Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8⁺ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Summary

Vi beskriver her en protokol for at undersøge cytotoksicitet af pre-aktiveret CD8⁺ T celler mod kræftceller ved at afsløre apoptotiske kræft celler via real-time mikroskopi. Denne protokol kan undersøge mekanismerne bag myeloide celler-induceret T celle undertrykkelse og evaluere forbindelser sigter efterfyldning T celler via blokade af immun suppressiv myeloide celler.

Abstract

Potensering af tumor-drab evne til CD8⁺ T celler i tumorer, sammen med deres effektive tumor infiltration, er et centralt element i vellykket immunoterapi. Flere undersøgelser har vist, at tumor infiltrerer myeloide celler (fx myeloid-afledte suppressor celler (MDSCs) og tumor-associerede makrofager (TAMs)) undertrykke cytotoksicitet af CD8⁺ T-celler i tumor mikromiljø, og at målrette disse lovgivningsmæssige myeloide celler kan forbedre immunoterapi. Vi præsenterer her, en in vitro assay system for at vurdere immun suppressiv virkninger af monocytic-MDSCs og TAMs på tumor-drab evne til CD8⁺ T celler. Til dette formål, vi først kulturperler naive milt CD8⁺ T-celler med anti-CD3/CD28 aktiverende antistoffer i tilstedeværelse eller fravær af suppressor celler, og derefter Co kulturperler pre-aktiveret T celler med målrette kræftceller i tilstedeværelse af en fluorogenic caspase-3 substrat. Fluorescens fra substrat i kræftceller blev opdaget af real-time Fluorescens mikroskopi som en indikator for T-celle induceret tumor celle apoptose. I denne analyse, kan vi med succes afsløre stigning af tumor celle apoptose af CD8⁺ T celler og dets undertrykkelse af pre kultur med TAMs eller MDSCs. Denne funktionelle analyse er nyttige for efterforskningen CD8⁺ T celle undertrykkelse mekanismer af regulerende myeloide celler og identificerer druggable mål at overvinde det via high throughput screening.

Introduction

Det er kendt at CD8⁺ T celler kan fjerne tumorceller, når de udøver deres fulde cytotoksicitet. Efter aktivering af T-celle receptoren (TCR), CD8⁺ T celler formere sig og differentiere sig til cytotoksiske effektor celler. Den udvidede og aktiverede CD8⁺ T celler udskiller cytotoksiske granulat, herunder perforin og granzymes, der overføres til target-cellerne og indlede forskellige lytisk veje såsom caspase-3 medieret apoptose¹. CD8⁺ T celler kan også inducere tumor celle apoptose ved aktivering receptorer på target-cellerne, såsom receptorer for tumor nekrose faktor-α (TNF-α), første apoptose signal ligand (FasL) eller TNF-relaterede apoptose-inducerende ligand (spor). Desuden aktiveres CD8⁺ T celler udskiller interferon-γ (IFN-γ), der kan undertrykke tumor celleproliferation og øge følsomheden af tumorceller til CD8⁺ T-celler via op-regulering af FasL receptor¹. I lyset af potentialet for CD8⁺ T tumor drab evne, flere strategier til at øge deres cytotoksicitet (f.eks. checkpoint hæmmere, kræft vaccination og adoptiv overførsel af kimære antigen receptor (bil) udtrykker T-celler) er blevet etableret og vist betydelige terapeutiske virkninger på visse typer af kræft². Dog, akkumulere beviser tyder på, at tumor infiltrerer immun celler som regulerende T-celler, myeloid-afledte suppressor celler (MDSCs), og tumor-associerede makrofager (TAMs) kan undertrykke CD8⁺ T celle funktioner og begrænse effekten immunoterapi^3,4,5. For at forbedre sådanne immunoterapi, det er vigtigt at forstå, hvordan immun suppressor celler grænse CD8⁺ T-celle cytotoksicitet. Identifikation af CD8⁺ T-celle undertrykkelse mekanismer samt druggable mål at overvinde det, vil kræve udvikling og udnyttelse af in vitro-assays.

Guld standard metode til måling af CD8⁺ T-celle cytotoksicitet er chrom release analysen, hvor frigivelsen af den radioaktive sonde (⁵¹Cr), fra target celler der er mængden af CD8⁺ T-celler, er fast besluttet på⁶. Denne analyse har dog flere ulemper, herunder relativt lav følsomhed, høj baggrund, manglende evne til at opdage tidlige apoptotiske hændelser, farlige bortskaffelse problemer og begrænset kompatibilitet med automatiseret flydende håndtering og registrering for at støtte højere overførselshastighed applikationer. En anden fælles metode er flow cytometric analyser, hvor apoptose af mål tumorceller registreres af annexin V bindende⁷. I denne analyse er det muligt at opdage andre parametre såsom target celledød ved hjælp af propidium Iodid (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og effektor celle aktivering angivet ved CD107a eller CD69 udtryk, ud over apoptose i målcellerne⁷ . Denne analyse kræver imidlertid stort antal suppressor celler i forhold til chrom release assay. Det kræver også detachment og opdeling af vedhængende målcellerne og dette kan bias resultaterne. Faktisk, chrom frigive assay eller flow cytometric analyse ikke er almindeligt anvendt til at undersøge suppressor celle effekter på T-cellefunktioner. I stedet, måling af T-celle spredning angivet ved fortynding af et fluorescerende farvestof (f.eks. CFSE) pre-loaded ind i T-celler er ofte bruges til at evaluere hæmning af CD8⁺ T-cellefunktion af suppressor celler. Påvisning af IFN-γ produktion fra kulturperler T celler er en anden standard metode til at vurdere virkningerne af suppressor celler på T-celle aktivering^8,9. Men resultaterne fra disse assays ikke nødvendigvis korrelerer til målcellen drab evne af CD8⁺ T celler.

Vi præsenterer her en alternativ funktionel analyse for at evaluere virkningerne af suppressor celler, især makrofager i metastatisk tumorer, på cytotoksicitet af CD8⁺ T celler. Denne metode bestemmer cytotoksicitet af CD8⁺ T celler, pre kulturperler med eller uden suppressor celler i overværelse af anti-CD3/CD28 aktiverende antistoffer, ved at opdage tumor celle apoptose, anført af fluorescens fra en fluorogenic caspase-3 substrat⁶ ved hjælp af automatiseret time-lapse mikroskopi (figur 1). Denne protokol har flere fordele sammenlignet med andre metoder; Det kræver kun et lille antal celler, giver mulighed for påvisning af vedhængende tumor celledød med høj følsomhed, kan billedet real-time effektor-til-målet interaktion og er modtagelig for high throughput screening.

I denne protokol bruges metastase-associerede makrofager (MAMs) og deres stamfader monocytic-MDSCs (M-MDSCs) isoleret fra metastatisk tumorer i mus som suppressor celler. I musemodeller af metastatisk brystkræft, en særskilt population af makrofager karakteriseret som F4/80^højeLy6G^-CD11b^højLy6C^lav ophobes i lungerne som indeholder metastatisk tumorer. Denne makrofag befolkning er sjældent fundet i den normale lunge og dermed kaldes metastase-associerede makrofager (MAMs)¹⁰. I disse musemodeller, en anden myeloide celler befolkning, defineret som F4/80^højeLy6G^-CD11b^højLy6C^høj, også ophobes overvejende i metastatisk lunge hvor det giver anledning til MAMs¹¹. Baseret på deres egenskaber, kan CD11b^højLy6C^høj MAM stamfader celler repræsentere M-MDSCs¹².

Protocol

Alle procedurer, der involverer mus blev udført i overensstemmelse med licens tilladelse fra britiske Home Office (P526C60B3). Oplysninger om kommercielle reagenser og udstyr er angivet i Tabel af materialer.

1. forberedelse af target-cellerne, der udtrykker rødt fluorescerende proteiner i deres kerner

1. Opnå en target mus cancer cellelinie fra en passende kilde.
   Bemærk: I denne protokol, et stærkt metastatisk derivat af E0771 musen brystkirtler tumor celler (E0771-LG)¹³ er brugt. Forældrenes E0771 celler stammer fra C57BL/6 mus¹⁴.
2. Tø og opretholde et hætteglas med E0771-LG celler med Dulbeccos modificerede Eagles Medium (DMEM) herunder 10% (v/v) føtal bovint serum (FBS) i en celle kultur inkubator ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO₂.
   Bemærk: Det bør bekræftes, at cellerne er negative for mycoplasma. Med henblik herpå, kultur E0771 celler (eller celler testes) for 2-3 dage som beskrevet ovenfor (i fravær af antibiotika og antimykotika), indsamle 500 μL af næringssubstratet. Centrifugeres medium ved 12,419 x g i 60 s at fjerne celle debris og overføre supernatanten til nye rør. Bestemme mycoplasma forurening ved hjælp af en kommercielt tilgængelig mycoplasma testkit (Se Tabel af materialer) og/eller PCR¹⁵ efter fabrikantens anvisninger.
3. Frø 5 x 10³ E0771-LG celler pr. brønd i en 12-godt plade, og kultur celler med 10% (v/v) FBS-DMEM natten over i en inkubator ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO₂.
   Bemærk: Hvis spredning af target-cellerne er lav (befolkning fordobling tid større end 36 h), antallet af celler kan øges til 1 x 10⁴.
4. Udskift mediet med 1 mL 10% (v/v) FBS-DMEM herunder 10 μg/mL polybrene og tilsættes 25 μL lentiviral partikler (1 x 10⁶ TU/mL) kodning en nuklear begrænset rødt fluorescerende proteiner (mKate2, henvises til Tabel af materialer).
5. Kultur celler i 24 timer i en inkubator ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO₂.
6. Udskift mediet med 10% (v/v) FBS-DMEM og kultur celler i 24-48 timer i en inkubator ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO₂.
7. Udskift mediet med 10% (v/v) FBS-DMEM herunder 1 μg/mL puromycin, når celler begynder at udtrykke rødt fluorescerende proteiner, og kultur cellerne, indtil de er 80-90% sammenflydende.
   Bemærk: Koncentrationen af puromycin vil være forskellig mellem target celletyper og bør optimeres ved hjælp af un-transfected celler.
8. Subkultur den overlevende celler for 1-3 passager med 10% (v/v) FBS-DMEM herunder 1 μg/mL puromycin, og cryopreserve bestande i en flydende kvælstof vapor fase storagesystem indtil brug.

2. isolering af suppressor celler fra tumorer i mus

Bemærk: I denne protokol, suppressor celler (dvs., MAMs og M-MDSCs) er isoleret fra lungen indeholdende metastatisk tumorer etableret af E0771-LG celler. Betingelser for væv dissociation og celle sortering skal optimeres for at isolere cellerne fra forskellige væv.

1. Injicér 1 x 10⁶ kræftceller (E0771-LG) i halen vene af syngeneic (C57BL/6), kvindelig, 7-10 uge gamle mus.
2. Efter 14 dage, isolere lunge indeholdende metastatisk tumorer og forberede encellede suspensioner fra perfused lungerne via Enzymatisk nedbrydning som tidligere beskrevet¹¹.
   Bemærk: I denne protokol, fire mus er injiceret med kræftceller og deres metastatisk lunge kombineres for at opnå tilstrækkelig suppressor celler.
3. Inkuber enkelt celle suspensioner med anti-mus CD16/CD32 antistof i 30 min på isen, og plette med fluorescerende antistoffer mod CD45, F4/80, CD11b, Ly6C, og Ly6G (Se Tabel af materialer) for en anden 30 min.^{10,11 , 13}.
4. Vaske de farvede celler en gang med 1 mL PBS, som indeholder 2% (w/v) bovint serumalbumin (BSA), og genopslæmmes celle pellet med 500-1000 μL af PBS, som indeholder 2% (w/v) BSA.
5. Tilføje 3 μM af DAPI, og sortere M-MDSCs (DAPI^-CD45⁺F4/80⁺Ly6G^-CD11b^højLy6C^høj) og MAMs (DAPI^-CD45⁺F4/80⁺Ly6G^-CD11b^høj Ly6C^lav) ved hjælp af en celle sidesorteringen (tillægs figur 1).
   Bemærk: Tærsklen på Ly6C plan at skelne MAMs (Ly6C^lav) og M-MDSCs (Ly6C^høj) er baseret på de hjemmehørende alveolær makrofager (RMAC). Renheden af de sorterede celler er målt via flowcytometri med en forventet renhed af mere end 90%.
6. Resuspend sorteret cellerne med 400 μL af DMEM indeholdende 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1% (v/v) ikke-essentiel aminosyre, 1 mM natrium pyruvat, og 50 nM 2-mercaptoethanol (kaldet beriget-DMEM, E-DMEM).
7. Tæl antallet af levende celler benytter Trypan blå udstødelse metode¹⁶ og justere til 2 x 10⁶ celler/mL med E-DMEM.
8. Hold celler på køl indtil brug.

3. isolering af CD8⁺ T-celler fra milt af mus

1. Isolere milt fra en mus, der er syngeneic til target kræft cellelinje (dvs. C57BL/6 mus i denne protokol) som følger:
   1. Aflive dyret af CO₂ indånding.
   2. Placere dyret på en ren dissektion bord og aftør huden med 70% (v/v) ethanol.
   3. Skåret maven huden ved hjælp af saks til at eksponere milten
   4. Isolere milt, som er placeret ringere til maven, og læg det i et rør, der indeholder 5 mL iskold PBS.
2. Bruge indre stemplet en steril 5 mL sprøjte, male milt på en 100 μm celle si ligger på en 50 mL tube.
3. Igennem filteret ved hjælp af samlede 10 mL PBS cellerne.
4. Centrifugeres cellesuspension ved 337 x g i 5 min, og Opsug supernatanten.
5. Celle resuspenderes i 1 mL PBS, som indeholder 2 mM EDTA og 0,5% (w/v) BSA (kører buffer) og filtreres gennem et 40 μm celle si.
6. Antal levende celle og Juster til 1 x 10⁸ celler/mL ved hjælp af den buffer, der kører.
   Bemærk: Hold en lille alikvot af celler som en pre berigelse prøve for en renhed check.
7. Berige for CD8⁺ T-celler ved hjælp af en negativ udvalg kit og en magnetisk sorteringsanlæg (Se Tabel af materialer).
   1. Overføre 1 x 10⁸ (1 mL) af splenocytes cellerne til et 5 mL polystyren runde-nederste rør.
   2. Tilsæt 50 μL af biotinylated antistoffer, og der inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
   3. Tilsæt 125 μL af streptavidin konjugeret magnetiske perler, og der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
   4. Tilføje 1.325 mL kører buffer, og forsigtigt mix af pipettering.
   5. Placer røret ind i magneten, og Inkuber ved stuetemperatur til 2,5 min.
   6. Afhente magneten, og hæld beriget cellesuspension i en ny tube.
8. Resuspend beriget cellerne med 200 μl af E-DMEM (dvs.., DMEM som indeholder 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1% (v/v) ikke-essentiel aminosyre, 1 mM natrium pyruvat og 50 nM 2-mercaptoethanol).
9. Tæl antallet af levende celler og justere til 2 x 10⁶ celler/mL med E-DMEM. Holde cellerne ved 37 ° C i en CO₂ inkubator indtil brug.
   Bemærk: Hold en lille alikvot af celler som en post berigelse prøve for en renhed check.
10. Bestemme renheden af CD8⁺ T celler ved flowcytometri som følger:
    1. Tage 1 x 10⁴ celler fra før berigelse (trin 3.6) eller efter berigelse (trin 3.9) prøver og justere samlede volumen af hver 100 μL bruger kører buffer.
    2. Inkuber enkelt celle suspensioner med anti-mus CD16/CD32 antistof i 30 min på isen, og plette med fluorescerende antistoffer mod CD45, CD3, CD4 og CD8 (Se Tabel af materialer) for en anden 30 min.
    3. Vaske de farvede celler med 500 μL af PBS, som indeholder 2% (w/v) BSA, og genopslæmmes celle pellet med 500-1000 μL af PBS, som indeholder 2% (w/v) BSA.
11. Tilføje 3 μM af DAPI, og bestemme procentdelen af CD3⁺CD4^-CD8⁺ celler i den samlede CD45⁺ celle befolkning.

4. aktivering og udvidelse af den isolerede CD8⁺ T celler

1. Alikvot 1 x 10⁵ celler pr. 50 μL CD8⁺ T celler (udarbejdet i trin 3.9) i brønd af et U-bunden 96-brønd plade.
2. Tilføj 1 x 10⁵ celler pr. 50 μL suppressor celler (udarbejdet i trin 2.7) eller 50 μL af E-DMEM i brøndene.
3. Forbered aktivering medium, der består af E-DMEM, 4 x 10⁴ U/mL koloni-stimulerende faktor 1 (CSF-1), 240 U/mL interleukin-2 (IL-2), 8 μg/mL anti-mus CD3ε antistof og 16 μg/mL anti-mus CD28 antistof.
   Bemærk: CSF-1 er ikke påkrævet for T-celle aktivering, men er afgørende for overlevelse af suppressor celler i denne protokol (dvs., MAMs og M-MDSCs). Således, det er bevaret i fælles kultur af T-celler med målrette kræftceller til at bevare sammenhængen i kultur betingelser. Da CSF-1 findes i nano-molar koncentrationer i alle væv og er nødvendig for monocyt/makrofag levedygtighed in vivo, er dette en fysiologisk baggrund for disse celler.
4. Tilsæt 50 μL af aktivering medium (trin 4.3), og 50 μL af E-DMEM med eller uden reagenser skal testes.
5. Pladen anbringes i en inkubator ved 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO₂ og kultur cellerne i 4 dage.

5. opsætning af co kultur af target-celler med pre-aktiveret CD8⁺ T celler

1. Tilsæt 30 μL af 1: 100 fortyndet vækstfaktor-reduceret opløselige basalmembranen matrix (Table of Materials) i brønd af flad bund 96-brønd plade egnet til mikroskopi, og der inkuberes ved 37 ° C i en CO₂ inkubator i mindst 1 time.
2. Forberede målceller (dvs. E0771-LG celler udtrykker nukleare-begrænset rødt fluorescerende proteiner).
   1. Inkuber target-cellerne med 1 mL 0,05% trypsin/EDTA ved stuetemperatur i 1 minut, og høste cellerne af blid pipettering.
   2. Tilføje 9 mL af DMEM herunder 10% (v/v) FBS, og der centrifugeres cellesuspension ved 337 x g i 5 min.
   3. Genopslæmmes celler med 500 μL af E-DMEM, og Tæl antallet af levende celler.
      Bemærk: Før tælle target-cellerne, filtrere cellerne gennem en 40μm celle si at producere enkelt cellesuspension.
   4. Justere tæthed til 2 x 10⁴ celler/mL (= 1 x 10³ celler pr. 50 μl) ved at tilføje E-DMEM, og holde celler på is.
3. Forberede effektor celler (dvs., pre-aktiveret CD8⁺ T celler).
   1. Resuspend celler i et godt af 96-brønd plade (trin 4.5) grundigt af pipettering, og overførsel af flydende CD8⁺ T celler ind i en ny 1,5 mL rør.
      Bemærk: MAMs og M-MDSCs stramt overholder godt og er ikke løsrevet af den pipettering.
   2. At indsamle tilbageværende celler, tilføje 200 μl af PBS i brønden og overføre til tube taktfast 5.3.1.
   3. Cellerne vaskes med 1 mL af E-DMEM en gang (centrifugeres ved 337 x g) i 5 min, Aspirér og kassér supernatanten), og pelleten dem med 100 μL af E-DMEM.
   4. Tæl antallet af levende celler (ved hjælp af metoden trypan blå udelukkelse), justere tæthed til 1,6 x 10⁵ celler/mL (= 4 x 10³ celler/25 μl) og holde celler på is.
4. Opsug basalmembranen matrix fra hvert hul i pladen i trin 5.1.
5. Tilsæt 1 x 10³ celler/50 μL af target-cellerne (trin 5.2.4) i hver brønd og bland godt.
   Bemærk: For at undgå kant effekter på grund af fordampning af medium, kun de inderste 60 wells af 96 godt plade skal anvendes til analyse.
6. Tilsættes 25 μL af E-DMEM herunder 4 x 10³ U/mL IL-2 og 10 μM fluorogenic caspase-3 substrat (Se Tabel af materialer).
7. Tilsæt 4 x 10³ celler/25 μL af CD8⁺ T celler (trin 5.3.4) i passende brønde og bland godt.
   Bemærk: Tilstedeværelsen af for mange celler i en godt gør analysen mere vanskeligt. I denne model, en 4:1 effektor: target ratio (samlede celle nummer 5 x 10³ celler/brønd) var optimal, men en 8:1-forhold var ikke optimalt. Brønde, der indeholder følgende fire kontrolelementer er nødvendige for at støtte med dataanalyse: målrette cellerne i massefylden anvendes til fælles kultur wells (1 x 10³ celler/brønd) i medium med og uden caspase-3 substrat, effektor celler (1 x 10³ celler / godt) i medium med og uden caspase-3 substrat.
8. Tilsæt 200 μl af PBS eller sterilt vand i alle Tom brønd (især brønde i periferien af pladen) for at reducere fordampningen af medium fra eksperimentelle brønde.
9. Sæt pladen i en time-lapse fluorescens mikroskop, der holdes på 37 ° C, luftfugtighed 95% og 5% CO₂.
   Bemærk: Ryste pladen i et cross-mønster til at distribuere alle celler jævnt, og lad derefter pladen forblive ved stuetemperatur på en flad overflade for 10-20 min før du overfører til rugemaskine.

6. imaging af celler

Bemærk: Detaljeret billede erhvervelse indstillinger vil variere med mikroskop og fluorophores anvendes; følgende generelle erhvervelse parametre skal være ansat for optimale resultater.

1. Ved hjælp af en passende autofokus rutine på mikroskopet, erhverve billeder der dækker mindst 25% af det samlede areal i hver eksperimentelle godt af 96-brønd plade.
2. Sæt mikroskop til at erhverve billeder i fasekontrast samt en fluorescerende kanal egnet til nukleare-begrænset rødt fluorescerende proteiner (mKate2) og en fluorescerende kanal egnet til den grønne fluorogenic aktiveret caspase-3 substrat (med excitation på 488 nm) (figur 2).
3. Fange billeder i eksperimentel brønde i fasekontrast og de 2 fluorescerende kanaler hver 1 til 3 h i mindst 72 timer.

7. billedanalyse bruger billede analyse software

Bemærk: Detaljeret billede analyse indstillinger varierer afhængigt af den anvendte software (der henvises til Tabel af materialer); følgende generelle analyse procedurer bør være ansat for optimale resultater.

1. Afgøre, om spektrale un-blanding er påkrævet for at adskille den fluorescerende signal udsendes af target cellekerner fra, der udsendes af apoptotiske kerner og eventuelt oprette en analyse protokol til at opnå dette;
   1. Se en kontrol godt indeholdende eneste target-cellerne (mkate2-mærket) i medium uden caspase-3 substrat i grøn fluorescerende kanal.
   2. Observere om grønne fluorescens udsendes af de røde kerner (kerner vises grøn)
   3. Hvis grøn Fluorescens er tilsyneladende i kerner, den spektrale unmixing adgangskontrol i billedbehandling software og øge procentdelen af røde fjernet fra grøn, indtil det grønne signal forsvinder (vores erfaring, dette er normalt 6-7% for lyse mKate2 Fluorescens).
   4. Hvis grøn fluorescens ikke fremgår i nogen kerner, er ingen spektral urtåge nødvendigt.
      Bemærk: Denne spektral unmixing korrektion testen kan også udføres ved hjælp af et godt af target-cellerne i medium indeholdende caspase-3 substrat. Men der er normalt en meget lav grad af spontan apoptose i target-cellerne (mindre end 10%), hvilket resulterer i et par target cellekerner udsender grønne fluorescens på grund af aktivering af caspase 3 i stedet for fluorescens bløder igennem. Ægte fluorescens bløder igennem fremgår disse betingelser når grøn Fluorescens er tilsyneladende i alle kerner.
   5. Se et kontrolelement som godt indeholder kun effektor celler (kerner umærket) i medium uden caspase-3 substrat i den røde og grønne kanal individuelt.
   6. Observere om enten grøn eller rød fluorescens udsendes af kerner. Hvis hverken rød eller grøn Fluorescens er synlige i de enkelte kanaler er ingen spektral urtåge nødvendigt.
      Bemærk: I vores erfaring, mus CD8⁺ T celler er ikke auto-fluorescerende og dermed ingen spektral urtåge er nødvendige for disse celler. Spectral unmixing korrektion prøven kan også udføres ved hjælp af et godt af effektor celler i medium indeholdende caspase-3 substrat. Men der er som regel et vist niveau af spontan apoptose resulterer i effektor cellekerner udsender grønne fluorescens på grund af aktivering af caspase-3. Ægte fluorescens bløder igennem fremgår disse betingelser når grøn Fluorescens er tilsyneladende i alle kerner.
2. Bruge et fluorescens baggrund subtraktion metode (f.eks. TopHat), med relevante parametre for prøven, for at løse de fluorescerende objekter i begge fluorescerende kanaler.
   Bemærk: I den grønne kanal vi brugte TopHat (kerner radius = 10,0 µm, grønne fluorescens tærskel = 0,7 grøn kalibrering enheder). I den røde kanal vi brugte TopHat (kerner radius = 10,0 µm, røde fluorescens tærskel = 0,5 røde kalibrering enheder).
3. Bruge relevante parametre for kant-opdeling for at løse individuelle fluorescerende kerner.
   Bemærk: Vi ikke bruge edge opdeling i den grønne eller røde fluorescens kanal.
4. Bruge billeder i den røde kanal fra brøndene indeholder kun target-cellerne (med caspase substrat) for at bestemme størrelsen af målet kerner.
   Bemærk: Vi brugte 80 µm².
5. Bruge billeder i den grønne kanal fra brøndene med kun effektor celler (med caspase substrat) for at bestemme den gennemsnitlige størrelse af apoptotiske effektor kerner.
   Bemærk: Én apoptotic effektor kerner varierede fra 40-80 µm² i disse eksperimenter.
6. Oprettet en analyse procedure til at tælle antallet af fluorescerende target cellekerner ved hjælp af et passende minimum størrelse begrænsning (fx minimumsareal, mindste diameter) (figur 2, target detection maske).
   Bemærk: Vi brugte en minimum kerner område (rød fluorescens) = 80 µm².
7. Oprettet en analyse procedure til at tælle antallet af apoptotiske kerner, som er større end den gennemsnitlige størrelse af apoptotiske effektor kerner (figur 2, størrelse begrænset apoptose maske).
   Bemærk: Størrelse filter blev sat til 80 µm² (dvs. kun områder af grønne fluorescens større end denne størrelse var talt op, således undtagen én apoptotic effektor kerner). Med disse parametre, øger nøjagtigheden af analysen i tælle apoptotiske target cellekerner, selv om nogle aggregater af apoptotiske effektor celler kan medregnes.
8. Oprettet en analyse procedure til at tælle antallet af apoptotiske target-cellerne ved at tælle kerner hvor rødt fluorescerende signal (fra trin 7.6) og størrelse-begrænset grøn fluorescerende signal (fra trin 7.7) betydeligt lokalisere Co (figur 2, R /G overlapning maske).
   Bemærk: En passende Co lokalisering kan variere fra 30% til 100% af den gennemsnitlige størrelse af målet kerner. Overlapning størrelse filter blev sat til 40 µm².
9. Bestemme antallet af apoptotiske target cellekerner og antallet af mål cellekerner i brøndene for hver eksperimentelle betingelse løbet hele tiden.

8. dataanalyse ved hjælp af beregning og grafisk software

1. Graf antallet af apoptotiske target cellekerner fremstillet i trin 7,9 løbet hele tiden for de eksperimentelle brønde. Hvis flere brønde blev brugt for hver eksperimentelle betingelse, grafisk præsentere resultater som betyder ± standardafvigelse.
2. Beregne den apoptotiske brøkdel af befolkningen i target-cellerne ved at dividere antallet af apoptotiske celler i hver brønd med antallet af target-cellerne i hver brønd ved hvert tidspunkt.
3. Afbilde resultaterne i trin 8.2.
4. Bestemme arealet under kurven (AUC) for hver kurve. Peak apoptotiske brøkdel af befolkningen for hver kurve kan også bestemmes samt det tidspunkt, hvor peak opstår, hvis det ønskes. Afgøre, om AUC bestemmes for de eksperimentelle betingelser er væsentligt anderledes, ved hjælp af passende statistiske test.
   Bemærk: Den uparret t-test med welchs korrektion blev anvendt på AUC resultater.

Representative Results

Denne metode er baseret på enkle Co kultur af målrette kræftceller med effektor CD8⁺ T celler, der har været præ kulturperler, med eller uden suppressor celler i overværelse af anti-CD3/CD28 aktiverende antistoffer. Det registrerer CD8⁺ T-celle-induceret kræft celle apoptose over tid efter fælles kultur, således at evaluering af virkningerne af suppressor celler på cytotoksicitet af CD8⁺ T celler.

Typisk, kræftceller øge grøn fluorescens i deres kerner efter aktivering af en nuklear-targeting caspase biosensor når disse celler tage kontakt med CD8⁺ T celler der er pre-aktiveret af antistoffer i mangel af suppressor celler () Figur 3; Supplerende Movie 1). Grøn fluorescens fra caspase substratet var påvises for mindst 15 h efter apoptose blev indledt. Nogle spontane apoptose af effektor CD8⁺ T celler blev også observeret over tid, selv om disse celler blev kulturperler i isolation (figur 4; Supplerende Movie 2). Dog kerner størrelser af CD8⁺ T celler er mindre end de af kræftceller og dermed apoptotiske 'effektor' celler kan udelukkes fra apoptotiske 'target' celle tæller af en størrelse begrænsning billede analysemetode (figur 2 og figur 4). Selvom nogle målrette kræftceller viser en lille afrundet form uden grønne fluorescens, påvirker dette ikke analysen, som disse celler er under mitosen snarere end apoptose (supplerende film 3), og dermed er udelukket fra apoptotiske 'mål' celle tæller med en rød/grøn overlapning maske (tillægs figur 2). Spontan apoptose af målrette kræftceller er lejlighedsvis fundet selv i den fælles kultur (supplerende film 3). Men fælles kultur af target kræft celler med pre-aktiveret CD8⁺ T celler øget tumor celle apoptose over niveauerne af spontan apoptose i monokultur af kræftceller (figur 4). Generelt, når du bruger et optimalt forhold af målrette kræftceller til effektor celler, et højdepunkt i antallet af apoptotiske målrette kræftceller kan observeres (figur 5A). Denne peak er tydeligere, når dataene er udtrykt som den apoptotiske brøkdel af celle målgruppen (figur 5B). I dette eksperiment de basale apoptose af mål tumorceller toppede 24 h (med apoptotiske brøkdel = 0,08), men CD8⁺ T-celle-induceret apoptose nået et maksimalt niveau på 17 h (med apoptotiske brøkdel = 0.66).

Det fandt vi yderligere CD8⁺ T celler pre inkuberes med MAMs eller M-MDSCs kunne gøre kontakt med target kræftceller, men denne kontakt syntes at resultere i færre tilfælde af kræft celle apoptose i forhold til CD8⁺ T celler pre-aktiveret uden suppressor celler (figur 3 og figur 4; Supplerende Movie 4 og supplerende film 5). Selv om CD8⁺ T celler pre inkuberes med myeloide celler lejlighedsvis induceret kræft celle apoptose, der var også nogle spredning af target kræftceller, der ikke har været stimuleret til at gennemgå apoptose tid i løbet af de eksperiment (supplerende film 6). I overensstemmelse med disse resultater, peak brøkdel af apoptotiske kræftceller kulturperler med CD8⁺ T celler pre inkuberes med myeloide celler (apoptotiske brøkdel = 0,38 på 23 h for MDSC-E og 0,25 på 20 h for MAM-E) var betydeligt lavere end i kræftceller kulturperler med CD8⁺ T celler som ikke pre rugede med suppressor celler (figur 6).

Figur 1: en ordning viser forsøgsmetoden. Naive milt CD8⁺ T celler er kulturperler med anti-CD3/CD28 aktiverende antistoffer med eller uden metastaser-associerede makrofager (MAMs) eller monocytic-myeloid-afledt suppressor celler (M-MDSCs). Efter 4 dage, flydende CD8⁺ T celler er indsamlet og co kulturperler med målrette kræftceller i overværelse af fluorogenic caspase-3 substrat. Apoptotiske kræftceller er påvist under real-time Fluorescens mikroskopi. Billeder vist er anskaffet ved hjælp af en levende celle-imaging platform (Se Tabel af materialer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: identifikation af apoptotiske målceller adskiller sig fra apoptotiske effektor celler. Øverste række: Image erhvervelse i den røde kanal giver mulighed for identifikation af target cellekerner af target detection maske (pink analyse mask). Mellemste række: billeder erhvervet i den grønne kanal angive apoptotiske effektor og target-cellerne. Asize begrænset apoptose maske (krikand analyse maske; større end 80 µm²) tillader én apoptotic effektor celler skal udelukkes fra analysen. Nederste række: sammensatte billeder flettede røde og grønne kanaler med fase kontrast billede (til venstre) eller rød/grøn overlapper maske (til højre). Identifikation af co lokaliseret, størrelse-begrænset grønne fluorescens med røde fluorescens (gul analyse maske), tillader mere nøjagtig detektering af apoptotiske målet kerner (gul pilespids) ved at udelukke aggregater af apoptotiske effektor celler (hvid pilespidser). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Interaktion mellem CD8⁺ T celler og kræftceller. Stills fra repræsentative time-lapse film af E0771-LG_NLR målceller (T) Co kulturperler med effektor CD8⁺ T celler (E) på 4:1 effektor/target ratio. MDSC-E og MAM-E angiver effektor celler pre inkuberes med M-MDSCs og MAMs henholdsvis. Sammensatte billeder (herunder billeder fra fase kontrast, røde og grønne kanaler) er vist. Pilespidser sporer de samme celler gennem de forskellige områder og tidspunkter. Gul pilespidser: et mål, der knytter til effektorer og undergår apoptose, hvid pilespidser: et mål, der knytter til effektorer men ikke undergår apoptose. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: påvisning af apoptotiske kræftceller. Repræsentative felter udvundet fra time-lapse film på 18 h efter billeddannelse. Sammensatte billeder (venstre, fase kontrast, røde og grønne kanaler) og billeder fra rød kanal uden (midten) eller (til højre) rød/grøn overlapning maske (gul) er vist. Gule prikker i højre kolonne repræsenterer apoptotiske kræftceller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: CD8⁺ T-celle-induceret kræft celle apoptose. (A) antallet af apoptotiske kræftceller kulturperler med effektor C8⁺ T-celler på forskellige effektor til target ratio (E:T). (B) apoptotiske brøkdel af målpopulationen celle. Data er middel ± SD. betyder arealet under kurven (AUC) er også vist. Parrede t-test med welchs korrektion blev brugt til at analysere AUC. * P < 0,0001 i forhold til E:T = 0:1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Virkninger af tumor infiltrerer myeloide celler på cytotoksicitet af CD8⁺ T celler. (A) antallet af apoptotiske kræftceller (mål: T) kulturperler med C8⁺ T celler (effektor: E) på 4:1 E:T ratio. CD8⁺ T celler var pre kulturperler i fravær (sort cirkel) eller tilstedeværelsen af monocytic-myeloid-afledt suppressor celler (MDSC-E: blå cirkel) eller metastase-associerede makrofager (MAM-E: rød cirkel). Data er middel ± SD. (B) apoptotiske brøkdel af målpopulationen celle. Data er middel ± SD. betyde AUC er også vist. Parrede t-test med welchs korrektion blev brugt til at analysere AUC. * P < 0,0001 i forhold til T, ^#P < 0,0001 sammenlignet med E + T. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tillægs figur 1. Gating strategi at isolere suppressor celler fra metastatisk lunge. (A) repræsentative dot grunde til at isolere monocytic myeloid-afledte suppressor celler (M-MDSCs) og metastaser-associerede makrofager (MAMs). Tærsklen på Ly6C plan at skelne MAMs (Ly6C^lav) og M-MDSCs (Ly6C^høj) er baseret på bopæl alveolær makrofager (RMAC). (B) renhed af de sorterede M-MDSCs (CD45⁺Ly6G^-CD11b⁺Ly6C^høj) og MAMs (CD45⁺Ly6G^-CD11b⁺Ly6C^lav). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Tillægs figur 2. Repræsentative billeder af mitotiske target-cellerne. Stills fra repræsentative time-lapse film af mål E0771-LG_NLR celle mono-kultur. Top: sammensatte billeder herunder billeder fra fase kontrast, røde og grønne kanaler. Bund: sammensatte billeder (røde og grønne kanaler) med rød/grøn overlapper maske. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3. Virkningerne af tumor infiltrerer myeloide celler om spredning af CD8⁺ T-celler. (A) repræsentative histogrammer viser fortynding af fluorescerende mærkning med CFSE i CD8⁺ T celler. Naive milt CD8⁺ T celler blev isoleret som beskrevet i protokollen-3 og mærket med 5 µM af CFSE ved 37 ° C i 15 min. Mærket T celler var kulturperler i overværelse af IL-2 og anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer med eller uden myeloide celler som beskrevet i protokol 4. Efter 4 dage, blev grønne fluorescens i T-celler opdaget af flow Flowcytometret. (B) Division indeks af CD8⁺ T celler beregnet som tidligere beskrevet¹⁷. Data er middel ± SEM. * P < 0,01 i forhold til at styre, ^#P < 0,05 i forhold til αCD3/CD28 Ab. venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 1. Film i figur 3 og 4; E + T. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 2. Film i figur 3 og 4; Effektor (E). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende film 3. Film i figur 3 og 4; Mål (T). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 4. Film i figur 3 og 4; MDSC-E + T. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende film 5. Film i figur 3 og 4; MAM-E + T. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende film 6. Film i figur 3 og 4; MAM-E + T (spredning). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne metode er baseret på to separate Co kultur trin: Co dyrkning CD8⁺ T celler med potentielle suppressor celler, og co dyrkning 'konditionerede' CD8⁺ T celler med mål tumorceller (figur 1). Det første skridt i fælles kultur er meget lig at for CD8⁺ T celle spredning assays almindeligt anvendt til at bestemme virkningen af suppressor celler på CD8⁺ T-cellefunktion. Men T celleproliferation, ikke altid er korrelerer med deres cytotoksicitet. For eksempel, har vi fundet at co kultur med M-MDSCs eller MAMs steg i stedet for reduceret spredning af CD8⁺ T-celler i overværelse af CD3/CD28 aktivering antistoffer (supplerende figur 3), boer disse præ aircondition CD8⁺ T-celler viste reduceret cytotoksicitet mod målrette kræftceller (figur 4, figur 5, figur 6). Disse resultater fremhæve betydningen af evalueringen af funktionelle aktivitet, fremgår af target kræft celle apoptose, der tilbydes af denne CD8⁺ T-celle cytotoksicitet assay.

I denne analyse har vi identificeret at CD8⁺ T celler kræver ca 15 h af fælles kultur for at fremkalde maksimal apoptose af E0771-LG mus brystkirtler tumorceller (figur 5). Denne forsinkelse kan skyldes forsinkelse mellem første kontakt af effektor celler med mål samt ledsagende immun synapse dannelse og tidsforbruget til at inducere apoptotisk signaler i mål som målt ved aktivering af caspase-3 (supplerende film 1 ). Vi har også identificeret som antallet af apoptotiske tumorceller nået et plateau efter 24 h, som er sandsynligvis på grund af afskaffelsen af mål af T-celler og/eller tab af fluorescerende signal fra døde celler. Denne evne til at identificere tidspunktet for peak apoptose er en væsentlig fordel ved denne analyse, da fastsættelse af et optimalt tidspunkt er vigtigt for passende sammenligninger mellem forskellige betingelser. I vores tilfælde f.eks forskellen i cytotoksicitet mellem kontrol CD8⁺ T celler og MDSC/MAM-uddannet CD8⁺ T celler var meget større på 15-18 h i forhold til 72 h (figur 5), og dermed et slutpunkt eksperiment ved hjælp af en 72 h inkubationstiden ville give misvisende resultater.

Denne metode giver også mulighed for visualisering af real-time effektor til målcellen interaktion, som ville give større indsigt i den mekanisme, der ligger til grund for begrænset cytotoksicitet af CD8⁺ T celler pre inkuberes med suppressor celler. For eksempel, vi bemærkede, at CD8⁺ T celler pre inkuberes med M-MDSCs eller MAMs stødt og kommunikerede med mål tumorceller men ikke altid inducerer apoptose (supplerende film 4, supplerende film 5, supplerende film 6). Selvom vi ikke sætte tal på denne begivenhed, vil det være muligt og interessant at måle og sammenligne andelen af møder og deres interaktion tid i sammenhæng med apoptose induktion. En anden stor fordel er, at denne metode kræver et lille antal celler (f.eks., 1 x 10³ mål) og effektor celler pr. brønd 4 x 10,³ . I virkeligheden, kan denne protokol være yderligere miniaturized til 384-godt plade-format, hvis det ønskes. Denne analyse er derfor velegnet til high throughput screening og eksperimenter hvor celle tal er begrænset, såsom in vitro- test ved hjælp af precious celler stammer fra in vivo eller ex vivo prøver.

På den anden side er en begrænsning af den nuværende assay tilstedeværelsen af betydelige antal døde effektor celler i nogle betingelser. For at øge nøjagtigheden i skelne apoptose af målrette kræftceller fra af effektor CD8⁺ T celler, kerner af target celler er mærket og en kerner størrelse begrænsning (der udelukker effektor celler) anvendes til dataanalyse i dette assay (figur 2). Der er dog visse tilfælde hvor overlejring af aggregater af (grøn) apoptotiske CD8⁺ T celler på ikke-apoptotiske målrette kræftceller, som kan forvirre resultaterne. Denne begrænsning kan afbødes ved hjælp af en død celle fjernelse kolonne på effektor celler før Co kultur med mål tumorceller, under forudsætning af tilstrækkelig antal effektorceller celler er tilgængelige. Med mere komplekse mikroskopi systemer, kan det også være muligt at reducere de falsk positive signal ved mærkning effektor CD8⁺ T celler med en fluorophore adskilt fra target cellekerner og fluorogenic caspase-3 substrat.

Hidtil har denne protokol er blevet udnyttet til at undersøge antigen non-specifik aktivering af CD8⁺ T celler. Selv om MDSCs og TAMs i tumor mikromiljø undertrykke T-cellefunktioner gennem antigen uspecifikke mekanismer, undertrykke MDSCs i de perifere lymfevæv T-celle respons i en antigen specifikke måde¹⁸. For at undersøge immun suppressiv funktioner af disse celletyper, en in vitro-spredning analyse ved hjælp af CD8⁺ T celler fra OT-1 Transgene mus er almindeligt anvendt. I denne analyse, OT-1 T-celler (udtrykker ægalbumin (æg) specifikke T-celle receptoren) er co kulturperler med suppressor MDSCs i nærværelse af æg peptider, som er gældende for den første kultur i vores cytotoksicitet assay (dvs.., aktiveringen af T-celler i tilstedeværelse eller fravær af undertrykkerne). Det er også muligt at manipulere målrette kræftceller til at udtrykke æg, som kan fremkalde antigen-specifikke kræft celle drab af OT-1 T-celler. Derfor vil analysen også aktivere undersøgelse af MAM/MDSC-medieret undertrykkelse af antigen-specifikke T-celle aktivering. Det er også muligt at anvende analyse for at undersøge menneskelige celler, som aktivering antistoffer mod CD3 og CD28 er kommercielt tilgængelige, og en protokol til at isolere menneskelige TAMs fra kliniske prøver er blevet etableret¹⁹.

Kollektivt, denne analyse er meget alsidig og kan bruges til at undersøge cytotoksicitet af andre immun celletyper. I øjeblikket, i vores laboratorier, det er også for at undersøge antigen-afhængige celle cytotoksicitet under forskellige forhold og er også ved at blive udviklet for høj overførselshastighed screening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA (1X)	Gibco	25300-054
12-Well Cell Culture Plate	Freiner Bio-One	665-180
1x PBS	Gibco	14190-094
2-mercaptethanol	Sigma	M6250-10ML
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube	FALCON	352054
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )	Costar	3799	Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells
96-well plate (Flat bottom)	Nunc	165305	Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody	BIO-RAD	MCA497A647	Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody	Biolegend	100730	Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells
anti-mouse CD28 Antibody	Biolegend	102111	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e Antibody	Biolegend	100314	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100236	Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody	Biolegend	128026	Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells
Bovine Serum Albmin	Sigma	A1470-100G
Cell Strainer (100μm Nylon)	FALCON	352360	To smash the spleen
Cell Strainer (40μm Nylon)	FALCON	352340	To filter the lung digestion
DAPI	Biolegend	422801
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium	Gibco	41966-029
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit	StemCell Technologies	19853
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FITC anti-mouse CD4 Antibody	Biolegend	100406	Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells
Geltrex Ready-to-Use	Gibco	A1596-01	Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent	Essen BioScience	4476	Lenti viral particules encoding mKate2
IncuCyte ZOOM	Essen BioScience		Detector (fluorescence microscope)
IncuCyte ZOOM 2018A	Essen BioScience		Analysis software
L-Glutamine (100X)	Gibco	A2916801
Lung Dissociation Kit	Miltenyi	130-095-927	Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
Non-essential amino acid (100X)	Gibco	11140-035
NucView488	Biotium	10403	Fluoregenic caspase-3 substrate
PE anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127607	Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101216	Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells
Pen Strep	Gibco	15140-122	Penicillin Streptomycin for primary culture of cells
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody	Biolegend	103132	Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma	H9268
Puromycin	Gibco	A11138-03
RBC Lysis Buffer (10X)	Biolegend	420301
Recombinant murine IL-2	Peprotech	212-12	Activation of isolated CD8+ T cells
Sodium pyruvate (100X)	Gibco	11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	101320
: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm)  : Green channel excitation: 440 - 480 nm  : Green channel emission: 504 - 544 nm  : Red channel excitation: 565-605 nm  : Red channel emission: 625 - 705 nm