.

2. preparar pipetas de vidrio de gran diámetro

  1. Establece un vaso capilar en un tirador de la pipeta y fabricar Micropipetas con una punta cónica fina a través de dos etapas tirando.
  2. La micropipeta en un microforge y póngase en contacto con la punta de la micropipeta a un filamento de platino en la porción cónica con un diámetro de 30 a 50 μm.
  3. Calentar el filamento brevemente (5 s) y apague inmediatamente.
    Nota: Esta manipulación se forma una grieta en la calefacción del punto, por el que la punta de la micropipeta se corta, dejando un gran agujero con un diámetro de 30 a 50 μm.

3. tratamiento de la superficie del portaobjetos de vidrio con un bajo bien cóncavo (Siliconization para un acabado repelente al agua)

  1. Limpie la superficie de lo portaobjetos de vidrio con un pozo poco profundo con agua destilada y etanol.
  2. Aplicar un volumen adecuado (por ejemplo, 100 μL) de un reactivo siliconado (repelente al agua) en el agujero deslizante de vidrio.
  3. Secar el reactivo totalmente en el aire.
  4. Coloque el portaobjetos de cristal sobre la platina de un microscopio invertido.

4. forma el CBB y realizar mediciones electrofisiológicas

  1. Añada 100 μl de hexadecano en pozos poco profundos del vidrio siliconado agujero deslizante.
    Nota: Para el método de lípidos, los fosfolípidos se dispersan en hexadecano (20 mg/mL) previamente.
  2. Llenar la solución electrolítica a mitad de la longitud de la micropipeta, utilizando una jeringa de tuberculina.
  3. Establecer la micropipeta en el soporte de una micropipeta con un puerto de presión, permitiendo que el electrodo de Ag/AgCl alambre en remojo en la solución de electrólito de la pipeta.
  4. Conecte uno de los titulares de la micropipeta a la etapa principal de un amplificador de la abrazadera del remiendo y el otro a tierra.
  5. Conecte una microinyectora para el puerto de presión del titular de la micropipeta.
  6. Establezca la micropipeta en una posición adecuada sobre el escenario de un microscopio invertido mediante la manipulación del instrumental quirúrgico.
  7. Ajustar el desplazamiento del electrodo potencial.
    1. Lugar 1 μl de la solución de electrólito mismo solía llenar la micropipeta en la superficie plana alrededor de los pozos poco profundos de la agujero deslizante de vidrio, creando una cúpula de electrolito.
    2. Moje la punta de dos Micropipetas en la cúpula de electrolitos mediante la manipulación del instrumental quirúrgico.
    3. Ajustar el electrodo potencial offset del amplificador de patch-clamp.
    4. Rompiendo el CBB para confirmar el correcto desplazamiento al final de los experimentos a través de la aplicación de un alto potencial de membrana (avería eléctrica; uso de Zap en el amplificador), haciendo que las dos burbujas para ser fundidos en uno (fusión de la burbuja).
    5. Corregir la ensambladura líquida potencial54 en los casos donde se utilizan soluciones electrolíticas asimétrica, tal que el valor calculado se añade a la membrana aplicada potencial para el verdadero potencial de la membrana.
      Nota: La ensambladura líquida potencial se calcula usando el programa JPCalc55.
  8. Extraer la solución liposomada de la punta.
    Nota: Cuando se examinan los canales soluble en agua usando el método de lípidos, aspiración de la solución liposomada no es necesario.
    1. Coloque 1 μl de solución de liposomas en la superficie plana alrededor de los pozos poco profundos del vidrio agujero deslizante (cúpula que contiene liposomas).
    2. Manipular el instrumental quirúrgico e inserte la punta de la micropipeta en la cúpula que contiene liposomas.
    3. Aspirar la solución que contiene liposomas bajando la presión dentro de la titular de la micropipeta utilizando la microinyectora.
    4. Repita el procedimiento para la otra pipeta.
  9. Manipular el instrumental quirúrgico y sumerja la punta de la micropipeta en el hexadecano en pozos poco profundos.
  10. Sople una burbuja de agua poco a poco aumentando la presión hasta que la burbuja alcanza el tamaño deseado (por ejemplo, 50 μm de diámetro) y mantener la misma presión después de eso.
  11. Deseche las burbujas al pasar la punta a través de la interfaz de aire de aceite si es difícil de mantener estable el tamaño de las burbujas.
  12. Repita los pasos de 4.8 a 4.9 hasta que se forman burbujas estables.
  13. Manipular las burbujas para permitir el contacto entre ellos (figura 5).
    Nota: A veces, las burbujas acercan espontáneamente para formar el CBB. En otros casos, las burbujas están cercanas pero no en contacto con ellos. En este caso, empujar las burbujas entre sí mecánicamente.
  14. Ajustar la presión para mantener el tamaño de la burbuja, porque el tamaño puede cambiar poco a poco incluso en la presión intra-burbuja constante.
  15. Fijar la membrana potencial en el valor adecuado usando el amplificador de patch-clamp y esperar a que el canal actual a emerger (figura 6).

5. medir la capacitancia de la bicapa

  1. Medir la capacitancia eléctrica de bicapa (Cel) aplicando una rampa de potencial.
    Nota: Cuando la tasa de cambio de voltaje en el comando de la rampa es 10 mV/10 ms (o 1 V/s) seguido de-10 mV/10 ms, la amplitud del salto actual sobre cambios en la pendiente corresponde a la lectura del valor de membrane'scapacitance (p. ej. 100 pA → 100 pF).
  2. Evaluar el área de la bicapa de dos burbujas apilados uno sobre el otro y enfocar el microscopio en el plano de la bicapa para ver el borde de la bicapa (figura 6).
    Nota: La forma de bicapa sobre todo es circular, y se calcula el área del radio.
  3. Calcular la capacitancia de membrana específicos (Csp) dividiendo la capacitancia eléctrica de la zona de la bicapa (Csp = Cel/A).
  4. Calcular el espesor de la bicapa (grueso del núcleo hidrofóbico) usando Dc = (εrε0) /Csp (donde εr y ε0 representan la permitividad de la región hidrofóbica de la bicapa y la permitividad de vacío, respectivamente).

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Representative Results

Un enganche típico tenía un diámetro de 50 μm (figura 56) y la capacitancia de membrana específicos en hexadecano fue 0.65 μF/cm2. El tamaño de la burbuja fue arbitrariamente controlado por la presión intra-burbuja. Cuando pequeñas burbujas son necesarias para grabaciones de poco ruido, el diámetro de la punta debe ser correspondientemente pequeño. Por ejemplo, para un tamaño de burbuja de 50 μm de diámetro, el diámetro de la punta debe ser 30 μm.

Una vez que había formado el CBB, las moléculas de canal en solución acuosa o en el liposoma espontáneamente fueron insertadas en la bicapa en un lapso de unas pocas decenas de minutos. Inserción de los canales fue confirmada por el aumento progresivo de la amplitud actual (figura 7) con el potencial de membrana aplicada. El área más pequeña de la membrana (< 1.000 μm2) con respecto a que en la convencional PLB y DIB sistemas mejoraron sustancialmente la relación señal a ruido eléctrica.

Las grabaciones actuales podrían ser continuadas hasta que la membrana se interrumpió y se fusionaron las dos burbujas. Nuevas burbujas fueron explotadas y el enganche esférico formado inmediatamente y en varias ocasiones. La pipeta puede utilizar en varias ocasiones dentro de un día.

Ciclo de adjuntar y separar. Una bicapa formada por el método de enganche puede ser desintegrada en dos monocapas. Separar-adjuntar de la CBB puede repetirse manipulando las dos burbujas (ciclo de trabajo de detach-attach). Este proceso fue supervisado por la aparición de la corriente del canal de parto prematuro, un canal de péptido de una esponja marina, como fue insertado fácilmente en el bilayer del lípido para formar un poro selectivo de cationes monovalentes52,56. El canal de pTB actual surgió inmediatamente después de instalar las dos monocapas, y la corriente se convirtió en más grande como el área de contacto mayor (figura 8). La amplitud de la corriente se sincronizó con el detach-Fije la manipulación de la CBB.

Las mediciones de un canal del canal de la emisora KcsA. El canal de potasio de la emisora KcsA es pH sensible, siendo activado por el pH ácido intracelular57. Por lo tanto, la solución electrolítica fue fijada para ser asimétrica58,59,60. En el paso 4.2 de formación CBB, la solución de la pipeta del lado izquierdo se fijó en pH 4, mientras que la de la derecha fue fijada en pH 7.525. En paso 4.7.1, una suspensión de proteoliposome, en lugar de suspensión de liposomas, se colocó sobre el vidrio de la diapositiva para la aspiración en la pipeta de izquierda. En consecuencia, el canal de la emisora KcsA fue orientado en la membrana con su dominio citoplásmico hacia la burbuja izquierda. Liposomas con la relación de peso de proteína: lípidos de 1: 2000 son adecuados para un canal grabación actual y aquellos con un 1:10 cociente son para la grabación actual macroscópico.

Membrana asimétrica. Una bicapa lipídica asimétrica puede ser formado usando suspensiones de liposomas diferentes para cada burbuja (lípido-en)15,32. La orientación del canal de la emisora KcsA de la membrana fue regulada mediante el establecimiento de un pH de solución asimétrica (pH 4en/pH 7hacia fuera), hacia que lado citoplasmático hacia el lado izquierdo. En consecuencia, la izquierda fue asignada como"," mientras que el lado derecho fue asignado como "out." Para examinar la dependencia de lípidos en la compuerta del canal de la emisora KcsA, se utilizaron cuatro tipos de CBB (incluyendo un CBB asimétrica); es decir, PGen/PGhacia fuera, PGen/PChacia fuera, PCen/PGhacia fueray PCen/PCa (PG: fosfatidilglicerol) (figura 9). El canal de la emisora KcsA exhibe alta probabilidad abierto (> 90%) solo en los PGen/PGhacia fuera y PG/PCa membranasin. El canal de la emisora KcsA requiere la existencia de los fosfolípidos aniónicos en el folleto interior de la membrana para un alta probabilidad abierta26.

Figure 1
Figura 1 : Lípidos bicapa y abrazadera del remiendo métodos. Varios métodos han sido desarrollados para la formación de la bicapa lipídica. (A) método Patch-clamp. (B) lípido planar convencional bicapa método, que proporciona una bicapa independiente, sobre todo vertical, en un pequeño agujero. Método (C) Punta-dip. Una monocapa en la interfase aire-agua se coloca en la punta de un electrodo de vidrio. Se han desarrollado diversas modificaciones. (D) gota interfaz bicapa método. (E) en contacto con el método de burbuja bicapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 2
Figura 2 : En contacto con la formación de burbujas bicapa. Como se sopla una burbuja en una fase de aceite, las moléculas de lípido transferencia espontáneamente a la interfaz agua-aceite. Diferentes tipos de lípidos como liposomas están incluidos en cada una burbuja (lípido-in), y monocapas son formadas exclusivamente por los lípidos pertinentes. Acoplamiento de dos monocapas genera una membrana bicapa asimétrica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 3
Figura 3 : Distinct fases en el bilayer del contacto de la burbuja y la dinámica de los lípidos en esto. Guarnición de la burbuja de lípidos constituyen una fase donde pertenecen a una monocapa o una bicapa. Flip-flop de lípidos a través de la bicapa es infrecuente, y la membrana asimétrica se mantiene durante mucho tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 4
Figura 4 : Entrega de lípidos con el método de salida de lípidos o lípidos en. Los lípidos se agregan en un solvente orgánico (lípido-out; A y C) o en solución acuosa como liposomas (lípido-en; B y D). En el método de lípidos, se forma una membrana asimétrica. Canal formando sustancias que son solubles en solución acuosa (azul), tales como péptidos, se agregan en una de las burbujas y espontáneamente se inserta en la bicapa. En el método de lípidos, se inserta una parte de los canales en liposomas, que luego se fusionan a la bicapa. Proteínas de canal (rojo) se reconstituyen en liposomas en el método de salida de lípidos o lípidos en, que se agregan luego en una de las burbujas y espontáneamente unida a la bicapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 5
Figura 5 : Imagen microscópica de contacto y formación de la burbuja bicapa. La bicapa se observa desde una dirección tangencial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 6
Figura 6 : Observación de la bicapa para medir el área de bicapa. Dos burbujas se apilan uno sobre el otro mediante la manipulación de la pipeta, y el microscopio se centra a nivel de la bicapa de contacto de la burbuja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 7
Figura 7 : Inserción gradual del canal de la emisora KcsA en la membrana del bilayer burbuja contacto. El E71A mutante del canal de la emisora KcsA fue utilizado para demostrar la detección inmediata de los canales insertados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 8
Figura 8 : Separar-fije de monocapas y las respuestas de los canales. Un canal de péptido, polytheonamide B, fue añadido en una de las burbujas, que luego fue espontáneamente incorporado a la membrana. Cuando, los canales en la membrana se retiran pero se conservaron en el folleto de la membrana del lado canal añadido. En archivo adjunto, los canales fueron insertados en la membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 9
Figura 9 : Formación de una actividad asimétrica membrana y canal, depende de la composición del prospecto. El canal de la emisora KcsA está regulado por ácidos lípidos, como el PG, en el folleto interior de la membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

PLB convencional Parche de liposomas DIB CBB
Tasa de éxito1 alta baja muy alta muy alta
Inmediata reformability2 No intermedio
Membrana asimétrica No
Intercambio de solución lento muy rápido lento rápido
Relación señal/ruido3 baja alta baja alta
Deformación de la membrana No No No 4
Manipulación mecánica No 5
Perfusión de membrana No No
Composiciones de lípidos diversas limitada6 diversas diversas
1 La tasa de éxito de la formación de bilayer del lípido estable por ensayo.
2 Formación de una nueva membrana rápidamente después descomponen de una membrana. Además, la membrana está formada repetidamente.
3 La relación de señal a ruido (S/N) representa el principal de ruido eléctrico de fondo generado a partir de la capacitancia de la membrana.
4 Cóncava o convexa de la membrana puede ser formada aplicando diferentes presiones internas entre dos burbujas.
5 Sólo aumentando la tensión de la membrana.
6 Los fosfolípidos que se pueden formar vesículas unilaminar gigante son aplicables, pero el giga-sello no puede ser logrado.

Tabla 1: Características de varias membranas de bicapa lipídica.

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Discussion

El método de enganche de la formación de la bicapa de lípidos se basa en el principio de una gotita de agua en aceite, revestido por una monocapa20. Técnicamente, los procedimientos para la formación de CBB son fáciles, especialmente para los investigadores de la abrazadera del remiendo, que son expertos en manipular Micropipetas de vidrio. La configuración electrofisiológica para la abrazadera del remiendo se utiliza fácilmente en el CBB cuando dos manipuladores de la pipeta con micromanipuladores disponibles. Por otro lado, porque el enganche esférico es un sucesor de la PLB convencional, para que una gran cantidad de conocimiento fisicoquímico ha sido acumulado8, este fondo así como conocimiento de la química superficial38 es útil para el funcionamiento y manipulando el CBB. El enganche sirve una plataforma versátil para el estudio de canal-membrana contemplación con su capacidad de modificar la composición química y estado físico61. En CBB, lípidos recubren la burbuja pueden difundir libremente a través de la frontera de la fase de monocapa y folleto de la bicapa, y hemos desarrollado técnicas como conexión-desconexión de la bicapa y la membrana perfusión métodos45. Hemos ampliado CBB para en vitro canal síntesis de la proteína, donde realizaron la síntesis del canal en la burbuja, y las proteínas recién sintetizadas canal fueron sometidas a transferencia espontánea a la bicapa bajo la aplicación de un potencial de membrana donde las funciones del naciente canal del canal de la emisora KcsA trazó desde el momento de iniciar la transcripción y traducción del ADN de la emisora KcsA62.

Entre los pasos del Protocolo, es esencial mantener el tamaño de la burbuja. Las burbujas lentamente pueden se hinchan o encogen espontáneamente porque la transferencia de lípidos a la interfaz es lenta y la tensión de la monocapa es propensa a cambiar. En particular, la primera burbuja inflada justo después de succión de la solución de liposomas (pasos 4.8.3 y 4.10) es difícil de mantener debido a la tensión de la monocapa se baja por los liposomas acumulado en la punta de la pipeta. Descartando las burbujas iniciales y la formación subsecuente de burbujas proporcionan el CBB estable. Seguimiento visual del tamaño de burbuja y ajuste fino de la presión son necesarios.

Hay limitaciones experimentales el método de enganche. Aunque el enganche está diseñado para mediciones electrofisiológicas, la resistencia eléctrica de la bicapa de ciertas composiciones de lípidos puede no ser lo suficientemente alta (p. ej., GΩ 100) para las grabaciones de un canal. Por ejemplo, dioleoyl fosfatidilcolina se utiliza con frecuencia para liposomas, pero es eléctricamente agujereado CBB en 25 ° C63. CBB no puede formarse incluso con especies de lípidos cuya temperatura de transición de fase es superior a la temperatura de la grabación. De hecho, CBB formación fue difícil con el phosphatidylcholine del dipalmitoyl a temperatura ambiente, pero aumento de la temperatura por encima de Tm eludieron el problema64. En estos experimentos, la temperatura fue controlada mediante el uso de una placa de calor transparente (véase Tabla de materiales) debajo de la diapositiva de cristal62. La temperatura de transición de fase de la lípidos utilizados diphytanoyl fosfatidilcolina está por debajo de 0 ° C 65y CBB es fácilmente formada32,45,51 en un rango de temperatura amplio.

Los fosfolípidos de la interfaz agua-aceite son proporcionados desde cualquiera de los dos el método lípido o lípido, donde la tasa de transferencia es relativamente más lenta en la salida de lípidos que en el método de lípidos63. Además, por razones desconocidas, la resistencia eléctrica de la membrana bicapa es relativamente más pequeña con el método de lípidos que con el método de lípidos.

En el protocolo (paso 4.8), una solución de liposomas y liposomas canal reconstituido (1 μl) se carga desde la punta de la pipeta (pasos 4.9 y 4.10), y el resto de la pipeta contiene la solución electrolítica previamente llenada. Esto es sólo para la conservación de materiales, tales como lípidos y moléculas de canal. En consecuencia, los liposomas se difunden gradualmente hacia la solución de la parte superior de la pipeta, y después de un tiempo, la concentración de lípidos en la punta de la pipeta se vuelve insuficiente para monocapas de lípidos de forma. En este caso, Solución Liposomada fresco debe ser aspirada desde la punta (paso 4.8). Este cambio de concentración temporal puede eludirse cuando la pipeta entera se llena con la solución que contiene lípidos y moléculas de canal, mientras que los liposomas se establecen gradualmente en las burbujas. En este caso, las burbujas se renuevan.

Electrophysiologically, el tamaño CBB es mayor que la de la abrazadera del remiendo, produciendo así una mayor capacitancia de la membrana. Sin embargo, la resistencia en serie (la resistencia eléctrica en una serie de resistencia de la membrana) es mucho menor que para la abrazadera del remiendo (pipeta resistencia > 1 MΩ), que acelera la velocidad de la abrazadera de tensión y atenúa el ruido de fondo (~ 100 kΩ) serie resistencia a errores y en la membrana de tensión fijada potenciales66,67,68. El ruido de fondo es una función de la capacitancia de la membrana y la resistencia en serie, donde una resistencia serie baja complementa una capacitancia elevada de la membrana, resultando en bajo fondo ruido9.

Como regla general de experimentos de la bicapa de lípidos, detergentes no puede usarse para lavar material de vidrio. Incluso una cantidad de rastro de detergente perturba la integridad de la bicapa. Solventes orgánicos tales como Cloroformo/metanol y el etanol puede usarse para tales propósitos de la limpieza en su lugar.

En general, la CBB integra los beneficios de la abrazadera del remiendo (p. ej., la manipulación mecánica de la membrana) y la PLB (p. ej., la capacidad de modificar la composición de lípidos de la membrana). Varios tipos de sustancias formadoras de canal y las proteínas de canal han sido estudiados52,53,69,70. El desarrollo de este método es oportuno ya que cada vez más investigadores se centran en la interacción del canal de la membrana y el CBB ofrece una plataforma versátil para varios experimentos. Además se espera evolución experimental en el método de enganche.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de interés que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Mariko Yamatake y Masako Takashima para asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por KAKENHI grant números 16H 00759 y 17 H 04017 (SO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)
Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

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Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid BilayerMore

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

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