Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lipid lipidens experiment med kontakt bubbla lipidmonolager för Patch-låskretsar

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för bildandet av lipid lipidmonolager med en kontakt bubbla lipidens metod. En vatten bubbla blåses in i ett organiskt lösningsmedel, whereby en enskiktslager bildas i vatten-olja-gränssnittet. Två pipetter är manipulerade docka bubblorna för att bilda en lipidens.

Abstract

Lipid lipidmonolager ger en unik experimentell plattform för funktionella studier av jonkanaler, vilket gör att undersökningen av kanal-membran interaktioner under olika membran lipider kompositioner. Bland dem, har den droplet gränssnitt lipidens vunnit popularitet; dock hindrar stort membran storlek inspelning av låga elektriska bakgrundsljud. Vi har etablerat en kontakt bubbla lipidens (CBB) metod som kombinerar fördelarna med planar lipid lipidens och patch-clamp metoder, såsom förmågan att variera lipid sammansättning och att manipulera lipidens mekanikerna, respektive. Med hjälp av setup för konventionella patch-clamp experiment, utföras CBB-baserade experiment lätt. I korthet en elektrolytlösning i glas pipett blåses in i ett organiskt lösningsmedel fas (hexadecane) och pipett trycket upprätthålls för att erhålla en stabil bubblornas storlek. Bubblan är spontant fodrad med en lipid enskiktslager (ren lipider eller blandade lipider), som ges från liposomer i bubblorna. Nästa, de två enskiktslager-fodrade bubblorna (~ 50 µm i diameter) på spetsen av glas pipetter är dockade för lipidens bildandet. Införsel av kanal-färdigberett liposomer bubblan leder till inkorporeringen av kanaler i den lipidens, möjliggör enkanalig pågående inspelning med en signal-brus-förhållande jämförbar med patch-clamp inspelningar. CBBs med en asymmetrisk lipid sammansättning bildas lätt. CBB förnyas flera gånger med blåser ut tidigare bubblor och bildar nya. Olika kemiska och fysiska störningar (t.ex., membran perfusion och lipidens spänningar) kan åläggas den CBBs. häri presenterar vi den grundläggande proceduren för CBB bildandet.

Introduction

Jonkanaler är cellmembranet inte bara ett stödjande material utan en partner för att generera den ion fluxen. Funktionellt, membranet är en elektrisk isolator som ion kanaler är inbäddade, och alla cellmembran är förmedlas med en vilande membranpotential. Konventionellt, infördes en godtycklig membranpotential från en yttre krets som elektrisk ström genom kanaler mättes. Denna kvantitativa utvärderingen av ion flux på olika membran potentialer avslöjade dessa kanaler, såsom deras jonselektiva genomträngning och Usenets funktioner1,2molekylära egenskaper. Membranet plattformen för funktionella studier av jonkanaler är antingen cellmembranet eller lipid lipidens membranet. Historiskt, enkanalig elektriska aktuella registreringar utfördes först i lipid lipidmonolager3,4och de relevanta teknikerna utvecklades för cellmembran, såsom metoden patch-clamp (figur 1A )5,6. Sedan dess har har dessa två tekniker utvecklats separat för olika ändamål (figur 1)7,8.

Membran lipider och lipidens membran är för närvarande i fokus för forskning för sina roller i att stödja struktur och funktion av kanal proteiner. Snabb tillgång till metoder att variera lipid sammansättningen i lipidmonolager är därför i hög efterfrågan. Lipid lipidens bildandet metoder såsom den planar lipid lipidens (PLB)8,9,10,11, vatten-i-olja droplet lipidens12och droplet gränssnitt lipidens (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 tekniker (figur 1) är gemensamma val, vilket ger en möjlighet för att undersöka funktionen kanal under varierande lipid kompositioner20. Även om DIB är tekniskt enklare att producera än de konventionella PLB, storleken på DIB har skapat en avskräckande för patch-låskretsar att tillämpa den för att studera enkanalig nuvarande inspelningar med vanliga medelstora konduktans (< 100 pS).

För att kringgå bakgrundsljud, måste området lipidens minimeras. Denna fråga påminner om repetitioner av historia i utveckla elektrofysiologiska tekniker för lipid lipidmonolager (figur 1). I början bildades en små lipidens (1-30 µm i diameter) på spetsen av en pipett (tip-dip metod. Figur 1 C) 21 , 22 , 23, i stället för att använda en fristående lipidens (~ 100 µm i diameter) på en hydrofoba septum i en kammare (figur 1B). Tip-dip metoden möjliggjorde elektriska mätningar med mycket lägre bakgrund buller24. Våra erfarenheter med PLB25,26, tip-dip22,23,27och patch-clamp28,29,30, 31 metoder ledde oss till en ny idé att bilda lipid lipidmonolager med hjälp av principerna för den vatten-i-olja lipidens. Vi har hänvisat till detta som kontakt bubbla lipidens (CBB) metod20,32. I denna metod, snarare än hängande vattendropparna i en olja fas (figur 1D), en vatten bubbla blåses från glas pipett (med spets diameter av ungefärligt 30 µm) in i olja fas (figur 1E och 2), där den bubbla upprätthålls genom att tillämpa ett fast tryck. En enskiktslager bildar spontant på gränssnittet vatten-olja på ytan av bubblan. Sedan två bubblor är dockade genom manipulering av två glas pipetter och lipidens bildas när de två enskiktslager närmar varandra, vilket ger en jämvikt lipidens område. Storleken på bubblan styrs av intra-bubble trycket (hålla trycket) och jämväl lipidens storlek. En genomsnittlig diameter av 50 µm används ofta. Även om volymen av bubblan är liten (< 100 pL), den är ansluten till den större volymen av pipett lösningen som är i intervallet mikroliter, som utgör den bulk elektrolyt fasen.

Det finns många fördelar med att använda metoden CBB (tabell 1). Membran av olika lipid kompositioner kan produceras som en lipid lipidens bildandet teknik, och asymmetrisk membran är lättare bildas32 än de av de konventionella vikning metod33. Lipidens kan manipuleras mekaniskt, till skillnad från den konventionella PLB som endast kan böjas med ett hydrostatiskt tryck skillnaden34,35. Genom att ändra anläggningen trycket, bubblorna antingen Förstora eller förminska, leder till ökad eller minskad membran spänning32. Lipidens är mekaniskt löstagbar i enskiktslager, liknar de frysa-fraktur teknik36,37 membran i morfologiska studier, men med CBB, en manöver möjliggör upprepade lossa och fästa cykler32 . Den lilla volymen av elektrolytlösning inom bubblan tillåter effektiv fusion av kanal-färdigberett liposomer till lipidens och sannolikheten att få kanal inspelningar är mycket högre än med konventionella PLB tekniken. Liten bubbla volymen kan också snabba perfusion (inom ~ 20 ms) en gång en annan injektion pipett infogas antingen av bubblor. Till skillnad från metoden patch-clamp, när brutit, CBB membran bildas igen omedelbart och upprepade gånger, och pipetter kan användas flera gånger om dagen. Genom att integrera fördelarna med patch-clamp och PLB metoder, ger CBB en mångsidig plattform för att variera de fysikalisk-kemiska förhållandena av membranet, så att för oöverträffad studier av kanal-membran interaktioner.

Innan vi presenterar en detaljerad protokollet av CBB bildandet processen, presenteras fysikalisk bakgrund av lipidens bildandet första, som kommer att vara till hjälp för patch-låskretsar att lösa experimentella svårigheter avseende membran bildandet som påträffas.

CBB experiment ge lektioner i ytkemi vetenskap38. CBB är lik en såpbubbla som blåst från ett sugrör i luften, där jämväl, en vatten bubbla blåses in i ett organiskt lösningsmedel. Man kommer att märka att en vatten bubbla knappast är uppblåst när membran lipider inte ingår i antingen vatten bubblan eller organiska lösningsmedel. I avsaknad av sulfat lipider, ytspänningen på ett vatten-olja-gränssnitt är hög och intra-bubble trycket för att blåsa en bubbla kommer att vara hög. Detta är ett förverkligande av Laplace ekvation (ΔP = 2 γ/R, där ΔP är intra-bubble trycket, γ är ytspänningen och R är radien bubbla). När koncentrationen av lipider i antingen den organiska fasen eller elektrolytlösningen är hög, tätheten av lipider i enskiktslager ökar, som dikteras av den Gibbs adsorption isotherm (-dγ = Γjag dµjag, där Γjag är ytan överskottet av förening jag och µjag är kemiska potentialen för komponenten jag)39, leder till en lägre ytspänning och användarvänlighet bubbla bildandet. I CBB, lipidens kan observeras från en tangentiell vinkel (figur 2) och kontakt vinkeln mellan enskiktslager och lipidens är mätbara. Denna vinkel representerar en equilibrium mellan surface tensions av enskiktslager och lipidens (unga ekvation: γbi = γmo cos(θ), där γbi är lipidens spänningen, γmo är enskiktslager spänningen och θ är den kontakta vinkeln). Förändringarna i kontaktvinkel ange förändringar i lipidens spänningen, tanke på att enskiktslager spänningen utvärderas från förändringar i kontaktvinkel som en funktion av membranet potential (ung-Lippmann ekvation: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), där Cm är den membran kapacitansen, V är membranpotentialen och θ0 och θv är kontakt vinklarna vid 0 och V mV, respektive)40,41 ,42. När två bubblor är tillräckligt nära, närmar de sig varandra spontant. Detta är på grund av van der Waals kraften, och vi kan visuellt Observera denna dynamiska process i CBB formation.

Ett CBB-system består av olika faser: nämligen en bulk olja fas, vatten bubblor belagd med en enskiktslager och en kontakta lipidens (figur 3). Dessa är som påminner om flera faser i en PLB, såsom lösningsmedel innehållande torus runt den lipidens och en tunn organisk fas inklämt av två enskiktslager43,44. I CBB, fasen enskiktslager är kontinuerlig med lipidens bipacksedeln och lipid molekyler diffunderar lätt mellan enskiktslager och bipacksedeln. Den enskiktslager fasen omfattar de flesta av bubbla ytan, som utgör den stora fasen som fungerar som en reservoar som lipid. Eftersom hydrofoba svansen av lipider i enskiktslager sträcker sig utåt till bulk olja fas, öppnar lipidens inredningen eller hydrofoba kärnan till bulk olja fas. En hydrofob substans som injiceras in i olja fas nära lipidens är alltså kunna lätt komma åt lipidens interiören. Detta är den membran perfusion teknik vi hade utvecklat nyligen45, som lipid sammansättningen i lipidens ändras snabbt (inom en sekund) under kanal nuvarande inspelningar. Vi hittade att kolesterolhalten i lipidens reversibelt kunde kontrolleras genom stänger kolesterol perfusionen på45. I händelse av att koncentrationen av det aktuella ämnet i enskiktslager och lipidens skiljer sig, upplösas koncentrationsgradient av den relevanta substansen omedelbart genom diffusion, som är känd som den Marangoni effekt46, 47. däremot, flip-flops över enskiktslager är långsam48,49,50.

Använder metoden CBB lipidens bildas under mångsidig fysikalisk-kemiska förhållanden, såsom en elektrolyt pH så lågt som 1 51, en salt (K+, Na+, etc.) koncentration upp till 3 M, en så hög som ±400 mV membranpotentialen och ett system temperatur på upp till 60 ° C.

Det finns flera alternativ för bildandet av CBB och införlivandet av kanal molekyler däri. För bildandet av enskiktslager i vatten-olja-gränssnittet läggs lipider antingen i ett organiskt lösningsmedel (lipid-ut metoden. Figur 4 A, 4 C) eller i en bubbla som liposomer (lipid-i metod. Figur 4 ” B, 4 D). Särskilt, tillåter lipid-i metoden bildandet av asymmetriska membran15,32. Kanal-molekyler som är lösliga i vattenlösning (t.ex., kanal-bildar peptider) läggs direkt in i den bubbla (figur 4A, B)52,53, medan kanal proteiner är beredd till liposomer, som läggs sedan in i bubblan (figur 4C, D). Häri, bildandet av CBBs av lipid-i-metoden för antingen en kanal peptid (polytheonamide B (pTB); Figur 4 A) eller ett protein (KcsA kaliumkanal, figur 4C) visas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbered liposomer

  1. Skingra fosfolipider (t.ex., 10 mg i pulver) i kloroform vid en önskad koncentration (t.ex., 10 mg/mL).
  2. Avdunsta kloroform.
    1. Plats fosfolipid lösningen i en runda-botten kolven och ställ den på en rotationsindunstare (se Tabell för material) ansluten till gasflaskan N2 . Rotera kolven under N2 flöde i rumstemperatur tills en tunn fosfolipid film visas (efter ~ 30 min).
    2. Placera öppna kolven i exsickator som är ansluten till en vakuumpump. Med hjälp av vakuum pumpen, aspirera insidan av exsickatorn för flera timmar att ta bort kloroform grundligt.
  3. Lägga till en lämplig volym av en elektrolytlösning till kolven och avbryta den fosfolipid för att erhålla en 2 mg/mL fosfolipid suspension.
  4. Sonikera upphängningen för flera tiotals sekunder med hjälp av ett bad någon sonikator (se Tabell för material) för att erhålla en multilayered vesikler (MLV) suspension.
  5. För beredning av proteoliposomes som innehåller ion kanal proteiner, lägga till en protein lösning (med de proteiner som solubilized med lämpligt tvättmedel; 2% volym är högst) till MLV upphängningen och Sonikera i flera sekunder med den bad någon sonikator.

2. Förbered stora-Bore glas pipetter

  1. Ställ ett glas kapillär till en pipett avdragare och fabricera Mikropipetter med en fin avsmalnande spets genom två steg att dra.
  2. Mikropipett på en microforge och kontakta mikropipett till en platina glödtråden på den koniska delen spets med en diameter på 30 till 50 µm.
  3. Värma glödtråden kort (5 s) och omedelbart stänga av den.
    Obs: Detta manipulation bildar en spricka vid uppvärmning peka, whereby spetsen av en mikropipett klipps av, lämna ett stort hål med en diameter på 30 till 50 µm.

3. behandla ytan på glasskiva med ett grunt konkav väl (Siliconization för en vattenavvisande Finish)

  1. Rengöra ytan på glasskiva med ett grunt väl med destillerat vatten och etanol.
  2. Applicera en lämplig volym (t.ex., 100 µL) ett siliconizing reagens (vattenavvisande) på hålet bild glaset.
  3. Torka reagensen helt i luften.
  4. Placera glasskiva på scenen av en inverterade Mikroskop.

4. bilda CBB och utföra Elektrofysiologisk mätning

  1. Tillsätt 100 µL av hexadecane i grunda brunnen av silikoniserat hål skjut glaset.
    Obs: För lipid-ut metoden, fosfolipider är spridda i hexadecane (20 mg/mL) i förväg.
  2. Fyll elektrolytlösningen upp till halva längden av en mikropipett, med en tuberkulin spruta.
  3. Ange mikropipett på mikropipett innehavaren med en tryck-port, vilket gör att tråden Ag/Granulatfyllda att suga in pipett elektrolytlösningen.
  4. Anslut en mikropipett innehavare till huvud scenen av en patch-clamp förstärkare och den andra till elektriska marken.
  5. Anslut en microinjector till trycket porten av innehavaren av mikropipett.
  6. Ange mikropipett till en lämplig position ovanför scenen av en inverterade Mikroskop genom att manipulera micromanipulator.
  7. Justera förskjutningen för elektrod potential.
    1. Plats 1 µL av samma elektrolytlösning används för att fylla mikropipett på den plana ytan runt grunda brunnen av hål skjut glaset, skapa en elektrolyt kupol.
    2. Blötlägg spetsen på båda Mikropipetter i elektrolyten kupolen genom att manipulera micromanipulator.
    3. Justera elektrod offset potential för patch-clamp förstärkaren.
    4. Bekräfta rätt offset i slutet av experiment genom att bryta CBB genom tillämpning av en hög membranpotential (elektrisk uppdelning; med Zap på förstärkaren), orsakar två bubblor för att vara smält till en (bubbla fusion).
    5. Korrigera den flytande junction potentiella54 i de fall där asymmetriska elektrolyt lösningar används, så att det beräknade värdet läggs till tillämpad membranet potential för den sanna membranpotentialen.
      Obs: Den flytande junction potentiella beräknas med hjälp av programmet JPCalc55.
  8. Rita Liposom lösningen från spets.
    Obs: När vattenlösliga kanaler undersöks med hjälp av metoden lipid-out, sugning av Liposom lösningen är inte nödvändigt.
    1. Placera 1 µL Liposom lösning på den plana ytan runt grunda brunnen av hål skjut glaset (Liposom-innehållande dome).
    2. Manipulera micromanipulator och sätt spetsen på mikropipett i Liposom-innehållande kupolen.
    3. Aspirera Liposom-innehållande lösningen genom att sänka trycket inuti hållaren mikropipett med hjälp av microinjector.
    4. Upprepa proceduren för den andra pipetten.
  9. Manipulera micromanipulator och doppa spetsen av en mikropipett i hexadecane i den grunda brunnen.
  10. Blåsa en bubbla i vattnet sakta genom att öka trycket tills bubblan når önskad storlek (t.ex., 50 µm i diameter) och behålla samma tryck därefter.
  11. Kassera bubblor genom att passera spetsen genom gränssnittet olja-luft om det är svårt att hålla storleken på bubblorna stabilt.
  12. Upprepa steg 4,8 till 4,9 tills stabil bubblor bildas.
  13. Manipulera bubblor för att möjliggöra kontakt mellan dem (figur 5).
    Obs: Ibland, bubblorna närma varandra spontant för att bilda CBB. I andra fall bubblorna är nära men kontaktar inte varandra. I detta fall driva bubblorna varandra mekaniskt.
  14. Finjustera trycket att bibehålla bubbelstorlek, eftersom storleken kan gradvis förändra även vid konstant intra-bubbla trycket.
  15. Ange membranet potential till lämpligt värde med hjälp av patch-clamp förstärkaren och vänta på kanalen som är aktuella att dyka upp (figur 6).

5. Mät lipidens kapacitans

  1. Mäta den lipidens elektrisk kapacitansen (Cel) genom att tillämpa en ramp som är potentiella.
    Obs: När förändringstakten den spänning i kommandot ramp är 10 mV/10 ms (eller 1 V/s) följt av-10 mV/10 ms, amplituden av nuvarande hoppet vid ändringar i lutningen motsvarar Läs membrane'scapacitance värde (t.ex. 100 pA → 100 pF).
  2. Utvärdera området lipidens i två bubblor staplade en på annat och fokusera mikroskopet på lipidens nivå Visa kanten av lipidens (figur 6).
    Obs: Lipidens formen är mestadels cirkulär och området beräknas från radien.
  3. Beräkna den specifika membran-kapacitansen (Csp) genom att dividera den elektriska kapacitansen av området lipidens (Csp = Cel/A).
  4. Beräkna lipidens tjocklek (tjocklek av hydrofoba core) med Dc = (εrε0) /Csp (där εr och ε0 representerar Dielektricitetskonstant lipidens hydrofoba region och Dielektricitetskonstant av vakuum, respektive).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En typisk CBB hade en diameter av 50 µm (figur 56) och den specifika membran kapacitansen i hexadecane var 0,65 µF/cm2. Bubbelstorleken kontrollerades godtyckligt av intra-bubble trycket. När små bubblor är nödvändiga för låg ljudnivå inspelningar, bör spets diameter vara motsvarande små. Till exempel för en bubbelstorlek 50 µm i diameter, bör spets diameter vara 30 µm.

När CBB hade bildat, infördes kanal molekylerna i vattenlösning eller i Liposom spontant lipidens inom loppet av några tiotals minuter. Införande av kanalerna bekräftades av en stegvis ökning av nuvarande amplitud (figur 7) under den tillämpade membranpotentialen. Området mindre membran (< 1000 µm2) klimatuppvärmningspotential i konventionella PLB och DIB system väsentligen förbättrat det elektriska signal-brus-förhållandet.

Aktuella inspelningar kan pågå tills membranet stördes och de två bubblorna samman. Nya bubblor blåstes och CBB bildade omedelbart och upprepade gånger. Pipetten kan användas upprepade gånger inom en dag.

Duty cycle av bifoga och lossa. En lipidens bildas av metoden CBB kan vara desintegrerade in i två enskiktslager. Lossa-bifoga av CBB kan upprepas genom att manipulera de två bubblorna (månadskapacitet för detach-attach). Denna process var övervakas av utseendet på kanal strömmen av pTB, en peptid kanal från en marin svamp, så det var lätt infogas i den lipid lipidens att bilda en monovalent katjon-selektiv pore52,56. PTB kanalen nuvarande uppstod omedelbart efter fästa de två enskiktslager, och nuvarande blev större som kontaktytan ökat (figur 8). Amplituden av nuvarande synkroniserades med detach-bifoga manipulation av CBB.

Enkanalig mätningar av KcsA kanalen. KcsA kaliumkanal är pH-känsliga, aktiveras av sura intracellulära pH57. Således sattes elektrolytlösningen vara asymmetriska58,59,60. I steg 4,2 i CBB bildandet sattes pipett lösningen på vänster sida vid pH 4, på höger sida var fastställa pH 7.525. I steget 4.7.1 placerades en proteoliposome suspension, i stället för Liposom fjädring, på bilden glaset för aspiration i vänster pipetten. Följaktligen var kanalen KcsA orienterade i membranet med dess cytoplasmiska domänen inför vänster bubblan. Liposomer med protein: lipid viktförhållandet mellan 1: 2000 är lämpliga för enkanalig nuvarande inspelning och de med en 1:10 baserat är för makroskopisk pågående inspelning.

Asymmetrisk membran. En asymmetrisk lipid lipidens kan bildas med olika Liposom suspensioner för varje bubbla (lipid-in)15,32. Orienteringen för KcsA kanalen i membranet reglerades genom att ange en asymmetrisk lösning pH (pH 4i/pH 7ut), vilket leder till dess cytoplasmiska sida vara mot vänster sida. Följaktligen tilldelades till vänster som ”i”, medan höger sida tilldelades som ”out”. För att undersöka lipid beroendet gating KcsA kanal, användes fyra typer av CBB (inklusive en asymmetrisk CBB); nämligen, PGi/PGut, PGi/Stut, PCi/PGut, och PCi/Stut (PG: phosphatidylglycerol) (figur 9). Kanalen KcsA uppvisade hög öppen sannolikhet (> 90%) endast i PGi/PGut och PGi/Stut membran. KcsA kanalen kräver förekomsten av anjon fosfolipider i den inre bipacksedeln av membranet för en öppen kickprobability26.

Figure 1
Figur 1 : Lipid lipidens och patch-clamp metoder. Olika metoder har utvecklats för att bilda den lipid lipidens. (A) Patch-clamp metod. (B) konventionell planar lipid lipidens metod, som ger en fristående, mestadels vertikal, lipidens på ett litet hål. (C) Tip-dip metod. En enskiktslager i luft-vatten-gränssnittet är placerad på toppen av en glaselektrod. Olika ändringar har utvecklats. (D) droplet lipidens gränssnittsmetod. (E) kontakta bubbla lipidens metod. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 2
Figur 2 : Kontakta bubbla lipidens bildandet. Som en bubbla blåses in i en olja fas, överföra lipid molekyler spontant till vatten-olja-gränssnittet. Olika typer av lipider som liposomer ingår i varje bubbla (lipid-i), och enskiktslager är bildat uteslutande av de relevanta lipider. Dockning två enskiktslager genererar en asymmetrisk lipidens membran. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 3
Figur 3 : Distinct faser i den kontakt bubbla lipidens, och dynamiken i lipider däri. Lipider foder bubblan utgör en fas där de tillhör antingen en enskiktslager eller en lipidens. Flip-flop av lipider över lipidens är ovanlig, och asymmetrisk membranet finns kvar under lång tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 4
Figur 4 : Levererar lipider med metoden lipid-out eller lipid-i. Lipider läggs antingen i ett organiskt lösningsmedel (lipid-ut; A och C) eller i vattenlösning som liposomer (lipid-i; B och D). I metoden lipid-i bildas en asymmetrisk membran. Kanal-bilda ämnen som är lösliga i vattenlösning (blå), till exempel peptider, läggs in i ett av bubblor och spontant infogas i lipidens. I metoden lipid-i infogas en del av kanalerna i liposomer, som smälts sedan till lipidens. Kanal proteiner (röd) är färdigberett i liposomer i antingen lipid-out eller lipid-i metoden, som sedan läggs in i ett av bubblor och spontant smält till lipidens. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 5
Figur 5 : Bildning och mikroskopisk bild av kontakten bubbla lipidens. Lipidens observeras från en tangentiell riktning. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 6
Figur 6 : Observation av lipidens för att mäta området lipidens. Två bubblor är staplade en på annan genom pipett manipulation, och Mikroskop är inriktad på nivån för den kontakt bubbla lipidens. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 7
Figur 7 : Stegvis införande av KcsA kanalen i kontakt bubbla lipidens membranet. E71A mutant KcsA kanalen användes för att Visa omedelbar upptäckt av de infogade kanalerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 8
Figur 8 : Detach-bifoga enskiktslager och svaren kanaler. En peptid kanal, polytheonamide B, lades in i ett av bubblor, som inkorporerades sedan spontant i membranet. När fristående, kanaler i membranet återtog men behölls på membran bipacksedeln av kanal-lagt till sida. Vid kvarstad, fördes kanalerna in i membranet. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 9
Figur 9 : Bildandet av en asymmetrisk membran och kanal aktivitet beroende på sammansättningen av bipacksedeln. Kanalen KcsA regleras av sura lipider, såsom PG, i den inre bipacksedeln av membranet. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Konventionella PLB Liposom patch DIB CBB
Framgång kurs1 hög låg mycket hög mycket hög
Omedelbar reformability2 Ja Nej mellanliggande Ja
Asymmetrisk membran Ja Nej Ja Ja
Lösning exchange långsam mycket snabb långsam snabb
S/N-förhållande3 låg hög låg hög
Membranet deformation Nej Nej Nej Ja4
Mekanisk manipulation Nej Ja5 Ja Ja
Membranet perfusion Nej Nej Ja Ja
Lipid kompositioner olika begränsade6 olika olika
1 Andelen framgångsrika bildar stabila lipid lipidens per studie.
2 Bildandet av ett nytt membran snabbt efter bryter ner av ett membran. Dessutom bildas membran flera gånger.
3 Förhållandet signal-brus (S/N) representerar den elektriska bakgrund buller primära genereras från den membran kapacitansen.
4 Konkav eller konvex membran kan bildas genom att tillämpa olika inre tryck mellan två bubblor.
5 Endast ökar membran spänningen.
6 Fosfolipider som kan bilda giant unilamellar blåsor är tillämpliga, men giga-tätningen kan inte uppnås.

Tabell 1: Kännetecken för olika lipid lipidens membran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden CBB för lipid lipidens bildandet är baserad på principen om en vatten-i-olja droplet kantad av en enskiktslager20. Tekniskt, förfarandena för att bilda CBBs är lätt, särskilt för patch-clamp forskare, som är skicklig på att manipulera glas Mikropipetter. Den elektrofysiologiska setup för patch klämman används lätt i CBB när två pipett manipulatorer med microinjectors finns tillgängliga. Däremot, eftersom CBB är en efterträdare av den konventionella PLB, för vilket en stor mängd fysikalisk kunskap har varit ackumulerade8, denna bakgrund samt kunskap om ytkemi38 är bra för drift och manipulera CBBs. CBB serverar en mångsidig plattform för att studera kanal-membran samspelar med sin förmåga att ändra kemiska sammansättning och fysiska status61. I CBB, lipider foder bubblan kan diffusa fritt över gränsen av enskiktslager fas och bipacksedel av lipidens, och vi har utvecklade tekniker såsom lipidens bifoga-lossa och membran perfusion metoder45. Vi har utökat CBBs för in vitro- kanal proteinsyntesen, där kanal syntes utfördes i bubblan, och nyligen syntetiserade kanal proteiner utsattes för spontana överföring till lipidens under tillämpningen av en membranpotential där spårades begynnande kanal funktioner av KcsA kanalen från tiden av initiera transkription/översättning av KcsA DNA62.

Bland steg i protokollet, att upprätthålla bubbelstorleken är kritisk. Bubblorna kan långsamt svälla eller krympa spontant eftersom lipid transfer till gränssnittet är långsam och enskiktslager spänningen är benägen att förändras. Särskilt den första bubblan uppblåsta strax efter sugning av Liposom lösningen (steg 4.8.3 och 4.10) är svåra att underhålla eftersom enskiktslager spänningen sänks av liposomer ackumulerad vid spetsen på pipetten. Kasta bort de första bubblorna och efterföljande bildandet av bubblorna ger stabil CBB. Visuell spårning av bubbelstorlek och finjustering av trycket är nödvändiga.

Det finns experimentella begränsningar CBB-metoden. Även CBB är avsedd för elektrofysiologiska mätningar, det elektriska motståndet av lipidens för vissa lipid kompositioner kanske inte är tillräckligt högt (t.ex., 100 GΩ) för enkanalig inspelningar. Till exempel dioleoyl fosfatidylkolin används ofta för liposomer, men det bildar elektriskt läckande CBBs vid 25 ° C63. CBBs kan ännu inte bildas med lipid arter vars fas övergångstemperaturen ligger över inspelningen temperaturen. Faktiskt, CBB bildandet var svårt med dipalmitoyl fosfatidylkolin i rumstemperatur, men att höja temperaturen över Tm kringgått de problem64. I dessa experiment, temperaturen kontrollerades med hjälp av en transparent värme platta (se Tabell för material) bredvid bilden glas62. Fas övergångstemperaturen av den vanliga lipid diphytanoyl fosfatidylkolin är under 0 ° C 65, och CBBs är lätt bildas32,45,51 på ett brett temperaturområde.

Fosfolipider av vatten-olja-gränssnittet tillhandahålls från antingen lipid-i lipid-ut metoden eller, där överföringshastigheten är relativt långsammare i lipid-out än i de lipid-i metod63. Dessutom, av okänd anledning är det elektriska motståndet av lipidens membranet relativt mindre med lipid-ut metoden än med metoden lipid-i.

I protokollet (steg 4,8), en lösning av liposomer och kanal-färdigberett liposomer (1 µL) läses från spetsen på pipetten (steg 4.9 och 4.10), och resten av pipetten innehåller tidigare fyllda elektrolytlösningen. Detta är bara för att bevara material, såsom lipider och kanal molekyler. Följaktligen liposomer diffusa gradvis mot den övre pipett lösningen, och efter ett tag, lipid koncentrationen vid spetsen av pipetten blir otillräcklig till formuläret lipid enskiktslager. I det här fallet bör färsk Liposom lösning vara aspirerade från spets (steg 4,8). Ändringen temporal koncentration kan kringgås när hela pipetten är fylld med lösningen innehållande lipider och kanal molekyler, medan liposomer gradvis bosätta sig i bubblorna. I det här fallet förnyas bubblor.

Elektrofysiologiskt, är CBB större än den patch clamp, vilket ger en större membran kapacitans. Men serien motstånd (det elektriska motståndet i en serie av membran motstånd) är mycket lägre (~ 100 kΩ) än för patch klämman (pipett motstånd > 1 MΩ), som accelererar hastigheten på spänningen klämman och dämpar bakgrundsljud och serien motstånd fel i spänning-fastklämd membranet potential66,67,68. Bakgrund buller är en funktion av den membran kapacitansen och serien motståndet, där en låg serie motstånd kompletterar en hög membran kapacitans, vilket resulterar i låg bakgrund buller9.

Som regel av lipid lipidens experiment användas rengöringsmedel att tvätta glas. Ännu ett spår mängd tvättmedel perturbs integriteten för lipidens. Organiska lösningsmedel såsom kloroform/metanol och etanol bör användas för sådana rengöring ändamål istället.

Sammantaget integrerar CBB fördelarna med både patch klämman (t.ex., mekanisk manipulation av membranet) och PLB (t.ex., förmågan att ändra lipid sammansättningen av membranet). Olika typer av kanal-bilda ämnen och kanal proteiner har varit studerade52,53,69,70. Utvecklingen av denna metod är lägligt eftersom allt fler forskare fokuserar på kanal-membran samspelet, och CBB ger en mångsidig plattform för olika experiment. Ytterligare förväntas experimentella utvecklingar i CBB metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Mariko Yamatake och Masako Takashima för tekniskt bistånd. Detta arbete var stöds delvis av KAKENHI grant nummer 16H 00759 och 17 H 04017 (SO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer Associates Inc. Sunderland. (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. New York. (2009).
  8. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer. New York. (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. Tokyo. 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033 (2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a, Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110 (2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , Springer. New York. (2003).
  39. Butt, H. -J., Kappl, M. Surface and Interfacial Forces. , Wiley-VCH. Weinheim. (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. Miller, C. , Springer. New York. 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857 (2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , Springer. (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. Biochemistry. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. Biochemistry. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782 (2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, Suppl. 1 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochemistry. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it's a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , In Press (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Tags

Neurovetenskap fråga 143 Lipid lipidens Patch Clamp vatten-i-olja Droplet enskiktslager jonkanal elektrofysiologi ytkemi
Lipid lipidens experiment med kontakt bubbla lipidmonolager för Patch-låskretsar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter